Summary
우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자로 전기 천공함으로써 1 차 인간 색소 상피 세포를 형질 감염시키는 프로토콜을 개발했습니다. 성공적인 형질감염은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 면역블로팅 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 입증되었다.
Abstract
점점 더 고령화되는 사회는 신경 퇴행성 질환의 발병률을 증가시킵니다. 지금까지 병리학 적 메커니즘이 부적절하게 이해되어 정의 된 치료법의 확립을 방해합니다. 보호 인자의 발현 증가를 위한 세포 기반 부가 유전자 요법은 연령 관련 황반변성(AMD)과 같은 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 유망한 옵션으로 간주됩니다. 우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 신경계에서 신경 보호 및 항 혈관 신생 단백질로 특징 지어지는 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자를 1 차 인간 색소 상피 (PE) 세포의 게놈에 안정적으로 발현시키는 방법을 개발했습니다. 일차 PE 세포를 인간 공여자의 눈으로부터 분리하고 배양물에서 유지하였다. 합류점에 도달한 후, 1 x 104 세포를 11 μL의 재현탁 완충액에 현탁시키고, 30 ng의 과민성 SB (SB100X) 트랜스포자제 플라스미드 및 470 ng의 PEDF 트랜스포존 플라스미드를 함유하는 2 μL의 정제된 용액과 합하였다. 유전자 변형은 다음 매개 변수를 사용하여 모세관 전기 천공 시스템으로 수행되었습니다 : 전압 1,100V 및 너비 20ms의 펄스 2 개. 형질감염된 세포를 소 태아 혈청이 보충된 배지를 함유하는 배양 플레이트로 옮겼고; 항생제와 항진균제가 첫 번째 배지 교환과 함께 추가되었습니다. 성공적인 형질감염은 독립적으로 수행된 실험에서 입증되었다. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR)은 PEDF 전이유전자의 발현 증가를 보여주었다. PEDF 분비는 면역블로팅에 의해 평가되고, 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 정량화된 바와 같이, 유의하게 상승하였고, 안정하게 유지되었다. SB100X 매개 전달은 PE 세포의 게놈에 안정적인 PEDF 유전자 통합을 허용하고 AMD 또는 기타 망막 퇴행성 질환을 치료하기 위한 세포 기반 유전자 추가 요법의 개발에 중요한 PEDF 의 지속적인 분비를 보장했습니다. 더욱이, 인간 PE 세포로의 PEDF 트랜스포존의 통합 프로파일의 분석은 거의 임의의 게놈 분포를 나타내었다.
Introduction
고령은 신경 퇴행성 질환의 주요 위험으로 설명됩니다. 60세 이상의 환자에서 심각한 시력 상실을 유발하는 다유전자 질환인 연령 관련 황반변성(AMD)은 실명 및 시력 손상의 가장 흔한 4가지 원인1에속하며 2040년에는 2억 8,800만 명으로 증가할 것으로예상됩니다2. 맥락 모세 혈관과 망막 광 수용체 사이에 위치한 단단히 채워진 세포의 단일 층 인 망막 색소 상피 (RPE)의 기능 장애는 AMD의 발병 기전에 기여합니다. RPE는 정상적인 망막 기능3 에 필수적인 여러 작업을 수행하고 망막과 융모막의 구조적 무결성을 유지하는 데 필수적인 다양한 성장 인자와 인자를 분비하여 광수용체 생존을 지원하고 순환 및 영양소 공급을 위한 기반을 제공합니다.
건강한 눈에서 색소 상피 유래 인자(PEDF)는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 효과 균형을 유지하고 세포자멸사로부터 뉴런을 보호하고 내피 세포 증식을 방지하며 모세혈관 내피를 안정화시킵니다. 이동 된 VEGF- 대 -PEDF 비율은 동물 모델 4,5뿐만 아니라 AMD 및 증식 성 당뇨병 성 망막증 6,7,8,9,10으로 인한 맥락막 신생 혈관 (CNV) 환자의 샘플에서 관찰 된 안구 신생 혈관과 관련이 있습니다. . 강화된 VEGF 농도는 현재 표준 처리의 표적이다. 항 -VEGF 의약품 인 베바시주맙, 라니비주맙, 아플리버셉트 및 가장 최근에는 브롤루시주맙이 CNV 환자의 약 1/3에서 시력을 개선하거나 90 %의 사례에서 시력을 안정화시킵니다11,12,13. 그러나, 빈번한, 종종 한 달에 한 번씩, 유리체내 주사는 부작용의 위험을 수반하고14, 환자 순응도를 손상시키며, 의료 시스템(15)에 상당한 경제적 부담을 나타낸다. 또한, 특정 비율의 환자 (2 % -20 %)는 항 -VEGF 요법16,17,18,19에 반응하지 않거나 잘 반응하지 않습니다. 이러한 부정적인 수반 물은 대체 치료법, 예를 들어 안내 임플란트, 세포 및 / 또는 유전자 치료 접근법의 개발을 필요로합니다.
유전자 치료는 유전성 및 비 유전성 질환에 대한 유망한 치료법으로 발전했으며 비 기능적 유전자 서열을 복원하거나 오작동하는 유전자 서열을 억제하려고합니다. 원인 인자의 식별 및 대체가 거의 불가능한 다 유전자 질병의 경우, 전략은 보호 인자의 지속적인 전달을 목표로합니다. AMD의 경우, 엔도스타틴 및 안지오스타틴 20의 안정한 발현, VEGF 길항제 가용성 fms-유사 티로신 키나제-1(sFLT-1)21,22, 분화의 보체 조절 단백질 클러스터 59(CD59)23 또는 PEDF 24,25와 같은 다양한 부가 요법이 개발되었습니다. . 눈, 특히 망막은 밀폐 된 구조, 우수한 접근성, 작은 크기 및 면역 특권으로 인해 유전자 기반 약물의 탁월한 표적이며, 따라서 낮은 치료 용량의 국소 전달을 허용하고 이식이 거부 반응에 덜 취약합니다. 또한 눈은 비침습적 모니터링을 가능하게 하며 다양한 이미징 기술로 망막을 검사할 수 있습니다.
바이러스 벡터는, 그의 높은 형질도입 효율 때문에, 치료 유전자를 표적 세포 내로 전달하는 주요 비히클이다. 그러나, 사용된 바이러스 벡터에 따라, 면역 및 염증 반응26, 돌연변이 유발 및 발암 효과27,28, 또는 다른 조직에서의 전파29와 같은 상이한 유해 반응이 설명되었다. 실질적인 제한에는 제한된 포장 크기(30)뿐만 아니라 임상 등급 로트(31,32)의 생산과 관련된 어려움 및 비용이 포함됩니다. 이러한 단점은 리포/폴리플렉스, 초음파 또는 전기천공을 통해 전달되는 비바이러스, 플라스미드 기반 벡터의 추가 개발을 촉진했습니다. 그러나, 숙주 게놈으로의 전이유전자의 게놈 통합은 일반적으로 플라스미드 벡터로 촉진되지 않으며, 따라서 일시적인 발현을 초래한다.
트랜스포존은 유전자 치료에 채택 된 특성 인 게놈 내에서 위치를 변경하는 자연 발생 DNA 단편입니다. 능동적 통합 메커니즘으로 인해, 트랜스포존-기반 벡터 시스템은 삽입된 전이유전자의 연속적이고 일정한 발현을 허용한다. 물고기33에서 발견되는 고대 Tc1/마리너형 트랜스포존으로부터 재구성되고 분자 진화에 의해 더욱 개선되어 과민성 변이체 SB100X34를 초래한 잠자는 숲속의 미녀(SB) 트랜스포존은 다양한 일차 세포에서 효율적인 전이를 가능하게 하고 다양한 질병 모델(35)에서 표현형 교정에 사용되었습니다. 현재 SB 트랜스포존 시스템을 사용하여 13 건의 임상 시험이 시작되었습니다. SB100X 트랜스포존 시스템은 말단 반전 반복(TYR)에 의해 측면에 있는 관심 유전자로 구성된 트랜스포존과 트랜스포존을 동원하는 트랜스포아제의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. 세포로의 플라스미드 DNA 전달 후, 트랜스포아제는 TIR에 결합하고 트랜스포존의 절제 및 세포 게놈으로의 통합을 촉매합니다.
우리는 신생 혈관 AMD 치료를위한 비 바이러스 세포 기반 첨가제 요법을 개발했습니다. 상기 접근법은 SB100X 트랜스포존 시스템36,37,38에 의해 PEDF 유전자를 일차 색소 상피(PE) 세포 내로의 전기천공 기반 삽입을 포함한다. 트랜스포아제와 PEDF의 유전 정보는 별도의 플라스미드에 제공되므로 이상적인 SB100X 대 PEDF 트랜스포존 비율을 조정할 수 있습니다. 전기천공은 표면적을 최소화하면서 전극 사이의 최대화된 갭 크기를 특징으로 하는 피펫 기반 모세관 형질주입 시스템을 사용하여 수행됩니다. 상기 장치는 광범위한 포유동물 세포 39,40,41에서 우수한 형질감염 속도를 달성하는 것으로 나타났다. 작은 전극 표면적은 균일한 전기장을 제공하고 전기분해(42)의 다양한 부작용을 감소시킨다.
형질감염된 색소 상피 세포에 의해 분비되는 PEDF의 항혈관신생 기능성은 인간 제대 정맥 내피 세포(43)의 발아, 이동 및 세포자멸사를 분석하는 다양한 시험관내 실험에서 나타내었다. 또한, 각막 신생혈관의 토끼 모델44 및 CNV43,45,46의 래트 모델에서 PEDF-형질감염된 세포를 이식한 결과 신생혈관의 감소가 나타났다.
여기에서는 모세관 형질주입 시스템을 사용하는 SB100X 트랜스포존 시스템을 통해 PEDF 유전자를 일차 인간 RPE 세포에 안정적으로 삽입하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 형질감염된 세포를 21일 동안 배양한 후, 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR)에 의한 PEDF 유전자 발현 및 면역블로팅 및 효소결합면역흡착 분석법에 의한 PEDF 단백질 분비의 관점에서 분석하였다(ELISA, 도 1).
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Protocol
인간 기증자의 눈은 헬싱키 의정서 선언에 따라 정보에 입각 한 동의를 얻은 후 안과학과의 아헨 각막 은행 (RWTH Aachen 대학 병원)에서 획득했습니다. 인체 시료 수집 및 사용 절차는 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 1차 인간 RPE 세포의 분리
- 멸균 보호 복과 장갑을 배치하십시오. 층류 아래에 멸균 드레이프를 놓습니다.
- 멸균 준비 도구 및 기타 필요한 멸균 장비를 층류 아래에 놓습니다.
- 눈 지구본의 수령, 준비 시작 및 가능한 이상을 기록하십시오. 기증자의 나이, 성별, 사망 원인 및 사망 시점과 눈 제거 사이의 기간을 등록하십시오.
- 아이 글로브를 멸균 거즈 압축에 넣고 한 손으로 잡습니다.
- 메스와 여분의 미세한 뾰족한 눈 가위를 사용하여 윤부 뒤쪽으로 약 3.5mm 떨어진 원주 절단으로 앞쪽 세그먼트와 뒤쪽 세그먼트를 분리합니다.
- 후방 세그먼트를 아래쪽으로 기울인 후 대장균 겸자를 사용하여 유리체와 망막을 조심스럽게 제거하십시오.
- 직선 홍채 집게를 사용하여 붕괴된 RPE/choroidea 복합체를 조심스럽게 재배열한 다음 곡선형 홍채 집게로 제자리에 고정합니다.
- 10% 태아 소 혈청(FBS), 80U/mL 페니실린 및 80μg/mL 스트렙토마이신(Pen/Strep) 및 2.5μg/mL 암포테리신 B(AmphoB)가 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지/Ham의 F-12 영양소 혼합물(DMEM/F12) 1mL로 후면 아이컵을 채웁니다.
참고: 돼지 또는 소 눈에서 1차 RPE 세포를 분리하는 것과는 달리36,37, 후방 안안컵은 트립신으로 채우고 배양할 필요가 없습니다. - 불 광택이 나는 곡선 유리 파스퇴르 피펫으로 시신경에서 윤부쪽으로 망막 색소 상피를 부드럽게 닦고 대장균 집게를 사용하여 윤부에 RPE / 융모막 복합체를 고정하여 RPE 세포를 수확합니다. 세포 현탁액을 페트리 접시에 옮깁니다.
- 1.8 단계와 1.9 단계를 반복하고 페트리 접시의 모든 세포를 수집합니다. 단일 채널 피펫(100-1,000 μL)을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 세포 현탁액을 조심스럽게 재현탁합니다.
- 각 아이 글로브의 RPE 세포 현탁액을 24웰 세포 배양 플레이트의 3개 웰에 시드하고 FBS, Pen/Strep 및 AmphoB가 보충된 DMEM/F12로 최대 1mL를 채웁니다.
- RPE 세포 배양물을 합류점에 도달할 때까지 95% 공기 및 5%CO2 의 가습된 분위기에서 37°C로 유지한다. 세포 배양 배지를 일주일에 두 번 교체하십시오.
2. 일차 인간 RPE 세포의 전기 천공
- SB100X 트랜스포자제/PEDF 트랜스포존 플라스미드 혼합물의 제조
- 제조업체의 프로토콜에 따라 형질주입과 같은 응용 분야에 사용하기에 적합한 것으로 확인된 일반적인 플라스미드 정제 키트를 사용하여 SB100X 트랜스포아제 및 PEDF 트랜스포존 플라스미드 DNA를 정제합니다.
- 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 플라스미드 DNA 함량을 정량화하고 10mM Tris-HCl(pH 8.5)로 250ng/μL 농도로 조정합니다.
- 250ng/μL SB100X 트랜스포아제 플라스미드 DNA(예: 2.5μL)의 한 부분을 250ng/μL PEDF 트랜스포존 플라스미드 DNA(예: 40μL)의 16개 부분과 혼합합니다. 잔류 플라스미드 혼합물은 -20°C에서 저장될 수 있다.
참고: 플라스미드 혼합물의 여러 반복적인 동결 및 해동 주기는 피해야 합니다. - 29.4ng의 SB100X 트랜스포아제 플라스미드와 470.6ng의 PEDF 트랜스포존 플라스미드를 포함하는 SB100X 트랜스포자제/PEDF 트랜스포존 플라스미드 혼합물 2μL를 멸균 1.5mL 안전 잠금 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 세포와 섞일 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
- 모세관 형질주입 시스템의 설정
참고: 1차 인간 RPE 세포의 전기천공은 제조업체의 프로토콜에 따라 10μL 키트를 사용하는 모세관 형질주입 시스템을 통해 수행되었습니다. 상기 시스템은 형질주입 장치, 형질주입 피펫, 및 역형 피펫을 포함한다. 키트에는 10μL 형질주입 팁, 버퍼 튜브, 전해 버퍼 E(버퍼 E) 및 재현탁 버퍼 R(버퍼 R)이 포함되어 있습니다.- 파이펫 스테이션을 형질주입 장치에 연결합니다.
- 버퍼 튜브에 3mL의 버퍼 E를 채우고 딸깍 소리가 들릴 때까지 피펫 스테이션에 삽입합니다.
알림: 버퍼 튜브의 측면 전극이 파이펫 스테이션의 측면 볼 플런저에 연결되어 있는지 확인하십시오. - 일차 인간 RPE 세포의 전기천공을 위해, 형질주입 장치에서 다음 펄스 조건을 설정하십시오: 1,100V(펄스 전압), 20ms(펄스 폭), 2개의 펄스(펄스 번호).
- 배양된 1차 인간 RPE 세포의 제조
- 위상차 현미경을 통해 1차 RPE 세포 배양의 모양과 형태를 문서화합니다. 저배율 현미경 사진을 통해 RPE 세포가 합류하고 통합된 단층으로 성장하는 것을 입증하고 고배율 현미경 사진을 찍어 RPE 세포의 전형적인 조약돌 형태를 지적합니다.
- 세포 배양 배지를 흡인하고 1 mL 완충 인산염 식염수(PBS, pH 7.4)로 세포를 2회 세척한다.
- 7-15 분 동안 95 % 공기 및 5 % CO2 의 가습 된 분위기에서 37 ° C에서 0.5mL 0.05 % 트립신 -EDTA로 1 차 인간 RPE 세포를 트립신 화합니다. 세포 분리를 현미경으로 확인하십시오.
- FBS가 보충된 1mL의 DMEM/F12로 트립신 처리를 중단합니다. 혈구계를 사용하여 세포 계수를 위해 20μL 분취량을 취합니다. RPE 셀 현탁액을 106 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 20 μL 분취량을 20 μL 트리판 블루 용액과 혼합합니다. 혈구계의 각 절반에 10 μL를 피펫팅하고 위상차 현미경으로 세포를 계수한다.
- 원심분리 후 RPE 세포 펠릿을 1mL의 PBS에 재현탁합니다.
- 형질주입 반응당 10,000-100,000 RPE 세포를 취하여 106 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
참고: 전기장 적용 및 플라스미드 DNA 첨가를 통한 형질감염 반응 외에도, 각 접근법에는 두 가지 상이한 대조군 배양이 포함됩니다: (1) 전기장 적용 없음 및 플라스미드 DNA 없음; (2) 전기장 적용이 있지만 플라스미드 DNA는 없습니다. - 세포 펠릿을 11μL의 완충액 R에 재현탁하고 2μL의 SB100X 트랜스포자제/PEDF 트랜스포존 플라스미드 혼합물과 결합합니다(단계 2.1.4 참조).
참고: 완충액 R에 재현탁시킨 후, 세포 생존율 및 형질주입 효율의 감소를 피하기 위해 세포를 15분 이내에 처리해야 합니다. - 클램프가 피스톤의 장착 스템을 완전히 집어들 때까지 트랜스펙션 피펫의 헤드를 10μL 트랜스펙션 팁에 삽입합니다. 세포/플라스미드 용액을 형질주입 팁으로 끌어올립니다.
알림: 기포의 생성과 형질주입 팁으로의 흡인을 피하십시오. - FBS가 보충되지만 Pen/Strep 및 AmphoB가 없는 DMEM/F12 1mL를 24웰 세포 배양 플레이트의 필요한 웰 수에 제공합니다.
- 전기 천공 공정
- 딸깍 소리가 들릴 때까지 형질주입 피펫을 피펫 스테이션에 놓인 버퍼 튜브에 삽입합니다(2.2.2단계 참조).
알림: 트랜스펙션 피펫의 금속 헤드가 파이펫 스테이션 내부의 볼 플런저와 버퍼 튜브에 연결되어 있는지 확인하십시오. - 형질주입 장치의 터치스크린에서 시작을 누릅니다. 전기 펄스를 적용하기 전에 장치는 버퍼 튜브와 트랜스펙션 피펫이 제대로 삽입되었는지 자동으로 확인합니다. 전기 펄스가 전달되면 터치스크린에 완료 가 표시됩니다.
- 피펫 스테이션에서 형질주입 피펫을 조심스럽게 제거하고 세포/플라스미드 용액을 세포 배양 플레이트의 준비된 웰에 피펫팅하여 10μL 형질주입 팁에서 전기천공된 세포를 즉시 해제합니다(단계 2.3.10 참조).
- 형질감염된 RPE 세포 배양물을 95% 공기 및 5%CO2의 가습된 분위기에서 37°C로 유지한다. Pen / Strep 및 AmphoB를 전기 천공 3 일 후 첫 번째 배지 교환과 함께 추가하십시오.
- 딸깍 소리가 들릴 때까지 형질주입 피펫을 피펫 스테이션에 놓인 버퍼 튜브에 삽입합니다(2.2.2단계 참조).
3. 형질감염된 1차 인간 RPE 세포 분석
- 샘플 준비
- 3주의 배양 시간 후, 궁극적으로 RPE 세포 배양물을 정의된 1.0mL DMEM/F12의 정의된 부피로 FBS, Pen/Strep 및 AmphoB가 보충된 24시간의 정의된 시간 동안 배양합니다.
- 세포 배양 상청액을 취하여 추가로 가까운 시간 처리가 될 때까지 -20°C에서 저장하거나 열적으로 불안정한 샘플 및 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관합니다.
- 형질감염된 RPE 세포 배양물을 95% 공기 및 5%CO2 의 가습 분위기에서 37°C에서 0.05% 트립신-EDTA 0.5mL로 10분 동안 트립신화합니다.
- FBS가 보충된 1mL의 DMEM/F12로 트립신 처리를 중단합니다. 혈구계를 사용하여 세포 계수를 위해 작은 부분 표본을 취하십시오 (2.3.5 단계 참조). RPE 세포 현탁액을 106 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 추가 처리가 있을 때까지 RPE 셀 펠릿을 -80°C에서 보관하십시오.
- 웨스턴 블롯팅에 의한 PEDF 분비 평가
참고: 정성적 평가를 위해, 세포 배양 상청액(단계 3.1.2 참조)은 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 후속 웨스턴 블롯팅을 통해 분석됩니다. 에 따라 PEDF 트랜스포존 플라스미드 DNA가 사용되면, 상청액은 다르게 처리되어야 한다.- 세포 배양 상청액으로부터 His-tagged PEDF 융합 단백질의 정제
- 베벨 컷 팁을 사용하여 시료당 30μL 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 슬러리를 취하고 원심분리(30초 동안 2,660 x g )로 Ni-NTA 수지를 펠릿화합니다.
- Ni-NTA 수지를 200μL의 1x 인큐베이션 완충액(50mM NaH2PO4,300mM NaCl, 10mM 이미다졸, pH 8.0)으로 조심스럽게 재현탁시키고 원심분리(30초 동안 2,660 x g)로 펠렛화합니다.
- 이전 단계를 반복합니다.
- Ni-NTA 수지를 샘플 당 40 μL 4x 인큐베이션 완충액 (200 mMNaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)으로 조심스럽게 재현탁시킨다.
- 900μL의 세포 배양 상청액을 260μL의 4x 배양 완충액 및 55μL의 전처리된 Ni-NTA 슬러리와 혼합합니다(단계 3.2.1.4 참조).
- 혼합물을 실온에서 60분 동안 로킹 셰이커에서 배양합니다.
- Ni-NTA 수지를 원심분리(60초 동안 2660 x g )로 펠렛화한다.
- Ni-NTA 수지를 175μL의 1x 인큐베이션 완충액 및 펠렛 수지와 함께 원심분리(60초 동안 2,660 x g )로 조심스럽게 재현탁합니다.
- 이전 단계를 반복합니다.
- Ni-NTA 수지를 30μL의 용리 완충액(50mMNaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 8.0)으로 조심스럽게 재현탁하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 로킹 쉐이커에서 인큐베이션한다.
- 원심분리에 의해 Ni-NTA 수지를 펠렛화한다(30초 동안 2,660 x g ).
- 상청액을 조심스럽게 취하여 2x SDS 샘플 버퍼47과 혼합합니다.
- 혼합물을 95°C에서 5분 동안 가열하고, 정제된 Ni-NTA 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리한다.
- 앞서 설명한 바와 같이 항-Penta-His 항체 (마우스 모노클로날, 1:500) 및 양 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합 항-마우스 항체 (토끼 폴리클로날, 1:1,000)를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행한다36,37.
- 태그되지 않은 PEDF 단백질의 직접 분석
- 15μL의 세포 배양 상청액을 취하여 2x SDS 샘플 버퍼47과 혼합합니다.
- 혼합물을 95°C에서 5분 동안 가열하고, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 단백질을 분리한다.
- 앞서 설명한 바와 같이 항-인간 PEDF 항체 (토끼 폴리클로날, 1:4,000) 및 HRP-접합된 항-토끼 항체 (염소 폴리클로날, 1:2,000)를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행한다38.
- ELISA에 의한 PEDF 분비의 정량화
- 제조자의 프로토콜에 따라 인간 PEDF ELISA 키트를 사용하여 세포 배양 상청액을 분석한다(단계 3.1.2 참조).
- 분비된 PEDF의 양을 각각의 형질감염 반응에 대해 결정된 시간 및 세포 수와 관련시킨다 (단계 3.1.4 참조).
- 형질감염된 RPE 세포에서 PEDF 유전자 발현 분석
- 제조자의 프로토콜에 따라 시판되는 키트를 사용하여 RPE 세포 펠릿으로부터 총 RNA를 분리한다(단계 3.1.5 참조).
- 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 RNA 함량을 정량화합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사 시스템을 사용하여 0.1μg RNA에 대한 역전사를 수행합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 실시간 qPCR을 수행한다38.
- 형질감염된 RPE 세포에서 유전자 삽입 부위 분석
- 제조자의 프로토콜에 따라 시판되는 키트를 사용하여 RPE 세포 펠릿으로부터 게놈 DNA를 분리한다(단계 3.1.5 참조).
- 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 DNA 함량을 정량화합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 계산-보조된 반-특이적 PCR 체계를 사용하여 삽입 부위 라이브러리를 생성한다38.
- 앞서 설명한 대로 전산 분석을 수행한다38.
- 세포 배양 상청액으로부터 His-tagged PEDF 융합 단백질의 정제
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Representative Results
일차 인간 RPE 세포의 배양 및 전기천공
우리는 동물 기원의 충분한 수의 1차 RPE 세포의 파종이 착색된, 육각형 모양의 세포(36,37,48)의 통합된 단일층으로의 배양 및 성장을 허용한다는 것을 보여주었다. 단단한 접합을 형성하고, 식세포 활성을 나타내고, 시험관 내48에서 특정 마커 유전자를 발현하는 이들의 능력은 생체내에서 망막 색소 상피의 실질적인 작업을 반영한다. 인간 공여자의 눈으로부터 분리된 배양된 1차 RPE 세포는 또한 공여자의 연령(65.3±9.94a, 최소: 49A, 최대: 83a, n=12), 분리 후 부검 시간(37.3±17.0시간, 최소: 16시간, 최대: 68시간, n=12), 및 배양 시간(27.6± 14.1d, 최소: 13d, 최대: 61 d, n = 12) (그림 2, 왼쪽 패널). 모세관 형질주입 시스템을 사용하여 일차 인간 RPE 세포에 단기 전기 펄스를 적용하는 것은 상피 형태에 부정적인 영향을 미치지 않았습니다(그림 2, 오른쪽 패널). 다양한 전기 파라미터의 테스트는 펄스 전압이 1,200V이고 펄스 폭이 20ms인 두 개의 펄스가 양호하고 안정적인 형질주입 효율과 가장 많은 수의 실행 가능한 RPE 셀(미공개 데이터)을 산출하는 것으로 나타났습니다.
배양된 1차 인간 RPE 세포에 PEDF 유전자의 SB100X 매개 삽입
우리는 250 ng (0.08 pmol) SB100X 트랜스포자제와 250 ng (0.052 pmol) PEDF 트랜스포존에서 12.2 ng (0.0039 pmol) SB100X 트랜스포아제와 487.8 ng (0.1 pmol) PEDF 트랜스포존에 이르는 SB100X 트랜스포존의 플라스미드 DNA 비율을 테스트했습니다. 이 접근법은 29.4 ng (0.0094 pmol) SB100X 트랜스포아제와 470.6 ng (0.098 pmol) PEDF 트랜스포존 및 23.8 ng (0.0076 pmol) 플러스 476.2 ng (0.099 pmol)의 두 조합을 최고의 전치 효율을 얻은 것으로 식별했습니다37. 배양된 1차 인간 RPE 세포에서, SB100X 트랜스포존 시스템을 사용한 PEDF 전이유전자의 전달은 지속적으로 증가된 PEDF 유전자 발현 및 PEDF 단백질 분비를 허용하였다. His-태그된 재조합 PEDF의 경우, 형질감염된 1차 인간 RPE 세포로부터의 세포 배양 배지의 웨스턴 블롯 분석은 500일 이상 동안 전이유전자 침묵 없이 일정한 수준에서 PEDF 분비를 입증하였다(도 3A). 비-태그된 PEDF의 경우, 형질감염된 1차 인간 RPE 세포에서의 분비가 또한 형질감염되지 않은 세포38에 비해 유의하게 증가된 것으로 나타났다. 연속적으로 수행된 형질주입으로부터의 세포 배양 배지의 대표적인 웨스턴 블롯 분석은 형질주입 후 21일째에 보편적으로 더 높은 PEDF 분비율을 명확하게 나타내었고(도 3B), 추구된 배양에서, 적어도 165일 동안 장기간 상승된 PEDF 분비가 입증되었다(도 3C). ELISA 기반 정량은 각각의 비형질주입 대조군 세포에 비해 형질감염된 1차 인간 RPE 세포에서 총 PEDF 분비의 20배 증가를 입증했습니다(그림 3D). 이러한 증가는 또한 유전자 발현 수준에서도 확인되었으며, 여기서 총 PEDF 발현은 30배 이상 상승하였다(도 3E).
그림 1: SB100X 트랜스포존 시스템을 통해 PEDF 유전자를 일차 인간 RPE 세포에 전기천공 기반으로 삽입하는 워크플로. 이 계획은 (A) 1차 인간 RPE 세포의 분리 및 합류 단층에 대한 후속 배양, (B) SB100X 트랜스포아제 및 PEDF 트랜스포존 플라스미드 DNA의 정제를 포함한 전기천공 공정의 단일 단계, SB100X 트랜스포자제/PEDF의 제조의 연대순 과정을 설명합니다. 트랜스포존 플라스미드 혼합물, 모세관 형질주입 시스템의 설정, 배양된 일차 인간 RPE 세포의 제조, 전기천공, 파종, 및 형질감염된 RPE 세포의 배양, 뿐만 아니라 (c) 세포 배양 상청액 및 형질감염된 세포 샘플의 제조를 포함하는, 형질감염된 일차 인간 RPE 세포의 분석, PEDF 분비의 평가 및 정량화, 및 PEDF 유전자 발현의 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다른 기증자의 눈에서 분리된 RPE 세포의 위상차 현미경 사진. 기증자 연령, 분리 후 시간 및 전기천공 적용 전 배양 시간이 다른 1차 인간 RPE 세포의 배양(왼쪽 패널) 및 모세관 형질주입 시스템을 사용하여 전기 매개변수 1,100V(펄스 전압), 20ms(펄스 폭) 및 2펄스(펄스 수)에 노출된 형질감염된 1차 인간 RPE 세포의 배양(오른쪽 패널 ), 조약돌 모양의 패턴으로 착색된 세포의 합류 통합 단분자층을 나타내었다(scale bars: 500 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 1차 인간 RPE 세포의 SB100X 매개 형질감염 후 PEDF 분비 및 PEDF 유전자 발현. (A-C) 모세관 형질주입 시스템을 사용하여 29.4ng(0.0094pmol) SB100X 트랜스포자제 플라스미드와 470.6ng(0.098pmol) PEDF 트랜스포존 플라스미드의 혼합물로 형질감염된 배양된 1차 인간 RPE 세포에서 PEDF 분비 안정성에 대한 면역블롯 기반 분석. (A) 26세의 공여자로부터의 RPE 세포(암컷, 부검 후 분리 시간: 26시간, 전기천공 전 배양 시간: 14일)를 형질감염시키고 500일 이상 동안 배양물을 유지하였다. His-태그된 재조합 PEDF (~48 kDa)를 상이한 시점에서 세포 배양 배지로부터 정제하고, 항-Penta-His 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다. (b) 비-태그된 재조합 PEDF의 경우, 53세의 공여자로부터의 RPE 세포 (암컷, 사후 분리 시간: 28시간, 형질주입 전 배양 시간: 19일)를 플라스미드 DNA 없이 전기천공하고(대조군 배양물 #1 및 #2) 또는 플라스미드 DNA(PEDF-형질감염된 세포 배양물 #3 내지 #7)를 첨가하여 21일 동안 배양물에 유지하였다. 세포 배양 상청액을 정제하지 않고 항-PEDF 항체를 사용하는 면역블로팅에 의해 직접 분석하였다. 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 대조군 (배양물 #1 및 #2) 및 형질감염된 세포(배양물 #3 및 #4)에서 세포내 PEDF의 수준을 나타내었다. 유사한 단백질 양의 로딩은 GAPDH 단백질 밴드의 동일한 밀도 (~ 36 kDa)로 표시되었습니다. (C) 장기 PEDF 분비의 분석을 위해, 63세의 공여자로부터의 RPE 세포(남성, 분리 후 시간: 26시간, 형질주입 전 배양 시간: 15일)를 플라스미드 DNA 없이 전기천공하고(대조군 배양물 #1 및 #2) 또는 플라스미드 DNA(PEDF-형질감염된 세포 배양 #3)를 사용하여 적어도 165일 동안 배양물을 유지하였다. 세포 배양 배지는 정제되지 않았지만, 항-PEDF 항체를 이용한 면역블로팅에 의해 직접 분석하였다. (D) 형질감염된 1차 인간 RPE 세포(2개 샘플) 및 형질주입되지 않은 대조군 세포(4개 샘플)에서 총 PEDF 분비량의 ELISA 기반 정량화. 형질감염된 세포의 분비를 형질주입되지 않은 세포의 분비와 비교하였다 (*p=0.0264, 웰치의 보정을 사용한 짝을 이루지 않은 t 시험). (e) 형질감염된 1차 인간 RPE 세포에서의 내인성 및 전체(내인성 플러스 재조합) PEDF 유전자 발현은 형질주입되지 않은 대조군 세포에서의 발현과 관련되었고, 그의 발현은 1(점선)로 설정되었다. 데이터는 상자-수염 그림(수염: 최소에서 최대)으로 표시됩니다. 총 PEDF 유전자 발현을 내인성 PEDF 유전자 발현과 비교하였다 (유의하지 않음, 웰치의 보정을 갖는 짝을 이루지 않은 t 검정). 태그되지 않은 재조합 PEDF(B-E)에 대한 결과는 29.4ng(0.0094pmol)에 470.6ng(0.098pmol)를 더한 SB100X-to-PEDF 트랜스포존 비율로 형질감염된 최대 27명의 공여자로부터의 1차 RPE 세포의 전체 데이터 세트의 2개 단위를 나타내며, 이는 Thumann et al. 2017 38에 의해 기술되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리 프로젝트에서 우리는 보호 환경의 확립 및 유지를 위한 장기 치료제로 형질감염된 세포를 사용하기 위해 효과적인 인자를 지속적으로 과발현하고 분비하는 유전자 변형 1차 인간 RPE 세포의 비바이러스 생산을 목표로 합니다. 우리는 항 혈관 신생 및 신경 보호 기능을 가진 유비쿼터스 발현 다기능 단백질 인 PEDF를 암호화하는 유전자의 도입을 확립했습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 SB100X 트랜스포존 시스템을 사용하여 1차 인간 RPE 세포를 안정적이고 재현성 있게 형질주입하는 데 사용할 수 있습니다. RPE 세포로의 DNA 전달 및 도입은 큐벳 대신 특정 팁을 전기 천공 챔버로 사용하는 피펫 기반 모세관 형질주입 시스템으로 수행됩니다.
후속 형질감염에 사용될 형태학적으로 잘 분화된 세포로 구성된 1차 RPE 배양의 농축은 인간 기증자(연령 및 일반적인 건강 상태) 및 눈의 수령(세포 분리의 사후 시간)과 관련된 여러 요인의 영향을 받습니다. 새로 분리되고 파종된 1차 RPE 세포는 육각형 모양의 세포의 단층을 개발하는 데 최소 2주가 필요합니다. 일반적으로, 형질감염 전에 합류점에 도달하는 데 더 많은 시간이 필요한 세포 배양은 또한 형질감염 후에 가속화된 순응 및 확산을 보였다. 세포 부착 및 확산은 또한 세포 분리 또는 형질감염 과정 동안 손상된 RPE 세포로부터의 유리 색소 침착에 의해 방해된다.
SB 트랜스포존 시스템은 치료적으로 관련된 뉴클레오티드 서열을 다양한 유형의 세포로 효율적이고 안전하게 전달하여 이후에 유전자 기반 세포 치료에 적용할 수 있도록 하는 널리 사용되는 유전 도구입니다. 특히 향상된 변종 SB100X는 바이러스 벡터와 비바이러스 플라스미드 DNA의 장점을 결합합니다. 통합 작용 모드는 발현 카세트의 숙주 세포 게놈으로의 안정적인 게놈 통합을 보장하고 관심 유전자 또는 서열의 지속적인 발현을 가능하게 합니다. 잠재적 돌연변이 유발 및 종양 발생27,28의 위험이 높은 활성 전사 단위에 우선적으로 통합되는 레트로바이러스 벡터와 달리, SB 기반 통합 프로파일은 무작위입니다. 이것은 인간 세포 49,50,51,52뿐만 아니라 일차 래트 및 인간 RPE 세포 38,46을 포함한 다양한 배양 및 일차 포유류 세포를 사용하는 많은 연구에서 입증되었습니다. 또한, SB 트랜스포존 시스템을 플라스미드 DNA로 적용하면 면역원성이 감소하고 제조 공정이 용이해집니다.
SB100X 트랜스포아제와 PEDF 트랜스유전자의 유전 정보를 별도의 플라스미드에 전달하는 것은 최적의 SB100X 대 PEDF 트랜스포존 비율을 정밀하게 조정할 수 있기 때문에 중요한 측면입니다. 앞서 기술된 바와 같이, SB 트랜스포존 시스템은 과량의 트랜스포아제 발현에 민감하며, 이는 전좌 활성(53)의 억제를 초래한다. 우리는 또한 ARPE-19 세포, 일차 인간 RPE 배양물54의 선택적 트립신화에 의해 정제된 자발적으로 진화된 세포주 및 1차 RPE 세포에 대해 이 효과를 관찰했습니다. 여기서, 최대 55.6 ng (0.018 pmol) SB100X 트랜스포자제 플러스 444.4 ng (0.093 pmol) PEDF 트랜스포존의 SB100X- 대 PEDF 트랜스포존 비율로의 형질감염은 PEDF 분비 율37을 명백히 감소시켰다. 이상적인 트랜스포자제 대 트랜스포존 비율은 새로 구성된 모든 트랜스포존 플라스미드에 대해 결정되어야 합니다.
비바이러스성 플라스미드 기반 벡터는 리포/폴리플렉스, 나노입자, 레이저, 초음파 또는 전기천공을 통해 이식할 수 있습니다. 우리는 이미 일차 PE 세포의 리포펙션-기반 형질감염이 효율적이지 않다는 것을 보여주었고, 따라서 전기천공-기반 유전자 전달로 전환되었다36. 전기 천공은 세포에 단기간 전기장을 적용하는 것으로 정의되며, 이로 인해 막의 투과성이 증가하고 수성 기공이 형성되어 플라스미드 DNA가 세포로 들어갈 수 있습니다. 일반적으로, 세포, 플라스미드 DNA, 및 전도성 완충액의 혼합물은 전기 펄스를 생성하는 전기천공 장치에 연결되는 두 전극 사이의 특정 전기천공 챔버 내로 채워진다. 이 소위 벌크 전기 천공 설정에서 기존의 큐벳 전기 천공 챔버는 두 개의 평행 판형 전극을 특징으로하며, 그 거리는 전기 천공 반응 당 사용되는 셀 유형 및 셀 수에 따라 가변적 인 (0.1-0.4mm) 있습니다. 양호한 형질주입 효율에도 불구하고, 상이한 부작용은 형질감염된 세포의 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있다, 예를 들어, pH 변화, 열 발생, 기포 생성, 및 난류 흐름. 모세관 형질주입 시스템은 적어도 최소화된 표면적 및 이들 사이의 최대화된 갭 크기(42 )를 갖는 전극을 보유함으로써 및 특정 재현탁 및 전해 완충액을 사용함으로써 큐벳계 부작용을 감쇠시키고; 그러나 그들의 구성은 공개되지 않았습니다.
세포 생존을 증가시킨 벌크 전기천공 설정 내의 개선에도 불구하고 특정 비율의 세포에 대한 돌이킬 수 없는 손상은 불가피합니다. 더욱이, 세포에 통합된 플라스미드의 양의 정밀한 제어는 불가능하다. 보다 최근의 소형 전기 천공 시스템 개발은 벌크 전기 천공과 관련된 한계를 더욱 줄임으로써 추가적인 개선을 가능하게했습니다. 이 새로운 장치는 미세 전극, 미세 유체 또는 나노 구조를 기반으로합니다. 그들은 유전자 치료, 재생 의학 및 현장 세포 내 조사 분야에서 새로운 응용 관점을 제공합니다 (Chang et al. 및 Shi et al.) 55,56.
우리는 초기에 큐벳 기반 시스템을 사용하여 수행되었다가 이후에 피펫 기반 모세관 시스템을 사용하여 확립된 전기천공이 색소 상피 세포주 ARPE-19와 1차 PE 세포 36,37,38,57,58을 모두 형질감염시키는 데 적합하고 효율적인 방법임을 입증했습니다. . 사용되는 세포 유형에 따라, 양호한 형질주입 효율 및 세포 생존 모두를 허용하는 파라미터를 적용하여 적절한 전기천공 프로토콜을 정의하는 것이 중요하다. 불충분한 전기장은 세포가 손상되는 것을 방지하지만 형질주입 효율이 낮습니다. 전기장 강도의 증가와 함께, 향상된 형질주입 효율이 달성된다. 그러나 높은 전기 매개 변수는 돌이킬 수없는 세포 손상으로 인해 죽은 세포의 비율을 높입니다. ARPE-19 세포주의 경우, 모세관 형질주입 시스템을 사용하여, 1,350V, 20ms, 및 2펄스의 전기천공 파라미터가 100%37의 초기 형질주입 효율을 초래하는 것으로 나타났다. 1차 RPE 세포의 형질주입을 위해 이러한 파라미터를 적용하면 효율성도 양호했지만, 1,100V, 20ms 및 2펄스의 전기천공 파라미터와 비교할 때 형질주입 후 배양된 세포 수가 더 적었습니다(데이터는 표시되지 않음). 따라서 세포 손상을 방지하고 형질감염된 세포를 덜 수용하기 위해 더 가벼운 전기천공 매개변수를 선택하기로 결정했습니다.
이 접근법의 전반적인 목표는 신생 혈관 AMD로 고통받는 환자의 치료를위한 PEDF- 형질 감염된 세포의 임상 적용에 있습니다. 이 요법은 SB100X 트랜스포존 시스템을 기반으로 생체 외에자가 색소 상피 세포에 PEDF 전이 유전자를 안정적으로 도입 한 다음 형질 감염된 세포를 환자의 망막 하 공간에 이식하는 것으로 구성됩니다. 따라서, PEDF-형질감염된 세포가 형질전환되지 않고 섬유아세포 형태 및 성장 거동을 획득하지 않도록 하는 것이 중요하다. 형질감염된 세포가 PEDF의 지속적이고 일관된 분비를 허용한다는 것을 증명하는 것도 중요합니다. 또한 특정 기간 동안 특정 수의 세포에서 분비되는 PEDF의 정확한 양을 아는 것이 중요합니다.
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Disclosures
Zoltán Ivics와 Zsuzsanna Izsvák는 SB 트랜스포존 기술에 대한 여러 특허의 발명가입니다.
Acknowledgments
이 작업은 연구, 기술 개발 및 시연을위한 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램, 보조금 계약 번호 305134의 지원을 받았습니다. Zsuzsanna Izsvák는 유럽 연구위원회 (European Research Council, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742)의 자금 지원을 받았습니다. 저자는 탁월한 기술 지원을 해준 Anna Dobias와 Antje Schiefer (안과학과, RWTH Aachen 대학 병원 Aachen)와 인간 기증자의 눈을 제공 한 Aachen 각막 은행 (안과학과, 대학 병원 RWTH Aachen)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation of primary human RPE cells | |||
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
| Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
| Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
| Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
| Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
| Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
| Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
| Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
| Electroporation of primary human RPE cells | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
| 12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
| Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
| 10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
| 1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| 2x SDS Sample Buffer | |||
| 4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
| Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
| Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
| LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
| LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
| LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |
References
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