Summary

Laser Doppler Perfusion Imaging i musen hindlimb

Published: April 18, 2021
doi:

Summary

Her præsenterer vi en protokol, der demonstrerer teknikken og de nødvendige kontroller til Laser Doppler perfusionsbilleddannelse for at måle blodgennemstrømningen i musens bagben.

Abstract

Blodgennemstrømning opsving er et kritisk resultat foranstaltning efter eksperimentelle hindlimb iskæmi eller iskæmi-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) er en almindelig, noninvasive, repeterbar metode til vurdering af blodgennemstrømningen opsving. Teknikken beregner den samlede blodgennemstrømning i det udtagne væv fra Doppler skift i frekvens forårsaget, når en laser rammer bevægelige røde blodlegemer. Målinger udtrykkes i vilkårlige perfusionsenheder, så det kontralaterale ikke-greb ved leg bruges normalt til at hjælpe med at kontrollere målinger. Måledybden ligger i området 0,3-1 mm; for hindlimb iskæmi betyder det, at dermal perfusion vurderes. Dermal perfusion er afhængig af flere faktorer – vigtigst af hudtemperatur og bedøvelsesmiddel, som skal kontrolleres omhyggeligt for at resultere i pålidelige aflæsninger. Desuden kan hår og hud pigmentering ændre evnen til laser til enten at nå eller trænge ind til dermis. Denne artikel demonstrerer teknikken med LDPI i musen baglimb.

Introduction

Hudsår med utilstrækkelig sårheling er en førende årsag til amputationer hos humane patienter1. Tilstrækkelig sårheling kræver højere niveauer af arteriel perfusion end nødvendigt for at opretholde intakt hud, som er kompromitteret hos patienter med perifer arteriel sygdom2,3,4. Flere andre reumatologiske tilstande og diabetes kan også føre til forstyrret og utilstrækkelig hudmikrocirkulation til at helbrede sår5,6. Mange diabetikere har samtidig perifer arteriel sygdom, placere dem på særligt høj risiko for amputation. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) anvendes i kliniske situationer til at evaluere hudens mikrocirkulation, samt i forskningssituationer til at evaluere blodgennemstrømningen og blodgennemstrømningen opsving efter eksperimentelle hindlimb iskæmi, iskæmi-reperfusion, og mikrokirurgiske klapper7.

LDPI-systemet projicerer en laveffektlaserstråle, der afbøjes af et scanningsspejl for at bevæge sig over et område af interesse. Dette adskiller sig fra Laser Doppler flowmetri, som giver en perfusionsmåling for det lille vævsområde i direkte kontakt med flowmetrisonden8. Når laserstrålen interagerer med bevægeligt blod i mikrovasculaturen, gennemgår den et Doppler-frekvensskift, som fotodeteres af scanneren og omdannes til vilkårlige perfusionsenheder. Da LDPI er en lysbaseret teknik, er den begrænset med hensyn til dybdegennemtrængning til 0,3-1 mm, hvilket betyder, at der for det meste vurderes dermal perfusion7. Dermal flow kan ændres ved hudtemperatur og det sympatiske nervesystem, som kan blive påvirket af forskellige bedøvelsesmidler9. Målinger fra den optiske laser påvirkes også af omgivende lysforhold, hudpigmentering og kan blokeres af overliggende pels eller hår7.

LDPI er den mest anvendte forskningsteknik til at overvåge perfusionsgendannelse efter iskæmi, fordi det ikke er udbredt, ikke kræver kontrastadministration og har hurtige scanningstider, der tillader dataindsamling på flere dyr. Dette gør det ideelt at hjælpe med at afgøre, om behandlinger rettet mod terapeutisk arteriogenese eller angiogenese er effektive i små dyremodeller. Genvinding af blodgennemstrømningen efter hindlimb-iskæmi målt ved LDPI korrelerer godt medudviklingen af sikkerhedsstillelsen, når den vurderes på andre måder , f.eks. Målet med denne protokol er at demonstrere vurderingen af hindlimb perfusion ved hjælp af LDPI.

Protocol

Dyreforsøg blev udført i henhold til en protokol godkendt af University of Washington Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Forberedelse af scanner Juster scannerhøjden, så afstanden til det scannede motiv er ca. 30 cm. Tænd billedbilledet, og start den tilknyttede software. Åbn programmet Måling. Hvis softwaren kommunikerer korrekt med scanneren, vises advarslen om, at den infrarøde laser er aktiveret. Kalibrere maski…

Representative Results

Vellykket LDPI bør resultere i konsekvente gentagne målinger scanninger, med ikke mere end 100-150 perfusion enhed variation (svarende til omkring 10% af den sædvanlige gennemsnitlige perfusion for musen fodspjæld) mellem de tre scanninger (Figur 2). Som det fremgår af figur 2, hjælper gentagne scanninger med at fastslå, at musen er blevet passende ekvilibreret, således at iskæmisk/kontrolforholdet bedst afspejler den underliggende blodgennemstrømning …

Discussion

Ensartet teknik er afgørende for at opnå pålidelige resultater med LDPI. Det samme bedøvelsesmiddel, temperaturindstillinger, museposition og interesseområde bør bruges gennem hele tidsforløbet. Forskellige bedøvelsesmidler vil resultere i højere eller lavere perfusionsværdier9. Isoflurane anæstesi er praktisk på grund af sin hurtige debut og fremkomst samt den samlede sikkerhed. En konsistent procentdel af isofluran bør anvendes som dybde af anæstesi med denne vasodilatoriske middel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev udført med brug af faciliteter og ressourcer på VA Puget Sound Health Care Center. Arbejdet er, at forfatteren og ikke nødvendigvis afspejler den holdning eller politik Department of Veterans Anliggender eller den amerikanske regering. Dr. Tang er i øjeblikket finansieret via VA (Merit 5 I01 BX004975-02).

Materials

Black nonreflective material Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister A.M. Bickford Inc 80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe Harvard Apparatus Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine Drager Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber VetEquip 941444 2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager Moor Instruments MoorLDI2-IR Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone Multiple manufacturers
Nair Nair
Oxygen tank Multiple manufacturers
Surgilube Multiple distributors

References

  1. Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. Epidemiology of limb loss. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).
  2. Farber, A. Chronic Limb-Threatening Ischemia. New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).
  3. Abularrage, C. J., et al. Evaluation of the microcirculation in vascular disease. Journal of Vascular Surgery. 42 (3), 574-581 (2005).
  4. Houben, A., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  5. Mahe, G., Humeau-Heurtier, A., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 5 (1), 155-163 (2012).
  6. Murray, A. K., Herrick, A. L., King, T. A. Laser Doppler imaging: a developing technique for application in the rheumatic diseases. Rheumatology (Oxford). 43 (10), 1210-1218 (2004).
  7. Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser Doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors (Basel). 13 (1), 500-515 (2012).
  8. Sonmez, T. T., et al. A novel laser-Doppler flowmetry assisted murine model of acute hindlimb ischemia-reperfusion for free flap research. PLoS One. 8 (6), 66498 (2013).
  9. Gargiulo, S., et al. Effects of some anesthetic agents on skin microcirculation evaluated by laser Doppler perfusion imaging in mice. BMC Veterinary Research. 9, 255 (2013).
  10. Ankri-Eliahoo, G., Weitz, K., Cox, T. C., Tang, G. L. p27(kip1) Knockout enhances collateralization in response to hindlimb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (5), 1351-1359 (2016).
  11. McEnaney, R. M., Shukla, A., Madigan, M. C., Sachdev, U., Tzeng, E. P2Y2 nucleotide receptor mediates arteriogenesis in a murine model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (1), 216-225 (2016).
  12. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
  13. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
  14. Chalothorn, D., Faber, J. E. Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb. Physiological Genomics. 42 (3), 469-479 (2010).
  15. Helisch, A., et al. Impact of mouse strain differences in innate hindlimb collateral vasculature. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (3), 520-526 (2006).
  16. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (8), 1748-1756 (2011).
  17. Forrester, K. R., Stewart, C., Tulip, J., Leonard, C., Bray, R. C. Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue. Medical & Biological Engineering & Computing. 40 (6), 687-697 (2002).
  18. Briers, J. D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging. Physiological Measurement. 22 (4), 35-66 (2001).
  19. Heeman, W., Steenbergen, W., van Dam, G., Boerma, E. C. Clinical applications of laser speckle contrast imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 24 (8), 1-11 (2019).
  20. Nguyen, T., Davidson, B. P. Contrast Enhanced Ultrasound Perfusion Imaging in Skeletal Muscle. Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 163-177 (2019).
  21. Zaccagnini, G., et al. Magnetic Resonance Imaging Allows the Evaluation of Tissue Damage and Regeneration in a Mouse Model of Critical Limb Ischemia. PLoS One. 10 (11), 0142111 (2015).
  22. Penuelas, I., et al. PET as a measurement of hindlimb perfusion in a mouse model of peripheral artery occlusive disease. Journal of Nuclear Medicine. 48 (13), 1216-1223 (2007).
  23. Jia, Y., Qin, J., Zhi, Z., Wang, R. K. Ultrahigh sensitive optical microangiography reveals depth-resolved microcirculation and its longitudinal response to prolonged ischemic event within skeletal muscles in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (8), 086004 (2011).
  24. Turaihi, A. H., et al. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. Journal of Visualized Experiments. (121), e54912 (2017).
  25. Liu, C., et al. Enhanced autophagy alleviates injury during hindlimb ischemia/reperfusion in mice. Experimental and Therapeutic Medicine. 18 (3), 1669-1676 (2019).
  26. Liu, D. L., Svanberg, K., Wang, I., Andersson-Engels, S., Svanberg, S. Laser Doppler perfusion imaging: new technique for determination of perfusion and reperfusion of splanchnic organs and tumor tissue. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (4), 473-479 (1997).
  27. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat. Journal of Visualized Experiments. (135), e56243 (2018).
  28. Zhang, D., Li, S., Wang, S., Ma, H. An evaluation of the effect of a gastric ischemia-reperfusion model with laser Doppler blood perfusion imaging. Lasers in Medical Science. 21 (4), 224-228 (2006).
  29. Fitzal, F., et al. Circulatory changes after prolonged ischemia in the epigastric flap. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (7), 535-543 (2001).

Play Video

Cite This Article
Tang, G. L., Kim, K. J. Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb. J. Vis. Exp. (170), e62012, doi:10.3791/62012 (2021).

View Video