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Genetics

न्यूरोमस्कुलर विकारों के लिए चिकित्सा की जांच करने के लिए मायोब्लास्ट में मानव फाइब्रोब्लास्ट का प्रत्यक्ष पुनर्प्रोग्रामिंग

Published: April 3, 2021 doi: 10.3791/61991
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2,3,4,6, 5, 1,6, 1,6
1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

Summary

यह प्रोटोकॉल मायोब्लास्ट में त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के रूपांतरण और मायोट्यूब में उनके भेदभाव का वर्णन करता है। सेल लाइनें न्यूरोमस्कुलर विकारों वाले रोगियों से प्राप्त होती हैं और इसका उपयोग रोग तंत्र की जांच करने और चिकित्सीय रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

मस्कुलर डिस्ट्रोफीज में रोगविज्ञान और चिकित्सीय लक्ष्यों दोनों की जांच मानव मायोब्लास्ट की सीमित प्रसार क्षमता से बाधित हुई है । कई माउस मॉडल बनाए गए हैं लेकिन वे या तो वास्तव में बीमारी के मानव फिजियोपैथोलॉजी का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं या मनुष्यों में पाए जाने वाले उत्परिवर्तनों के व्यापक स्पेक्ट्रम के प्रतिनिधि नहीं हैं। मानव प्राथमिक मायोब्लास्ट का अमरीकरण इस सीमा का एक विकल्प है; हालांकि, यह अभी भी मांसपेशियों की बायोप्सी पर निर्भर है, जो आक्रामक हैं और आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। इसके विपरीत, त्वचा बायोप्सी प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं और रोगियों के लिए कम आक्रामक. त्वचा बायोप्सी से प्राप्त फाइब्रोब्लास्ट को अमर और मायोब्लास्ट में स्थानांतरित किया जा सकता है, जो उत्कृष्ट मायोजेनिक क्षमता वाली कोशिकाओं का स्रोत प्रदान करता है। यहां, हम एक मायोजेनिक वंश में फाइब्रोब्लास्ट की एक तेज और प्रत्यक्ष पुनर्प्रोग्रामिंग विधि का वर्णन करते हैं। फाइब्रोब्लास्ट को दो लेंटीवायरस के साथ स्थानांतरित किया जाता है: प्राथमिक संस्कृति और टीईटी-अकक्षीय MYODको अमर करने के लिए एचटीईआरटी, जो डॉक्सीसाइक्लिन के अलावा, फाइब्रोब्लास्ट के रूपांतरण को मायोब्लास्ट में लाती है और फिर मायोट्यूब्स को परिपक्व करती है, जो देर से भेदभाव मार्कर व्यक्त करती है। यह त्वरित अंतरप्रदर्शन प्रोटोकॉल पैथोलॉजिकल तंत्र की जांच करने और न्यूरोमस्कुलर विकारों के लिए अभिनव जीन-आधारित या औषधीय बायोथेरेपी की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

मानव ऊतकों से सीधे प्राप्त सेलुलर मॉडल कई मानव आनुवंशिक विकारों को मॉडल करने के लिए उपयोगी होते हैं, मूल जीनोमिक संदर्भ होने के लाभ के साथ और, कई मामलों में, रोगियों में मनाए गए एक ही आणविक और सेलुलर हॉलमार्क को पुन: उत्पन्न करते हैं। न्यूरोमस्कुलर विकारों के क्षेत्र में, मांसपेशियों की बायोप्सी मानव मायोब्लास्ट का एक बड़ा स्रोत रही है और रोग तंत्र की स्पष्टता में मदद की है। इसके अतिरिक्त, वे दवाओं और जीन चिकित्सा के वीवो परीक्षण में के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं । एक तरफ, मांसपेशियों के टुकड़ों से मायोब्लास्ट का व्युत्पन्न अपेक्षाकृत आसान है। दूसरी ओर, प्राथमिक मायोब्लास्ट की संस्कृति और रखरखाव चुनौतीपूर्ण हैं, क्योंकि उनकी सीमित प्रसार दर और विट्रो1में प्रतिकृति सेनेसेंस है। इन सीमाओं के लिए एक विकल्प यह है कि कंकाल की मांसपेशीविशेषताओंके संरक्षण के साथ मानव टेलोमेरेज(एचटीआरटी)और/या साइक्लिन-डिपेंडेंट किनेज़ 4 (सीडीके4)जीन2,3के सम्मिलन के साथ मायोब्लास्ट को अमर किया जाए । फिर भी, प्राथमिक मायोब्लास्ट का अपमान अभी भी मांसपेशियों की बायोप्सी पर निर्भर है, रोगियों को नुकसान के साथ एक शल्य प्रक्रिया, जो कई मामलों में, उन्नत पतन में उनकी मांसपेशियों की है। इस प्रकार, इन रोगियों की मांसपेशी फाइब्रोटिक और/या एडीपोज ऊतक के एक महत्वपूर्ण अनुपात से बना है और कम मांसपेशियों की कोशिकाओं की पैदावार, अमरीकरण के लिए पहले कोशिकाओं की शुद्धि की आवश्यकता होती है ।

मांसपेशियों की बायोप्सी के विपरीत, त्वचा बायोप्सी अधिक सुलभ होती है और रोगियों के लिए कम हानिकारक होती है। प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट विट्रो मेंत्वचा के टुकड़ों से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि फाइब्रोब्लास्ट मुख्य रूप से न्यूरोमस्कुलर विकारों के कारण म्यूटेशन से प्रभावित नहीं होते हैं, उन्हें मायोब्लास्ट में स्थानांतरित किया जा सकता है। यह मायोड जीन, एक मायोजेनिक नियामक प्रतिलेखन कारक5के सम्मिलन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इस पांडुलिपि में, हम फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की स्थापना से लेकर विभेदित मायोट्यूब (विधि का एक प्रतिनिधि सारांश चित्र 1 में चित्रित किया गया है) की स्थापना से ट्रांसफेडेड मायोब्लास्ट प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

चिकित्सीय रणनीतियों का पूर्व-नैदानिक परीक्षण मानव रोगियों में पाए जाने वाले उत्परिवर्तनों के समान उत्परिवर्तनों को ले जाने वाले सेलुलर और पशु मॉडलों पर निर्भर करता है। हालांकि पशु मॉडलों का विकास CRISPR/Cas96जैसी जीन-संपादन प्रौद्योगिकियों के अग्रिम के साथ अधिक व्यवहार्य हो गया है, यह अभी भी चुनौतीपूर्ण और महंगा है । इस प्रकार, रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइनें मॉडल रखने के लिए एक सुलभ विकल्प हैं, जो डफेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) जैसे रोग के उत्परिवर्तनों के बड़े स्पेक्ट्रम को कवर करती हैं। इस तरह की विकृतियों के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा के विकास के लिए सेल मॉडल का अस्पष्टीकरण और निर्माण महत्वपूर्ण हैं।

जिन व्यक्तिगत उपचारों की जांच की गई है, उनमें से एक लंघन रणनीतियां विभिन्न मस्कुलर डिस्ट्रोफीज7,8के लिए आशाजनक लोगों में से एक हैं। इस रणनीति में एक छोटा लेकिन कार्यात्मक प्रोटीन का उत्पादन होता है। यह स्प्लिसेकोसोम के लिए एक्सोन परिभाषा को छुपाकर किया जाता है, इसलिए अंतिम दूत से उत्परिवर्तित एक्सोन को छोड़कर। यह एक बहुत ही आशाजनक तकनीक है जिसे एफडीए द्वारा डीएमडी के लिए अनुमोदित किया गया है। इस प्रकार, हम इस प्रोटोकॉल में भी वर्णन करते हैं, दो अलग-अलग एक्सोन लंघन संबंधित प्रौद्योगिकियों के साथ मायोब्लास्ट को स्थानांतरित करने के तरीके: एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एओएन) और यू7स्नर्न्ना-एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी)। एऑन ट्रांसफैक्शन9को बढ़ावा देने के लिए डिज़ाइन किए गए कई दृश्यों की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए एक अच्छा उपकरण है। हालांकि, एओएन की गतिविधि क्षणिक है। एंटीसेंस दृश्यों की निरंतर अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, हमने एएवी के साथ संयुक्त छोटे परमाणु आरएनए (snRNAs) का भी पता लगाया, जिससे परमाणु स्थानीयकरण और स्प्लिसिंग मशीनरी10में शामिल किया गया । U7 एक snrna है जो हिस्टोन एमआरएनए के प्रसंस्करण में शामिल है जिसे प्रोटीन को बांधने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है जो इसे स्प्लिकोसोम में रीडायरेक्ट करेगा और एंटीसेंस सीक्वेंस11वितरित करेगा। एएवी वैक्टर के संयोजन में संशोधित U7 snRNAs का उपयोग एओएन की सीमाओं को पार करता है जिसके परिणामस्वरूप एओएन की निरंतर अभिव्यक्ति होती है और ब्याज के ऊतकों का बेहतर लेनदेन होता है12. हम इस प्रोटोकॉल के लिए DMD रोगियों से प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए exon-लंघन रणनीति वर्णन ।

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Protocol

सभी प्रयोगों और बायोप्सी राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुमोदन के तहत शामिल संस्थानों के नैतिक नियमों का पालन किया गया ।

1. डर्मल फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की दीक्षा

  1. फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की स्थापना
    1. 15 एमएल शंकु नलियों में फाइब्रोब्लास्ट माध्यम(टेबल 1)का 10 एमएल अलीकोट। इस माध्यम में त्वचा बायोप्सी रखी जानी चाहिए और ले जाया जाना चाहिए। बायोप्सी को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि इसे संसाधित नहीं किया जाता है, अधिमानतः उसी दिन।
      नोट: संदूषण के संभावित विकास से बचने के लिए 24-36 घंटे के भीतर त्वचा बायोप्सी का उपयोग करें।
    2. ट्यूब से मीडिया को एस्पिरेट करें और बायोप्सी को 10 एमएल 1X पीबीएस (कमरे के तापमान) के साथ तीन बार कुल्ला करें। तीसरे वॉश के बाद पीबीएस को ट्यूब में छोड़ दें।
    3. पीबीएस और त्वचा को 10 सेमी2 डिश पर डालें।
    4. बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, बायोप्सी को यथासंभव छोटे टुकड़ों में काट लें।
    5. एक पिपेट का उपयोग करके, एक व्यक्तिगत त्वचा के टुकड़े को स्थानांतरित करें और इसे एक साफ 10 सेमी2 डिश में छोड़ दें। प्रति डिश 10 से 12 टुकड़े रखें।
    6. प्रत्येक टुकड़े के चारों ओर से पीबीएस की अधिकता को एस्पिरेट करें। टुकड़े को आकांक्षी न करने के लिए सावधान रहें।
    7. बर्तन को आंशिक रूप से ढक्कन के साथ कवर करें और त्वचा के टुकड़ों को 5-20 मिनट तक सूखने दें। टुकड़ों को जरूरत से ज्यादा सूखने न दें।
    8. एक बार जब टुकड़े सूख जाते हैं, तो पकवान को 45 डिग्री पर झुकाएं और धीरे-धीरे कोने में फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 12 एमएल जोड़ें। पकवान नीचे कम, ध्यान से मीडिया का वितरण तो टुकड़े मीडिया द्वारा उठा नहीं है ।
    9. व्यंजनों को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें। 5-7 दिनों में मीडिया को बदलें, और सप्ताह में एक बार बाद।
    10. टुकड़ा(चित्रा 2)से उभरते फाइब्रोब्लास्ट का निरीक्षण करें और, एक बार ढुलमुल, कोशिकाओं को 75 सेमी2 फ्लास्क में पारित करें। माध्यम निकालें, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला और 1 मिलील 0.25% ट्राइप्सिन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या जब तक सभी कोशिकाओं को उठा लिया जाता है। ट्राइप्सिन को बाधित करने और कोशिकाओं को एक नए फ्लास्क में स्थानांतरित करने के लिए 10 एमएल फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ मीडियम जोड़ें।
      नोट: पैसेज नंबर नामकरण के लिए, P1 की स्थापना तब की जाती है जब त्वचा बायोप्सी से उभरे पहले फाइब्रोब्लास्ट को प्रसार के लिए एक नए फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया जाता है।
  2. प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट लाइनों का क्रायोप्रिजर्वेशन
    1. एक बार 75 सेमी2 फ्लास्क को मिलाकर, इसे 10 एमएल 1X पीबीएस और एस्पिरेट पीबीएस के साथ कुल्ला करें।
    2. कोशिका की सतह में 0.25% ट्राइप्सिन का 3 एमएल जोड़ें। फ्लास्क को इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए रखें। माइक्रोस्कोप के नीचे फ्लास्क की जांच करें ताकि यह देखा जा सके कि कोशिकाओं को उठाया गया है या नहीं। यदि नहीं, तो फ्लास्क को अतिरिक्त 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    3. एक बार कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, फ्लास्क और पिपेट ऊपर और नीचे के लिए फाइब्रोब्लास्ट मीडिया के 7 एमएल जोड़ने के लिए कोशिकाओं को फिर से खर्च । कोशिकाओं को 50 एमएल शंकु नली में ले लीजिए।
    4. ट्राइपैन ब्लू का 100 माइक्रोन एलिकोट तैयार करें, और ट्राइपैन ब्लू के साथ मिलाएं, क्रायोप्रेयरेवित होने वाले नमूने से 100 माइक्रोन निकालें। गिनती करने के लिए हीमोसाइटोमीटर पर मिश्रण लोड करें। माइक्रोस्कोप के नीचे हीमोसाइटोमीटर के चार अलग-अलग क्षेत्रों में कोशिकाओं की गणना करें। कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करने के लिए, सूत्र का उपयोग करें: (गिना कोशिकाओं/100) * संस्कृति की मात्रा ।
    5. कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर शंकु ट्यूबों स्पिन।
    6. माध्यम से ऊपर रखें और कोशिकाओं को ठंड माध्यम की पर्याप्त मात्रा में फिर से खर्च करें: प्रत्येक 1 मिलियन कोशिकाओं/शीशी के अनुसार 1 एमएल। प्रत्येक लेबल क्रायोवियल को 1 एमएल को समरूप और वितरित करने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे।
    7. शीशियों को फ्रीजिंग बॉक्स में रखें, और शीशियों को रात भर-80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से फ्रीज करने की अनुमति दें ।
    8. अगले दिन शीशियों को तरल नाइट्रोजन टैंक या -150 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।

2. फाइब्रोमायोब्लास्ट्स (एफएम) सेल लाइन की स्थापना

  1. बीज प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट एक 12 अच्छी तरह से थाली (2 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) के दो कुओं में लगभग 30% की लहर पर है ताकि अगले दिन के बारे में ५०% संकुचन है ।
  2. लेंटीवायरल ट्रांसडक्शन के लिए, फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 400 माइक्रोन में एचटीईआरटी-प्यूरोमाइसिन लेंटीवायरस के 2 से 5 x 109 वीजी (वायरल जीनोम कण) जोड़ें। दूसरी अच्छी तरह से, फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के सिर्फ 400 माइक्रोल जोड़ें। अगले दिन मीडिया के 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: लेंटीवायरस उत्पादन के लिए प्लाज्मिड समूह से प्राप्त किए गए थे जिसने चाउच एट अल,2009 पेपर प्रकाशित किया था। उन्हें 200713 में एचटीईआरटी प्लाज्मिड और बार्डे एट अल,200614 में माईओडी प्लाज्मिड के डिजाइन के लिए उपयोग की जाने वाली टीईटी-ऑन प्रणाली के लिए व्यक्तिगत रूप से वर्णित किया गया है। वे Genethon, फ्रांस के साथ एक सामग्री हस्तांतरण समझौते के लिए धन्यवाद प्राप्त किया गया (कृपया इन प्लाज्मिड्स प्राप्त करने के लिए डॉ विंसेंट मौली से संपर्क करें-vincent.mouly@upmc.fr)। संक्षेप में, एचटीईआरटी में सीएमवी प्रमोटर द्वारा संचालित एचटीआरटी संस्करण 1 होता है जबकि प्यूरोमाइसिन पीजीके प्रमोटर द्वारा संचालित होता है। मायोडी प्लाज्मिड में एक मायओडी संस्करण 1 है जो दमनकारी rtTA2 के नियंत्रण में एक सीएमवी प्रमोटर द्वारा संचालित है। इस प्लाज्मिड में एसवी40 प्रमोटर के लिए धन्यवाद व्यक्त किए गए हाइग्रोमाइसिन चयन भी शामिल हैं।
    लेंटीवायरस का उत्पादन नियमित लेंटीवायरल उत्पादन (देखें वांग और मैकमैनस जोव प्रोटोकॉल15)का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप में, एमडीएल-हेल्पर, रेव-हेल्पर, एसवीएस-जी-हेल्पर को कैल्शियम क्लोराइड वर्षा के माध्यम से या तो एचआरटी या मायओडी प्लाज्मिड्स के माध्यम से भी संक्रमित किया गया था । 48 घंटे के बाद, सुपरनिटेंट एकत्र किया गया था, और फिर अतिरिक्त तीन दिनों के लिए। इसके बाद सभी सुपरनेट को अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन द्वारा केंद्रित किया गया था। इसके बाद गोली को ट्रिस-एचसीएल + एनएसीएल + ईडीटीए बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया । टाइटर अनुमान का मूल्यांकन मानक लेंटीवायरस क्यूपीसीआर परख द्वारा किया गया था।
  3. एक या दो दिन बाद, कोशिकाओं को 6-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें और 60-70% संगम तक पहुंचने तक उन्हें विकसित करें।
  4. फाइब्रोब्लास्ट माध्यम को 1 μg/mL प्यूरोमाइसिन के साथ पूरक करें और प्रत्येक कुएं में 2 एमएल जोड़ें।
  5. कोशिकाओं को चयन के तहत तब तक रखें जब तक कि नियंत्रण में सभी कोशिकाएं अच्छी तरह से मर न जाएं (12 दिन तक), हर 2-3 दिनों में मीडिया बदलें। आगे प्रसार के लिए दो 10 सेमी 2 व्यंजन में 6 अच्छीतरह से थाली से कोशिकाओं मार्ग ।
  6. चयन के बाद फाइब्रोब्लास्ट की शीशियों को फ्रीज करें। एफ (एचTer) के रूप में लेबल।
  7. बीज hTERT-व्यक्त फाइब्रोब्लास्ट (F (hTer)) फाइब्रोब्लास्ट माध्यम में लगभग 30% संगम पर, एक 12 अच्छी तरह की थाली के दो कुओं में, अगले दिन के बारे में ५०% संगम है ।
  8. लेंटीवायरस ट्रांसडक्शन के लिए, 2 से 5 x 109 वीजी मायोड-हाइग्रोमाइसिन्ब लेंटीवायरस को फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 400 माइक्रोल में मिलाएं और संबंधित कुओं में जोड़ें; तीसरे कुएं में 400 माइक्रोन फाइब्रोब्लास्ट माध्यम जोड़ें। अगले दिन मीडियम का 1 एमएल डालें।
  9. एक या दो दिन बाद कोशिकाओं को 6-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें और 60-70% संगम तक बढ़ते हैं।
  10. हाइग्रोमाइसिन बी (400 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ मीडियम को सप्लीमेंट करें और प्रत्येक कुएं में 2 एमएल जोड़ें।
  11. कोशिकाओं को चयन के तहत तब तक रखें जब तक कि नियंत्रण में सभी कोशिकाएं अच्छी तरह से मर न जाएं (12 दिन तक), हर 2-3 दिनों में मीडिया बदलें।
  12. चयन के बाद फाइब्रोब्लास्ट की शीशियों को फ्रीज करें। एफएम के रूप में लेबल सेल पहचान संख्या/नाम के बाद ।

3. ट्रांसफेशन प्रोटोकॉल

  1. बीज 30-40% संगम के साथ 10 सेमी2 व्यंजन पर एफएम ट्रांसड्यूडेड। एक 12 अच्छी तरह से थाली में, बीज 6 x 104 कोशिकाओं (यह व्यक्तिगत सेल लाइन पर निर्भर है) ।
    नोट: इम्यूनोदाता के लिए, ग्लास कवरलिप या मैट्रिगेल के साथ लेपित कक्ष स्लाइड पर बीज कोशिकाएं। डीएमईएम माध्यम में 1:10 पर पतला मैट्रिक्स, सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा जोड़ें, और स्लाइड को एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें। कोशिकाओं को बोने से पहले ही बंद कर देते हैं।
  2. मायोब्लास्ट इंडक्शन के लिए, जब फाइब्रोब्लास्ट 70% संगम(चित्रा 3 ए)तक पहुंच गया, तो पीबीएस के साथ सेल की सतह को खंगाल ते हैं और ताजा 8 माइक्रोग्राम/एमएल डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक ताजा मायोब्लास्ट मीडिया जोड़ते हैं।
    नोट: भेदभाव की सफलता पिछले ८०% संगम समझौता किया है ।
  3. दो से तीन दिनों के बाद, कोशिकाओं को 90-95% कंप्लेंट कर रहे है और उनके आकृति विज्ञान बदल गया होगा(चित्रा 3B)। पीबीएस के साथ सेल की सतह कुल्ला और ताजा 8 μg/mL doxycycline के साथ पूरक ताजा भेदभाव मीडिया जोड़ें ।
  4. जब तक मायोट्यूब्स स्थापित नहीं हो जाते (आकृति विज्ञान के माध्यम से पुष्टि)(चित्रा 3C)न हो जाएं, तब तक हर 2-3 दिन में मीडिया को बदलना जारी रखें।
  5. मायोट्यूब भेदभाव शुरू करने के सात से दस दिन बाद, कोशिकाओं को पूरी तरह से विभेदित किया जाना चाहिए और अलग या मरना शुरू हो सकता है। ऐसा होने से पहले, आगे के विश्लेषण के लिए मायोट्यूब की कटाई करें।
    नोट: मायोट्यूब गठन का समय पाठ्यक्रम सेल लाइन पर निर्भर करता है। मांसपेशियों से संबंधित प्रोटीन में उत्परिवर्तन मायोजेनिक क्षमता में हस्तक्षेप कर सकते हैं। जब मायोट्यूब उज्ज्वल दिखाई देने लगते हैं और सीमाओं पर सफेद दिखने लगते हैं तो यह एक संकेत है कि वे अलग होना शुरू कर रहे हैं(चित्र 4)।
  6. मायोट्यूब को फसल करने के लिए, मीडिया एकत्र करें और इसे 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। माध्यम में मायोट्यूब हो सकते हैं जो अलग हो गए हैं।
  7. 5 एमएल पीबीएस के साथ मायोट्यूब्स कुल्ला और 50 एमएल ट्यूब में पीबीएस ट्रांसफर करें।
  8. कोशिका की सतह में 0.25% ट्राइप्सिन का 3 एमएल जोड़ें। डिश को इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए रखें। माइक्रोस्कोप के नीचे पकवान की जांच करें कि कोशिकाओं को उठाया गया है या नहीं। यदि नहीं, तो इसे अतिरिक्त 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  9. एक बार कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, पकवान के लिए फाइब्रोब्लास्ट मीडिया के 7 एमएल जोड़ें और ऊपर और नीचे पिपेट कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए । 50 एमएल शंकु नली के लिए कोशिकाओं को ले लीजिए।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 1,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  11. ध्यान से गोली को परेशान किए बिना, तरल को बंद कर दें। आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों को स्टोर करें।

4. विभेदित मायोट्यूब का इम्यूनोस्टेटिंग

नोट: इम्यूनोदाता के लिए, ऊपर बताए गए ग्लास कवरस्लिप या चैंबर स्लाइड में कोशिकाओं को बढ़ाएं।

  1. एक बार मायोट्यूब पूरी तरह से अलग हो जाते हैं, मीडिया को बंद कर देते हैं और ध्यान से पीबीएस के साथ स्लाइड कुल्ला। पीबीएस को बंद करें।
  2. ताजा 4% पीएफए (12-अच्छी प्लेट के प्रति कुएं 500 माइक्रोन) जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। पीएफए को बंद कर दिया।
  3. 1 एमएल पीबीएस के साथ कुल्ला।
  4. कमरे के तापमान पर 0.2 एम ग्लाइसिन के साथ इनक्यूबेट, 10 मिनट के लिए। ग्लाइसिन को बंद कर दिया।
  5. पीबीएस 0.5% ट्राइटनएक्स-100 (300 माइक्रोन/वेल ऑफ ए 12-वेल प्लेट) के साथ 10 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ पर्मेबिलाइज करें।
  6. ३०० μL के साथ ब्लॉक/
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट 1:50 अवरुद्ध समाधान के 300 माइक्रोन में, कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए, कोमल मिलाते हुए के साथ।
  8. 5 मिनट के लिए पीबीएस के 1 एमएल/वेल के साथ तीन बार कुल्ला, कोमल मिलाते हुए के साथ ।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट 1:500 अवरुद्ध समाधान के 300 माइक्रोन में, 1 घंटे के लिए, कमरे के तापमान पर, कोमल मिलाते हुए के साथ। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली को कवर करें।
  10. 5 मिनट के लिए पीबीएस के 1 एमएल/वेल के साथ तीन बार कुल्ला, कोमल मिलाते हुए के साथ ।
  11. 10 मिनट के लिए पीबीएस में पतला DAPI के साथ इनक्यूबेट। पीबीएस के 1 एमएल/वेल के साथ तीन बार कुल्ला ।
  12. एक गिलास स्लाइड करने के लिए बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें। संदंश के साथ कवरलिप निकालें और इसे बढ़ते माध्यम की बूंद पर नीचे रखें।
  13. एक कागज तौलिया पर उलटा स्लाइड और धीरे बुलबुले और बढ़ते माध्यम की अधिकता को दूर करने के लिए प्रेस ।
  14. स्लाइड्स को नेल पॉलिश के साथ सील करें और इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्रांसफैक्शन

नोट: नीचे दिया गया प्रोटोकॉल 6-अच्छी प्लेट के ट्रांसफैक्शन के लिए है। छोटी या बड़ी प्लेटों के लिए तदनुसार वॉल्यूम समायोजित करें। जब कोशिकाएं भेदभाव चरण के लिए तैयार होती हैं तो ट्रांसफैक्शन 100% कॉन्फ्ल्यूरेंट मायोब्लास्ट में किया जाता है।

  1. मायोब्लास्ट ग्रोथ मीडिया को एस्पिरेट करें और 1 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
  2. ऑप्टिमईएम मीडिया का 500 माइक्रोल/वेल जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. ऑप्टिमईएम के 100 माइक्रोल में एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड (एऑन) को वांछित अंतिम एकाग्रता (यानी 50 एनएम, 100 एनएम, 200 एनएम, 500 एनएम) में पतला करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    नोट: यह प्रोटोकॉल 2'ओमेथिल-फॉस्फोरोथिओएट एओएन के लिए अनुकूलित है।
  4. 1:1 (μg डीएनए: μL लिपोफेक्टामाइन) का अंतिम अनुपात देने के लिए ऑप्टिमेम (100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा) के साथ लिपोफेक्टामाइन मिलाएं। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  5. पतला ओं के साथ पतला लिपोफेक्टामाइन मिलाएं। जटिल गठन की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट करके धीरे-धीरे मिलाएं। हवा के बुलबुले से बचें।
  6. संबंधित कुओं में लिपोफेक्टामाइन और एओन मिक्स के 200 माइक्रोल जोड़ें। कोशिकाओं को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
  7. अगले दिन ट्रांसफैक्शन मिश्रण को हटा दें और डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक गर्म भेदभाव मीडिया के 2 एमएल जोड़ें।
  8. प्रोटीन विश्लेषण के मामले में आरएनए निष्कर्षण या सात से 21 दिनों के लिए कम से कम तीन दिन बाद कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    नोट: आरएनए और/या प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए आवश्यक भेदभाव के दिन ब्याज या सेल लाइन के जीन के अनुसार भिन्न हो सकते हैं । डीएमडीके मामले में, तीन दिनों के भीतर अपने एमआरएनए का पता लगाना संभव है। डिस्ट्रोफिन प्रोटीन का पता लगाने के लिए कम से कम सात दिनों की आवश्यकता होती है। यह सेल लाइन के आधार पर अलग-अलग होगा। एऑन और ट्रांसफैक्शन रीएजेंट की उच्च सांद्रता ट्रांसफेक्शन को प्रभावित कर सकती है।

6. AAV1-U7 ट्रांसडक्शन

नोट: इस प्रोटोकॉल को 6-अच्छी प्लेटों के लिए अनुकूलित किया गया था। संस्कृति सतह क्षेत्र के आनुपातिक मात्रा को समायोजित करें। जब कोशिकाएं भेदभाव चरण के लिए तैयार होती हैं तो ट्रांसडक्शन 100% कॉन्फ्ल्यूरेंट मायोब्लास्ट में किया जाता है। AAV1 सुसंस्कृत मायोब्लास्ट की सबसे अच्छी ट्रांसडक्शन क्षमता के साथ एएवी सेरोटाइप है।

  1. मायोब्लास्ट ग्रोथ मीडियम को एस्पिरेट करें और 1 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें ।
  2. कमजोर 0.5-1 x 1011 AAV1-U7 के वायरल कणों गर्म भेदभाव मीडिया के 700 μL में doxycycline के साथ पूरक.
    नोट: हम वायरल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए qPCR का उपयोग करें। उपयोग किए जाने वाले वायरस की मात्रा मात्राकरण विधि के आधार पर भिन्न हो सकती है और इसे पहले रिपोर्टर परख का उपयोग करके निर्धारित किया जाना चाहिए।
  3. वायरल मिक्स को समरूप ढंग से गिराकर कुएं में डालें।
  4. अगले दिन, डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक गर्म भेदभाव मीडिया के 1.3 एमएल जोड़ें।
  5. आरएनए निष्कर्षण के लिए कम से कम तीन दिन बाद या प्रोटीन विश्लेषण के मामले में सात से 21 दिन कोशिकाओं को इकट्ठा करें।

7. आरएनए निष्कर्षण

नोट: इस चरण के दौरान उपयोग की जाने वाली सभी सामग्री RNase मुक्त होनी चाहिए।

  1. प्रति गोली TRIzol के 500 μL जोड़ें और ऊपर और नीचे कई बार पाइप अप और नीचे सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को समरूप रूप से lysed हैं।
  2. सेल को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटेड करें।
  3. क्लोरोफॉर्म के 100 माइक्रोन जोड़ें और 15 एस के लिए मैन्युअल रूप से हिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। जलीय चरण (ऊपरी एक) को इकट्ठा करें और इसे एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. जलीय चरण की 1 मात्रा के लिए, इथेनॉल 100% की 1 मात्रा जोड़ें और पिपटिंग द्वारा मिलाएं।
    नोट: हम कॉलम शुद्धि और एकाग्रता की सलाहते हैं।
  6. नमूना को एक संग्रह ट्यूब में एक ज़िमो-स्पिन आईसी कॉलम में स्थानांतरित करें और 30 एस के लिए 12,000 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  7. इन-कॉलम DNase I पाचन के लिए, 400 माइक्रोन आरएनए वॉश बफर के साथ कॉलम को प्री-वॉश करें। 30 एस के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  8. प्रति नमूना DNase प्रतिक्रिया मिश्रण के 40 μL तैयार करें। 35 माइक्रोन डीएनए पाचन बफर के साथ 5 μL DNase I मिलाएं।
  9. मिश्रण सीधे कॉलम मैट्रिक्स में जोड़ें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  10. कॉलम में 400 μL आरएनए प्रेप बफर जोड़ें और 30 एस के लिए 12,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  11. कॉलम में 700 माइक्रोन आरएनए वॉश बफर जोड़ें और 30 एस के लिए 12,000 एक्स जी पर सेंट्रलाइज करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  12. वॉश बफर को पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करने के लिए 2 मिनट के लिए कॉलम और 12,000 एक्स जी पर 400 μL आरएनए वॉश बफर जोड़ें। कॉलम को ध्यान से RNase-मुक्त 1.5mL ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  13. कॉलम मैट्रिक्स में सीधे 15 माइक्रोन न्यूक्लियेज-फ्री पानी जोड़ें। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट और 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: eluted आरएनए इकट्ठा करें और उपज बढ़ाने के लिए कॉलम में फिर से लागू करें। 1 मिनट के लिए 12,000 x g पर सेंट्रलाइज।
  14. बर्फ पर नमूने रखें और एक नैनोड्रॉप में नमूनों की मात्रा निर्धारित करें।
  15. -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।

8. आरटी-पीसीआर विश्लेषण

नोट: इस चरण में, हम डिस्ट्रोफिन एमआरएनए की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए अभिकर्षकों का एक सुझाव प्रस्तुत करते हैं, लेकिन इसे आसानी से पसंद के अन्य अभिकर्षकों के अनुकूल किया जा सकता है।

  1. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन
    1. सभी अभिकर्णों को पिघलाकर बर्फ पर रखें।
    2. 5x रिएक्शन बफर के 4 माइक्रोन, डीएनटीपी मिक्स (10 mM) के 2 माइक्रोन, रिबॉक आरनैस अवरोधक के 1 माइक्रोन और रेवर्टएड आरटी के 1 माइक्रोन के साथ मिश्रण तैयार करें।
    3. ट्यूब को धीरे-धीरे और अपकेंद्रित्र संक्षेप में मिलाएं।
    4. 0.2 मिलील पीसीआर ट्यूबों में, प्रति प्रतिक्रिया 1 माइक्रोग्राम रखने के लिए आरएनए की पर्याप्त मात्रा जोड़ें। नाभिक मुक्त पानी q.s.p 12 μL जोड़ें । रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट के बिना एक ट्यूब को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में और आरएनए के बजाय नाभिक मुक्त पानी के साथ एक ट्यूब शामिल करें ।
    5. प्रति ट्यूब प्रतिक्रिया मिश्रण के 8 माइक्रोन वितरित करें। इसकी कुल मात्रा 20 माइक्रोल है।
    6. एक थर्मोसाइकिलर में ट्यूब रखें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट और उसके बाद 42 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट। 70 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्म करके प्रतिक्रिया बंद करो।
    7. ट्यूबों को बर्फ पर या लंबे भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. पीसीआर
    नोट: एक्सॉन जंक्शनों पर डिजाइन प्राइमर अधिमानतः।
    1. भंवर अभिकर् स और उपयोग से पहले नीचे स्पिन।
    2. 0.5 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर (25 माइक्रोनएम), 0.5 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर (25 माइक्रोनएम), 12.5 माइक्रोन 2x पीसीआर मास्टर मिक्स, और 8.5 माइक्रोन का उपयोग करके एक मास्टर मिक्स तैयार करें।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए एक ट्यूब में मास्टर मिश्रण के 22 μL Aliquot।
    4. अपने संबंधित पीसीआर ट्यूब में सीडीएनए (150 एनजी) के 3 माइक्रोन जोड़ें। पीसीआर निगेटिव कंट्रोल ट्यूब में नाभिक मुक्त पानी के 3 माइक्रोन जोड़ें।
    5. भंवर और पीसीआर ट्यूब नीचे स्पिन।
    6. एक थर्मोसाइकिलर में 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, (टीएम-5) के लिए 30 एस के लिए डिग्री सेल्सियस, 72 डिग्री सेल्सियस के लिए (1 मिनट/केबी) 34 बार, 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इष्टतम एनीलिंग तापमान अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है। सुझाए गए मास्टर मिक्स के लिए प्राइमर पिघलने के तापमान से 5 डिग्री सेल्सियस घटाएं।
    7. एक एगर उठे जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया के 12 माइक्रोन लोड करें और नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

9. पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति का पता लगाना

नोट: यह प्रोटोकॉल डिस्ट्रोफिन, एक बड़ी झिल्ली प्रोटीन के लिए अनुकूलित है। विभिन्न प्रोटीन के लिए विशिष्ट शर्तों की आवश्यकता हो सकती है।

  1. प्रोटीन निष्कर्षण
    1. भेदभाव के 7-21 दिनों के बाद, 100 माइक्रोन 0.5 एम ईडीटीए, और 50 माइक्रोन प्रोटीज़ अवरोधकों के साथ पीबीएस के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें। कोशिकाओं को अलग करने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। स्नैप तरल नाइट्रोजन में ट्यूब सूई द्वारा गोली फ्रीज। गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या लाइसिस चरण में आगे बढ़ें।
    2. 1% डिजिऑनिन, 1% प्रोटीज अवरोधक, 10% फॉस्फेट अवरोधक, और बेस बफर को कुल मात्रा (60 माइक्रोल प्रति सेल गोली) में जोड़कर लाइसिस बफर तैयार करें।
    3. बर्फ पर, सेल पेलेट में लाइसिस बफर के 60 माइक्रोन जोड़ें। 5 एस के लिए Sonicate । 8 एस के लिए बर्फ पर बैठने दें। सोनीशन दोहराएं और दो बार आराम करें।
    4. 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट नमूने।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    6. सुपरनैंट को साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. निर्माता निर्देशों के बाद, बिसिनकोनिक एसिड (बीसीए) परख द्वारा नमूनों की मात्रा निर्धारित करें।
    8. लैमली बफर की उचित मात्रा के साथ प्रोटीन समाधान मिलाएं। 100 माइक्रोग्राम के एलिकोट्स बनाएं। यदि आवश्यक हो, तो वॉल्यूम को बेस लाइसिस बफर के साथ 25 माइक्रोन में समायोजित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
  2. पश्चिमी धब्बा
    1. बर्फ पर गल नमूने।
    2. नमूनों को 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर विकृत करें, फिर उन्हें बर्फ में ठंडा करें, नीचे स्पिन करें।
    3. 20X ट्रिस-एसीटेट एसडीएस 200 एमएल डीएच2ओ में बफर चल रहा है और 500 माइक्रोन एंटीऑक्सीडेंट जोड़ें।
    4. 3-8% ट्राइस-एसीटेट पॉलीएक्रीलामाइड जेल को कंघी को हटाकर तैयार करें और डीएच2ओ के साथ रिंसिंग करें इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण में जेल को इकट्ठा करें। चल रहे बफर के साथ भीतरी कक्ष भरें।
    5. जेल में प्रोटीन सीढ़ी के 5 माइक्रोन और 25 माइक्रोन सैंपल लोड करें। बाहरी कक्ष को चलने वाले बफर से भरें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 80 वी पर चलाएं। इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 120 वी पर।
    7. 20X मेथनॉल के 150 एमएल के साथ 1X ट्रांसफर बफर के 3 एल, 20X ट्रांसफर बफर के 150 एमएल और डीएच 2 ओ के2,700एमएल के साथ इसे 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    8. फिल्टर पेपर के 4 टुकड़े और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली का एक टुकड़ा काटें। ट्रांसफर बफर के साथ एक ट्रे में पेपर फिल्टर और झिल्ली को भिगो दें।
    9. धीरे-धीरे मामले से जेल को हटा दें और इसे फिल्टर पेपर, झिल्ली और स्पंज के साथ स्थानांतरण उपकरण में इकट्ठा करें। जेल नकारात्मक पक्ष और सकारात्मक पक्ष पर झिल्ली पर रखा गया है।
    10. 300 एमए पर स्थानांतरण चलाएं, सरगर्मी, 4 डिग्री सेल्सियस पर, रात भर।
    11. कमरे के तापमान पर, कोमल आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए बफर को अवरुद्ध करने के 10 एमएल में झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    12. बफर को अवरुद्ध करने के 10 एमएल और डिस्ट्रोफिन एंटीबॉडी (1:200) के 50 माइक्रोन के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    13. अवरुद्ध बफर को त्यागें और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। कमरे के तापमान पर कम से कम 2 घंटे या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के साथ इनक्यूबेट।
    14. कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए, 0.1% ट्वीन पीबीएस के साथ झिल्ली को तीन बार कुल्लाएं।
    15. अवरुद्ध समाधान के 10 एमएल, एंटी-रैबिट एंटीबॉडी (1:5000) के 2 माइक्रोन, और 0.2% ट्वीन के 20 माइक्रोन का उपयोग करके माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    16. झिल्ली में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। कोमल आंदोलन के साथ 1 एच के लिए इनक्यूबेट, प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया।
    17. एंटीबॉडी समाधान को त्यागें और 0.1% ट्वीन पीबीएस के साथ झिल्ली को 3 बार कुल्लाएं, कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए, प्रकाश से संरक्षित।
    18. एक्सपोजर और इमेजिंग डिवाइस पर झिल्ली की छवि।
    19. निर्माता निर्देशों के बाद, वापस 700 कुल प्रोटीन दाग के साथ कुल प्रोटीन के लिए झिल्ली दाग।
      नोट: पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा डिस्ट्रोफिन का पता लगाने की उम्र/रोगी के उत्परिवर्तन और सेल की फ्यूज करने की क्षमता और पर्याप्त डिस्ट्रोफिन जमा करने के लिए पर्याप्त समय संलग्न रहने पर निर्भर करता है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि मानव त्वचा से व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों को कैसे स्थापित किया जाए और उन्हें मायोब्लास्ट में परिवर्तित किया जाए और फिर विभेदित मायोट्यूब में परिवर्तित किया जाए। इस प्रकार की सेल लाइन न्यूरोमस्कुलर विकारों के अध्ययन और संभावित उपचारों के इन विट्रो परीक्षण के लिए अत्यंत उपयोगी है।

फिगर 1 में फाइब्रोब्लास्ट रूपांतरण का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाया गयाहै । चित्रा 2A त्वचा का एक टुकड़ा और इससे उभर रहे फाइब्रोब्लास्ट को दिखाता है। जब संगम(चित्रा 2B)तक पहुंच जाता है तो फाइब्रोब्लास्ट को एक नई डिश में पारित किया जाना चाहिए। चित्रा 3 ए डॉक्सीसाइक्लिन के साथ पूरक मायोब्लास्ट विकास माध्यम में बदलने से पहले फाइब्रोब्लास्ट के आदर्श संगम को दर्शाता है। कोशिकाओं को लगभग 70% संकुचित होना चाहिए क्योंकि वे अभी भी रूपांतरण प्रक्रिया के दौरान पैदा होते हैं। यदि कोशिकाएं 80% से ऊपर हैं, तो भेदभाव से समझौता किया जा सकता है। मायोब्लास्ट में रूपांतरण में दो से चार दिन लगते हैं, और आकृति विज्ञान के अवलोकन से इसकी पुष्टि होती है। कोशिकाएं लम्बी और समानांतर रूप से उन्मुख हो जाती हैं, जैसा कि चित्र 3बीमें दिखाया गया है। विभेदन माध्यम के अलावा, मायोब्लास्ट विभाजित करना बंद कर देते हैं और बहुनीय मायोट्यूब(चित्रा 3सी)बनाने के लिए फ्यूज करना शुरू कर देते हैं। जब मायोट्यूब सीमाएं सफेद और उज्ज्वल दिखती हैं, तो वे अलग होने वाले होते हैं(चित्रा 4)। इस बिंदु पर, कोशिकाओं को इकट्ठा या ठीक करें।

विभेदन सफलता विभिन्न सेल लाइनों/उत्परिवर्तनों के बीच भिन्न होगी । परिपक्व मायोट्यूब द्वारा व्यक्त मांसपेशियों के प्रोटीन की इम्यूनोस्टेपिंग परिवर्तित फाइब्रोब्लास्ट(चित्रा 5)की मायोजेनिक क्षमता की पुष्टि करतीहै । आरएनए-Seq विश्लेषण एफएम myotubes और कंकाल की मांसपेशी की तुलना भ्रूण (MYH3) और नवजात (MYH8) myosin श्रृंखला जीन और मांसपेशियों के साथ अच्छा समग्र ट्रांसक्रिप्टोम चौड़ा संबंध(चित्रा 6)से टेप की उच्च स्तरीय अभिव्यक्ति से पता चला । विशाल सारकोमरिक प्रोटीन टिटिन (टीटीएन), नेबुलिन (एनईबी), और ऑब्लोसिन (ओबीएससीएन) के लिए ट्रांसक्रिप्ट भी एफएम मायोट्यूब द्वारा व्यक्त किए जाते हैं, जो मायोफिब्रिलोजेनेसिस में शामिल इन बड़े टेपों को अपरेगुलेशन का संकेत देते हैं। इस प्रकार, एफएम कोशिकाओं में एक मांसपेशी-विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल होती है, जो यह प्रदर्शित करती है कि वे मांसपेशियों से व्युत्पन्न सेल लाइनों के लिए एक उपयोगी और विश्वसनीय किराए हैं।

Exon लंघन वर्णन करने के लिए, हम DMD जीन में सबसे लगातार exon दोहराव में से एक में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया । Exon 2 के दोहराव DMD पढ़ने फ्रेम के व्यवधान की ओर जाता है, इस प्रकार exon लंघन के बाद पढ़ने के फ्रेम की बहाली पूर्ण लंबाई डिस्ट्रोफिन की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व करना चाहिए। हालांकि, यह भी संभव है कि एक्सोन 2 का लंघन बहुत कुशल है जिसके परिणामस्वरूप आउट-ऑफ-फ्रेम ट्रांसक्रिप्ट होता है। फिर भी, इस मामले में, एक्सॉन 2 की दोनों प्रतियों को छोड़ना एक्सोन 5 में मौजूद एक वैकल्पिक आंतरिक राइबोसोम प्रवेश स्थल (आईआरई) के उपयोग को प्रेरित करता है, जिससे कार्यात्मक एन-कट्पीट डिस्ट्रोफिन का उत्पादन होता है जिसे रोगियों में पहचाना गया था जो अभी भी उनके 70 के दशक12में एम्बुलेंट था। चित्रा 7A एक्सोन 2 दोहराव के साथ एफएम कोशिकाओं के आरटी-पीसीआर के प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है । एफएम कोशिकाओं या तो एऑन या AAV1-U7 के साथ इलाज किया गया एक एंटीसेंस अनुक्रम ले जाने के लिए exon 2 छोड़ । चित्रा 7Bमें, एक इम्यूनोब्लॉट AAV1-U7 के साथ इलाज एफएम कोशिकाओं में एन-कट्से डिस्ट्रोफिन का पता लगाने से पता चलता है । एफएम कोशिकाओं के इन विट्रो उपचार exon-लंघन रणनीतियों के लिए अवधारणा के सबूत के रूप में कार्य करता है ।

Figure 1
चित्रा 1:फाइब्रोब्लास्ट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व मायोजेनिक कोशिकाओं में रूपांतरण। मानव विषयों से त्वचा की बायोप्सी प्राप्त की जाती है। त्वचा के टुकड़े संस्कृति व्यंजनों पर रखे जाते हैं। एक सप्ताह के भीतर फाइब्रोब्लास्ट उभरने लगते हैं। फाइब्रोब्लास्ट को पहले एचटीआरटी जीन के साथ ट्रांसड्यूड किया जाता है, और फिर मायोड जीन के साथ, लेंटीवायरल वैक्टर का उपयोग करके। संक्रमित कोशिकाओं के एंटीबायोटिक चयन के बाद, मायोब्लास्ट में रूपांतरण को मायोब्लास्ट विकास माध्यम में डॉक्सीसाइक्लिन के अलावा प्रेरित किया जाता है। दो से चार दिनों के भीतर, कोशिकाएं लम्बी और समानांतर रूप से उन्मुख हो जाती हैं। विभेदन माध्यम पर स्विच करने के बाद, मायोब्लास्ट एक दूसरे के साथ फ्यूज होता है और बहुनीय मायोट्यूब बनाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:संस्कृति में त्वचा बायोप्सी के टुकड़े। (A)त्वचा के टुकड़े से उभरने वाला पहला फाइब्रोब्लास्ट। (ख)त्वचा के टुकड़े से कन्फ्यूलेंट फाइब्रोब्लास्ट उभरा। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3:फाइब्रोब्लास्ट ट्रांसफेशन। (A)70% कन्फ्यूशियस फाइब्रोब्लास्ट्स की प्रतिनिधि छवि। (ख)परिवर्तित मायोब्लास्ट ने लम्बी आकृति विज्ञान किया है और समानांतर रूप से संगठित हैं। (ग)मायोट्यूब को 7 दिनों के लिए अलग किया गया था । स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4:myotubes अलग करने की प्रतिनिधि छवि। तीर मायोट्यूब के सफेद और उज्ज्वल किनारों को अलग करना शुरू करने का संकेत देते हैं। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5:विभेदित मायोट्यूब का इम्यूनोफ्लोरेसेंस। एक स्वस्थ(ए)व्यक्ति और न्यूरोमस्कुलर विकारों(बी और सी)के रोगियों से प्राप्त मायोसिन भारी श्रृंखला का इम्यूनोस्टेटिंग । बी में मायोटोनिक डिस्ट्रॉफी प्रकार 1 (DM1) से कोशिकाओं को दिखाया जाता है जिसमें 230 सीटीजी दोहराता है, और सी में 900 सीटीजी दोहराता है के साथ DM1 कोशिकाएं हैं। स्केल बार: 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6:कंकाल की मांसपेशी की तुलना में एफएम मायोट्यूब का ट्रांसक्रिप्टोम पैटर्न। कंकाल की मांसपेशी की तुलना में एफएम मायोट्यूब का ट्रांसक्रिप्टोम पैटर्न। 12,134 टेप के लिए प्रति मिलियन मैप किए गए रीड काउंट एफएम मायोट्यूब्स और एक मानव कंकाल मांसपेशी बायोप्सी से तैयार इलुमिना आरएनए-सेक्यू पुस्तकालयों के लिए दिखाए गए हैं। दो पुस्तकालयों के बीच ट्रांसक्रिप्ट स्तर 0.71 का पियर्सन सहसंबंध और 0.73 का स्पीयरमैन रैंक सहसंबंध था। विकासात्मक मायोसिन भारी श्रृंखलाओं और बड़े सारकोमरिक प्रोटीन के लिए ट्रांसक्रिप्ट लाल रंग में हाइलाइट किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:प्रतिनिधि आरटी-पीसीआर और पश्चिमी दाग एफएम सेल में डीएमडी एक्सोन लंघन दिखा रहा है । (A)अभिव्यक्ति DMD द्वारा आरटी-पीसीआर । डीएमडी एक्सोन 2 के दोहराव को शरण देने वाले रोगी से फाइब्रोब्लास्ट को एफएम कोशिकाओं में बदल दिया गया था। मांसपेशी बायोप्सी से निकाले गए आरएनए को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जिसमें यह दर्शाया गया था कि एफएम अनुपचारित कोशिकाएं एक ही डुप्लिकेट ट्रांसक्रिप्ट व्यक्त करती हैं। एफएम एऑन के साथ इलाज कोशिकाओं exon 2 दोहराव के एक आंशिक लंघन है, जबकि AAV1-U7 इलाज कोशिकाओं exon 2 दोहराव के साथ टेप की प्रधानता से पता चला छोड़ दिया । (ख) AAV1-U7 के साथ इलाज एफएम कोशिकाओं के प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट । छोटे एन-कटेड डिस्ट्रोफिन का पता उपचार के 14 दिन बाद (तीर द्वारा इंगित) था। पहले Wein एट अल में प्रकाशित डेटा । डीएमडी एक्सॉन 5 आईईआरई से अनुवाद के परिणामस्वरूप एक कार्यात्मक डिस्ट्रोफिन आइसोफॉर्म होता है जो मनुष्यों और चूहों में डिस्ट्रोफिनोपैथी को कम करता है। नेचर मेडिसिन। 2014. 2020 स्प्रिंगर नेचर लिमिटेड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ मीडियम 20% एफबीएस, 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइसोटिक के साथ डीएमईएम
फ्रीजिंग माध्यम 10% DMSO, 90% फाइब्रोब्लास्ट माध्यम
डॉक्सीसाइक्लिन स्टॉक सॉल्यूशन 1000X 1 एमएल अल्ट्रा-प्योर वाटर में 8 मिलीग्राम डॉक्सीसाइक्लिन। 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर में फ़िल्टर करें। पीसीआर ट्यूबों में अलीकोट। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, प्रकाश से संरक्षित।
मायोब्लास्ट माध्यम कंकाल मांसपेशी सेल विकास माध्यम (ऊपर सूची देखें) की खुराक के साथ, 8 μg/mL doxycycline । उदाहरण के लिए: 100 एमएल में 1000X स्टॉक समाधान का 100 μL।
भेदभाव माध्यम कंकाल मांसपेशी कोशिका की खुराक के साथ विभेदन माध्यम (ऊपर सूची देखें), 8 μg/mL doxycycline । उदाहरण के लिए: 100 एमएल में 1000X स्टॉक समाधान का 100 μL।
धुंधला होने के लिए समाधान अवरुद्ध करना 1X पीबीएस में 10% बकरी सीरम (या जानवर का सीरम जिसमें माध्यमिक एंटीबॉडी उठाया गया था)
प्रोटीन निष्कर्षण के लिए बेस बफर नैक 150 एमएम, ट्रिस 50 एमएम, 005% एनपी-40। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

तालिका 1: मध्यम व्यंजनों

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Discussion

अच्छी गुणवत्ता के साथ एफएम सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए, कुछ कदम महत्वपूर्ण हैं। जितनी जल्दी त्वचा बायोप्सी को संसाधित किया जाता है, स्वस्थ फाइब्रोब्लास्ट प्राप्त करने की संभावना उतनी ही अधिक होती है। फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की मार्ग संख्या भी महत्वपूर्ण है। प्राथमिक कोशिकाओं में सीमित प्रसार क्षमता होती है और कई मार्गों के बाद, वे प्रतिकृति सेन्सेंस में प्रवेश करते हैं। इस प्रकार, कम पैसेज संख्या पर फाइब्रोब्लास्ट का स्टॉक करना बेहतर होता है और कोशिकाओं को यथाशीघ्र पारित होने पर बदलना बेहतर होता है।

एक अन्य महत्वपूर्ण कदम यह भी है कि वायरल उत्पादन हो जिसमें अधिकतम शुद्धता और सटीक मात्रा हो । उदाहरण के लिए, क्यूपीसीआर का उपयोग करके वायरल जीनोम क्वांटिफिकेशन उचित माप प्रदान करता है, लेकिन डीडीपीसीआर (डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर) द्वारा परिमाणीकरण अधिक सटीक है।

इसके अलावा, मायोब्लास्ट रूपांतरण के लिए फाइब्रोब्लास्ट का पर्याप्त संगम महत्वपूर्ण है। यदि कोशिकाएं 70% से नीचे या 80% से ऊपर हैं, तो मायोजेनिक भेदभाव बिगड़ा हो सकता है। यदि कोशिकाएं बहुत ही संकुचित हैं, तो मायोट्यूब की परतों का सुपरपोजिशन होगा, जो धुंधला और इमेजिंग में हस्तक्षेप करता है। डॉक्सीसाइक्लिन की एकाग्रता सही सक्रियण और मायोड जीन की निरंतर अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है। मीडिया में बदलाव करने से पहले हमेशा मध्यम अधिकार में डॉक्सीसाइक्लिन जोड़ना बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह मध्यम में पतला होने के बाद जल्दी से कम हो जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होता है। स्टॉक को 1000X की एकाग्रता पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। गल गए एलिकोट्स को फिर से फ्रीज न करें। प्रजनन योग्य प्रयोगों को सुनिश्चित करने और तकनीकी मुद्दों से आनुवंशिक उत्परिवर्तन के कारण बिगड़ा भेदभाव को भेदभाव करने के लिए इन विवरणों का पालन करना बहुत महत्वपूर्ण है । फिर भी, उत्परिवर्तन या बीमारी के प्रकार के आधार पर, एक अच्छा भेदभाव संभव नहीं हो सकता है। विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, समान मार्ग संख्याओं पर प्रयोगों को दोहराना बहुत महत्वपूर्ण है।

हमारे अनुभव में, भेदभाव क्षमता कम से कम 25-27 पारित होने तक बनी हुई है, विशेष रूप से जंगली प्रकार के नियंत्रण में। एक ही कुछ रोगग्रस्त सेल लाइनों के लिए मान्य हो सकता है, लेकिन यह सेल लाइन पर निर्भर करता है। कुछ डीएमडी सेल लाइनें अभी भी P20 के ऊपर मायोजेनिक क्षमता को बनाए रखती हैं। विपक्ष में, एक मायोटोनिक डिस्ट्रॉफी टाइप 1 (DM1) सेल लाइन P8 के बाद कम मायोजेनिकिटी प्रस्तुत किया । हालांकि, DM1 के मामले में, यह आश्चर्य की बात नहीं है क्योंकि यह प्रदर्शित किया गया है कि DM1 में उत्परिवर्तन अप्रत्यक्ष रूप से मांसपेशियों में भेदभाव16में एक भूमिका निभाते हैं । मायोजेनिक विभेदन क्षमता को बनाए रखने को व्यक्तिगत रूप से संबोधित किया जाना चाहिए, लेकिन आम तौर पर, अधिकांश सेल लाइनें इसे पी 20-25 तक बनाए रखती हैं।

संक्षेप में, फाइब्रोब्लास्ट का मायोब्लास्ट में रूपांतरण न्यूरोमस्कुलर विकारों के लिए चिकित्सीय रणनीतियों का अध्ययन और परीक्षण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह मांसपेशियों की बायोप्सी के जटिल अस्पष्टता से बचने और रोगियों के लिए मांसपेशियों की बायोप्सी की असुविधा को कम करके मानव कोशिका मॉडल तक पहुंच की सुविधा प्रदान करता है।

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Disclosures

राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल exon 2 लंघन यहां Audentes चिकित्सा विज्ञान के लिए वर्णित कार्यक्रम लाइसेंस दिया है । K.M.F. और N.W. इस लाइसेंस का एक परिणाम के रूप में रॉयल्टी भुगतान प्राप्त हुआ है ।

Acknowledgments

हम मॉडल के बारे में अतीत में अपने ज्ञान को साझा करने के लिए डॉ विंसेंट मौली का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को अमेरिका के नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर्स एंड स्ट्रोक (R01 NS043264 (K.M.F., द्वारा समर्थित किया गया है। और आर.B.डब्ल्यू)), अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य राष्ट्रीय गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोग संस्थान (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., और N.W.) । एनडब्ल्यू को ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी/राष्ट्रव्यापी चिल्ड्रन हॉस्पिटल मांसपेशी ग्रुप और फिलिप फाउंडेशन से फैलोशिप सपोर्ट मिला है । इस काम को आंतरिक विवेकाधीन फंडों द्वारा भी समर्थित किया गया था और एक्सोन 2 लंघन कार्य का हिस्सा CureDuchenne (K.M.F.) और एसोसिएशन फ्रैंकाइज कॉन्ट्रे लेस मायोपैथी द्वारा भी समर्थित किया गया है। आईआरबी नंबर: आईआरबी #: आईआरबी10-00358/CR00005138 और IBCSC #: IBS00000123 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm dish Corning 430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red Thermo Fisher 2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP3994
12-well plate Corning 3513
20X Transfer buffer Thermo Fisher NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer Thermo Fisher LA0041
3-8% Tris-Acetate gel Thermo Fisher EA0378BOX
75 cm2 flask Corning 430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X Thermo Fisher 15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody Developmental Studies Hybridome Bank MF20 supernatant Dilution 1:50
Antioxidant Thermo Fisher NP0005
BCA Protein Assay Thermo Fisher 23227
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
DAPI Thermo Fisher D3571 Dilution 1:1000
Digitonin Millipore Sigma 300410250MG
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate Thermo Fisher 10569044
DNAse I set (250U) Zymo Research Corporation E1010
Doxycycline Hydrochloride Fisher Scientific BP2653-5
Dup2 human primers Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG
TTTCTC 3'		 Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'
Dystrophin antibody Abcam ab15277 Dilution 1:200
Fetal bovine serum Thermo Fisher 16000
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A11001 Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X Thermo Fisher 78430
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hygromycin B Thermo Fisher 10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) Li-Cor 926-68071 Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system Thermo Fisher 15852
Laemmli Bioworld 105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher L3000008
Matrigel GFR membrane matrix Corning 354230
Methanol Fisher Scientific A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher 51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm GE Healthcare Life Sciences 10600002
Normal Goat serum control Thermo Fisher 10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS) Li-Cor 927-40003 Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher 11058021
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PCR master mix Thermo Fisher K0172
Phosphatase inhibitor Thermo Fisher A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio Rad 1610374
Puromycin Thermo Fisher A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization Li-Cor 926-11021
RevertAid kit Thermo Fisher K1691
RNA Clean & Concentrator-25 Zymo Research Corporation R1018
Scalpels Aspen Surgical 372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium Promocell C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium Promocell C23060
Triton X-100 Acros Organics 215682500
TRIzol reagent Thermo Fisher 15596026
Tween 20 Fisher Scientific BP337500
Ultra low temperature freezer Thermo Scientific 7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
Vectashield antifade mounting medium Vector Labs H1000

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References

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न्यूरोमस्कुलर विकारों के लिए चिकित्सा की जांच करने के लिए मायोब्लास्ट में मानव फाइब्रोब्लास्ट का प्रत्यक्ष पुनर्प्रोग्रामिंग
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Almeida, C. F., Frair, E. C., Huang, N., Neinast, R., McBride, K. L., Weiss, R. B., Flanigan, K. M., Wein, N. Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders. J. Vis. Exp. (170), e61991, doi:10.3791/61991 (2021).

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