Summary
Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.
Abstract
Las investigaciones sobre la fisiopatología y las dianas terapéuticas en distrofias musculares se han visto obstaculizadas por la limitada capacidad proliferativa de los mioblastos humanos. Se han creado varios modelos de ratón, pero no representan realmente la fisiopatología humana de la enfermedad o no son representativos del amplio espectro de mutaciones que se encuentran en los seres humanos. La inmortalización de los mioblastos primarios humanos es una alternativa a esta limitación; sin embargo, todavía depende de biopsias musculares, que son invasivas y no fácilmente disponibles. Por el contrario, las biopsias cutáneas son más fáciles de obtener y menos invasivas para los pacientes. Los fibroblastos derivados de biopsias de piel pueden ser inmortalizados y transdiferenciados en mioblastos, proporcionando una fuente de células con un excelente potencial miogénico. Aquí, describimos un método de reprogramación rápida y directa de fibroblasto en un linaje miogénico. Los fibroblastos se transducen con dos lentivirus: hTERT para inmortalizar el cultivo primario y un MYODinducible en tet, que tras la adición de doxiciclina, induce la conversión de fibroblastos en mioblastos y luego miotubes maduros, que expresan marcadores de diferenciación tardía. Este protocolo de transdiferenciación rápida representa una poderosa herramienta para investigar mecanismos patológicos e investigar bioterapias innovadoras basadas en genes o farmacológicas para trastornos neuromusculares.
Introduction
Los modelos celulares obtenidos directamente de los tejidos humanos son útiles para modelar muchos trastornos genéticos humanos, con la ventaja de tener el contexto genómico original y, en muchos casos, reproducir las mismas señas de identidad moleculares y celulares observadas en los pacientes. En el campo de los trastornos neuromusculares, biopsias musculares han sido una gran fuente de mioblastos humanos y han ayudado en la elucidación de mecanismos patológicos. Además, son una herramienta importante para las pruebas in vivo de fármacos y terapias génicas. Por un lado, la derivación de mioblastos de fragmentos musculares es relativamente fácil. Por otro lado, la cultura y el mantenimiento de los mioblastos primarios son difíciles, debido a su limitada tasa de proliferación y senescencia replicativa in vitro1. Una alternativa para estas limitaciones es inmortalizar los mioblastos con la inserción de los genes telomerasa humana(hTERT)y/o quinasa 4(CDK4)dependientes de la ciclina2,3,con preservación de las características musculares esqueléticas4. Sin embargo, la obtensión de los mioblastos primarios sigue dependiendo de la biopsia muscular, un procedimiento quirúrgico con desventajas para los pacientes, que, en muchos casos, tienen sus músculos en degeneración avanzada. Así, el músculo de estos pacientes se compone de una proporción significativa de tejido fibromático y/o adiposo y produce menos células musculares, requiriendo la purificación de las células previamente a la inmortalización.
A diferencia de las biopsias musculares, las biopsias de la piel son más accesibles y son menos dañinas para los pacientes. Los fibroblastos primarios se pueden derivar de fragmentos de piel in vitro. Aunque los fibroblastos no se ven afectados principalmente por mutaciones que causan trastornos neuromusculares, pueden ser transdiferenciados en mioblastos. Esto se puede lograr mediante la inserción del gen Myod, un factor de transcripción regulador miogénico5. En este manuscrito, describimos el protocolo para obtener mioblastos transdiferenciados, desde el establecimiento de cultivos de fibroblastos hasta la obtensión de miotubes diferenciados (se representa un resumen representativo del método en la Figura 1).
Las pruebas preclínicos de estrategias terapéuticas dependen de modelos celulares y animales portadores de mutaciones similares a las mutaciones encontradas en pacientes humanos. Aunque el desarrollo de modelos animales se ha vuelto más factible con el avance de tecnologías de edición genética como CRISPR/Cas96,sigue siendo desafiante y costoso. Por lo tanto, las líneas celulares derivadas del paciente son una opción accesible para tener modelos, cubriendo el gran espectro de mutaciones de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). La obtención y la creación de modelos celulares son cruciales para el desarrollo de terapias personalizadas para este tipo de patologías.
Entre las terapias personalizadas que se han investigado, las estrategias de salto exon es una de las prometedoras para diferentes distrofias musculares7,8. Esta estrategia consiste en producir una proteína más corta pero funcional. Esto se realiza ocultando la definición exon al empalme, excluyendo así el exon mutado del mensajero final. Esta es una tecnología muy prometedora que ha sido aprobada por la FDA para dmd. Así, también describimos en este protocolo, métodos para transfectar mioblasts con dos exon diferentes saltando tecnologías relacionadas: oligonucleótidos antisense (AON) y virus asociados al U7snRNA-adeno (AAV). La transfección AON es una buena herramienta para la proyección inicial de varias secuencias diseñadas para promover el salto exon9. Sin embargo, la actividad de los AON es transitoria. Para obtener una expresión sostenida de secuencias antisense, también exploramos pequeñas ANR nucleares (SNRNAs) combinadas con AAV, permitiendo la localización e inclusión nuclear en la maquinaria de empalme10. U7 es un snRNA implicado en el procesamiento de ARNm de histona que se puede diseñar para unir proteínas que lo redirigirán al empalme y entregarán secuencias antisense11. El uso de SNRNAs U7 modificados en combinación con vectores AAV supera las limitaciones de los AONs, lo que resulta en una expresión continua de los ANV y una mejor transducción de tejidos de interés12. Utilizamos células derivadas de pacientes con DMD para este protocolo para ilustrar la estrategia de salto exon.
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Protocol
Todos los experimentos y biopsias se llevaron a cabo siguiendo las reglas éticas de las instituciones involucradas bajo la aprobación de la Junta Nacional de Revisión Institucional del Hospital de Niños.
1. Inicio del cultivo de fibroblastos dérmicos
- Establecimiento del cultivo de fibroblastos
- Aliquot 10 mL de medio fibroblasto(Tabla 1)en tubos cónicos de 15 ml. La biopsia de la piel debe colocarse y transportarse en este medio. La biopsia se puede almacenar a 4 °C hasta que se procese, preferentemente el mismo día.
NOTA: Utilice la biopsia de piel en un plazo de 24-36 horas para evitar el crecimiento potencial de la contaminación. - Aspirar los medios del tubo y enjuagar la biopsia con 10 mL 1X PBS (temperatura ambiente) tres veces. Después del tercer lavado, deje el PBS en el tubo.
- Vierta el PBS y la piel en un plato de 10 cmy 2.
- Usando bisturíes estériles, corta la biopsia en fragmentos lo más pequeños posible.
- Con una pipeta, transfiera un fragmento de piel individual y colópelo en un plato limpio de 10 cmy 2. Coloque de 10 a 12 fragmentos por plato.
- Aspirar el exceso de PBS de alrededor de cada fragmento. Tenga cuidado de no aspirar el fragmento.
- Cubra los platos parcialmente con la tapa y deje que los fragmentos de la piel se sequen durante 5-20 min. No permita que los fragmentos se sequen excesivamente.
- Una vez que los fragmentos estén secos, incline el plato a 45 grados y agregue lentamente 12 ml de fibroblasto medio a la esquina. Baje el plato, distribuyendo cuidadosamente los medios de comunicación para que los fragmentos no los levanten los medios de comunicación.
- Coloque los platos en la incubadora (37 °C, 5% CO2). Reemplace los medios en 5-7 días, y una vez a la semana siguiente.
- Observe los fibroblastos que emergen del fragmento(Figura 2)y, una vez confluentes, pase las células a frascos de 75 cmy 2. Retire el medio, enjuague las células con PBS y agregue 1 mL 0.25 % trypsin. Incubar a 37 °C durante 5 minutos o hasta que se levanten todas las células. Añadir 10 mL fibroblasto medio de crecimiento para inhibir la trippsina y transferir las células a un nuevo matraz.
NOTA: Para la nomenclatura del número de paso, P1 se establece cuando los primeros fibroblastos que surgieron de la biopsia de la piel se transfieren a un nuevo matraz para la proliferación.
- Aliquot 10 mL de medio fibroblasto(Tabla 1)en tubos cónicos de 15 ml. La biopsia de la piel debe colocarse y transportarse en este medio. La biopsia se puede almacenar a 4 °C hasta que se procese, preferentemente el mismo día.
- Criopreservación de las líneas primarias de fibroblastos
- Una vez que el matraz de 75 cm2 sea confluente, enjuáguelo con 10 mL 1X PBS y aspirar PBS.
- Añadir 3 ml de 0,25 % de trypsina a la superficie celular. Coloque el matraz en la incubadora durante 5 minutos. Compruebe los matraces debajo del microscopio para ver si las células están levantadas. Si no es así, coloque el matraz de nuevo en la incubadora durante 5 minutos adicionales.
- Una vez que las células están separadas, agregue 7 ml de medios fibroblastos al matraz y pipeta hacia arriba y hacia abajo para volver a usar las células. Recoge las células en un tubo cónico de 50 ml.
- Preparar 100 μL aliquot de azul tripán, y eliminar 100 μL de la muestra que se está criopreservando, mezclar con el azul trypan. Cargue la mezcla en el hemociclo para contar. Cuente las células en cuatro campos diferentes del hemociclograma bajo el microscopio. Para calcular el número total de celdas, utilice la fórmula: (celdas contadas/100) * volumen de cultivo.
- Gire los tubos cónicos a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente o a 4 °C.
- Aspirar fuera del medio y resuspend las células en el volumen adecuado de medio de congelación: 1 mL por cada 1 millón de células / vial. Pipeta arriba y abajo para homogeneizar y distribuir 1 mL a cada criovial etiquetado.
- Coloque los viales en la caja de congelación y deje que los viales se congele a una velocidad de 1 °C/min a -80 °C congelador durante la noche.
- Al día siguiente transfiera los viales a un tanque de nitrógeno líquido o al congelador -150 °C.
2. Establecimiento de la línea celular FibroMyoblasts (FM)
- Fibroblastos primarios de semillas en aproximadamente el 30% de la confluencia en dos pozos de una placa de 12 pozos (2 x 104 células/pozo) con el fin de tener alrededor del 50% de la confluencia al día siguiente.
- Para la transducción lentiviral, añadir de 2 a 5 x 109 vg (partículas del genoma viral) de hTERT-puromicina lentivirus en 400 μL de medio fibroblasto. Al segundo pozo, agregue sólo 400 μL de fibroblasto medio. Agregue 1 ml de medios al día siguiente.
NOTA: Los plásmidos para la producción de lentivirus se obtuvieron del grupo que publicó el artículo Chaouch et al, 2009. También se describen individualmente en Aure et al, 200713 para plásmido hTERT y Barde et al, 200614 para el sistema Tet-on utilizado para el diseño de plásmido MyoD. Se obtuvieron gracias a un Acuerdo de Transferencia de Material con Genethon, Francia (póngase en contacto con el Dr. Vincent Mouly para obtener estos plásmidos - vincent.mouly@upmc.fr). Brevemente, el hTERT consiste en hTERT variante 1 conducido por un promotor CMV mientras que la puromicina es impulsada por un promotor PGK. El plásmido MyoD contiene una variante myoD 1 impulsada por un promotor cmv bajo el control del represor rtTA2. Este plásmido también contiene la selección de higromicina expresada gracias al promotor SV40.
Los Lentivirus se produjeron utilizando la producción lentiviral regular (véase el protocolo Wang y McManus JoVe15). Brevemente, MDL-helper, Rev-Helper, SVS-G-helper fueron transfectados a través de la precipitación de cloruro de calcio también de plásmidos hTERT o MyoD. Después de las 48 h, el sobrenadante fue recogido, y luego por tres días adicionales. Todo sobrenadante se concentró entonces por ultracentrifugación. A continuación, el pellet se resuspendó en el búfer Tris-HCL+NaCl+EDTA. La estimación del titer fue evaluada por el ensayo estándar de lentivirus qPCR. - Uno o dos días más tarde, transfiera las células a una placa de 6 pozos y cultivarlas hasta alcanzar el 60-70% de confluencia.
- Complemente el medio fibroblasto con 1 μg/ml de puromicina y agregue 2 ml a cada pozo.
- Mantenga las celdas bajo selección hasta que todas las celdas del pozo de control estén muertas (hasta 12 días), cambiando los medios cada 2-3 días. Pasa las células del plato de 6 pozos a dos platos de 10 cmy 2 para una mayor proliferación.
- Congelar viales de fibroblastos después de la selección. Etiqueta como F(hTer).
- Fibroblastos que expresan hTERT de semillas (F(hTer)) con aproximadamente un 30% de confluencia en el medio fibroblasto, en dos pozos de una placa de 12 pozos, para tener alrededor del 50% de confluencia al día siguiente.
- Para la transducción del lentivirus, mezcle de 2 a 5 x 109 vg de MyoD-hygromycinB lentivirus en 400 μl de fibroblasto medio y añada a los pozos respectivos; al tercer pozo añadir 400 μl de fibroblasto medio. Añadir 1 ml de medio al día siguiente.
- Uno o dos días más tarde transfiere las células a una placa de 6 pozos y crece hasta un 60-70% de confluencia.
- Complemente el medio de crecimiento de fibroblastos con higromicina B (400 μg/ml) y agregue 2 ml a cada pozo.
- Mantenga las celdas bajo selección hasta que todas las celdas del pozo de control estén muertas (hasta 12 días), cambiando los medios cada 2-3 días.
- Congelar viales de fibroblastos después de la selección. Etiquetar como FM seguido por el número/nombre de identificación de la celda.
3. Protocolo de transdiferenciación
- Semilla transducida FM en 10 cm2 platos con 30-40% de confluencia. En una placa de 12 pozos, sembrar 6 x 104 células (esto depende de la línea celular individual).
NOTA: Para la inmunodetención, las células de semillas en las cubiertas de vidrio o las toboganes de cámara recubiertas con Matrigel. Diluya Matrigel a la 1:10 en el medio DMEM, agregue un volumen suficiente para cubrir la superficie y deje que los toboganes se sienten a temperatura ambiente durante una hora. Aspirar justo antes de sembrar las células. - Para la inducción de mioblastos, cuando los fibroblastos alcanzaron el 70% de confluencia(Figura 3A),enjuagar la superficie celular con PBS y añadir medios de mioblastos frescos complementados con doxycyclina fresca de 8 μg/ml.
NOTA: El éxito de la diferenciación se ve comprometido más allá del 80% de confluencia. - Después de dos o tres días después, las células son 90-95% confluentes y su morfología habrá cambiado (Figura 3B). Enjuague la superficie celular con PBS y agregue medios de diferenciación frescos complementados con doxycyclina fresca de 8 μg/ml.
- Continúe cambiando de medio cada 2-3 días sin pasar hasta que se establezcan los myotubes (confirmar a través de morfología) (Figura 3C).
- Siete a diez días después de comenzar la diferenciación de miotube, las células deben ser completamente diferenciadas y pueden comenzar a desprenderse o morir. Antes de que esto suceda, coseche los miotubes para su posterior análisis.
NOTA: El curso de tiempo de la formación de miotube depende de la línea celular. Las mutaciones en proteínas relacionadas con el músculo pueden interferir en el potencial miogénico. Cuando los myotubes comienzan a aparecer brillantes y miran de blanco los bordes es una señal que están empezando a separar (Figura 4). - Para cosechar miotubes, recoge los medios y transfiéralo a un tubo cónico de 50 ml. El medio puede contener miotubes que se han desprendido.
- Enjuague los myotubes con PBS de 5 ml y transfiera PBS al tubo de 50 ml.
- Añadir 3 ml de 0,25 % de trypsina a la superficie celular. Coloque el plato en la incubadora durante 5 minutos. Compruebe el plato debajo del microscopio para ver si las células están levantadas. Si no es así, colóquelo de nuevo en la incubadora durante 5 minutos adicionales.
- Una vez que las células estén separadas, agregue 7 ml de medios fibroblastos al plato y pipeta hacia arriba y hacia abajo para volver a usar las células. Recoja las células al tubo cónico de 50 ml.
- Centrífuga a 1.200 x g durante 7 min a 4 °C.
- Aspirar cuidadosamente fuera del líquido, sin perturbar el pellet. Guarde los pellets a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
4. Inmunodetención de miotubes diferenciados
NOTA: Para la inmunodetención, haga crecer las células en manchas de vidrio o toboganes de cámara como se indicó anteriormente.
- Una vez que los miotubes están completamente diferenciados, aspirar fuera de los medios y enjuagar cuidadosamente las diapositivas con PBS. Aspirar PBS apagado.
- Añadir PFA fresco al 4% (500 μL por pozo de una placa de 12 pozos) e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Aspirar PFA apagado.
- Enjuague con 1 mL PBS.
- Incubar con glicina de 0,2 M a temperatura ambiente, durante 10 min. Aspirar glicina.
- Permeabilizar con PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL/pozo de una placa de 12 pozos), durante 10 min con agitación suave.
- Bloquee con 300 μL/pozo de solución de bloqueo, durante 10 minutos con agitación suave.
- Incubar con anticuerpo primario diluido 1:50 en 300 μL de solución de bloqueo, durante 2 horas a temperatura ambiente, con suave agitación.
- Enjuague tres veces con 1 mL/pozo de PBS durante 5 minutos, con suave agitación.
- Incubar con anticuerpo secundario diluido 1:500 en 300 μL de solución de bloqueo, durante 1 hora, a temperatura ambiente, con suave agitación. Cubra la placa con papel de aluminio.
- Enjuague tres veces con 1 mL/pozo de PBS durante 5 minutos, con suave agitación.
- Incubar con DAPI diluido en PBS durante 10 minutos. Enjuague tres veces con 1 mL/pozo de PBS.
- Agregue una gota de medio de montaje a una diapositiva de vidrio. Retire la tapa con fórceps y colóquela boca abajo en la caída del medio de montaje.
- Invierta el deslizamiento sobre una toalla de papel y presione suavemente para eliminar burbujas y el exceso de medio de montaje.
- Selle las diapositivas con esmalte de uñas y guárdelo a 4 °C hasta que se tocen las imágenes.
5. Transfección de oligonucleótidos antisense
NOTA: El protocolo a continuación es para la transfección de una placa de 6 pozos. Ajuste los volúmenes en consecuencia para placas más pequeñas o más grandes. La transfección se realiza en mioblastos 100% confluentes cuando las células están listas para el paso de diferenciación.
- Aspirar el medio de crecimiento de mioblast y enjuagar las células con 1 mL PBS.
- Añadir 500 μL/pozo de medios OptiMEM e incubar a 37 °C durante 1 hora.
- Diluir el oligonucleótido antisense (AON) en 100 μL de OptiMEM a la concentración final deseada (es decir, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
NOTA: Este protocolo está optimizado para AONs 2'ometil-fosforotioato. - Mezclar la lipofectamina con OptiMEM (volumen final de 100 μL) para dar una relación final de 1:1 (ADN μg: lipofectamina μL). Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Combine la lipofectamina diluida con el AON diluido. Mezcle suavemente pipeteando e incubando durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir una formación compleja. Evite las burbujas de aire.
- Añadir 200 μL de lipofectamina y mezcla de AON a los pozos respectivos. Incubar las células durante la noche a 37 °C, 5% CO2.
- Al día siguiente eliminar la mezcla de transfección y añadir 2 ml de medios de diferenciación caliente complementados con doxiciclina.
- Recoger células al menos tres días después para la extracción de ARN o de siete a 21 días en caso de análisis de proteínas.
NOTA: Los días de diferenciación necesarios para detectar el ARN y/o la expresión proteica pueden variar en consecuencia según el gen de interés o la línea celular. En el caso de dmd,es posible detectar su ARNm en un plazo de tres días. La detección de proteínas de distrofina requiere al menos siete días. Esto variará dependiendo de la línea celular. Las altas concentraciones de AON y reactivo de transfección pueden afectar la transdiferenciación.
6. Transducción AAV1-U7
NOTA: Este protocolo fue optimizado para placas de 6 pozos. Ajuste los volúmenes proporcionalmente a la superficie de cultivo. La transducción se realiza en mioblastos 100% confluentes cuando las células están listas para el paso de diferenciación. AAV1 es el serotipo AAV con la mejor capacidad de transducción de mioblasts cultivados.
- Aspirar fuera del medio de crecimiento de mioblastos y enjuagar las células con 1 mL PBS.
- Diluir 0,5-1 x 1011 partículas virales de AAV1-U7 en 700 μL de medios de diferenciación cálidos complementados con doxiciclina.
NOTA: Utilizamos qPCR para determinar la concentración viral. La cantidad de virus a utilizar puede variar dependiendo del método de cuantificación y debe determinarse previamente utilizando un ensayo de reportero. - Añade la mezcla viral al pozo soltándola homogéneamente.
- Al día siguiente, añadir 1,3 ml de medios de diferenciación cálidos complementados con doxiciclina.
- Recoger las células al menos tres días después para la extracción de ARN o de siete a 21 días en caso de análisis de proteínas.
7. Extracción de ARN
NOTA: Todo el material utilizado durante este paso debe estar libre de RNase.
- Añadir 500 μL de TRIzol por pellet y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que las células se lilicen homogéneamente.
- Transfiera el lisato celular en un tubo de 1,5 ml e incubado durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 100 μL de cloroformo y agitar manualmente durante 15 s. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Recoger la fase acuosa (superior) y transferirla a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Para 1 volumen de la fase acuosa, agregue 1 volumen de etanol 100% y mezcle por pipeteo.
NOTA: Recomendamos purificación y concentración de columnas. - Transfiera la muestra a una columna IC Zymo-Spin en un tubo de recogida y centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través.
- Para la digestión DNase I en columna, prelavar la columna con 400 μL RNA Wash Buffer. Centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través.
- Prepare 40 μL de mezcla de reacción DNase por muestra. Mezclar 5 μL DNase I con 35 μL dna digestión buffer.
- Agregue la mezcla directamente a la matriz de columnas. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
- Agregue 400 μL RNA Prep Buffer a la columna y centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través.
- Añadir 700 μL RNA Wash Buffer a la columna y centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través.
- Añadir 400 μL RNA Wash Buffer a la columna y centrífuga a 12.000 x g durante 2 minutos para garantizar la eliminación completa del búfer de lavado. Transfiera la columna cuidadosamente a un tubo RNase-free de 1,5 ml.
- Agregue 15 μL de agua libre de nucleasa directamente a la matriz de columnas. Incubar durante 5 minutos y centrífuga a 12.000 x g durante 1 minuto.
NOTA: Recoja el ARN eluted y aplíquelo de nuevo a la columna para aumentar el rendimiento. Centrífuga a 12.000 x g durante 1 minuto. - Coloque muestras sobre hielo y cuantifique las muestras en un Nanodrop.
- Almacene muestras a -80 °C.
8. Análisis RT-PCR
NOTA: En este paso, presentamos una sugerencia de reactivos para detectar la expresión del ARNm de distrofina, pero se puede adaptar fácilmente a otros reactivos de elección.
- transcripción inversa
- Descongela todos los reactivos y mantenlos en hielo.
- Preparar una mezcla con 4 μL de 5x búfer de reacción, 2 μL de mezcla dNTP (10 mM), 1 μL de inhibidor ribolock RNase y 1 μL de RevertAid RT.
- Mezcle el tubo suavemente y centrífuga brevemente.
- En tubos PCR de 0,2 ml, añada el volumen adecuado de ARN para tener 1 μg por reacción. Añadir agua libre de nucleasa q.s.p 12 μL. Incluya un tubo sin la transcriptasa inversa como control negativo y un tubo con agua libre de nucleasa en lugar de ARN.
- Distribuya 8 μL de mezcla de reacción por tubo. El volumen total es de 20 μL.
- Coloque los tubos en un termociclo e incubar durante 5 minutos a 25 °C seguido de 60 min a 42 °C. Detenga la reacción calentando a 70 °C durante 5 minutos.
- Coloque los tubos sobre hielo o a -20 °C para mayor almacenamiento.
- PCR
NOTA: Diseño de imprimaciones en cruces exons preferiblemente.- Reactivos de vórtice y gire hacia abajo antes de su uso.
- Preparar una mezcla maestra utilizando 0,5 μL de imprimación hacia adelante (25 μM), 0,5 μL de imprimación inversa (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix y 8,5 μL de agua sin nucleasa por muestra.
- Aliquot 22 μL de mezcla maestra en un tubo para cada muestra.
- Añadir 3 μL de cDNA (150 ng) a su tubo PCR respectivo. Añadir 3 μL de agua libre de nucleasa al tubo de control negativo PCR.
- Vórtice y girar por los tubos PCR.
- Incubar los tubos en un termociclo a 95 °C durante 3 min, 95 °C para 30 s, (Tm-5) °C para 30 s, 72 °C para (1 min/kb) 34 veces, 72 °C durante 5 minutos.
NOTA: La temperatura óptima de recocido se puede determinar empíricamente. Para la mezcla maestra sugerida, reste 5 °C de la temperatura de fusión de imprimación. - Cargue 12 μL de la reacción PCR en un gel de agarose y congele las muestras a -20 °C.
9. Detección de la expresión de distrofina por Western Blotting
NOTA: Este protocolo está optimizado para la distrofina, una gran proteína de membrana. Pueden ser necesarias condiciones específicas para diferentes proteínas.
- Extracción de proteínas
- Después de 7-21 días de diferenciación, recoger células con 5 ml de PBS con 100 μL 0.5 M EDTA, y 50 μL inhibidores de la proteasa. Incubar a 37 °C hasta que las células se desprendan. Centrífuga a 1.200 x g durante 5 min a 4 °C. Enganche el pellet sumergiendo el tubo en nitrógeno líquido. Almacene el pellet a -80 °C o continúe con el paso de lisis.
- Preparar el búfer de lisis añadiendo 1% de digitonina, 1% inhibidor de la proteasa, 10% inhibidor de la fosfatasa, y buffer base al volumen total (60 μL por pellet celular).
- Agregue 60 μL de tampón de lisis al pellet celular, sobre hielo. Sonicate por 5 s. Deja reposar en hielo durante 8 s. Repita los pasos de sonicación y descanso dos veces.
- Incuba muestras en hielo durante 30 minutos.
- Centrífuga a 14.000 x g durante 20 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a tubos limpios.
- Cuantificar muestras por ensayo de ácido bicinchoninic (BCA), siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Mezcle la solución proteica con el volumen adecuado del búfer Laemmli. Hacer coácuotas de 100 μg. Si es necesario, ajuste el volumen a 25 μl con el búfer de lisis base. Almacene muestras a -80 °C.
- Hinchazón occidental
- Descongelar muestras en hielo.
- Desenvríe las muestras a 100 °C durante 5 minutos, luego enfríe en hielo, gire hacia abajo.
- Diluir el amortiguador de funcionamiento 20X Tris-acetato SDS en 200 ml dH2O y añadir 500 μL antioxidante.
- Prepare el gel de poliacrilamida tris-acetato del 3-8% quitando el peine y enjuagando con dH2O. Montar el gel en el aparato de electroforesis. Llene la cámara interna con el búfer en ejecución.
- Cargue 5 μL de escalera proteica y 25 μL de muestra en el gel. Llene la cámara externa con el búfer en ejecución.
- Correr a 80 V durante 1 h a 4 °C. Luego, a 120 V por 2 h a 4 °C.
- Prepare 3 L de búfer de transferencia 1X con 150 ml de metanol de 20X, 150 ml de búfer de transferencia de 20X y 2.700 ml de dH2O. Enfríe hasta 4 °C.
- Corte 4 trozos de papel filtrante y un trozo de membrana nitrocelulosa. Remoje el filtro de papel y la membrana en una bandeja con búfer de transferencia.
- Retire suavemente el gel de la caja y ensérrelo en el aparato de transferencia con papel de filtro, membrana y esponjas. El gel se coloca en el lado negativo y la membrana en el lado positivo.
- Ejecute la transferencia a 300 mA, revolviendo, a 4 °C, durante la noche.
- Bloquee la membrana en 10 ml de amortiguador de bloqueo durante 1 h con agitación suave, a temperatura ambiente.
- Preparar la solución de anticuerpos primarios con 10 ml de búfer de bloqueo y 50 μL de anticuerpo de distrofina (1:200).
- Deseche el búfer de bloqueo y agregue la solución de anticuerpos principal. Incubar con agitación suave durante al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
- Enjuague la membrana tres veces con 0.1% PBS de interpolación, durante 5 minutos con agitación suave.
- Preparar solución secundaria de anticuerpos utilizando 10 ml de solución de bloqueo, 2 μL de anticuerpo anti-conejo (1:5000) y 20 μL de 0,2% de interpolación.
- Agregue la solución secundaria de anticuerpos a la membrana. Incubar durante 1 h con agitación suave, cubierto con papel de aluminio para proteger de la luz.
- Deseche la solución de anticuerpos y enjuague la membrana 3 veces con 0.1% Tween PBS, durante 5 minutos con agitación suave, protegido de la luz.
- Exposición e imagen de la membrana en un dispositivo de imágenes.
- Manchar la membrana para la proteína total con la mancha total de proteína Revert 700, siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA: La detección de distrofina por hinchazón occidental depende de la edad/mutación del paciente y la capacidad de la célula para fusionarse y permanecer unido suficiente tiempo para acumular suficiente distrofina.
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Representative Results
Este protocolo muestra cómo establecer cultivos de fibroblastos derivados de la piel humana y convertirlos en mioblastos y luego en miotubes diferenciados. Este tipo de línea celular es extremadamente útil para el estudio de trastornos neuromusculares y pruebas in vitro de terapias potenciales.
Se muestra una representación esquemática de la conversión fibroblasta en la figura 1. La Figura 2A muestra un fragmento de piel y los fibroblastos que emergen de ella. Los fibroblastos deben pasarse a un plato nuevo cuando se alcanza la confluencia(Figura 2B). Figura 3A muestra la confluencia ideal de fibroblastos antes de cambiar a mioblasto medio de crecimiento complementado con doxiciclina. Las células deben ser alrededor del 70% confluentes porque todavía proliferan durante el proceso de conversión. Si las células están por encima del 80% de confluentes, la diferenciación puede verse comprometida. La conversión en mioblastos tarda de dos a cuatro días, y se confirma mediante la observación de la morfología. Las células se alargan y se orientan paralelamente, como se muestra en la Figura 3B. Después de la adición del medio de diferenciación, los mioblasts dejan de dividirse y comienzan a fusionarse para formar miotubes multinucleados (Figura 3C). Cuando los bordes de los myotubes se ven blancos y brillantes, están a punto de desprenderse (Figura 4). En este punto, recopile o corrija las celdas.
El éxito de diferenciación variará entre diferentes líneas celulares/mutaciones. La inmunodetención de proteínas musculares expresadas por miotubes maduros confirma el potencial miogénico de los fibroblastos convertidos (Figura 5). El análisis de ARN-Seq que comparó los miotubes FM y el músculo esquelético mostró una expresión de alto nivel de transcripciones de los genes embrionarios (MYH3) y neonatales (MYH8) de la cadena de miosina y una buena correlación general de todo el transcriptoma con el músculo (Figura 6). Las transcripciones de las proteínas sarcoméricas gigantes titina (TTN), nebulina (NEB) y oscurina (OBSCN) también son expresadas por myotubes FM, lo que indica una regulación de estas grandes transcripciones implicadas en la miofibrillogénesis. Por lo tanto, las células FM tienen un perfil de expresión específico del músculo, demostrando que son un sustituto útil y confiable para las líneas celulares derivadas del músculo.
Para ilustrar el salto exon, usamos este protocolo en una de las duplicaciones de exon más frecuentes en el gen DMD. La duplicación de exon 2 conduce a la interrupción del marco de lectura dmd, por lo tanto, la restauración del marco de lectura después de salto exon debe conducir a la expresión de la distrofina de longitudcompleta. Sin embargo, también es posible que saltarse exon 2 sea muy eficiente, lo que resulta en una transcripción fuera de fotogramas. Sin embargo, en este caso, saltarse ambas copias de exon 2 induce la utilización de un sitio de entrada de ribosoma interno alternativo (IRES) presente en exon 5, produciendo así distrofina funcional truncada N que se identificó en pacientes aún ambulantes en sus 70s12. La Figura 7A muestra los resultados representativos de RT-PCR de las células FM con duplicación exon 2. Las células FM fueron tratadas con AON o AAV1-U7 llevando una secuencia antisensa para omitir exon 2. En la Figura 7B, un inmunoblot muestra la detección de la distrofina truncada N en células FM tratadas con AAV1-U7. El tratamiento in vitro de las células FM sirve como prueba de concepto para las estrategias de salto de exon.
Figura 1: Representación esquemática de la conversión de fibroblastos en células miogénicas. Se obtiene una biopsia de piel de sujetos humanos. Los fragmentos de piel se colocan en platos de cultivo. Dentro de una semana, empiezan a surgir fibroblastos. Los fibroblastos primero se transducen con el gen hTERT y luego con el gen Myod, utilizando vectores lentivirales. Después de la selección de antibióticos de las células infectadas, la conversión en mioblastos es inducida por la adición de doxiciclina al medio de crecimiento de mioblastos. Dentro de dos a cuatro días, las células se alargan y se orientan paralelamente. Después de cambiar al medio de diferenciación, el mioblasto se fusiona entre sí y forma myotubes multinucleados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fragmentos de biopsia de piel en el cultivo. (A) Primeros fibroblastos que emergen del fragmento de la piel. B) Los fibroblastos confluentes emergieron del fragmento de la piel. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Transdiferenciación de fibroblastos. (A) Imagen representativa de fibroblastos confluentes al 70%. B) Los mioblastos convertidos tienen morfología alargada y están organizados paralelamente. (C) Los miotubes se diferenciaron durante 7 días. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen representativa de desmontar myotubes. Las flechas indican los bordes blancos y brillantes de los myotubes que comienzan a desprenderse. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Inmunofluorescencia de miotubes diferenciados. Inmunodetención de cadena pesada de miosina en miotubes derivados de un individuo sano(A)y pacientes con trastornos neuromusculares (B y C). En B se muestran células de distrofia miotónica tipo 1 (DM1) que llevan 230 repeticiones CTG, y en C son células DM1 con 900 repeticiones CTG. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Patrón de transcriptoma de myotubes FM en comparación con el músculo esquelético. Patrón de transcriptoma de myotubes FM en comparación con el músculo esquelético. Los recuentos de lectura por millón de lecturas mapeadas para 12.134 transcripciones se muestran para las bibliotecas illumina RNA-Seq preparadas a partir de miotubes FM y una biopsia muscular esquelética humana. Los niveles de transcripción entre las dos bibliotecas tenían una correlación de Pearson de 0,71 y una correlación de rango de Spearman de 0,73. Las transcripciones para las cadenas pesadas de miosina de desarrollo y las grandes proteínas sarcoméricas se resaltan en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Representante RT-PCR y mancha occidental que muestra el exon DMD saltando en las celdas FM. (A) Expresión DMD por RT-PCR. Los fibroblastos de un paciente que albergaba una duplicación de DMD exon 2 se convirtieron en células FM. Arn extraído de la biopsia muscular se utilizó como el control, mostrando que las células sin tratar FM expresan la misma transcripción duplicada. Las células FM tratadas con AON tienen una omisión parcial de la duplicación de exon 2, mientras que las células tratadas con AAV1-U7 mostraron un predominio de transcripciones con duplicación exon 2 omitidas. (B) Inmunoblot representativo de células FM tratadas con AAV1-U7. Distrofina más pequeña truncada N se detectó 14 días después del tratamiento (indicado por la flecha). Datos publicados previamente en Wein et al. La traducción de un DMD exon 5 IRES da como resultado una isoforma de distrofina funcional que atenúa la distrofinopatía en humanos y ratones. Medicina de la Naturaleza. 2014. 2020 Springer Nature Limited. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio de crecimiento de fibroblastos | DMEM con 20% FBS, 1% antibiótico-antimicotico |
| Medio de congelación | 10% DMSO, 90% medio de fibroblasto |
| Solución de stock de doxiciclina 1000X | 8 mg de doxiciclina en 1 ml de agua ultra-pura. Filtro en filtro de jeringa de 0,22 μm. Aliquot en tubos PCR. Conservar a -20 °C, protegido de la luz. |
| Medio myoblast | Medio de crecimiento de células musculares esqueléticas (ver lista anterior) con suplementos, 8 μg /mL doxiciclina. Por ejemplo: 100 μL de solución de stock 1000X en 100 ml. |
| Medio de diferenciación | Medio de diferenciación de células musculares esqueléticas con suplementos (ver lista anterior), 8 μg /mL doxiciclina. Por ejemplo: 100 μL de solución de stock 1000X en 100 ml. |
| Solución de bloqueo para manchas IF | 10% suero de cabra (o suero de animal en el que se elevó anticuerpo secundario) en 1X PBS |
| Amortiguador base para extracción de proteínas | NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 0,05 % NP-40. Ajuste el pH a 7,4. Conservar a 4 °C. |
Tabla 1: Recetas medianas
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Discussion
Para obtener líneas celulares FM con buena calidad, algunos pasos son críticos. Cuanto antes se procese la biopsia de la piel, mayores serán las posibilidades de obtener fibroblastos sanos. El número de pasajes de cultivos de fibroblastos también es importante. Las células primarias tienen una capacidad proliferativa limitada y después de muchos pasajes, entran en senescencia replicativa. Por lo tanto, es mejor tener un stock de fibroblastos en un número de paso bajo y transformar las células en el paso más temprano posible.
Otro paso importante es también tener una producción viral que tenga la máxima pureza y cuantificación precisa. Por ejemplo, la cuantificación del genoma viral mediante qPCR proporciona mediciones razonables, pero la cuantificación por ddPCR (PCR de gota digital) es más precisa.
Además, la confluencia adecuada de fibroblastos para la conversión de mioblastos es fundamental. Si las células están por debajo del 70% o por encima del 80% confluentes, la diferenciación miogénica puede verse afectada. Si las células son demasiado confluentes, habrá la superposición de capas de miotubes, que interfieren con la tinción y las imágenes. La concentración de doxiciclina es crucial para la correcta activación y expresión sostenida del gen Myod. Es muy crítico añadir siempre la doxiciclina al medio justo antes de realizar cambios en los medios, ya que se degrada rápidamente después de diluirse en medio y almacenarse a 4 °C. El stock debe almacenarse a -20 °C a una concentración de 1000X y protegerse de la luz. No vuelva a congelar las coartadas descongeladas. Es muy importante seguir estos detalles para garantizar experimentos reproducibles y discriminar una diferenciación deteriorada debido a una mutación genética por cuestiones técnicas. Sin embargo, dependiendo de la mutación o el tipo de enfermedad, una buena diferenciación puede no ser posible. Para garantizar resultados de confianza, es muy importante replicar experimentos en números de pasaje similares.
En nuestra experiencia, la capacidad de diferenciación persiste al menos hasta el paso 25-27, especialmente en controles de tipo salvaje. Lo mismo puede ser válido para algunas líneas celulares enfermas, pero depende de la línea celular. Algunas líneas celulares DMD todavía conservan el potencial miogénico por encima de P20. En oposición, una línea celular de distrofia miotónica tipo 1 (DM1) presentó una reducción de la miogenicidad después de P8. Sin embargo, en el caso de DM1, esto no es sorprendente, ya que se ha demostrado que las mutaciones en DM1 indirectamente juegan un papel en la diferenciación muscular16. La retención de la capacidad de diferenciación miogénica debe abordarse individualmente, pero generalmente, la mayoría de las líneas celulares la retienen hasta P20-25.
En resumen, la conversión de fibroblastos en mioblastos es una poderosa herramienta para estudiar y probar estrategias terapéuticas para trastornos neuromusculares. Facilita el acceso a los modelos celulares humanos evitando la complicada obtensión de biopsias musculares y reduce el inconveniente de una biopsia muscular para los pacientes.
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Disclosures
El Hospital Nacional de Niños ha autorizado el programa de saltos exon 2 descrito aquí a Audentes Therapeutics. K.M.F. y N.W. han recibido pagos de regalías como resultado de esta licencia.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al Dr. Vincent Mouly por compartir sus conocimientos en el pasado con respecto al modelo. Este trabajo ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Salud del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Estados Unidos (R01 NS043264 (K.M.F., y R.B.W.)), el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticos y cutáneas (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., y N.W.). N.W. ha recibido apoyo de becas de la Universidad Estatal de Ohio/Nationwide Children's Hospital Muscle Group y la Fundación Philippe. Este trabajo también fue apoyado por fondos discrecionales internos y parte de la obra de salto exon 2 ha sido apoyada también por CureDuchenne (K.M.F.) y la Asociación Francaise Contre Les Myopathies. Número IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS000000123.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
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