Summary
Molti modelli di endometriosi di roditori sono limitati dalla complessità tecnica, dalla riproducibilità e / o dalla necessità di animali immunocompromessi o topi reporter speciali. Presentiamo un sistema semplificato di induzione della lesione utilizzando qualsiasi topo sperimentale con un sistema di punteggio oggettivo verificabile in modo indipendente e senza necessità di ovariectomia o chirurgia di sopravvivenza.
Abstract
L'endometriosi è una delle principali cause di dolore pelvico e infertilità. È definito dalla presenza di tessuto endometriale in posizioni extrauterine. Lo sviluppo di nuove terapie e strumenti diagnostici per l'endometriosi è stato limitato a causa in parte delle sfide nello studio della malattia. Al di fuori dei primati, pochi mammiferi hanno le mestruazioni e nessuno sviluppa endometriosi spontanea. I modelli di roditori sono popolari ma richiedono l'induzione artificiale dell'endometriosi, con molti che utilizzano topi immunocompromessi o malattie indotte chirurgicamente. Recentemente, è stata data maggiore attenzione ai modelli che coinvolgono l'iniezione intraperitoneale. Presentiamo un modello murino di endometriosi che integra diverse caratteristiche dei modelli di endometriosi esistenti in un nuovo sistema semplificato che si basa sulla quantificazione microscopica al posto della classificazione soggettiva. In questo modello, eseguiamo la stimolazione ormonale dei topi donatori, l'iniezione intraperitoneale, l'indagine addominale sistematica e la raccolta dei tessuti e la quantificazione istologica che può essere eseguita e verificata in qualsiasi momento dopo l'autopsia. Questo modello richiede risorse e formazione minime; non richiede competenze da parte di tecnici di laboratorio nella chirurgia murina di sopravvivenza o nell'identificazione di lesioni endometriotiche grossolane; può essere usato in topi immunocompromessi, immunocompetenti e/o mutanti; e crea in modo affidabile lesioni endometriotiche che sono istologicamente coerenti con la malattia endometriotica umana.
Introduction
L'endometriosi è una malattia enigmatica del tratto riproduttivo femminile con significativi oneri finanziari e sanitari per le donne1,2. L'eziologia dell'endometriosi non è completamente compresa e sono state proposte molteplici spiegazioni tra cui metaplasia celomica, riposi mülleriani embrionali, reclutamento di cellule progenitrici derivate dal midollo osseo e mestruazioni retrograde3. Mentre possono essere coinvolti molteplici aspetti di questi meccanismi proposti, e nessuna singola spiegazione può spiegare tutte le forme della malattia, il modello principale di patogenesi dell'endometriosi è la mestruazione retrograda. Le mestruazioni retrograde sono il passaggio dell'effluente mestruale attraverso le tube di Falloppio e nella cavità peritoneale; si stima che il 90% delle donne mestruazioni si sottoponga regolarmente a mestruazioni retrograde4,5. Dato questo fenomeno comune delle mestruazioni retrograde, perché l'endometriosi si sviluppa solo in un sottogruppo di donne non è chiaro5. Per comprendere meglio l'eziologia di questa malattia, gli studi diretti sull'uomo non sono fattibili e gli studi sugli animali sono giustificati.
L'endometriosi è una sfida sia da trattare che da studiare. La prevalenza della malattia non è nota ma stimata in 10%1. Mentre alcuni tipi avanzati di endometriosi possono essere identificati con precisione attraverso l'imaging non invasivo, una diagnosi definitiva si ottiene solo attraverso l'analisi istopatologica di campioni di biopsia ottenuti chirurgicamente; lesioni che visivamente sembrano essere malate, possono infatti essere fibrosi o cicatrici da altre cause6. La gravità e l'estensione della malattia non sono correlate alla sintomatologia7.
Le lesioni dell'endometriosi sono costituite da tipi cellulari eterogenei e popolazioni che interagiscono in modi complessi all'interno del microambiente, limitando quindi l'utilità dei modelli cellulari8,9. Esistono modelli in vivo, ma questi hanno sfide e limitazioni intrinseche10,11,12. I modelli di primati sono ideali ma spesso non sonofattibili13,14,15. Pochi mammiferi non primati hanno le mestruazioni e sviluppano l'endometriosi spontaneamente16. Esistono modelli di roditori di endometriosi, ma ognuno ha limitazioni17. Molti di questi modelli richiedono un intervento chirurgico di sopravvivenza per suturare o impiantare il tessuto endometriale nella parete o nell'intestino del ricevente donatore, aggiungendo complessità tecnica, necessità di anestesia e confondendo i fattori immunitari dell'intervento stesso18,19,20. Inoltre, molti modelli richiedono l'ovariectomia e l'integrazione di estrogeni; mentre aumenta la resa della lesione, questo aggiunge tempo, spese e ulteriori interventi chirurgici di sopravvivenza. I modelli di iniezione intraperitoneale (IP) non richiedono anestesia o chirurgia di sopravvivenza e questi modelli simulano logicamente le mestruazioni retrograde meglio dei modelli di sutura21,22,23. La maggior parte dei modelli IP, tuttavia, sono soggetti a una maggiore variabilità nella posizione della lesione a causa della dispersione casuale dei frammenti endometriali dopo l'iniezione e quindi a una maggiore distorsione nell'identificazione e nella misurazione delle lesioni.
Qui presentiamo un modello murino di endometriosi che integra diverse caratteristiche dei modelli di endometriosi esistenti in un sistema nuovo, semplificato ed efficiente che si basa sulla quantificazione microscopica al posto della classificazione soggettiva.
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Protocol
NOTA: L'uso di animali in questo studio è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Cleveland Clinic Lerner Research Institute. Tutti gli standard di cura e utilizzo degli animali disponibili al pubblico sono stati eseguiti seguendo le linee guida del National Institutes of Health. Questa procedura utilizza tecniche asettiche. La capsula di Petri è sterile. Il PBS/soluzione salina utilizzato è sterile. Gli strumenti chirurgici per l'autopsia e la dissezione tissutale vengono sterilizzati in autoclave. Usiamo il 70% di EtOH sugli strumenti tra custodie di animali (se più di uno per sessione) per ridurre la contaminazione.
1. Preparazione dei topi donatori e riceventi (cfr. figura 1)
- Assicurarsi che sia in atto un'approvazione appropriata per lavorare con animali da laboratorio.
- Determinare il ceppo del mouse. In questi esperimenti, sono stati utilizzati topi wildtype e mutanti con un background C57BL / 6J, ma i ricercatori che utilizzano modelli simili riportano il successo con altri ceppi di topo come i topi BALB / c10. Inoltre, i topi donatori e/o riceventi possono utilizzare sistemi reporter, come topi GFP o RFP (vedere Figura 2 e Figura 3).
- Per la tempistica del trapianto di tessuto endometriale, assicurarsi che i topi donatori siano tra i 22-24 giorni al momento dell'iniezione di gonadotropina. Ciò garantisce che siano naïve dal punto di riproduzione, ad esempio, non ancora iniziato il ciclo estrale.
- Assicurarsi che i topi riceventi siano riproduttivamente intatti (nessuna ovariectomia precedente) tra i 2 ei 4 mesi di età. Sebbene non sia necessario, si raccomanda di posizionare periodicamente la lettiera imbevuta di urina da una gabbia per topi maschi nella gabbia del ricevente per facilitare il ciclo estrale in corso e di nuovo a 72 ore prima del trapianto di tessuto endometriale.
NOTA: Ciò non garantirà la sincronizzazione del ciclo estrale dei destinatari, poiché il posizionamento della lettiera imbevuta di urina dipende fortemente dalla quantità di lettiera maschile utilizzata e ha risultati variabili. Se si desidera la sincronizzazione del ciclo estrale, tre iniezioni sottocutanee consecutive di 100 ng/100 μL di estradiolo porteranno tutti gli animali alla fase estrale. Mentre non abbiamo trovato alcuna differenza nell'induzione della lesione basata sulla fase del ciclo estrale, altri gruppi hanno trovato la fase del ciclo importante10. - Iniettare per via sottocutanea Gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG, 2 UI diluita in 200 μL) in topi donatori per via sottocutanea utilizzando un ago sottile (25-27 Graccomandati). Non portare PMSG ai topi riceventi, in quanto innescherà l'ovulazione e il conseguente ambiente ad alto progesterone, che è meno ricettivo alla formazione di endometriosi.
NOTA: I modelli murini precedenti hanno utilizzato PMSG o estrogeni per stimolare la proliferazione endometriale nei topi donatori prima della raccolta endometriale23. PmSG è raccomandato per i seguenti motivi: l'emivita di PMSG è di 40 ore mentre l'emivita di 17-beta-estradiolo è di sole 2 ore. L'utilizzo di una singola iniezione sottocutanea di PMSG nei donatori 40 ore prima dell'approvvigionamento di tessuto endometriale fornisce una durata sostenuta dell'esposizione alla stimolazione della gonadotropina, che agisce per stimolare gli estrogeni endogeni. Molti preparati di estrogeni esogeni richiedono iniezioni multiple per innescare adeguatamente l'endometrio. - Dopo l'iniezione di PMSG, programmare l'autopsia, l'approvvigionamento e il trapianto nel ricevente tra 38-42 ore. Tempo il prelievo del tessuto endometriale dopo l'iniezione di gonadotropina per garantire la raccolta del tessuto prima dell'ovulazione, che si verifica a 42 ore dopo l'iniezione. L'ovulazione produce un ambiente ad alto progesterone (P4), che ridurrebbe l'instaurazione della lesione.
2. Approvvigionamento di tessuto endometriale di topo donatore
- Dopo l'eutanasia del topo donatore (utilizzando la camera CO2 seguita da lussazione cervicale), spruzzare l'addome con una soluzione di etanolo al 70%; questo serve a ridurre la contaminazione del tessuto procurato dalla flora cutanea e dai peli spostati. Con le forbici sezionanti, fai un cecchino trasversale poco profondo sulla linea mediana attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo. Quindi afferrando ogni lato dell'incisione cutanea, utilizzare la trazione smussata per aprire l'addome.
- Identificare l'utero. Prima di rimuovere l'utero, tagliare via il tessuto connettivo adiacente. Transect ogni corno uterino appena sotto la rispettiva tuba di Falloppio e poi transect la cervice per rimuovere l'intero utero in blocco.
- Dopo la rimozione dalla cavità addominale, ispezionare attentamente l'utero e rimuovere qualsiasi grasso periferico aggiuntivo o tessuto connettivo. Metti l'utero in una goccia di PBS fredda su una capsula di Petri. Determinare e documentare la massa combinata dell'intero utero.
- Transect ogni corno dal fondo dell'utero, rendendo la trasezione il più vicino possibile al fondo in modo da massimizzare la lunghezza di ogni corno. Usando l'aiuto di un microscopio di dissezione, posizionare una lama delle forbici di dissezione all'interno del lume del primo corno, quindi tagliare lungo l'asse maggiore del tubo. Aprire con attenzione il tubo, tenendo presente da quale parte è la sierosa e da quale parte è l'epitelio.
- Mettere 500 cc di soluzione salina o PBS su una nuova capsula di Petri; il liquido rimarrà insieme a causa della tensione superficiale.
- Quindi, eseguire la frammentazione dell'utero in modo uniforme. È meglio avere meno lesioni più grandi di molte lesioni più piccole. Inizia separando l'epitelio dal miometrio afferrando lo strato endometriale e staccandolo.
- In alternativa, è sufficiente frammentare il tessuto senza separare il miometrio (purché il lato epiteliale sia completamente esposto), ma mantenere il miometrio riduce la rilevanza fisiologica di questo modello per la malattia umana. Assicurarsi che i frammenti siano il più grandi possibile ma abbastanza piccoli da passare attraverso un ago da 18 G; (si consiglia 1 mm x 1 mm).
- Raccogliere 10-12 di questi frammenti di 1 mm x 1 mm dal primo corno (che corrisponde approssimativamente a 40 mg di tessuto nei topi C57BL / 6J). Inserire i frammenti raccolti nella raccolta di liquidi.
- Eseguire gli stessi passaggi per l'altro corno uterino per un totale di circa 24 frammenti per topo. Documentare il numero totale di frammenti.
3. Iniezione peritoneale di frammenti di tessuto nel topo ricevente
- Aspirare i frammenti sospesi di 1 mm x 1 mm utilizzando l'estremità smussata di una siringa da 1 cc; il volume totale dovrebbe essere di 1 ml.
- Attaccare un ago da 18 G alla siringa completa e caricare il fluido nell'ago. Prendere in considerazione una finta iniezione nella capsula di Petri per assicurarsi che tutto il tessuto passi attraverso l'ago.
- Prendi il mouse del destinatario. Prima o dopo l'iniezione IP, ottenere uno striscio vaginale del topo ricevente per la documentazione del ciclo estrale (10 μL di soluzione salina utilizzando la siringa a bulbo sull'orifizio vaginale e placcato sul vetrino con il coperchio).
- Eseguire l'iniezione intraperitoneale dei frammenti con la siringa con un angolo di 45 gradi, facendo attenzione a non iniettare per via sottocutanea.
- Se i frammenti rimangono dopo l'iniezione, prelevare altri 200 μL del fluido nella siringa per iniezione per garantire che tutti i frammenti siano iniettati con successo per via intraperitoneale.
- Una volta assicurato di non avere sanguinamento o complicazioni, rimette i topi riceventi nelle loro gabbie e alimenta una dieta normale.
4. Raccolta delle lesioni endometriotiche
- Eutanasia dei topi riceventi a circa 21 giorni dopo l'iniezione di frammenti post-trapianto.
NOTA: Dall'esperienza e dalla discussione con i collaboratori che utilizzano modelli simili, la dimensione e il numero massimo della lesione si verificano a circa 3 settimane dopo il trapianto; dopo 3 settimane, le lesioni iniziano a regredire di dimensioni. Viene utilizzato il metodo di eutanasia approvato dalla IACUC. - Dopo l'eutanasia e la lussazione cervicale, spruzzare l'addome dell'animale con il 70% di etanolo e tendare la pelle a tagliare superficialmente con le forbici sezionanti. Incidere la pelle e lo spazio sottocutaneo con le forbici per aprire senza mezzi termini l'addome.
- Prima di intraprendere qualsiasi ulteriore dissezione, viene eseguita un'indagine completa per le lesioni grossolane, con dimensioni misurate dalle pinze e documentate sulla loro regione anatomica (vedi sotto).
- Eseguire una raccolta completa di tre distinte regioni anatomiche in blocco (indipendentemente dal fatto che le lesioni possano essere apprezzate grossolanamente). Se le lesioni sono osservate in altre regioni (ad esempio, intestino), queste dovrebbero essere ignorate e non raccolte a meno che la lesione non attraversi una delle tre aree sottostanti.
- A = parete addominale/peritoneo (può essere appiattito in una cassetta o arrotolato, purché coerente tra i campioni).
- B = pancreas e grasso mesenterico.
- C = tessuto connettivo parauterino e grasso (tessuto bianco scintillante che circonda l'utero ma non coinvolge organi diversi dalla vescica; fare attenzione a non confondere la vescica per una lesione).
- Posizionare ogni area sezionata in una cassetta, opportunamente etichettata, e inserirla in formalina e processo come da protocollo di laboratorio per il sezionamento istologico.
- Blocchi di formalina di sezione in due vetrini (D1 e D2) per area tissutale a due profondità uniformi.
5. Punteggio delle lesioni endometriotiche
- Scansione (con ingrandimento 40x) e archiviazione delle diapositive.
- Utilizzare un software di lettura digitale delle diapositive, definire la distanza più lunga (X) tra i bordi di una lesione endometriotica, indipendentemente dal fatto che il bordo sia costituito da ghiandole o stroma, e contrassegnarla. Una lesione continua è definita da ghiandole circondate da stroma; la linea non attraversa necessariamente solo il tessuto endometriotico (come nel caso della determinazione dei punti finali su un fuoco di forma irregolare o ondulata dell'endometriosi) ma i due punti finali devono essere collegati da stroma e/o ghiandole continue (vedi Figura 4).
- Crea una seconda linea (Y) di 90 gradi attraverso la prima riga, con la lunghezza della seconda linea determinata seguendo le regole sopra riportate.
- Se si incontrano più lesioni non contigue, dare a ciascuna le proprie misurazioni X e Y.
- Calcola il punteggio finale per ogni diapositiva come somma delle aree (X * Y) di ciascuna lesione.
- Prendi il più grande dei punteggi delle due diapositive (D1 vs D2) come punteggio finale per quella regione (A, B, C).
- Sommare i punteggi di ogni regione per dare il punteggio microscopico finale per quell'animale.
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Representative Results
Per un esperimento iniziale di prova del concetto, l'endometrio donatore di topi RFP è stato iniettato in topi riceventi wildtype. La colorazione H&E ha rivelato la conferma istopatologica dell'architettura classica della lesione dell'endometriosi (Figura 3A). La microscopia fluorescente ha confermato che la lesione osservata in questione proveniva dal donatore (Figura 3B).
Il secondo esperimento è stato eseguito utilizzando 10 donatori wildtype C57BL/6J e 10 riceventi. Altri 5 riceventi hanno ricevuto un trattamento fittizio (iniettato con PBS e non frammenti endometriali) e hanno assegnato un numero di identificazione casuale; i revisori sono stati accecati prima dell'autopsia e della revisione istopatologica.
Tutti i riceventi hanno ricevuto tessuto endometriale donatore entro 42 ore dal trattamento con donatore PSMG. Non c'era correlazione tra questo intervallo di tempo e il peso uterino finale o le dimensioni della lesione. Al momento dell'approvvigionamento del donatore, il peso uterino totale medio era di 54 ± 9,5 mg. Il numero medio di frammenti è stato di 22,4 ± 5,2, con un conseguente peso medio del frammento di 2,5 ± 0,5 mg. L'intervento chirurgico all'endpoint si è verificato al giorno 20 o al giorno 22 per tutti i destinatari.
Con un numero medio di lesioni di 1,5 e un diametro totale lordo medio della lesione di 3,7 mm, questi punti finali sono simili ad altri studi che utilizzano modelli murini con un peso simile di frammenti endometriali iniettati (Figura 2)10. La prevalenza delle lesioni per tutti i topi era dell'80%. I topi senza lesioni avevano un frazionamento endometriale significativamente maggiore rispetto ai topi con lesioni (30,5 frammenti totali contro 20,3, rispettivamente; i frammenti totali medi per tutti i topi erano 22,4) con conseguente dimensione del frammento inferiore alla media al momento dell'iniezione (1,9 mg vs 2,6 mg). Come previsto, i controlli fittizi (iniettati con frammenti salini e non endometriali) non avevano alcuna malattia grossolana o microscopica. In uno studio successivo che ha utilizzato un numero espanso di topi, la fase estrale del topo ricevente non è stata associata al numero di lesioni o al punteggio microscopico della malattia.
Il numero lordo di lesioni sembra essere un marcatore surrogato povero per il carico totale della lesione, poiché vi era discordanza tra la malattia macroscopica e microscopica presente nei tessuti. Nel 60% (n = 6) dei casi, c'era accordo tra il punteggio macroscopico e microscopico (accordo definito come mostrare presenza o assenza e differenza nella dimensione totale era entro 3 mm). Tuttavia, nel 40% (n = 4) dei casi, c'era disaccordo, con il 10% (n = 1) del tempo in cui la malattia macroscopica era assente ma la malattia microscopica era presente dall'istologia, il 10% (n = 1) la malattia macroscopica è stata osservata nonostante nessuna assenza di endometriosi sull'istologia di conferma (Figura 5) e il restante 20% (n = 2) c'era accordo in presenza ma non nell'entità della dimensione della lesione. Pertanto, l'esame macroscopico per le lesioni da solo non è sufficiente per la quantificazione del carico di malattia da endometriosi.
Figura 1: Panoramica del modello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Regioni esaminate per la quantificazione delle lesioni. Mentre l'intestino e altre posizioni intraperitoneali possono ospitare lesioni, è più difficile distinguerli grossolanamente e un'indagine esaustiva dell'addome sarebbe più dispendiosa in termini di tempo con rendimenti decrescenti. Pertanto, un approccio coerente e sistematico di raccolta del tessuto completo (indipendentemente dalla presente malattia grave) viene eseguito nelle tre regioni più comuni di formazione dell'endometriosi: la parete addominale / peritoneo (A), il pancreas e il grasso mesenterico (B) e il grasso parauterino (C). Etichettate sono immagini rappresentative di reperti microscopici di lesioni da ciascuna delle tre regioni. Ingrandimento 40x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Induzione dell'endometriosi utilizzando topi donatori endometrio che esprimono proteine fluorescenti rosse. (A) Sezione H&E della lesione. (B) Microscopia fluorescente con colorazione DAPI. Ingrandimento 40x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative del software utilizzato per misurare le dimensioni delle dimensioni della lesione e quantificare il carico della lesione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Campioni rappresentativi di "lesioni" grossolane che non sono endometriosi mediante esame istopatologico. Ingrandimento 40x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il nostro studio dimostra che l'endometriosi può essere indotta in modo affidabile nei topi senza richiedere l'uso di ovariectomia e / o chirurgia di sopravvivenza e che le lesioni endometriali ectopiche possono essere identificate e quantificate utilizzando un'indagine standardizzata dell'addome e un'analisi istologica.
Molti studi murini di endometriosi utilizzano l'endometriosi indotta chirurgicamente in cui l'endometrio del donatore viene suturato in posizione all'intestino, alla parete addominale o ad altre posizioni intraperitoneali12,20. Ciò ha il vantaggio di standardizzare le dimensioni e la posizione del tessuto trapiantato. Tuttavia, oltre alle ulteriori sfide logistiche della chirurgia di sopravvivenza, questo può introdurre variabili confondenti dall'intervento stesso, dato che l'endometriosi è una malattia infiammatoria e che in un contesto clinico, l'endometriosi si sviluppa tipicamente prima di qualsiasi procedura chirurgica. L'iniezione intraperitoneale, d'altra parte, modella più accuratamente le mestruazioni retrograde che si pensa causino la maggior parte delle lesioni dell'endometriosi.
L'ovariectomia viene spesso eseguita in modelli di roditori per ridurre la variabilità introdotta dal ciclo estrale; e poiché l'endometriosi è una malattia ormono-dipendente, in questi casi vengono somministrate dosi soprafisiologiche di estradiolo. Questa pratica limita probabilmente l'applicabilità di un modello murino alla malattia umana. Il nostro studio dimostra che l'ovariectomia non è necessaria per creare in modo affidabile lesioni da endometriosi e che la fase del ciclo estrale non influisce sulla capacità di stabilire lesioni.
Una carenza di altri modelli di iniezione intraperitoneale è la dipendenza da misure soggettive delle dimensioni o del carico della lesione. Mentre l'uso di pinze o altri strumenti può fornire misure oggettive, queste misurazioni sono registrate al momento della raccolta della lesione e quindi non possono essere verificate in seguito e possono essere soggette a variabilità intra-osservatore. Nel nostro modello, la quantificazione istologica può essere eseguita e verificata molto tempo dopo l'autopsia, il che significa che coloro che eseguono l'autopsia non hanno bisogno di avere esperienza nell'identificazione delle lesioni grossolane e sono più facilmente accecati per quanto riguarda l'intervento ricevuto. Inoltre, come illustra il nostro lavoro, una parte della malattia può essere persa quando si fa affidamento solo sulla malattia grave; inoltre, molte lesioni sospette possono effettivamente essere fisiologiche (ad esempio, tessuto linfoide) o fibrosi. Infine, l'assunzione di sezioni standardizzate di intere regioni anatomiche in ciascun topo riduce ulteriormente la variabilità. Questo approccio di procurare la stessa quantità di tessuto per topo impedisce l'inevitabile sottovalutazione che si verificherebbe con piccoli campioni e il sovra-punteggio di campioni di grandi dimensioni, soprattutto perché può essere presente una malattia microscopica.
In definitiva, questi perfezionamenti servono sia a standardizzare che a semplificare l'approccio, risultando in un modello murino in grado di studiare l'endometriosi in modo ad alta produttività. Questo modello è un metodo saggiabile per lo screening di percorsi e bersagli farmacologici e il nostro laboratorio sta attualmente utilizzando questo modello per uno studio di convalida del farmaco. Questo modello è particolarmente utile quando si tenta di determinare l'importanza relativa dell'espressione genica aberrante (o del trattamento farmacologico) nell'endometrio del donatore rispetto all'ambiente peritoneale ricevente. Può anche essere utilizzato con topi reporter (come abbiamo mostrato) e topi immunocompromessi e knockout.
In sintesi, forniamo diverse importanti innovazioni che forniscono un modello murino con elevata affidabilità, riproducibilità e obiettività nello studio dell'endometriosi. Il nostro approccio fa progredire il campo non solo fornendo un processo semplice e semplificato per l'induzione della lesione, ma anche un modo standardizzato di misurare e riportare i dati.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Reizes per la loro revisione critica e le intuizioni durante la preparazione del manoscritto, così come i nuclei di imaging e istologia del Lerner Research Institute per la loro assistenza nella raccolta e nell'analisi dei dati. Questo lavoro è stato sostenuto attraverso un finanziamento interno attraverso il Comitato del programma di ricerca presso la Cleveland Clinic e da una sovvenzione esterna attraverso la Society for Reproductive Investigation e Bayer. La ricerca nel Laboratorio Reizes è finanziata anche attraverso VeloSano Bike to Cure, Centro di eccellenza della ricerca nel cancro ginecologico, e attraverso la Laura J. Fogarty Endowed Chair for Uterine Cancer Research. La Cleveland Clinic possiede l'autorizzazione di copyright per la Figura 1 e la Figura 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
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