Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61987
Automatic Translation
1, 2,3, 4,5, 4, 6, 7, 1, 2,3
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

Summary

Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.

Abstract

Giderek yaşlanan toplumumuz, nörodejeneratif hastalıkların artan insidansına yol açmaktadır. Şimdiye kadar, patolojik mekanizmalar yeterince anlaşılmamış, bu nedenle tanımlanmış tedavilerin kurulmasını engellemiştir. Koruyucu bir faktörün artan ekspresyonu için hücre bazlı katkı gen tedavileri, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için umut verici bir seçenek olarak kabul edilir. Sinir sisteminde nöroprotektif ve anti-anjiyojenik bir protein olarak karakterize edilen pigment epitel kaynaklı faktörü (PEDF) kodlayan genin, Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak primer insan pigment epitel (PE) hücrelerinin genomuna stabil ekspresyonu için bir yöntem geliştirdik. Primer PE hücreleri insan donör gözlerinden izole edildi ve kültürde tutuldu. Birleşmeye ulaştıktan sonra, 11 μL resüspansiyon tamponunda 1 x 104 hücre askıya alındı ve 30 ng hiperaktif SB (SB100X) transpozaz plazmidi ve 470 ng PEDF transpozon plazmidi içeren 2 μL saflaştırılmış bir çözelti ile birleştirildi. Genetik modifikasyon, aşağıdaki parametreler kullanılarak kılcal bir elektroporasyon sistemi ile gerçekleştirildi: 1.100 V voltajlı ve 20 ms genişliğinde iki darbe. Transfekte hücreler, fetal sığır serumu ile desteklenmiş ortam içeren kültür plakalarına aktarıldı; antibiyotikler ve antimikotikler ilk orta değişim ile eklendi. Başarılı transfeksiyon bağımsız olarak yapılan deneylerde gösterilmiştir. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), PEDF transgeninin artmış ekspresyonunu gösterdi. PEDF sekresyonu, immünoblotlama ile değerlendirildiği ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldüğü gibi anlamlı derecede yükselmiş ve stabil kalmıştır. SB100X aracılı transfer, PE hücrelerinin genomuna stabil bir PEDF gen entegrasyonuna izin verdi ve AMD veya diğer retinal dejeneratif hastalıkları tedavi etmek için hücre bazlı bir gen ekleme tedavisinin geliştirilmesi için kritik olan PEDF'nin sürekli salgılanmasını sağladı. Dahası, PEDF transpozonunun insan PE hücrelerine entegrasyon profilinin analizi, neredeyse rastgele bir genomik dağılım olduğunu göstermiştir.

Introduction

İleri yaş, nörodejeneratif hastalıklar için ana risk olarak tanımlanmaktadır. 60 yaşından büyük hastalarda ciddi görme kaybına yol açan poligenik bir hastalık olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), körlük ve görme bozukluğunun en yaygın dört nedenine aittir1 ve 2040 yılında 288 milyon kişiye yükselmesi beklenmektedir2. Koryokapillaris ve retinal fotoreseptörler arasında sıkıca paketlenmiş hücrelerin tek bir tabakası olan retinal pigment epitelinin (RPE) disfonksiyonları, AMD'nin patogenezine katkıda bulunur. RPE, normal bir retina fonksiyonu3 için gerekli olan birçok görevi yerine getirir ve retinanın ve koryokapilarisin yapısal bütünlüğünü korumak için gerekli olan çeşitli büyüme faktörlerini ve faktörlerini salgılar, böylece fotoreseptör sağkalımını destekler ve dolaşım ve besin tedariki için bir temel sağlar.

Sağlıklı gözlerde, pigment epitel kaynaklı faktör (PEDF), vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) etkilerini dengelemekten sorumludur ve nöronları apoptoza karşı korur, endotel hücre proliferasyonunu önler ve kılcal endoteli stabilize eder. Değişmiş bir VEGF-PEDF oranı, hayvan modelleri 4,5'te ve AMD ve proliferatif diyabetik retinopatiye bağlı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) olan hastaların örneklerinde gözlenen oküler neovaskülarizasyon ile ilişkilidir 6,7,8,9,10 . Gelişmiş VEGF konsantrasyonu, mevcut standart tedavinin hedefidir. Anti-VEGF farmasötikler bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ve en son brolucizumab CNV hastalarının yaklaşık üçte birinde görme keskinliğini arttırır veya vakaların% 90'ında görmeyi stabilize eder11,12,13. Bununla birlikte, sıklıkla, genellikle aylık intravitreal enjeksiyonlar, advers olay riski taşır14, hasta uyumunu bozar ve sağlık sistemleri için önemli bir ekonomik yük oluşturur15. Ayrıca, hastaların belirli bir yüzdesi (% 2-% 20) anti-VEGF tedavisine cevap vermemekte veya sadece zayıf tepki vermektedir16,17,18,19. Bu negatif eşlik edenler, göz içi implantlar, hücre ve/veya gen terapötik yaklaşımlar gibi alternatif tedavilerin geliştirilmesini gerektirmektedir.

Gen terapisi, kalıtsal ve kalıtsal olmayan hastalıklar için umut verici bir tedavi olarak gelişmiştir ve fonksiyonel olmayan gen dizilerini restore etmeyi veya arızalı olanları bastırmayı amaçlamaktadır. Etken faktörlerin tanımlanması ve değiştirilmesinin pek mümkün olmadığı poligenik hastalıklar için, stratejiler koruyucu bir faktörün sürekli olarak verilmesini amaçlamaktadır. AMD durumunda, endostatin ve anjiyostatin20'nin kararlı ekspresyonu, VEGF antagonisti çözünür fms benzeri tirozin kinaz-1 (sFLT-1) 21,22, farklılaşmanın tamamlayıcı düzenleyici protein kümesi 59 (CD59)23 veya PEDF24,25 gibi çeşitli katkı tedavileri geliştirilmiştir. . Göz ve özellikle retina, kapalı yapısı, iyi erişilebilirliği, küçük boyutu ve bağışıklık ayrıcalığı nedeniyle gen bazlı bir ilaç için mükemmel bir hedeftir, böylece düşük terapötik dozların lokalize bir şekilde verilmesine izin verir ve nakillerin reddedilmeye daha az duyarlı hale getirilmesine izin verir. Ayrıca, göz non-invaziv izlemeye olanak tanır ve retina farklı görüntüleme teknikleri ile incelenebilir.

Viral vektörler, yüksek transdüksiyon verimlilikleri nedeniyle, terapötik genleri hedef hücrelere iletmek için ana araçtır. Bununla birlikte, kullanılan viral vektöre bağlı olarak, immün ve inflamatuar yanıtlar26, mutajenik ve onkojenik etkiler 27,28 veya diğer dokularda yayılma29 gibi farklı advers reaksiyonlar tanımlanmıştır. Pratik sınırlamalar arasında sınırlı bir ambalaj boyutu30'un yanı sıra31,32 klinik sınıf lotlarının üretimi ile ilgili zorluklar ve maliyetler bulunmaktadır. Bu dezavantajlar, lipo / polipleksler, ultrason veya elektroporasyon yoluyla aktarılan viral olmayan, plazmid bazlı vektörlerin daha da geliştirilmesini teşvik etmiştir. Bununla birlikte, transgenin konakçı genomuna genomik entegrasyonu genellikle plazmid vektörleri ile desteklenmez, böylece geçici bir ekspresyon ile sonuçlanır.

Transpozonlar, genom içindeki konumlarını değiştiren doğal olarak oluşan DNA fragmanlarıdır, bu da gen terapisi için benimsenmiş bir özelliktir. Aktif bir entegrasyon mekanizması nedeniyle, transpozon tabanlı vektör sistemleri, yerleştirilen transgenin sürekli ve sabit bir ifadesine izin verir. Uyuyan Güzel (SB) transpozonu, balık33'te bulunan eski bir Tc1 / denizci tipi transpozondan yeniden oluşturulmuş ve hiperaktif varyant SB100X34 ile sonuçlanan moleküler evrimle daha da geliştirilmiş, çeşitli birincil hücrelerde verimli transpozisyon sağlamıştır ve farklı hastalık modellerinde fenotipik düzeltme için kullanılmıştır35. Şu anda, SB transpozon sistemi kullanılarak 13 klinik çalışma başlatılmıştır. SB100X transpozon sistemi iki bileşenden oluşur: terminal ters çevrilmiş tekrarlar (TIR'lar) tarafından kuşatılan ilgi genini içeren transpozon ve transpozonu harekete geçiren transpozaz. Plazmid DNA'sının hücrelere verilmesini takiben, transpozaz TIR'ları bağlar ve transpozonun eksizyonunu ve hücrenin genomuna entegrasyonunu katalize eder.

Neovasküler AMD tedavisi için viral olmayan hücre bazlı bir katkı maddesi tedavisi geliştirdik. Yaklaşım, PEDF geninin SB100X transpozon sistemi 36,37,38 aracılığıyla primer pigment epitel (PE) hücrelerine elektroporasyon bazlı yerleştirilmesini içerir. Transpozaz ve PEDF'nin genetik bilgisi ayrı plazmidler üzerinde sağlanır, böylece ideal SB100X-PEDF transpozon oranının ayarlanmasını sağlar. Elektroporasyon, yüzey alanlarını en aza indirirken elektrotlar arasında maksimum boşluk boyutu ile karakterize edilen pipet bazlı bir kılcal transfeksiyon sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Cihazın çok çeşitli memeli hücrelerinde mükemmel transfeksiyon oranları elde ettiği gösterilmiştir 39,40,41. Küçük elektrot yüzey alanı düzgün bir elektrik alanı sağlar ve elektroliz42'nin çeşitli yan etkilerini azaltır.

Transfekte pigment epitel hücreleri tarafından salgılanan PEDF'nin anti-anjiyojenik işlevselliği, insan göbek damarı endotel hücrelerinin filizlenme, göç ve apoptozunu analiz eden çeşitli in vitro deneylerde gösterilmiştir43. Ek olarak, kornea neovaskülarizasyonunun tavşan modelinde PEDF-transfekte hücrelerin transplantasyonu44 ve CNV 43,45,46'nın sıçan modelinde neovaskülarizasyonun azaldığını göstermiştir.

Burada, kılcal transfeksiyon sistemi kullanarak SB100X transpozon sistemi aracılığıyla PEDF geninin birincil insan RPE hücrelerine kararlı bir şekilde yerleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Transfekte edilen hücreler 21 gün boyunca kültürde tutuldu ve daha sonra kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile PEDF gen ekspresyonu ve immünoblotasyon ve enzime bağlı immünosorbent testi ile PEDF protein sekresyonu açısından analiz edildi (ELISA, Şekil 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan donör gözleri, Helsinki protokolleri Deklarasyonu'na uygun olarak bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra Oftalmoloji Bölümü Aachen Cornea Bankası'ndan (RWTH Aachen Üniversite Hastanesi) alınmıştır. İnsan örneklerinin toplanması ve kullanılmasına ilişkin prosedürler kurumsal etik kurul tarafından onaylanmıştır.

1. Birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonu

  1. Steril koruyucu giysiler ve eldivenler yerleştirin. Laminer bir akışın altına steril bir örtü yerleştirin.
  2. Steril hazırlama aletlerini ve diğer gerekli steril ekipmanları laminer akışın altına yerleştirin.
  3. Göz kürelerinin alınışını, preparatın başlangıcını ve olası anormallikleri kaydedin. Donörün yaşını, cinsiyetini, ölüm nedenini ve ölüm zamanı ile gözün çıkarılması arasındaki süreyi kaydedin.
  4. Göz küresini steril bir gazlı bez sıkıştırmasına yerleştirin ve bir elinizde tutun.
  5. Ön segmenti arka segmentten bir neşter ve ekstra ince sivri uçlu bir göz makası kullanarak limbusa yaklaşık 3,5 mm posterior çevresel bir kesimle ayırın.
  6. Arka segmenti aşağı doğru yatırdıktan sonra, kolibri forseps kullanarak vitreus ve retinayı dikkatlice çıkarın.
  7. Çökmüş RPE / choroidea kompleksini düz iris forseps kullanarak gizlice yeniden düzenleyin ve daha sonra kavisli iris forseps ile pozisyonda tutun.
  8. Arka göz kapağını, %10 fetal sığır serumu (FBS), 80 U/mL penisilin ve 80 μg/mL streptomisin (Pen/Strep) ve 2,5 μg/mL amfoterisin B (AmfoB) ile desteklenmiş 1 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta/Ham'ın F-12 Besin Karışımı (DMEM/F12) ile doldurun.
    NOT: Birincil RPE hücrelerinin domuz veya sığır gözlerindenizolasyonunun aksine, 36,37, arka göz kapağının tripsin ile doldurulması ve inkübe edilmesi gerekmez.
  9. Retinal pigment epitelini optik sinirden limbüse doğru ateşle parlatılmış kavisli bir cam Pasteur pipetle nazikçe fırçalayarak RPE / choroidea kompleksini kolibri forseps kullanarak limbusta sabitleyerek RPE hücrelerini toplayın. Hücre süspansiyonunu bir Petri kabına aktarın.
  10. 1.8 ve 1.9 adımlarını tekrarlayın ve Petri kabındaki tüm hücreleri toplayın. Tek kanallı pipet (100-1.000 μL) kullanarak yukarı ve aşağı pipet yaparak hücre süspansiyonunu dikkatli bir şekilde yeniden askıya alın.
  11. Her bir göz küresinin RPE hücre süspansiyonunu 24 delikli bir hücre kültürü plakasının üç kuyucuğuna tohumlayın ve FBS, Pen / Strep ve AmfoB ile desteklenmiş DMEM / F12 ile 1 mL'ye kadar doldurun.
  12. RPE hücre kültürlerini, birleşime ulaşana kadar% 95 hava ve% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de tutun. Hücre kültürü ortamını haftada iki kez değiştirin.

2. Birincil insan RPE hücrelerinin elektroporasyonu

  1. SB100X transpozaz/PEDF transpozon plazmid karışımının hazırlanması
    1. SB100X transpozaz ve PEDF transpozon plazmid DNA'sını, üreticinin protokolüne göre transfeksiyon gibi uygulamalarda kullanıma uygun olduğu belirlenen geleneksel plazmid saflaştırma kitlerini kullanarak saflaştırın.
    2. Plazmid DNA içeriğini bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak ölçün ve bunları 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) ile 250 ng / μL konsantrasyonuna ayarlayın.
    3. 250 ng/μL SB100X transpozaz plazmid DNA'sının (örneğin, 2.5 μL) bir kısmını, 16 porsiyon 250 ng/μL PEDF transpozon plazmid DNA'sı (örneğin, 40 μL) ile karıştırın. Kalıntı plazmid karışımı -20 °C'de saklanabilir.
      NOT: Plazmid karışımının tekrarlanan çoklu dondurma ve çözme döngülerinden kaçınılmalıdır.
    4. 29,4 ng SB100X transpozaz plazmidi ve 470,6 ng PEDF transpozon plazmidi içeren SB100X transpozon plazmid karışımının 2 μL'sini steril 1,5 mL güvenli kilitli mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Hücrelerle karışana kadar buz üzerinde tutun.
  2. Kılcal transfeksiyon sisteminin kurulması
    NOT: Birincil insan RPE hücrelerinin elektroporasyonu, üreticinin protokolüne göre 10 μL kiti kullanılarak kılcal transfeksiyon sistemi aracılığıyla gerçekleştirilmiştir. Sistem transfeksiyon cihazını, transfeksiyon pipetini ve pipet istasyonunu içerir. Kit 10 μL transfeksiyon uçları, tampon tüpler, elektrolitik tampon E (tampon E) ve resüsitasyon tamponu R (tampon R) içerir.
    1. Pipet istasyonunu transfeksiyon cihazına bağlayın.
    2. Bir tampon tüpünü 3 mL tampon E ile doldurun ve bir tıklama sesi duyulana kadar pipet istasyonuna takın.
      NOT: Tampon tüpünün yan elektrodunun pipet istasyonunun yan bilyalı pistonuna bağlı olduğundan emin olun.
    3. Birincil insan RPE hücrelerinin elektroporasyonu için, transfeksiyon cihazında aşağıdaki darbe koşullarını ayarlayın: 1.100 V (darbe voltajı), 20 ms (darbe genişliği), iki darbe (darbe sayısı).
  3. Ekili birincil insan RPE hücrelerinin hazırlanması
    1. Faz kontrast mikroskobu ile primer RPE hücre kültürlerinin şeklini ve morfolojisini belgeleyin. RPE hücrelerinin birleşik ve entegre bir tek katmana büyümesini göstermek için düşük büyütmeli mikrografların yanı sıra RPE hücrelerinin tipik parke taşı morfolojisine işaret etmek için daha yüksek büyütmeli mikrograflar alın.
    2. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücreleri 1 mL tamponlu fosfat salin (PBS, pH 7.4) ile iki kez yıkayın.
    3. Primer insan RPE hücrelerini, 7-15 dakika (maksimum) boyunca% 95 hava ve% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de% 0.5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ile tripsinize edin. Hücre ayrılmasını mikroskobik olarak kontrol edin.
    4. FBS ile desteklenmiş 1 mL DMEM / F12 ile tripsinizasyonu durdurun. Bir hemositometre kullanarak hücre sayımı için 20 μL aliquot alın. RPE hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 106 x g'de santrifüj yapın.
    5. 20 μL aliquot'u 20 μL tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. Pipet, hemositometrenin her yarısında 10 μL ve hücreleri bir faz kontrast mikroskobu altında sayar.
    6. Santrifüjlemeden sonra, RPE hücre peletini 1 mL PBS'de yeniden askıya alın.
    7. Transfeksiyon reaksiyonu başına 10.000-100.000 RPE hücresi alın ve bunları 10 dakika boyunca 106 x g'de santrifüj edin.
      NOT: Elektrik alan uygulaması ve plazmid DNA'sının eklenmesi ile transfeksiyon reaksiyonlarının yanı sıra, her yaklaşım iki farklı kontrol kültürü içerir: (1) elektrik alan uygulaması olmadan ve plazmid DNA'sı olmadan; (2) elektrik alan uygulaması ile, ancak plazmid DNA'sı olmadan.
    8. Hücre peletini 11 μL tampon R'de yeniden askıya alın ve SB100X transpozaz/PEDF transpozon plazmid karışımının 2 μL'si ile birleştirin (bkz. adım 2.1.4).
      NOT: R tamponunda yeniden süspansiyondan sonra, hücre canlılığında ve transfeksiyon verimliliğinde bir azalmayı önlemek için hücreler 15 dakika içinde işlenmelidir.
    9. Transfeksiyon pipetinin kafasını, kelepçe pistonun montaj sapını tamamen alana kadar 10 μL transfeksiyon ucuna yerleştirin. Hücre/plazmid çözeltisini transfeksiyon ucuna çekin.
      NOT: Hava kabarcıklarının oluşmasından ve bunların transfeksiyon ucuna aspirasyonunu önleyin.
    10. FBS ile desteklenmiş, ancak Pen / Strep olmadan ve AmfoB olmadan, 24 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasının gerekli sayıda kuyucuğuna 1 mL DMEM / F12 sağlayın.
  4. Elektroporasyon işlemi
    1. Transfeksiyon pipetini, bir tıklama sesi duyulana kadar pipet istasyonuna yerleştirilen tampon tüpüne yerleştirin (bkz. adım 2.2.2).
      NOT: Transfeksiyon pipetinin metal kafasının, pipet istasyonunun içindeki bilyalı pistona ve tampon tüpüne bağlı olduğundan emin olun.
    2. Transfeksiyon cihazının dokunmatik ekranında Başlat'a basın. Elektrik darbesinin uygulanmasından önce, cihaz tampon tüpünün ve transfeksiyon pipetinin düzgün bir şekilde yerleştirilip yerleştirilmediğini otomatik olarak kontrol eder. Elektrik darbeleri teslim edildikten sonra, dokunmatik ekranda Tamamlandı görüntülenir.
    3. Transfeksiyon pipetini pipet istasyonundan dikkatlice çıkarın ve hücre/plazmid çözeltisini hücre kültürü plakasının hazırlanan kuyucuklarına pipetleyerek elektroporated hücreleri derhal 10 μL transfeksiyon ucundan serbest bırakın (bkz. adım 2.3.10).
    4. Transfekte RPE hücre kültürlerini 37 ° C'de% 95 hava ve% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde tutun. Elektroporasyondan 3 gün sonra ilk orta değişim ile Pen / Strep ve AmphoB ekleyin.

3. Transfekte primer insan RPE hücrelerinin analizleri

  1. Numune hazırlama
    1. 3 haftalık bir yetiştirme süresinden sonra, RPE hücre kültürlerini FBS, Pen / Strep ve AmfoB ile desteklenmiş 1.0 mL DMEM / F12'lik tanımlanmış bir hacimde 24 saatlik tanımlanmış bir süre boyunca inkübe edin.
    2. Hücre kültürü süpernatantlarını alın ve daha yakın bir zamana kadar -20 ° C'de veya termal olarak kararsız numuneler ve uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın.
    3. Transfekte RPE hücre kültürlerini 37 °C'de 0,5 mL% 0,05 tripsin-EDTA ile, nemlendirilmiş bir atmosferde% 95 hava ve% 5 CO2 ile 10 dakika boyunca tripsinize edin.
    4. FBS ile desteklenmiş 1 mL DMEM / F12 ile tripsinizasyonu durdurun. Bir hemositometre kullanarak hücre sayımı için küçük alikotlar alın (bkz. adım 2.3.5). RPE hücre süspansiyonlarını 10 dakika boyunca 106 x g'de santrifüj edin.
    5. RPE hücre peletlerini bir sonraki işleme kadar -80 °C'de saklayın.
  2. PEDF sekresyonunun western blotlama ile değerlendirilmesi
    NOT: Kalitatif bir değerlendirme için, hücre kültürü süpernatantları (bkz. adım 3.1.2), sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve müteakip batı lekelenmesi yoluyla analiz edilir. Bağımlı olarak PEDF transpozon plazmid DNA'sı kullanıldığında, süpernatantların farklı şekilde işlenmesi gerekir.
    1. His-etiketli PEDF füzyon proteinlerinin hücre kültürü süpernatantlarından saflaştırılması
      1. Konik kesilmiş bir uç kullanarak numune başına 30 μL nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) bulamacı alın ve Ni-NTA reçinesini santrifüjleme ile pelet edin (30 s için 2.660 x g).
      2. Ni-NTA reçinesini 200 μL 1x inkübasyon tamponu (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0) ile dikkatlice yeniden askıya alın ve santrifüjleme yoluyla (30 s için 2.660 x g) pelet edin.
      3. Önceki adımı tekrarlayın.
      4. Ni-NTA reçinesini, numune başına 40 μL 4x inkübasyon tamponu (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0) ile dikkatli bir şekilde yeniden askıya alın.
      5. 900 μL hücre kültürü süpernatantını 260 μL 4x inkübasyon tamponu ve 55 μL ön işlemden geçirilmiş Ni-NTA bulamacı ile karıştırın (bkz. adım 3.2.1.4).
      6. Karışımı 60 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      7. Ni-NTA reçinesini santrifüjleme ile pelet (60 s için 2660 x g).
      8. Ni-NTA reçinesini 175 μL 1x inkübasyon tamponu ve santrifüjleme yoluyla pelet reçinesi (60 s için 2.660 x g) ile dikkatlice yeniden askıya alın.
      9. Önceki adımı tekrarlayın.
      10. Ni-NTA reçinesini 30 μL elüsyon tamponu (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8.0) ile dikkatlice yeniden askıya alın ve karışımı 20 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      11. Ni-NTA reçinesini santrifüjleme ile pelet edin (30 s için 2.660 x g).
      12. Süpernatantı dikkatlice alın ve 2x SDS numune tamponu47 ile karıştırın.
      13. Karışımı 95 ° C'de 5 dakika ısıtın ve Ni-NTA saflaştırılmış proteinleri %10'luk bir SDS-poliakrilamid jel üzerinde ayırın.
      14. Daha önce tarif edildiği gibi anti-Penta-His antikorları (fare monoklonal, 1:500) ve yaban turpu peroksidaz (HRP)-konjuge anti-fare antikorları (tavşan poliklonal, 1:1,000) kullanarak batı lekelemesi yapın36,37.
    2. Etiketlenmemiş PEDF proteinlerinin doğrudan analizi
      1. 15 μL hücre kültürü süpernatantı alın ve 2x SDS numune tamponu47 ile karıştırın.
      2. Karışımı 95 ° C'de 5 dakika ısıtın ve proteinleri% 10'luk bir SDS-poliakrilamid jel üzerinde ayırın.
      3. Daha önce tarif edildiği gibi anti-insan PEDF antikorları (tavşan poliklonal, 1: 4.000) ve HRP konjuge anti-tavşan antikorları (keçi poliklonal, 1: 2.000) kullanarak batı lekelemesi yapın38.
    3. ELISA ile PEDF sekresyonunun nicelleştirilmesi
      1. Üreticinin protokolüne göre bir insan PEDF ELISA kiti kullanarak hücre kültürü süpernatantlarını analiz edin (bkz. adım 3.1.2).
      2. Salgılanan PEDF miktarını, her transfeksiyon reaksiyonu için belirlenen zamana ve hücre sayısına bağlayın (bkz. adım 3.1.4).
    4. Transfekte RPE hücrelerinde PEDF gen ekspresyonunun analizi
      1. Toplam RNA'yı RPE hücre peletlerinden izole edin (bkz. adım 3.1.5), üreticinin protokolüne göre ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak.
      2. RNA içeriğini bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak ölçün.
      3. Üreticinin protokolüne göre bir ters transkripsiyon sistemi kullanarak 0.1 μg RNA üzerinde ters transkripsiyon gerçekleştirin.
      4. Daha önce açıklandığı gibi gerçek zamanlı qPCR gerçekleştirin38.
    5. Transfekte RPE hücrelerinde transgen yerleştirme bölgelerinin analizi
      1. Genomik DNA'yı RPE hücre peletlerinden izole edin (bkz. adım 3.1.5), üreticinin protokolüne göre ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak.
      2. Bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak DNA içeriğini ölçün.
      3. Daha önce açıklandığı gibi hesaplama destekli hemi'ye özgü PCR şeması kullanarak ekleme sitesi kitaplıkları oluşturun38.
      4. Daha önce açıklandığı gibi hesaplamalı analiz yapın38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Birincil insan RPE hücrelerinin yetiştirilmesi ve elektroporasyonu
Yeterli sayıda hayvansal kökenli birincil RPE hücresinin tohumlanmasının, pigmentli, altıgen şekilli hücrelerin entegre bir tek katmanlı 36,37,48'e yetiştirilmesine ve büyümesine izin verdiğini gösterdik. Sıkı kavşaklar oluşturma, fagositik aktivite gösterme ve spesifik belirteç genlerini in vitro48 eksprese etme yetenekleri, retinal pigment epitelinin in vivo olarak önemli görevlerini yansıtmaktadır. İnsan donör gözlerinden izole edilen ekili primer RPE hücreleri, donörün yaşına (65.3 ± 9.94 a, min: 49 a, max: 83 a, n = 12), ölüm sonrası izolasyon süresine (37.3 ± 17.0 h, min: 16 h, max: 68 h, n = 12) ve ekim süresine (27.6 ± 14.1 d, min: 13 d, max: 61 d, n = 12) (Şekil 2, sol panel). Kılcal transfeksiyon sistemi kullanılarak primer insan RPE hücrelerine kısa süreli elektriksel darbelerin uygulanması epitel morfolojisini olumsuz etkilememiştir (Şekil 2, sağ panel). Çeşitli elektriksel parametrelerin test edilmesi, 1.200 V'luk bir darbe voltajına ve 20 ms'lik bir darbe genişliğine sahip iki darbenin, iyi ve kararlı transfeksiyon verimlilikleri ve en yüksek sayıda canlı RPE hücresi (yayınlanmamış veriler) sağladığını ortaya koymuştur.

SB100X aracılı PEDF geninin ekili birincil insan RPE hücrelerine yerleştirilmesi
SB100X-PEDF transpozonunun plazmid DNA oranlarını 250 ng (0.08 pmol) SB100X transpozaz artı 250 ng (0.052 pmol) PEDF transpozonundan 12.2 ng (0.0039 pmol) SB100X transpozaz artı 487.8 ng (0.1 pmol) PEDF transpozonuna kadar test ettik. Bu yaklaşım, 29.4 ng (0.0094 pmol) SB100X transpozaz artı 470.6 ng (0.098 pmol) PEDF transpozonu ve 23.8 ng (0.0076 pmol) artı 476.2 ng (0.099 pmol) kombinasyonlarını en iyi transpozisyon verimliliklerini elde edenler olarak tanımlamıştır37. Ekili birincil insan RPE hücrelerinde, SB100X transpozon sistemi kullanılarak PEDF transgeninin verilmesi, sürekli artan bir PEDF gen ekspresyonu ve PEDF protein sekresyonuna izin verdi. Onun etiketli rekombinant PEDF için, transfekte edilmiş birincil insan RPE hücrelerinden hücre kültürü ortamının batı leke analizi, 500 günden fazla bir süre boyunca transgen susturulmadan sabit seviyelerde PEDF sekresyonunu göstermiştir (Şekil 3A). Etiketlenmemiş PEDF için, transfekte primer insan RPE hücrelerinde sekresyonun, transfekte edilmemiş hücrelere kıyasla anlamlı derecede arttığı gösterilmiştir38. Seri olarak gerçekleştirilen transfeksiyonlardan elde edilen hücre kültürü ortamının temsili bir batı lekesi analizi, transfeksiyondan 21 gün sonra evrensel olarak daha yüksek PEDF sekresyon oranını açıkça göstermiştir (Şekil 3B) ve takip edilen bir kültürde, uzun süreli yüksek PEDF sekresyonu en az 165 gün boyunca kanıtlanmıştır (Şekil 3C). ELISA bazlı niceleme, transfekte primer insan RPE hücrelerinde toplam PEDF sekresyonunun, ilgili transfekte olmayan kontrol hücrelerine kıyasla 20 kat arttığını göstermiştir (Şekil 3D). Bu artış, toplam PEDF ekspresyonunun 30 kattan fazla yükseltildiği gen ekspresyon seviyesinde de doğrulandı (Şekil 3E).

Figure 1
Şekil 1: SB100X transpozon sistemi aracılığıyla PEDF geninin birincil insan RPE hücrelerine elektroporasyon tabanlı yerleştirilmesi için iş akışı. Şema, (A) birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonu ve daha sonra akıcı bir tek katmana yetiştirilmesi, (B) SB100X transpozaz ve PEDF transpozon plazmid DNA'sının saflaştırılması, SB100X transpozaz / PEDF'nin hazırlanması dahil olmak üzere elektroporasyon işleminin tek adımlarının kronolojik seyrini açıklamaktadır. transpozon plazmid karışımı, kılcal transfeksiyon sisteminin kurulması, ekili birincil insan RPE hücrelerinin hazırlanması, elektroporasyon, tohumlama ve transfekte RPE hücrelerinin yetiştirilmesi ve ayrıca (C) hücre kültürü süpernatantlarının ve transfekte hücre örneklerinin hazırlanmasını içeren transfekte birincil insan RPE hücrelerinin analizleri, PEDF sekresyonunun değerlendirilmesi ve nicelleştirilmesi ve PEDF gen ekspresyonunun analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Farklı donör gözlerden izole edilen RPE hücrelerinin faz kontrast mikrografları. Donör yaşı, ölüm sonrası izolasyon süresi ve elektroporasyon uygulamasından önceki yetiştirme süresi (sol panel) bakımından farklılık gösteren primer insan RPE hücrelerinin kültürleri ve ayrıca kılcal transfeksiyon sistemi (sağ panel) kullanılarak 1.100 V (nabız voltajı), 20 ms (nabız genişliği) ve 2 darbe (darbe sayısı) elektrik parametrelerine maruz kalan transfekte birincil insan RPE hücrelerinin kültürleri ), parke taşı benzeri bir desende (ölçek çubukları: 500 μm) pigmentli hücrelerin birleştirilmiş entegre bir tek katmanını sergiledi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Primer insan RPE hücrelerinin SB100X aracılı transfeksiyonundan sonra PEDF sekresyonu ve PEDF gen ekspresyonu. (A-C) Kılcal transfeksiyon sistemi kullanılarak 29.4 ng (0.0094 pmol) SB100X transpozaz plazmidi artı 470.6 ng (0.098 pmol) PEDF transpozon plazmidinin bir karışımı ile transfekte edilen ekili primer insan RPE hücrelerinde PEDF sekresyon stabilitesinin immünoblot bazlı analizleri. (A) 26 yaşındaki bir donörden elde edilen RPE hücreleri (kadın, ölüm sonrası izolasyon süresi: 26 saat, elektroporasyondan önceki yetiştirme süresi: 14 gün) transfekte edildi ve 500 günden fazla kültürde tutuldu. Onun etiketli rekombinant PEDF (~ 48 kDa), farklı zaman noktalarında hücre kültürü ortamından saflaştırıldı ve anti-Penta-His antikorları kullanılarak batı lekelenmesi ile değerlendirildi. (B) Etiketlenmemiş rekombinant PEDF için, 53 yaşındaki bir donörden elde edilen RPE hücreleri (kadın, ölüm sonrası izolasyon süresi: 28 saat, transfeksiyondan önceki yetiştirme süresi: 19 gün), plazmid DNA'sı olmadan (kontrol kültürleri #1 ve #2) veya plazmid DNA'sı (PEDF-transfekte hücre kültürleri #3 ila #7) ilavesiyle elektroporate edildi ve 21 gün boyunca kültürde tutuldu. Hücre kültürü süpernatanları saflaştırılmadı, ancak anti-PEDF antikorları kullanılarak immünoblotlama ile doğrudan analiz edildi. Hücre lizatlarının batı leke analizi, kontrollerde (kültürler # 1 ve # 2) ve transfekte hücrelerde (kültürler # 3 ve # 4) hücre içi PEDF seviyesini göstermiştir. Benzer protein miktarlarının yüklenmesi, GAPDH protein bantlarının eşit yoğunluğu (~ 36 kDa) ile gösterilmiştir. (C) Uzun süreli PEDF sekresyonunun analizi için, 63 yaşındaki bir donörden (erkek, ölüm sonrası izolasyon süresi: 26 saat, transfeksiyondan önceki ekim süresi: 15 gün) RPE hücreleri, plazmid DNA'sı (kontrol kültürleri #1 ve #2) veya plazmid DNA'sı (PEDF-transfekte hücre kültürü #3) olmadan elektroporate edildi ve en az 165 gün boyunca kültürde tutuldu. Hücre kültürü ortamı saflaştırılmadı, ancak anti-PEDF antikorları kullanılarak immünoblotlama ile doğrudan analiz edildi. (D) Transfekte primer insan RPE hücrelerinde (iki örnek) ve transfekte olmayan kontrol hücrelerinde (dört örnek) toplam PEDF sekresyonunun ELISA tabanlı nicelleştirilmesi. Transfekte hücrelerin sekresyonu, transfekte olmayan hücrelerin salgılanması ile karşılaştırıldı (* p = 0.0264, Welch'in düzeltmesi ile eşleştirilmemiş t testi). (E) Transfekte primer insan RPE hücrelerinde endojen ve total (endojen artı rekombinant) PEDF gen ekspresyonu, ekspresyonu 1 (kesikli çizgi) olarak ayarlanan transfekte olmayan kontrol hücrelerindeki ekspresyon ile ilişkiliydi. Veriler bir kutu ve bıyık grafiği olarak sunulur (bıyıklar: min to max). Toplam PEDF gen ekspresyonu, endojen PEDF gen ekspresyonu ile karşılaştırıldı (anlamlı değil, Welch'in düzeltmesi ile eşleşmemiş t testi). Etiketlenmemiş rekombinant PEDF (B-E) için sonuçlar, Thumann ve ark. 201738 tarafından tanımlanan 29.4 ng (0.0094 pmol) artı 470.6 ng (0.098 pmol) SB100X-PEDF transpozon oranı ile transfekte edilen 27 donöre kadar birincil RPE hücrelerinin tüm veri setinin iki birimini temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Projemizde, transfekte edilen hücrelerin koruyucu bir ortamın kurulması ve sürdürülmesi için uzun süreli terapötik olarak kullanılması amacıyla sürekli olarak aşırı eksprese edilen ve etkili bir faktör salgılayan genetiği değiştirilmiş primer RPE hücrelerinin viral olmayan üretimini hedefliyoruz. Anti-anjiyojenik ve nöroprotektif fonksiyonlara sahip, her yerde eksprese edilen çok fonksiyonlu bir protein olan PEDF'yi kodlayan genin tanıtımını yaptık. Burada açıklanan protokol, SB100X transpozon sistemini kullanarak birincil insan RPE hücrelerini kararlı ve tekrarlanabilir bir şekilde transfekte etmek için kullanılabilir. DNA iletimi ve RPE hücrelerine sokulması, küvet yerine elektroporasyon odası olarak spesifik uçlar kullanan pipet bazlı kılcal transfeksiyon sistemi ile gerçekleştirilir.

Daha sonraki transfeksiyonlar için kullanılacak morfolojik olarak iyi diferansiye hücrelerden oluşan primer RPE kültürlerinin zenginleşmesi, insan donörü (yaş ve genel sağlık durumu) ve gözlerin alınması (hücre izolasyonunun ölüm sonrası zamanı) ile ilgili çeşitli faktörlerden etkilenir. Taze izole edilmiş ve tohumlanmış birincil RPE hücrelerinin, altıgen şekilli hücrelerden oluşan tek katmanlı bir tabaka geliştirmesi için en az 2 haftaya ihtiyacı vardır. Genel bir kural olarak, transfeksiyondan önce birleşmeye ulaşmak için daha fazla zamana ihtiyaç duyan hücre kültürleri de transfeksiyondan sonra yavaşlamış bir yapışma ve yayılma göstermiştir. Hücre yapışması ve yayılması, hücre izolasyonu veya transfeksiyon işlemi sırasında hasar gören RPE hücrelerinden serbest pigment birikmesi ile de engellenir.

SB transpozon sistemi, terapötik olarak ilgili nükleotid dizilerinin daha sonra gen tabanlı hücre terapilerinde uygulanacak çeşitli hücre tiplerine verimli ve güvenli bir şekilde verilmesini sağlayan yaygın olarak kullanılan bir genetik araçtır. Özellikle, geliştirilmiş varyantı SB100X, viral vektörlerin ve viral olmayan plazmid DNA'sının avantajlarını birleştirir. Bütünleştirici etki tarzı, ekspresyon kasetinin konakçı hücrenin genomuna kararlı bir genomik entegrasyonunu sağlar ve genin veya ilgilenilen dizinin sürekli bir ekspresyonunu sağlar. Tercihen potansiyel mutagenez ve onkogenez27,28 riski yüksek olan aktif transkripsiyon birimlerine entegre olan retroviral vektörlerin aksine, SB tabanlı entegrasyon profili rastgeledir. Bu, insan hücreleri 49,50,51,52'nin yanı sıra birincil sıçan ve insan RPE hücreleri 38,46 dahil olmak üzere çeşitli kültürlenmiş ve birincil memeli hücreleri kullanılarak yapılan çok sayıda çalışmada gösterilmiştir. Ayrıca, SB transpozon sisteminin plazmid DNA'sı olarak uygulanması, immünojenisitenin azalmasını sağlar ve üretim sürecini kolaylaştırır.

SB100X transpozaz ve PEDF transgeninin genetik bilgisinin ayrı plazmidler üzerinde verilmesi, optimal SB100X-PEDF transpozon oranının hassas bir şekilde ayarlanmasına izin verdiği için önemli bir husustur. Daha önce açıklandığı gibi, SB transpozon sistemi, transpoze aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlanan aşırı transpozaz ekspresyonuna duyarlıdır53. Bu etkiyi ARPE-19 hücreleri, birincil insan RPE kültürü54'ün seçici tripsinizasyonu ile saflaştırılan kendiliğinden evrimleşmiş bir hücre hattı ve birincil RPE hücreleri için de gözlemledik. Burada, 55.6 ng (0.018 pmol) SB100X transpozaz artı 444.4 ng (0.093 pmol) PEDF transpozonuna kadar SB100X-PEDF transpozon oranları ile transfeksiyon, açıkça azalmış PEDF sekresyon oranları37 ile sonuçlanmıştır. Yeni inşa edilen her transpozon plazmidi için ideal transpozaz-transpozon oranı belirlenmelidir.

Viral olmayan plazmid bazlı vektörler lipo-/polipleksler, nanopartiküller, lazer, ultrason veya elektroporasyon yoluyla aktarılabilir. Primer PE hücrelerinin lipofeksiyon bazlı transfeksiyonunun etkili olmadığını ve bu nedenle elektroporasyona dayalı gen transferine geçtiğini zaten gösterdik36. Elektroporasyon, hücrelere kısa süreli bir elektrik alanının uygulanması olarak tanımlanır, bu da membranın geçirgenliğinin artmasına ve plazmid DNA'sının hücreye girebileceği sulu gözeneklerin oluşumuna neden olur. Genel olarak, hücrelerin, plazmid DNA'sının ve iletken tamponun bir karışımı, elektrik darbelerini üreten elektroporasyon cihazına bağlı iki elektrot arasındaki belirli bir elektroporasyon odasına doldurulur. Bu sözde toplu elektroporasyon kurulumunda, geleneksel bir küvet elektroporasyon odası, hücre tipine ve elektroporasyon reaksiyonu başına kullanılan hücre sayısına bağlı olarak mesafesi değişken (0.1-0.4 mm) olan iki paralel plaka tipi elektrot ile karakterize edilir. İyi transfeksiyon verimliliklerine rağmen, farklı yan etkiler transfekte hücrelerin hayatta kalmasını olumsuz yönde etkileyebilir, örneğin pH değişiklikleri, ısı gelişimi, kabarcık üretimi ve türbülanslı akış. Kılcal transfeksiyon sistemi, en azından en aza indirilmiş yüzey alanına ve aralarında42 maksimum boşluk boyutuna sahip elektrotlara sahip olarak ve ayrıca spesifik resüsitasyon ve elektrolitik tamponlar kullanarak küvet bazlı yan etkileri hafifletir; ancak, kompozisyonları açıklanmaz.

Hücre sağkalımının artmasına yol açan toplu elektroporasyon kurulumundaki gelişmelere rağmen, hücrelerin belirli bir yüzdesinde geri dönüşü olmayan hasar kaçınılmazdır. Ayrıca, hücrelere entegre edilen plazmid miktarının kesin bir kontrolü mümkün değildir. Minyatür elektroporasyon sistemlerinin daha yeni gelişimi, toplu elektroporasyonla ilişkili sınırlamaları daha da azaltarak ek iyileştirmelere izin vermiştir. Bu yeni cihazlar mikroelektrotlara, mikroakışkanlara veya nanoyapılara dayanmaktadır. Gen terapisi, rejeneratif tıp ve in situ hücre içi araştırma alanlarında yeni uygulama perspektifleri sunarlar (Chang ve ark. ve Shi ve ark. tarafından gözden geçirilmiştir). 55,56.

Başlangıçta küvet bazlı bir sistem kullanılarak gerçekleştirilen ve daha sonra pipet bazlı kılcal sistem kullanılarak kurulan elektroporasyonun, hem pigment epitel hücre hattı ARPE-19'u hem de primer PE hücrelerini transfekte etmek için uygun ve etkili bir yöntem olduğunu gösterdik 36,37,38,57,58 . Kullanılan hücre tipine bağlı olarak, hem iyi transfeksiyon verimliliğine hem de hücre sağkalımına izin veren parametreleri uygulayan uygun elektroporasyon protokollerinin tanımlanması önemlidir. Yetersiz elektrik alanları hücrelerin zarar görmesini önler, ancak düşük transfeksiyon verimliliğine neden olur. Elektrik alan mukavemetindeki artışla birlikte, gelişmiş transfeksiyon verimlilikleri elde edilir. Bununla birlikte, yüksek elektrik parametreleri, geri dönüşümsüz hücre hasarı nedeniyle ölü hücrelerin daha yüksek yüzdelerine de yol açar. ARPE-19 hücre hattı için, kılcal transfeksiyon sistemi kullanılarak, 1.350 V, 20 ms ve 2 darbelik elektroporasyon parametrelerinin %100 başlangıç transfeksiyon verimliliğine neden olduğu gösterilmiştir37. Bu parametrelerin birincil RPE hücrelerinin transfeksiyonu için uygulanması, aynı zamanda 1.100 V, 20 ms ve 2 darbelik elektroporasyon parametrelerine kıyasla transfeksiyondan sonra daha az sayıda ekili hücrede de iyi verimliliklerle sonuçlandı (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, hücre hasarını önlemek ve daha az transfekte hücreleri kabul etmek için daha hafif elektroporasyon parametrelerinin seçilmesine karar verildi.

Bu yaklaşımın genel amacı, neovasküler AMD'den muzdarip hastaların tedavisinde PEDF-transfekte hücrelerin klinik uygulamasıdır. Tedavi, PEDF transgeninin SB100X transpozon sistemine dayanan otolog pigment epitel hücrelerine ex vivo olarak stabil bir şekilde sokulmasını ve ardından transfekte edilen hücrelerin hastanın subretinal boşluğuna transplantasyonunu içerir. Bu nedenle, PEDF-transfekte hücrelerin transdiferansiyel olmadığından ve fibroblastik bir şekil ve büyüme davranışı kazanmadığından emin olmak önemlidir. Transfekte edilen hücrelerin PEDF'nin sürekli ve tutarlı bir şekilde salgılanmasına izin verdiğini kanıtlamak da önemlidir. Ayrıca, belirli bir süre boyunca belirli sayıda hücre tarafından salgılanan kesin PEDF miktarını bilmek çok önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Zoltán Ivics ve Zsuzsanna Izsvák, SB transpozon teknolojisi üzerine çeşitli patentlerin mucitleridir.

Acknowledgments

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin araştırma, teknolojik geliştirme ve gösterim için Yedinci Çerçeve Programı, 305134 no'lu hibe anlaşması ile desteklenmiştir. Zsuzsanna Izsvák, Avrupa Araştırma Konseyi, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742) tarafından finanse edildi. Yazarlar, mükemmel teknik destek için Anna Dobias ve Antje Schiefer'e (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) ve insan donör gözlerini sağladıkları için Aachen Cornea Bank'a (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Colibri Forceps Geuder, Heidelberg, Germany G-18950
Curved Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18856
Disposable Scalpel (No. 11) Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor  Geuder, Heidelberg, Germany G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Glass Pasteur Pipettes Brand, Wertheim, Germany 747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress  Fink-Walter, Merchweiler, Germany 321063
Sterile Gloves Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) Corning, Corning, NY 351007
Sterile Surgical Gown Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 150628
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Inverted Microscope Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ Biochrom, Berlin, Germany L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Cytiva, Marlborough, MA 10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) BioProducts, Middletown, MD AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) Qiagen, Hilden, Germany 34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) 
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) Agilent Dako, Santa Clara, CA P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) Abcam, Cambridge, United Kingdom ab6721
Human PEDF ELISA Kit  BioProducts, Middletown, MD PED613
LAS-3000 Imaging System Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche Life Science, Penzberg, Germany 12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl) Roche Life Science, Penzberg, Germany 4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658004
Ni-NTA Superflow Qiagen, Hilden, Germany 30410
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1645050
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 51304
Reverse Transcription System  Promega, Madison, WI A3500
RNase-Free DNase Set Qiagen, Hilden, Germany 79254
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104
Rocking Shaker Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1704150
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Tags

Tıp Sayı 168 yaşa bağlı makula dejenerasyonu AMD kılcal elektroporasyon sistemi viral olmayan transfeksiyon pigment epitel kaynaklı faktör PEDF primer pigment epitel hücreleri Uyuyan Güzel transpozon sistemi SB
Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnen, S., Harmening, N., Marie,… More

Johnen, S., Harmening, N., Marie, C., Scherman, D., Izsvák, Z., Ivics, Z., Walter, P., Thumann, G. Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System. J. Vis. Exp. (168), e61987, doi:10.3791/61987 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter