Direkte omprogrammering af humane fibroblaster til myoblaster for at undersøge behandlingsformer for neuromuskulære lidelser

Summary

Denne protokol beskriver konverteringen af hudfibroblaster til myoblaster og deres differentiering til myorør. Cellelinjerne er afledt af patienter med neuromuskulære lidelser og kan bruges til at undersøge patologiske mekanismer og til at teste terapeutiske strategier.

Abstract

Undersøgelser af både patofysiologi og terapeutiske mål i muskeldystrofier er blevet hæmmet af den begrænsede proliferative kapacitet af menneskelige myoblaster. Flere musemodeller er blevet skabt, men de repræsenterer enten ikke rigtig sygdommens menneskelige fysiopatologi eller er ikke repræsentative for det brede spektrum af mutationer, der findes hos mennesker. Udødeliggørelsen af menneskets primære myoblaster er et alternativ til denne begrænsning; Det er dog stadig afhængig af muskelbiopsier, som er invasive og ikke let tilgængelige. I modsætning hertil er hudens biopsier lettere at opnå og mindre invasive for patienterne. Fibroblaster stammer fra hudens biopsier kan udødeliggøres og transdifferentieres i myoblaster, hvilket giver en kilde til celler med fremragende myogen potentiale. Her beskriver vi en hurtig og direkte omprogrammering metode fibroblast i en myogen afstamning. Fibroblaster transduceres med to lentivirus: hTERT at udødeliggøre den primære kultur og en tet-indukbel MYOD, som ved tilsætning af doxycyclin, fremkalder konvertering af fibroblaster i myoblaster og derefter modne myorør, som udtrykker sene differentiering markører. Denne hurtige transdifferentieringsprotokol repræsenterer et effektivt værktøj til at undersøge patologiske mekanismer og til at undersøge innovative genbaserede eller farmakologiske bioterapier for neuromuskulære lidelser.

Introduction

Cellulære modeller opnået direkte fra humane væv er nyttige til at modellere mange menneskelige genetiske sygdomme, med den fordel at have den oprindelige genomiske kontekst og i mange tilfælde reproducere de samme molekylære og cellulære kendetegn observeret hos patienterne. Inden for neuromuskulære lidelser har muskelbiopsier været en stor kilde til menneskelige myoblaster og har hjulpet med at belyse patologiske mekanismer. Derudover er de et vigtigt redskab til in vivo-test af lægemidler og genterapier. På den ene side er afledningen af myoblaster fra muskelfragmenter relativt let. På den anden side er kulturen og vedligeholdelsen af primære myoblaster udfordrende på grund af deres begrænsede spredningshastighed og repliktive senescens in vitro¹. Et alternativ til disse begrænsninger er at udødeliggøre myoblaster med indsættelsen af den menneskelige telomerase (hTERT) og / eller cyclin-afhængige kinase 4 (CDK4) gener^2,3, med bevarelse af skeletmuskulatur funktioner⁴. Ikke desto mindre er obtention af primære myoblaster stadig afhængig af muskelbiopsi, en kirurgisk procedure med ulemper for patienterne, som i mange tilfælde har deres muskler i avanceret degeneration. Således er musklen af disse patienter består af en betydelig andel af fibrotiske og / eller fedtvæv og giver færre muskelceller, der kræver rensning af cellerne tidligere til udødeliggørelse.

I modsætning til muskelbiopsier er hudbiopsier mere tilgængelige og er mindre skadelige for patienterne. Primære fibroblaster kan udledes af hudfragmenter in vitro. Selvom fibroblaster ikke primært påvirkes af mutationer, der forårsager neuromuskulære lidelser, kan de transdifferentieres til myoblaster. Dette kan opnås ved indsættelse af Myod-genet, en myogen regulatorisk transskriptionsfaktor⁵. I dette manuskript beskriver vi protokollen for at opnå transdifferentiated myoblaster, fra etablering af fibroblaster kulturer til obtention af differentierede myorør (et repræsentativt resumé af metoden er afbildet i figur 1).

Præklinisk testning af terapeutiske strategier er afhængig af cellulære modeller og dyremodeller, der bærer mutationer svarende til de mutationer, der findes hos mennesker. Selv om udviklingen af dyremodeller er blevet mere gennemførlig med udviklingen af genredigeringsteknologier som CRISPR/Cas9⁶, er det stadig udfordrende og dyrt. Således er patient-afledte cellelinjer en tilgængelig mulighed for at have modeller, der dækker det store spektrum af mutationer af sygdom som Duchenne muskeldystrofi (DMD). Obtention og oprettelse af cellemodeller er afgørende for udviklingen af personlige terapier til sådanne patologier.

Blandt personlige terapier, der er blevet undersøgt, exon springe strategier er en af de lovende dem for forskellige muskeldystrofier^7,8. Denne strategi består i at producere et kortere, men funktionelt protein. Dette gøres ved at skjule exon definition til splejsning, derfor udelukke muterede exon fra den endelige messenger. Dette er en meget lovende teknologi, der er blevet godkendt af FDA for DMD. Således beskriver vi også i denne protokol metoder til at transfektere myoblaster med to forskellige exon springe relaterede teknologier over: antisense oligonukleotider (AON) og U7snRNA-adeno-associeret virus (AAV). AON transfection er et godt værktøj til den indledende screening af flere sekvenser designet til at fremme exon springe⁹. AON'ernes aktivitet er imidlertid forbigående. For at opnå et vedvarende udtryk for antisensesekvenser undersøgte vi også små nukleare RNA'er (snRNA' er) kombineret med AAV, hvilket gjorde det muligt at lokalisere og inkludere nukleart i splejsningsmaskineriet¹⁰. U7 er en snRNA involveret i behandlingen af histone mRNA, der kan manipuleres til at binde proteiner, der vil omdirigere det til splejsning og levere antisense sekvenser¹¹. Brugen af modificerede U7 snRNA'er i kombination med AAV-vektorer overvinder begrænsninger af AON'er , hvilket resulterer i et fortsat udtryk for AON'erne og bedre transduktion af væv af interesse¹². Vi bruger celler afledt af DMD patienter til denne protokol til at illustrere exon-spring strategi.

Protocol

Alle eksperimenter og biopsier blev udført efter de etiske regler i de involverede institutioner under godkendelse af Nationwide Children's Hospital Institutional Review Board.

1. Indledning af dermal fibroblaster kultur

1. Etablering af fibroblaster kultur
   1. 10 mL fibroblastmedium(tabel 1)i 15 mL koniske rør. Hudens biopsi skal placeres og transporteres i dette medium. Biopsi kan opbevares ved 4 °C, indtil den behandles, fortrinsvis samme dag.
      BEMÆRK: Brug hudens biopsi inden for 24-36 timer for at undgå potentiel vækst i forureningen.
   2. Aspirere mediet fra røret og skyl biopsien med 10 mL 1X PBS (stuetemperatur) tre gange. Efter den tredje vask skal PBS efterlades i røret.
   3. Hæld PBS og huden ud på en 10 cm² skål.
   4. Brug sterile skalpeller, skære biopsi i så små som muligt fragmenter.
   5. Brug en pipette, overfør et individuelt hudfragment og slip det i en ren 10 cm² skål. Placer 10 til 12 fragmenter pr parabol.
   6. Indsug overskuddet af PBS fra omkring hvert fragment. Pas på ikke at suge fragmentet.
   7. Dæk retterne delvist med låget og lad hudfragmenterne tørre i 5-20 minutter. Lad ikke fragmenterne tørre for meget.
   8. Når fragmenterne er tørre, vippes skålen ved 45 grader og tilsæt langsomt 12 mL fibroblast medium til hjørnet. Sænk fadet ned, og udtribuer forsigtigt mediet, så fragmenterne ikke løftes af medierne.
   9. Retterne anbringes i inkubatoren (37 °C, 5% CO₂). Udskift mediet om 5-7 dage og en gang om ugen efter.
   10. Overhold fibroblasterne, der kommer ud af fragmentet (Figur 2), og gang sammenflydende, passage cellerne i 75 cm² kolber. Mediet fjernes, cellerne skylles med PBS, og der tilsættes 1 mL 0,25 % trypsin. Inkuber ved 37 °C i 5 min., eller indtil alle celler er løftet. Tilsæt 10 mL fibroblast vækstmedium for at hæmme trypsin og overføre cellerne til en ny kolbe.
       BEMÆRK: For passagenummernomenklaturen etableres P1, når de første fibroblaster, der opstod fra hudens biopsi, overføres til en ny kolbe til spredning.
2. Kryopræservering af primære fibroblastlinjer
   1. Når den 75 cm² kolbe er sammenløbet, skylles den med 10 mL 1X PBS og aspirat PBS.
   2. Der tilsættes 3 mL på 0,25 % trypsin til celleoverfladen. Kolben anbringes i inkubatoren i 5 min. Kontroller kolberne under mikroskopet for at se, om cellerne løftes. Hvis ikke, skal kolben anbringes i inkubatoren i yderligere 5 minutter.
   3. Når cellerne er løsrevet, tilsættes 7 mL fibroblastmedie til kolben og pipetten op og ned for at genbruge cellerne. Indsaml cellerne i et 50 mL konisk rør.
   4. Der fremstilles 100 μL aliquot trypanblå, og 100 μL fjernes fra prøven, der kryopreserveres, blandes med trypanblån. Lad blandingen på hæmometeret for at tælle. Tæl cellerne i fire forskellige felter af hæmometeret under mikroskopet. Hvis du vil beregne det samlede antal celler, skal du bruge formlen: (optalte celler/100) * kulturvolumen.
   5. De koniske rør drejes ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur eller 4 °C.
   6. Aspirat ud af mediet og genbruges cellerne i tilstrækkelig mængde frysning medium: 1 mL pr hver 1 million celler / hætteglas. Pipette op og ned for at homogenisere og distribuere 1 mL til hver mærket kryoovial.
   7. Hætteglassene anbringes i fryseboksen, og hætteglassene kan fryse med en hastighed på 1 °C/min. ved fryseren på -80 °C natten over.
   8. Den følgende dag overføres hætteglassene til en flydende nitrogentank eller -150 °C fryser.

2. Etablering af fibromyoblaster (FM) cellelinje

1. Frø primære fibroblaster på ca 30% af sammenløbet i to brønde af en 12-godt plade (2 x 10⁴ celler / godt) for at have omkring 50% af sammenløbet den næste dag.
2. Til lentiviral transduktion tilsættes 2 til 5 x 10⁹ vg (virale genompartikler) af hTERT-puromycin lentivirus i 400 μL fibroblast medium. Til den anden brønd tilsættes kun 400 μL fibroblast medium. Tilføj 1 mL medier den følgende dag.
   BEMÆRK: Plasmids for lentivirus produktion blev indhentet fra den gruppe, der offentliggjorde Chaouch et al, 2009 papir. De er også beskrevet individuelt i Aure et al, 2007¹³ for hTERT plasmid og Barde et al, 2006¹⁴ for Tet-on system udnyttes til design af MyoD plasmid. De blev opnået takket være en materialeoverførselsaftale med Genethon, Frankrig (kontakt venligst Dr. Vincent Mouly for at få disse plasmider - vincent.mouly@upmc.fr). Kort, hTERT består af hTERT variant 1 drevet af en CMV promotor, mens puromycin er drevet af en PGK promotor. MyoD plasmid indeholder en MyoD variant 1 drevet af en CMV promotor under kontrol af repressoren rtTA2. Denne plasmid indeholder også hygromycin udvælgelse udtrykt takket være SV40 promotor.
   Lentivirus blev produceret ved hjælp af regelmæssig lentiviral produktion (se Wang og McManus JoVe protokol¹⁵). Kort, MDL-hjælper, Rev-Helper, SVS-G-hjælper blev transfected via calciumchlorid nedbør også af enten hTERT eller MyoD plasmider. Efter 48 timer blev supernatanten indsamlet og derefter i yderligere tre dage. Alle supernatant blev derefter koncentreret af ultracentrifugation. Pellet blev derefter genbrugt i Tris-HCL + NaCl + EDTA buffer. Titer estimering blev evalueret af standard lentivirus qPCR assay.
3. En eller to dage senere overføres cellerne til en 6-brønds plade og vokser dem, indtil de når 60-70% sammenløb.
4. Suppler fibroblastmediet med 1 μg/ml puromycin og tilsæt 2 ml til hver brønd.
5. Hold cellerne under markering, indtil alle celler i kontrolbrønden er døde (op til 12 dage), og skift medie hver 2-3 dage. Passage cellerne fra 6-brøndspladen i to 10 cm² retter for yderligere spredning.
6. Frys hætteglas af fibroblaster efter udvælgelse. Etiket som F(hTer).
7. Frø hTERT-udtrykke fibroblaster (F (hTer)) på omkring 30% sammenløb i fibroblast medium, i to brønde af en 12-brønds plade, at have omkring 50% sammenløb den næste dag.
8. For lentivirustransduktion blandes 2 til 5 x 10⁹ vg MyoD-hygromycinB lentivirus i 400 μl fibroblast medium og tilsættes til respektive brønde; til den tredje godt tilføje 400 μl fibroblast medium. Tilføj 1 mL medium den næste dag.
9. En eller to dage senere overføres cellerne til en 6-brønds plade og vokser indtil 60-70% sammenløb.
10. Fibervækstmediet suppleres med hygromycin B (400 μg/mL) og tilsættes 2 ml til hver brønd.
11. Hold cellerne under markering, indtil alle celler i kontrolbrønden er døde (op til 12 dage), og skift medie hver 2-3 dage.
12. Frys hætteglas af fibroblaster efter udvælgelse. Etiket som FM efterfulgt af celleidentifikationsnummeret/-navnet.

3. Protokol om transdifferentiation

1. Frø transduceret FM på 10 cm² retter med 30-40% sammenløb. I en 12-brønds plade, frø 6 x 10⁴ celler (dette afhænger af den enkelte celle linje).
   BEMÆRK: Til immunostaining, frøceller på glas coverlips eller kammer dias belagt med Matrigel. Fortynd Matrigel kl. 1:10 i DMEM-medium, tilsæt et volumen nok til at dække overfladen, og lad diasene sidde ved stuetemperatur i en time. Aspirat ud lige før såning cellerne.
2. For myoblaster induktion, når fibroblaster nåede 70% sammenløb(Figur 3A), skyl celleoverfladen med PBS og tilsæt friske myoblast medier suppleret med frisk 8 μg/mL doxycyclin.
   BEMÆRK: Succesen med differentiering er kompromitteret forbi 80% sammenløb.
3. Efter to til tre dage senere er cellerne 90-95% sammenflydende, og deres morfologi vil have ændret sig (Figur 3B). Celleoverfladen skylles med PBS, og der tilsættes friske differentieringsmedier suppleret med frisk 8 μg/mL doxycyclin.
4. Fortsæt med at skifte medie hver 2-3 dage uden at passere, indtil myotubes er etableret (bekræft via morfologi) (Figur 3C).
5. Syv til ti dage efter start myotube differentiering, celler bør være fuldt differentieret og kan begynde at løsne eller dø. Før dette sker, høst myotubes til yderligere analyse.
   BEMÆRK: Tidsforløbet for myotube-dannelse afhænger af cellelinjen. Mutationer i muskelrelaterede proteiner kan forstyrre det myogeniske potentiale. Når myotubes begynder at fremstå lyse og se hvide på grænserne er det et signal, de er begyndt at løsne (Figur 4).
6. At høste myotubes, indsamle medier og overføre det til en 50 mL konisk rør. Mediet kan indeholde myotubes, der har løsrevet.
7. Skyl myotuberne med 5 mL PBS og overfør PBS til 50 mL røret.
8. Der tilsættes 3 mL på 0,25 % trypsin til celleoverfladen. Placer skålen i inkubatoren i 5 minutter. Kontroller skålen under mikroskopet for at se, om cellerne løftes. Hvis ikke, skal du placere den tilbage i inkubatoren i yderligere 5 minutter.
9. Når cellerne er løsrevet, tilsættes 7 mL fibroblast medier til skålen og pipette op og ned for at genbruge cellerne. Indsaml cellerne til det 50 mL koniske rør.
10. Centrifuge ved 1.200 x g i 7 min ved 4 °C.
11. Indsug forsigtigt væsken uden at forstyrre pelleten. Pellets opbevares ved -80 °C indtil videreforarbejdning.

4. Immunostaining af differentierede myotuber

BEMÆRK: Til immunostaining dyrkes cellerne i glasovertræk eller kammerdias som nævnt ovenfor.

1. Når myotubes er fuldt differentieret, aspirere off medier og omhyggeligt skylle dias med PBS. Aspirate PBS slukket.
2. Tilsæt frisk 4% PFA (500 μL pr. brønd af en 12-brønds plade) og inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter. Aspirate PFA off.
3. Skyl med 1 mL PBS.
4. Inkuber med 0,2 M glycin ved stuetemperatur i 10 min. Aspirate glycin off.
5. Gennemtræng med PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL/brønd af en 12-brønds plade), i 10 minutter med blid omrøring.
6. Bloker med 300 μL/brønd af blokeringsopløsning i 10 minutter med let omrøring.
7. Inkuber med primært antistof fortyndet 1:50 i 300 μL blokeringsopløsning i 2 timer ved stuetemperatur med blid rysten.
8. Skyl tre gange med 1 mL/brønd PBS i 5 min, med blid rysten.
9. Inkuber med sekundært antistof fortyndet 1:500 i 300 μL blokeringsopløsning i 1 time ved stuetemperatur med blid rysten. Dæk pladen med aluminiumsfolie.
10. Skyl tre gange med 1 mL/brønd PBS i 5 min, med blid rysten.
11. Inkuber med DAPI fortyndet i PBS i 10 minutter. Skyl tre gange med 1 mL/brønd PBS.
12. Tilføj en dråbe montering medium til et glas dias. Fjern coverlip med pincet og læg den med forsiden nedad på dråben af monteringsmediet.
13. Vend glide på et køkkenrulle og forsigtigt trykke på for at fjerne bobler og overskydende montering medium.
14. Forsegl rutsjebanerne med neglelak og opbevar ved 4 °C, indtil de er billedbilleder.

5. Antisense oligonukleotid transfekt

BEMÆRK: Nedenstående protokol er til transinfektion af en 6-brønds plade. Juster mængderne i overensstemmelse hermed for mindre eller større plader. Transfekten sker i 100% sammenflydende myoblaster, når cellerne er klar til differentieringstrinnet.

1. Aspirér myoblastvækstmedierne, og skyl cellerne med 1 mL PBS.
2. Der tilsættes 500 μL/brønd OptiMEM-medier, og der inkuberes ved 37 °C i 1 time.
3. Antisense oligonukleotid (AON) fortyndes i OptiMEM's 100 μL til den ønskede endelige koncentration (dvs. 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
   BEMÆRK: Denne protokol er optimeret til 2'omethyl-phosphorothioate AONs.
4. Lipofectamin blandes med OptiMEM (sidste volumen på 100 μL) for at give et endeligt forhold på 1:1 (μg DNA: μL lipofectamin). Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
5. Kombiner den fortyndede lipofectamin med den fortyndede AON. Bland forsigtigt ved pipettering og inkubat i 20 minutter ved stuetemperatur for at tillade kompleks dannelse. Undgå luftbobler.
6. Der tilsættes 200 μL lipofectamin og AON-blanding til de respektive brønde. Cellerne inkuberes natten over ved 37 °C, 5% CO₂.
7. Den følgende dag fjernes transfektureblandingen, og der tilsættes 2 mL varme differentieringsmedier suppleret med doxycyclin.
8. Indsamle celler mindst tre dage senere til RNA-ekstraktion eller syv til 21 dage i tilfælde af proteinanalyse.
   BEMÆRK: De differentieringsdage, der er nødvendige for at detektere RNA og/eller proteinudtryk, kan variere i overensstemmelse hermed til det interessegen eller cellelinjen. I tilfælde af DMDer det muligt at registrere dets mRNA inden for tre dage. Dystropin proteindetektion kræver mindst syv dage. Dette vil variere afhængigt af cellelinjen. Høje koncentrationer af AON og transfektreagens kan påvirke transdifferentiationen.

6. AAV1-U7 transduktion

BEMÆRK: Denne protokol blev optimeret til 6-brønds plader. Juster mængderne proportionalt med kulturens overfladeareal. Transduktionen sker i 100% sammensatte myoblaster, når cellerne er klar til differentieringstrinnet. AAV1 er AAV serotype med den bedste transduktionskapacitet af dyrkede myoblaster.

1. Aspirat fra myoblast vækstmediet og skyl cellerne med 1 mL PBS.
2. Fortyndes 0,5-1 x 10¹¹ virale partikler af AAV1-U7 i 700 μL varme differentieringsmedier suppleret med doxycyclin.
   BEMÆRK: Vi bruger qPCR til at bestemme den virale koncentration. Mængden af virus, der skal anvendes, kan variere afhængigt af kvantificeringsmetoden og bør bestemmes tidligere ved hjælp af en reporteranalyse.
3. Tilsæt den virale blanding til brønden ved at droppe den homogent.
4. Den følgende dag tilsættes 1,3 mL varme differentieringsmedier suppleret med doxycyclin.
5. Opsaml cellerne mindst tre dage senere til RNA-ekstraktion eller syv til 21 dage i tilfælde af proteinanalyse.

7. RNA-ekstraktion

BEMÆRK: Alt materiale, der anvendes i dette trin, skal være RNase-fri.

1. Der tilsættes 500 μL TRIzol pr. pellet og pipettes op og ned flere gange for at sikre, at cellerne lyser homogent.
2. Cellens lysat overføres i et 1,5 mL rør og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
3. Der tilsættes 100 μL chloroform, og der rystes manuelt i 15 s. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
4. Centrifuge ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Saml den vandige fase (øverste) og overfør den til et nyt 1,5 mL rør.
5. For 1 volumen af den vandige fase tilsættes 1 volumen ethanol 100% og blandes ved pipetting.
   BEMÆRK: Vi anbefaler kolonnerensning og koncentration.
6. Prøven overføres til en Zymo-Spin IC-kolonne i et opsamlingsrør og centrifuge ved 12.000 x g i 30 s. Kassér gennemstrømningen.
7. For DNase I-fordøjelsen i kolonne skal kolonnen forvaskes med 400 μL RNA-vaskebuffer. Centrifuge ved 12.000 x g for 30 s. Kassér gennemstrømningen.
8. Der fremstilles 40 μL DNase-reaktionsblanding pr. prøve. Der blandes 5 μL DNase I med 35 μL DNA-fordøjelsesbuffer.
9. Føj blandingen direkte til kolonnematrixen. Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
10. Der tilsættes 400 μL RNA Prep Buffer til kolonnen og centrifuge ved 12.000 x g for 30 s. Kassér gennemstrømningen.
11. Der tilsættes 700 μL RNA-vaskebuffer til kolonnen og centrifuge ved 12.000 x g for 30 s. Kassér gennemstrømningen.
12. Der tilsættes 400 μL RNA-vaskebuffer til kolonnen og centrifuge ved 12.000 x g i 2 min. for at sikre fuldstændig fjernelse af vaskebufferen. Overfør kolonnen forsigtigt til et RNase-frit 1,5 mL rør.
13. Der tilsættes 15 μL nukleasefrit vand direkte til kolonnematrixen. Inkuber i 5 min og centrifuge ved 12.000 x g i 1 minut.
    BEMÆRK: Saml det eluterede RNA og påfør det igen på kolonnen for at øge udbyttet. Centrifuge ved 12.000 x g i 1 minut.
14. Placer prøver på is og kvantificere prøverne i en Nanodrop.
15. Prøverne opbevares ved -80 °C.

8. RT-PCR-analyse

BEMÆRK: I dette trin præsenterer vi et forslag om reagenser til påvisning af udtrykket dystrophin mRNA, men det kan let tilpasses andre reagenser efter eget valg.

1. Omvendt transskribering
   1. Tø alle reagenser op og hold dem på is.
   2. Der fremstilles en blanding med 4 μL 5x reaktionsbuffer, 2 μL dNTP-blanding (10 mM), 1 μL RiboLock RNase-hæmmer og 1 μL RevertAid RT.
   3. Røret blandes forsigtigt og centrifuge kort.
   4. I 0,2 mL PCR-rør tilsættes den tilstrækkelige mængde RNA for at have 1 μg pr. reaktion. Tilsæt nukleasefrit vand q.s.p 12 μL. Medtag et rør uden omvendt transskription som negativ kontrol og et rør med nukleasefrit vand i stedet for RNA.
   5. 8 μL reaktionsblanding pr. rør fordeles. Det samlede volumen er 20 μL.
   6. Rør anbringes i en termocykel og inkuberes i 5 min ved 25 °C efterfulgt af 60 min ved 42 °C. Reaktionen standses ved opvarmning ved 70 °C i 5 minutter.
   7. Sæt rørene på is eller ved -20 °C for længere opbevaring.
2. Pcr
   BEMÆRK: Design primere ved exons vejkryds helst.
   1. Vortex reagenser og spin ned før brug.
   2. Der fremstilles en masterblanding med 0,5 μL fremadprimer (25 μM), 0,5 μL omvendt primer (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix og 8,5 μL nukleasefrit vand pr. prøve.
   3. Aliquot 22 μL masterblanding i et rør for hver prøve.
   4. Der tilsættes 3 μL cDNA (150 ng) til det respektive PCR-rør. Der tilsættes 3 μL nukleasefrit vand til PCR's negative kontrolrør.
   5. Vortex og spin ned PCR rør.
   6. Rørene inkuberes i en termocykel ved 95 °C i 3 min., 95 °C i 30 s, (Tm-5) °C i 30 s, 72 °C i (1 min/kb) 34 gange, 72 °C i 5 min.
      BEMÆRK: Den optimale udglødningstemperatur kan bestemmes empirisk. Træk 5 °C fra primersmeltningstemperaturen for den foreslåede masterblanding.
   7. 12 μL af PCR-reaktionen belastes på en agarosegel, og prøverne fryses ved -20 °C.

9. Påvisning af dystrophin udtryk ved Western Blotting

BEMÆRK: Denne protokol er optimeret til dystrophin, et stort membranprotein. Særlige betingelser kan være nødvendige for forskellige proteiner.

1. Proteinudvinding
   1. Efter 7-21 dages differentiering opsamles celler med 5 mL PBS med 100 μL 0,5 M EDTA og 50 μL proteasehæmmere. Inkuber ved 37 °C, indtil cellerne løsnes. Centrifuge ved 1.200 x g i 5 min ved 4 °C. Snap fryse pellet ved at dyppe røret i flydende nitrogen. Pelletlen opbevares ved -80 °C, eller fortsæt til lysistrinnet.
   2. Forbered lysis buffer ved at tilføje 1% af digitonin, 1% protease hæmmer, 10% fosfatase hæmmer, og base buffer til det samlede volumen (60 μL per celle pellet).
   3. Der tilsættes 60 μL lysisbuffer til cellepillen på is. Sonicate i 5 s. Lad sidde på is i 8 s. Gentag sonikering og hviletrin to gange.
   4. Inkuber prøver på is i 30 minutter.
   5. Centrifuge ved 14.000 x g i 20 min ved 4 °C.
   6. Overfør supernatanten til rene rør.
   7. Kvantificer prøverne ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA) efter fabrikantens anvisninger.
   8. Bland proteinopløsningen med den passende mængde Laemmli buffer. Lav aliquots på 100 μg. Om nødvendigt justeres lydstyrken til 25 μl med basislyisbuffer. Prøverne opbevares ved -80 °C.
2. Vestlig blotting
   1. Tø prøver på is.
   2. Prøverne denatureres ved 100 °C i 5 min.
   3. 20X Tris-acetat SDS kører buffer i 200 mL dH₂O og tilsæt 500 μL antioxidant.
   4. Forbered 3-8% Tris-acetat polyacrylamid gel ved at fjerne kammen og skylning med dH₂O. Saml gelen i elektroforeseapparatet. Fyld det indre kammer med løbebuffer.
   5. 5 μL proteinstige og 25 μL prøve i gelen. Fyld det ydre kammer med kørende buffer.
   6. Kør ved 80 V i 1 time ved 4 °C. Derefter ved 120 V i 2 timer ved 4 °C.
   7. Forbered 3 L af 1X overførselsbuffer med 150 mL 20X methanol, 150 mL 20X overførselsbuffer og 2.700 mL dH₂O. Afkøles til 4 °C.
   8. Skær 4 stykker filterpapir og et stykke nitrocellulosemembran. Blødgør papirfilteret og membranen i en bakke med overførselsbuffer.
   9. Fjern forsigtigt gelen fra kabinettet og saml den i overførselsapparatet med filterpapir, membran og svampe. Gelen er placeret på den negative side og membranen på den positive side.
   10. Kør overførsel ved 300 mA under omrøring ved 4 °C natten over.
   11. Spær membranen i 10 mL blokeringsbuffer i 1 time med blid omrøring ved stuetemperatur.
   12. Primær antistofopløsning fremstilles med 10 ml blokeringsbuffer og 50 μL dystrophinantistof (1:200).
   13. Kassér blokeringsbufferen, og tilsæt den primære antistofopløsning. Inkuber med let omrøring i mindst 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
   14. Skyl membranen tre gange med 0,1% Tween PBS, i 5 minutter med blid omrøring.
   15. Sekundær antistofopløsning fremstilles ved hjælp af 10 ml blokeringsopløsning, 2 μL antikaninantistof (1:5000) og 20 μL på 0,2% tween.
   16. Tilsæt den sekundære antistofopløsning til membranen. Inkuber i 1 time med blid omrøring, dækket af aluminiumsfolie for at beskytte mod lys.
   17. Antistofopløsningen kasseres, og membranen skylles 3 gange med 0,1% Tween PBS i 5 minutter med let omrøring, beskyttet mod lys.
   18. Eksponering og billede membranen på en billedbehandling enhed.
   19. Plette membranen for total protein med Revert 700 Total Protein pletten, efter producentens anvisninger.
       BEMÆRK: Dystropindetektion ved vestlig blotting afhænger af patientens alder/ mutation og cellens evne til at smelte og forblive fastgjort nok tid til at akkumulere nok dystrophin.

Representative Results

Denne protokol viser, hvordan man etablerer menneskelige hud-afledt fibroblast kulturer og konvertere dem til myoblaster og derefter i differentierede myotubes. Denne type cellelinje er yderst nyttig til undersøgelse af neuromuskulære lidelser og in vitro-test af potentielle terapier.

En skematisk repræsentation af fibroblastkonverteringen er vist i figur 1. Figur 2A viser et fragment af huden og fibroblasterne, der kommer ud af den. Fibroblasterne skal overføres til en ny ret, når sammenløbet er nået (Figur 2B). Figur 3A viser den ideelle sammenløb af fibroblaster, før du skifter til myoblast vækstmedium suppleret med doxycyclin. Cellerne skal være omkring 70% sammenflydende, fordi de stadig formere sig under konverteringsprocessen. Hvis cellerne er over 80% sammensatte, kan differentieringen blive kompromitteret. Konverteringen til myoblaster tager to til fire dage, og det bekræftes ved observation af morfologien. Cellerne bliver aflange og parallelt orienterede, som vist i figur 3B. Efter tilføjelsen af differentieringsmediet holder myoblasterne op med at dividere og begynder at smelte for at danne multinukleerede myorør (Figur 3C). Når myotubes grænser ser hvide og lyse, de er ved at løsne (Figur 4). På dette tidspunkt skal du indsamle eller rette cellerne.

Differentieringssuccesen vil variere mellem forskellige cellelinjer/mutationer. Immunostaining af muskelproteiner udtrykt ved modne myorør bekræfter det myogeniske potentiale af konverterede fibroblaster (Figur 5). RNA-Seq analyse sammenligne FM myorør og skeletmuskulatur viste højt niveau udtryk for udskrifter fra embryonale (MYH3) og neonatal (MYH8) myosin kæde gener og god samlet transcriptome-dækkende korrelation med muskler (Figur 6). Udskrifter for den gigantiske sarkomeriske proteiner titin (TTN), nebulin (NEB), og obscurin (OBSCN) er også udtrykt af FM myotubes, der angiver opregulering af disse store udskrifter involveret i myofibrillogenesis. Fm-celler har således en muskelspecifik ekspressionsprofil, der viser, at de er et nyttigt og pålideligt surrogat for muskelafledte cellelinjer.

For at illustrere exon spring, vi brugte denne protokol i en af de hyppigste exon dobbeltarbejde i DMD genet. Duplikering af exon 2 fører til forstyrrelse af DMD-læserammen, således at restaureringen af læserammen efter exon skipping skal føre til udtrykket af dystrophin i fuld længde. Det er dog også muligt, at spring over exon 2 er meget effektiv, hvilket resulterer i en out-of-frame udskrift. Ikke desto mindre, i dette tilfælde, springe over begge kopier af exon 2 inducerer udnyttelsen af en alternativ intern ribosome entry site (IRES) til stede i exon 5, og dermed producere funktionelle N-afkortet dystrophin, der blev identificeret hos patienter stadig ambulant i 70'erne¹². Figur 7A viser repræsentative resultater af RT-PCR af FM-celler med exon 2-duplikering. FM-celler blev behandlet enten med AON eller AAV1-U7 med en antisensesekvens for at springe exon 2 over. I figur 7Bviser en immunoblot påvisning af N-afkortet dystrophin i FM-celler behandlet med AAV1-U7. In vitro behandling af FM-celler tjener som bevis for konceptet for exon-spring strategier.

Figur 1:Skematisk repræsentation af fibroblaster konvertering til myogen celler. En hudbiopsi opnås fra mennesker. Hudfragmenter placeres på kulturretter. Inden for en uge begynder fibroblaster at dukke op. Fibroblaster transduceres først med hTERT-genet og derefter med Myod-genet ved hjælp af lentivirale vektorer. Efter antibiotika udvælgelse af inficerede celler, konverteringen til myoblaster er induceret ved tilsætning af doxycyclin til myoblast vækstmedium. Inden for to til fire dage bliver cellerne aflange og parallelt orienterede. Efter at have skiftet til differentieringsmediet smelter myoblasten sammen med hinanden og danner multinukleerede myorør. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2:Hudbiopsifragmenter i kulturen. (A)Første fibroblaster på vej ud af huden fragment. (B) Sammenløbsfibroblaster opstod fra hudfragmentet. Skalalinje: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3:Fibroblaster transdifferentiation. (A)Repræsentativt billede af 70% sammenvævede fibroblaster. (B) Konverterede myoblaster har langstrakt morfologi og er parallelt organiseret. (C)Myotubes blev differentieret i 7 dage. Skalalinje: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Repræsentativt billede af afmontering af myorør. Pilene angiver de hvide og lyse kanter af myotubes begynder at løsne. Skalalinje: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5:Immunfluorescens af differentierede myorør. Immunostaining af myosin tung kæde i myorør stammer fra en sund (A) person og patienter med neuromuskulære lidelser (B og C). I B er vist celler fra myotonic dystrofi type 1 (DM1) transporterer 230 CTG gentagelser, og i C er DM1 celler med 900 CTG gentagelser. Skalalinje: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Transskriberingsmønster af FM-myorør sammenlignet med skeletmuskulaturen. Transcriptome mønster af FM myotubes i forhold til skeletmuskulatur. De læste tæller per million kortlagt læser for 12.134 udskrifter er vist for Illumina RNA-Seq biblioteker udarbejdet fra FM myotubes og en menneskelig skeletmuskel biopsi. Udskrift niveauer mellem de to biblioteker havde en Pearson korrelation på 0,71 og en Spearman rang korrelation på 0,73. Udskrifter for den udviklingsmæssige myosin tunge kæder og de store sarkomeriske proteiner er fremhævet med rødt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: Repræsentativ RT-PCR og western blot, der viser DMD exon spring i FM-celler. Fibroblaster fra en patient, der huser en duplikering af DMD exon 2, blev omdannet til FM-celler. RNA udvundet fra muskelbiopsi blev brugt som kontrol, der viser, at FM ubehandlede celler udtrykke den samme duplikerede udskrift. FM-celler behandlet med AON har en delvis spring af exon 2 dobbeltarbejde, mens AAV1-U7 behandlede celler viste en overvægt af udskrifter med exon 2 dobbeltarbejde sprunget over. (B) Repræsentativ immunoblot af FM-celler behandlet med AAV1-U7. Mindre N-afkortet dystrophin blev opdaget 14 dage efter behandlingen (angivet med pilen). Data, der tidligere er offentliggjort i Wein et al. Oversættelse fra en DMD exon 5 IRES resulterer i en funktionel dystrophin isoform, der dæmper dystrofi hos mennesker og mus. Naturmedicin. 2014. 2020 Springer Nature Limited. Klik her for at se en større version af dette tal.

Fibroblast vækstmedium	DMEM med 20% FBS, 1% antibiotika-antimicotic
Frysende medium	10% DMSO, 90% fibroblast medium
Doxycyclin lageropløsning 1000X	8 mg doxycyclin i 1 mL ultra-rent vand. Filter i 0,22 μm sprøjtefilter. Aliquot i PCR rør. Opbevares ved -20 °C, beskyttet mod lys.
Myoblast-medie	Skeletmuskulaturcellevækstmedium (se listen ovenfor) med kosttilskud, 8 μg/mL doxycyclin. For eksempel: 100 μL 1000X lageropløsning i 100 ml.
Differentieringsmedium	Skeletmuskulakulaturcelledifferentieringsmedium med kosttilskud (se listen ovenfor), 8 μg/mL doxycyclin. For eksempel: 100 μL 1000X lageropløsning i 100 ml.
Blokeringsløsning til IF-farvning	10% gedeserum (eller serum af dyr, hvor sekundært antistof blev opdrættet) i 1X PBS
Basisbuffer til proteinudvinding	NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 0,05 % NP-40. Juster pH til 7,4. Opbevares ved 4 °C.

Tabel 1: Mellemstore opskrifter

Discussion

For at opnå FM-cellelinjer af god kvalitet er nogle trin kritiske. Jo før hudens biopsi behandles, jo større er chancerne for at opnå sunde fibroblaster. Passagen antallet af fibroblaster kulturer er også vigtigt. Primære celler har begrænset proliferativ kapacitet, og efter mange passager kommer de ind i replikativ senescens. Således er det bedre at have en bestand af fibroblaster ved et lavt passagenummer og omdanne celler ved den tidligste passage som muligt.

Et andet vigtigt skridt er også at have viral produktion, der har maksimal renhed og nøjagtig kvantificering. For eksempel giver viral genomkvantificering ved hjælp af qPCR rimelige målinger, men kvantificering af ddPCR (digital dråbe PCR) er mere præcis.

Hertil kommer, at tilstrækkelig sammenløb af fibroblaster for myoblast konvertering er kritisk. Hvis cellerne er under 70% eller over 80% sammenflydende, kan den myogeniske differentiering blive forringet. Hvis cellerne er for sammenflydende, vil der være overlejring af lag af myorør, som forstyrrer farvning og billeddannelse. Koncentrationen af doxycyclin er afgørende for korrekt aktivering og vedvarende ekspression af Myod-genet. Det er meget vigtigt altid at tilsætte doxycyclin til mediet lige før medieskift, da det nedbrydes hurtigt efter fortyndet i medium og opbevares ved 4 °C. Bestanden skal opbevares ved -20 °C i en koncentration på 1000X og beskyttes mod lys. Optø ikke optøede aliquots igen. Det er meget vigtigt at følge disse detaljer for at sikre reproducerbare eksperimenter og diskriminere en nedsat differentiering på grund af en genetisk mutation fra tekniske problemer. Ikke desto mindre, afhængigt af mutationen eller typen af sygdom, en god differentiering kan ikke være muligt. For at sikre tillidsfulde resultater er det meget vigtigt at gentage eksperimenter med lignende passagenumre.

Det er vores erfaring, at differentieringen kapacitet fortsætter mindst op til passage 25-27, især i vilde-type kontrol. Det samme kan være gyldigt for nogle syge cellelinjer, men det afhænger af cellelinjen. Nogle DMD cellelinjer stadig bevare myogenic potentiale over P20. I opposition, en myotonisk dystrofi type 1 (DM1) celle linje præsenteret reduceret myogenicitet efter P8. Men i tilfælde af DM1 er dette ikke overraskende, da det er blevet påvist, at mutationer i DM1 indirekte spiller en rolle i muskeldifferentiering¹⁶. Fastholdelsen af den myogeniske differentieringskapacitet bør behandles individuelt, men generelt bevarer de fleste cellelinjer den op til P20-25.

Sammenfattende er konverteringen af fibroblaster til myoblaster et kraftfuldt værktøj til at studere og teste terapeutiske strategier for neuromuskulære lidelser. Det letter adgangen til menneskelige cellemodeller ved at undgå den komplicerede obtention af muskelbiopsier og reducere besværet med en muskelbiopsi for patienterne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red	Thermo Fisher	2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
12-well plate	Corning	3513
20X Transfer buffer	Thermo Fisher	NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer	Thermo Fisher	LA0041
3-8% Tris-Acetate gel	Thermo Fisher	EA0378BOX
75 cm2 flask	Corning	430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X	Thermo Fisher	15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody	Developmental Studies Hybridome Bank	MF20 supernatant	Dilution 1:50
Antioxidant	Thermo Fisher	NP0005
BCA Protein Assay	Thermo Fisher	23227
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
DAPI	Thermo Fisher	D3571	Dilution 1:1000
Digitonin	Millipore Sigma	300410250MG
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate	Thermo Fisher	10569044
DNAse I set (250U)	Zymo Research Corporation	E1010
Doxycycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP2653-5
Dup2 human primers	Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'	Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'
Dystrophin antibody	Abcam	ab15277	Dilution 1:200
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16000
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X	Thermo Fisher	78430
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hygromycin B	Thermo Fisher	10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Li-Cor	926-68071	Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system	Thermo Fisher	15852
Laemmli	Bioworld	105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher	L3000008
Matrigel GFR membrane matrix	Corning	354230
Methanol	Fisher Scientific	A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher	51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	GE Healthcare Life Sciences	10600002
Normal Goat serum control	Thermo Fisher	10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	Li-Cor	927-40003	Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PCR master mix	Thermo Fisher	K0172
Phosphatase inhibitor	Thermo Fisher	A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio Rad	1610374
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization	Li-Cor	926-11021
RevertAid kit	Thermo Fisher	K1691
RNA Clean & Concentrator-25	Zymo Research Corporation	R1018
Scalpels	Aspen Surgical	372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium	Promocell	C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium	Promocell	C23060
Triton X-100	Acros Organics	215682500
TRIzol reagent	Thermo Fisher	15596026
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500
Ultra low temperature freezer	Thermo Scientific	7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Vectashield antifade mounting medium	Vector Labs	H1000