Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הטיות כימיות של נוגדן מטוהר מכוון DEC-205 עם חלבון באורך מלא למיקוד תאים דנדריטיים של עכבר במבחנה וב- In Vivo

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/62018
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1, 1,2, 4, 4, *1,2,5, *1,2
1Immune Regulation Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Infection Immunology Group, Institute of Medical Microbiology, Infection Prevention and Control, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 3Institute for Molecular and Clinical Immunology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 4Cellular Proteome Research, Helmholtz Centre for Infection Research, 5Experimental Pneumology, University Hospital of Pneumology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים פרוטוקול להטיה הכימית של המודל אנטיגן אובלבומין לנוגדן ספציפי לקולטן אנדוציטוזיס עבור פילוח תאים דנדריטיים של ויוו. הפרוטוקול כולל טיהור של הנוגדן, הטיות כימיות של האנטיגן, כמו גם טיהור של ההצומדת ואימות ההטיות היעילות.

Abstract

אספקת אנטיגן ממוקדת לתאים דנדריטיים (DC) המציגים באופן צולב ב-vivo גורמת ביעילות לתגובות תאי אפקט T ומציגה גישה בעלת ערך בעיצוב החיסון. אנטיגן מועבר ל- DC באמצעות נוגדנים ספציפיים לקולטני אנדוציטוזיס כגון DEC-205 הגורמים לספיגה, עיבוד ו- MHC Class I- ו- II- presentation.

הטיות יעילות ואמינות של האנטיגן הרצוי לנוגדן מתאים הוא צעד קריטי בפילוח DC ובין היתר תלוי בפורמט האנטיגן. הטיות כימיות של חלבון באורך מלא לנוגדנים מטוהרים היא אסטרטגיה אפשרית אחת. בעבר, הקמנו בהצלחה קישור צולב של המודל אנטיגן אובלבומין (OVA) ונוגדן IgG2a ספציפי DEC-205 (αDEC-205) למחקרי מיקוד in vivo DC בעכברים. השלב הראשון של הפרוטוקול הוא טיהור הנוגדן מן supernatant של NLDC (תאים דנדריטיים שאינם לימפואידים)-145 hybridoma על ידי כרומטוגרפיה זיקה. הנוגדן המטוהר מופעל להטיה כימית על ידי סולפו-SMCC (סולפוסוקינימידיל 4-[N-maleimidomethyl] ציקלוהקסן-1-קרבוקסילאט) ובמקביל קבוצות סולפיהידיל של חלבון OVA נחשפות באמצעות דגירה עם TCEP-HCl (טריס (2-קרבוקסיתיל) פוספין הידרוכלוריד). עודף TCEP-HCl וסולפו-SMCC מוסרים והאנטיגן מעורבב עם הנוגדן הפעיל לצימוד בן לילה. αDEC-205/OVA מצומדת ומשוחררת מ-OVA לא מאוגד. הטיות מוצלחות של OVA ל- αDEC-205 מאומתת על ידי ניתוח כתם מערבי ובוחן חיסוני הקשור לאנזים (ELISA).

השתמשנו בהצלחה αDEC-205/OVA מוצלב כימית כדי לגרום לתגובות תאי T ציטוטוקסיות בכבד ולהשוות אדג'ובנטים שונים לפוטנציאל שלהם לגרום לחסינות הומוריסטית ותאית בעקבות פילוח vivo של DEC-205+ DC. מעבר לכך, הצמדי נוגדנים/אנטיגן בעלי זיקה כימית אלה מציעים כלים בעלי ערך לגיוס יעיל של תגובות חיסון לאנטיגנים של הגידולים והוכחו כנעלים על גישות חיסון קלאסיות בנוגע למניעה וטיפול בסוגים שונים של גידולים.

Introduction

תאים דנדריטיים (DC) הם שחקנים מרכזיים של המערכת החיסונית. הם קבוצה מגוונת של תאים המתמחים אנטיגן-מצגת ותפקידם העיקרי הוא לגשרחסינות מולדתאדפטיבית1,2. חשוב לציין, DC לא רק לשחק תפקיד חשוב בתגובות יעילות וספציפליות פתוגן, אלא גם מעורבים בהיבטים רבים של חסינות antitumor1,3.

בשל תפקידם הבלעדי בחסינות המארחת, DC נכנסה לפוקוס כתאי יעד לחיסון4. גישה אחת היא למקד אנטיגנים לוושינגטון ב- vivo כדי לגרום לתגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן ובשנים האחרונות, מספר רב של מחקרים הוקדשו להגדרת קולטנים מתאימים ואסטרטגיות מיקוד1,4. דוגמה אחת היא קולטן לציטין מסוג C DEC-205, אשר יכול להיות ממוקד על ידי נוגדנים ספציפיים DEC-205 כדי לגרום אנדוציטוזיס. חשוב לציין, פילוח DEC-205 בשילוב עם אדג'ובנטים מתאימים הוכח כמזינה ביעילות CD4+ ו- CD8+ T, כמו גם תגובות נוגדנים, גם נגד אנטיגנים גידול3,5,6,7,8,9.

ישנם מספר מחקרים המראים אנטיגנים מצומדים המיועדים לוושינגטון להיות עדיפים על אנטיגן חינם לא מצומד3,5,10,11,12. זה הופך את ההטיה של האנטיגן לוושינגטון בהתאמה מיקוד moiety צעד מרכזי בגישות מיקוד DC. במקרה של מיקוד DC באמצעות נוגדנים או שברי נוגדנים, אנטיגנים יכולים להיות מקושרים כימית או גנטית וכל אסטרטגיה מספקת יתרונות משלה(dis)1. מצד אחד, במבנים נוגדנים אנטיגן מהונדסים גנטית יש שליטה על מינון האנטיגן, כמו גם את המיקום המספק השוואה מעולה בין מגרשים1. יחד עם זאת, הטיות כימיות זקוקות לפחות הכנה ומספקת גמישות רבה יותר במיוחד כאשר מנסים לבדוק ולהשוות אנטיגנים שונים ו / או אסטרטגיות חיסון במודלים ניסיוניים ופרה קליניים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להטיה כימית יעילה ואמינה של אובלבומין (OVA) כאנטיגן חלבון מודל לנוגדן IgG2a ספציפי ל- DEC-205 (αDEC-205) המתאים למיקוד ב- vivo DC בעכברים. ראשית, αDEC-205 מטוהר מתאי היברידיומה NLDC-14513. עבור הטיות כימיות, נעשה שימוש באיתרונים הטרוביפונקטוריים סולפוסוצינימידיל 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-קרבוקסילאט (סולפו-SMCC), המכיל קבוצות אסתר ומליימיד NHS (N-הידרוקסיסוצינימיד), המאפשר הטיות קוולנטיות של מולקולות המכילות אמין וגופריתיל. באופן ספציפי, האמינים העיקריים של הנוגדן מגיבים בתחילה עם סולפו-SMCC וכתוצאה מכך מופעל maleimide αDEC-205 ואז מגיב עם חלבון OVA המכיל סולפיהידיל מופחת באמצעות TCEP-HCl (טריס (2-קרבוקסיתיל) הידרוכלוריד). המוצר הסופי הוא מצומד כימית αDEC-205/OVA(איור 1). מעבר להטיה הכימית עצמה, הפרוטוקול שלנו מתאר הסרה של עודף OVA מההצמדה, כמו גם אימות של הטיות מוצלחות באמצעות ניתוח כתם מערבי וביטול חיסוני ספציפי הקשור לאנזים. השתמשנו בהצלחה בגישה זו בעבר כדי להטות כימית OVA וחלבונים אחרים או פפטידים אימונוגניים ל αDEC-205. אנו מפגינים קשירה יעילה ל- CD11c+ תאים במבחנה, כמו גם אינדוקציה יעילה של חסינות תאית והומוריסטית ב- vivo.

אין ספק, ישנם חסרונות לשיטה זו כגון השוואת הרבה למגרש ובמינון המדויק של האנטיגן בתוך ההסתה הסופית. עם זאת, הטיות כימיות מספקות גמישות ניסיונית בבחירת הנוגדן ואנטיגן החלבון בהשוואה למבנים מהונדסים גנטית. לכן, אנו מאמינים שגישה זו חשובה במיוחד בהערכת אנטיגנים שונים ליעילותם ב- DC פילוח במודלים של עכברים פרה-קליניים, וחשוב גם בהקשר של תגובות חיסוניות אנטי-אטומיות ספציפיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים אושרו על ידי הסוכנות הממשלתית המקומית (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; קובץ מספר 33.12-42502-04-10/0108) ובוצעו על פי ההנחיות הלאומיות והמוסדיות.

1. ייצור αDEC-205 מקו התא ההיברידי NLDC-145

  1. לייצור נוגדנים, להפשיר תאי NLDC-145 המפיקים αDEC-205 ב 37 °C (50 °F) באמבט מים. להרחיב את התאים ב 37 °C (5% CO) ו 5% CO2. שני 75 ס"מ2 בקבוקים יידרשו כדי להמשיך לייצור נוגדנים. נהלי תרבית התאים צריכים להתבצע בארון בטיחות כדי להבטיח תנאי עבודה בטוחים ולמנוע זיהום של התרבויות.
    1. Resuspend 1 מ"ל של תאים מופשרים (1 x 106 - 5 x 106 תאים / מ"ל) ב 9 מ"ל של ISF-1 בינוני בתוספת עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין (התחמם מראש ל 37 °C ) לתוך בקבוק תרבית התא (25 ס"מ2). מניחים את הבקבוק אופקית באינקובטור תרבית תאים ב 37 °C (5°F), 5% CO2.
    2. תרבית התאים ב 37 °C (5% CO2),עד 70% מפגש. זה בדרך כלל צריך להיות מושגת לאחר 24 - 48 שעות.
    3. לאחר התאים הם 70% מפגש, להעביר את ההשעיה המלאה של תא NLDC-145 (10 מ"ל) לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל באמצעות בקר pipette עם pipette בטווח נפח בין 1-10 מ"ל. גלם את התאים על ידי centrifugation ב 250 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. ISF-1 חם מראש בינוני עד 37 °C באמבט מים ו resuspend הכדור ב 12 מ"ל של ISF-1 בינוני בתוספת עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין. מעבירים את ההשעיה של התא לבקבוק תרבית תאים טרי (75 ס"מ2).
    5. תרבית ולהרחיב את התאים ב- ISF-1 בינוני בתוספת עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין ב 37 °C (5%) CO2, עד 70% confluent ו 99% קיימא. זה בדרך כלל צריך להיות מושגת לאחר 48 - 72 שעות.
    6. לפצל את התאים לשני 75 ס"מ2 צלוחיות. כדי לעשות זאת תחילה לשטוף את המשטח התחתון / תרבית של תרבית התא עם השעיית התא כדי להסיר את כל תאי NLDC-145 מפני השטח. העבר 6 מ"ל של השעיית תא NLDC-145 כל אחד לאחד משני בקבוקים טריים 75 ס"מ2 ולהוסיף ISF-1 בינוני מחומם מראש בתוספת עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין עד 12 מ"ל.
      הערה: אל תחדש את המדיום של תרבית התא מכיוון שתאי NLDC-145 יתנו את המדיום. מעבירים את התאים יחד עם המדיום שלהם וממלאים את התרבות עד לנפח הרצוי במדיום טרי. זה חיוני עבור הכדאיות וייצור נוגדנים מקסימלי על ידי תאי NLDC-145.
    7. להרחיב את תרביות התא ב 37 °C (5% CO2),עד כ 70% confluent אשר מושגת בדרך כלל לאחר 48 - 72 שעות.
    8. לאחר התאים הם 70% מפגש, להעביר 10 מ"ל של ההשעיה המורחבת NLDC-145 תא מכל אחד 75 ס"מ2 בקבוקים לתוך PETG אחד (פוליאתילן טרפתלט גליקול) בקבוק הרים (1,050 ס"מ2). בשביל זה, לשטוף את המשטח התחתון / תרבית של תרבית התא עם השעיית התא כדי להסיר את כל התאים מפני השטח באמצעות בקר פיפטה ופיפטה של 10 מ"ל.
    9. הוסף 140 מ"ל של ISF-1 בינוני בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין (התחמם מראש ל 37 °C (57 °F) ישירות מתוך הבקבוק הבינוני לכל אחד NLDC-145 המכיל בקבוקי רולר הממלאים אותם עד 150 מ"ל סימן.
      הערה: ראה הערה בשלב 1.1.6.
    10. תרבות בקבוקי רולר ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 ו 25 סיבובים / דקה במשך שלושה ימים.
    11. הוסף 150 מ"ל של ISF-1 בינוני בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין (התחמם מראש ל 37 °C (50 °F) לכל אחד NLDC-145 המכיל בקבוקי רולר הממלאים אותם עד לסימן 300 מ"ל.
    12. תרבות בקבוקי רולר מכילים כעת 300 מ"ל תרבות כל אחד ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 ו 25 סיבובים / דקה במשך שלושה ימים נוספים.
    13. הוסף עוד 100 מ"ל של ISF-1 בינוני בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין (מחומם מראש ל 37 °C (50 °F) לכל אחד NLDC-145 המכיל בקבוקי רולר, ובכך למלא אותם עד 400 מ"ל סימן.
    14. תרבות בקבוקי רולר מכילים כעת תרבות 400 מ"ל כל אחד ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 ו 25 סיבובים / דקה במשך שבעה ימים נוספים.
      הערה: במהלך השבוע הזה, התרבות נעשית צפופה מאוד (עד 95% צפיפות) והערך יורד (עד 50%, ומאפשר שחרור נוגדנים מרבי.
  2. לטיהור של αDEC-205 מן supernatant התרבות לשפוך את השעיית תא NLDC-145 (משני בקבוקי רולר) ישירות 500 מ"ל בקבוקי צנטריפוגה אוטומטית.
    הערה: יש לאסוף נפח כולל של 800 מ"ל של תרבות.
    1. צנטריפוגות את התרבות במשך 30 דקות ב 8,600 x g ו 4 °C (4 °F) כדי להסיר תאים ופסולת.
    2. לאסוף את supernatants, להשליך את הכדורים ולאגד את supernatants בבקבוק ריאגנט סטרילי.
      הערה: ניתן להתחיל מיד בטיהור של αDEC-205 (שלב 2)או שניתן לאחסן את הסופר-נט לטווח קצר ב-4 °C (70 °F).

2. טיהור נוגדן αDEC-205 מסופרנטנט תא NLDC-145

הערה: מתוך NLDC-145 תא supernatant, αDEC-205 מטוהר באמצעות עמודת Sepharose G חלבון (לשימוש חוזר). מידות העמודות הן 15 מ"מ x 74 מ"מ וחלבון 5 מ"ל G Sepharose ארוזים לכל עמודה.

  1. להכנת ושטיפה של עמוד החלבון G Sepharose, יש לשים תקע גומי אטום על הפתח העליון של עמוד החלבון G Sepharose. לנקב את תקע הגומי עם שתי קנולס סטריליות (20 G x 1 1/2", 0.90 x 40 מ"מ).
    1. חבר מזרק 10 מ"ל לאחד משני הקנולות וצינור סיליקון גמיש (כ 100 ס"מ אורך, 2.5 - 3 מ"מ קוטר) עם מחבר צינורות הצינורית השנייה.
      הערה: בניית תקע המזרק/גומי ניתנת שימוש חוזר ומספקת ואקום וכתוצאה מכך זרימה רציפה של הנפח הגדול של תרבות-על-טבעית לעמודת החלבון G Sepharose. כדי לשים קץ, משכו מעט את הבוכנה של המזרק כדי להבטיח זרימת נוזלים רציפה בשלבים הבאים.
    2. לשטוף את העמודה עם 50 מ"ל של 0.1 M חומצה אצטית קרחונית (pH 2) כדי להסיר נוגדן פוטנציאלי שנותר מכל טיהור נוגדנים קודם. שים את קצה צינור הסיליקון בחומצה אצטית קרחונית 0.1 M (pH 2) מלא בבקבוק ריאגנט מלא. כתוצאה מהוואקום המושרה, 50 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית 0.1 M (pH 2) טיפה-2 לרוץ דרך עמודת החלבון G Sepharose.
      הערה: 0.1 M חומצה אצטית קרחונית (pH 2) צריך להיות מאוחסן בבקבוק ריאגנט או מלא טרי בכוס.
    3. לשטוף את העמודה עם 100-200 מ"ל תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). שים את הקצה של צינור הסיליקון לתוך PBS מלא בקבוק ריאגנט או. תן 100-200 מ"ל PBS לרוץ dropwise דרך עמודת החלבון G Sepharose.
  2. לטיהור נוגדנים מ-NLDC-145 supernatant, טען 800 מ"ל של חומר-על NLDC-145 (המתקבל בשלב 1.2.2) אל העמודה. שים את הקצה של צינור הסיליקון לתוך NLDC-145 סופרנטנט מלא בקבוק ריאגנט. תן 800 מ"ל NLDC-145 supernatant לרוץ dropwise דרך העמודה.
    1. לשטוף את העמודה עם 500 מ"ל של PBS. שים את קצה צינור הסיליקון בבקבוק ריאגנט מלא PBS או. תן 500 mL PBS לרוץ dropwise דרך העמודה.
    2. עבור elution, להשתמש 20 צינורות 1.5 מ"ל ו pipette 100 μL של 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) לתוך כל צינור 1.5 מ"ל. הסר את תקע הגומי מהעמוד ופיפטה 1 מ"ל של גליצין 0.1 M (pH 3) לתא העליון של עמודת החלבון G Sepharose כדי לחמוק מהנוגדן מהעמודה. לאסוף את הזרימה דרך ישירות כמו eluate באחד צינורות 1.5 מ"ל מוכן.
    3. חזור על שלב ההתחמקות (2.2.2.) עבור כל 20 הצינורות (1.5 מ"ל).
    4. לקבוע את הצפיפות האופטית של כל שברי elution ב 280 ננומטר (OD280)באמצעות ספקטרופוטומטר על מנת לזהות את השברים המכילים נוגדנים.
      הערה: השתמש בשבר ההתחמקות הראשון כריקים.
    5. איחד את כל השברים עם OD280 גדול מ- 0.5 (כ- 10 שברים).
    6. יש לאחסן את עמודת החלבון G Sepharose מלאה ב-20% אתנול ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. חייג את elutions pooled נגד 1000 מ"ל PBS (ב 2000 מ"ל כוס) ב 4 °C 5 °C צינורות דיאליזה עם משקל מולקולרי מנותק (MWCO) של 12 - 14 kDa.
    1. חותכים את צינורות הדיאליזה לחתיכות של 20 ס"מ. מרתיחים את צינורות הדיאליזה ב 500-800 מ"ל של 10 mM EDTA (pH 7.5) במשך 30 דקות בכנר באמצעות צלחת חמה כדי להסיר זיהום. יש להשליך את תמיסת EDTA 10 מ"מ (pH 7.5) ולהרתיח את צינורות הדיאליזה במים דה-יעוניים למשך 10 דקות.
      הערה: צינורות דיאליזה ניתן להשתמש ישירות או מאוחסן 0.01% נתרן אזיד (NaN3)/H2O פתרון ב 4 °C (5 °F) עד השימוש הבא.
    2. סגור את תחתית צינורות הדיאליזה עם סגירת צינורות דיאליזה מתאימה / חצי אחד, מהדק צירים וצינורות בזהירות את הנוגדנים לתוך צינורות הדיאליזה. סגור את החלק העליון של צינורות הדיאליזה עם מהדק שני.
    3. תקן את המהדק העליון של צינורות הדיאליזה לעמדה צפה, לשים אותו יחד עם מוט ערבוב מגנטי לתוך מלא PBS ומניחים את הכיס על stirrer מגנטי.
    4. דיאליזה לילה ערבוב ב 4 °C (5 °F).
  4. כדי להגדיל את הריכוז של αDEC-205, לטעון את הדיאליזה המלאה לרכז צנטריפוגלי עם 10 kDa MWCO. פתחו מהדק אחד של הצינורות והכניסו בזהירות את הדיאליזה המלאה מתוך צינורות הדיאליזה לרכז הצנטריפוגלי (10 kDa MWCO).
    הערה: אין לגעת בתחתית הרכז עם קצה הפיפטה.
    1. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב-693 x גרם (2,000 סל"ד) ו-4 מעלות צלזיוס.
    2. טען את רכז הצנטריפוגליה עם 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 693 x g (2,000 סל"ד) ו 4 °C (7 °F) עד שהנפח הסופי של פתרון נוגדנים עזב הוא 1-1.5 מ"ל.
      הערה: במידת הצורך, חזור על שלב המרכז של 2.4.1. כדי להסתגל לכמות הרצויה.
    3. באמצעות ספקטרופוטומטר, לקבוע את הצפיפות האופטית של פתרון מרוכז αDEC-205 ב 280 ננומטר (OD280). השתמש ב- PBS כריקים.
    4. חשב את הריכוז של αDEC-205 באמצעות הנוסחה הבאה:
      ריכוז [מ"ג/מ"ל] = OD280/1.4.
    5. סנן את פתרון αDEC-205 באמצעות יחידת סינון מזרק של 0.22 מיקרומטר.
      הערה: טיהור של αDEC-205 מן NLDC-145 תאי היברידית-145 תא-על יכול להיות מושגת גם על ידי FPLC (כרומטוגרפיה נוזלי חלבון מהיר). ניתן לאחסן את αDEC-205 המטוהר ב-4 °C (50°F) או ב--18 °C (50 °F) לאחסון לטווח ארוך.

3. הטיות כימיות של OVA ל- αDEC-205

הערה: יחס של 0.5 מ"ג חלבון OVA ל 2.5 מ"ג αDEC-205 (1:5) נדרש להטיה כימית אופטימלית. עם זאת, יחס זה יכול להשתנות עבור חלבונים ונוגדנים אחרים ויש אופטימיזציה עבור מצומדים חלופיים. הפחתת קשרים דיסולפידים של חלבון OVA מתבצעת באמצעות דגירה עם 30 mM TCEP-HCl, אשר חושף את קבוצות סולפיהידיל עבור הטיות כימיות αDEC-205 ו 240 מיקרול של TCEP-HCl נדרשים בשלב 3.2. שני השלבים, הפחתה הנגרמת על ידי TCEP של OVA (שלב 3.1.) והפעלת סולפו-SMCC של αDEC-205 (שלב 3.2.), רצוי להתבצע במקביל.

  1. הכינו טרי פתרון TCEP-HCl של 125 מ"מ (pH 7.0). שקול את הכמות הרצויה של TCEP-HCl ולהמיס את TCEP-HCl בבסיס טריס 0.9 M (pH 8.8). השתמש בפסי מחוון pH כדי לבדוק את ה- pH של פתרון TCEP-HCl 125 mM (שאמור להיות נייטרלי) ולהתאים את ה- pH עם בסיס Tris (pH 8.8).
    1. תמיסה חלבון OVA 200 μL (המכיל 0.5 מ"ג OVA) לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל. הוסיפו 240 מיקרול 125 מ"מ TCEP-HCl ו-560 מיקרו-לן של מים סטריליים אולטרה-טחונים לחלבון OVA באמצעות פיפטה לריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל חלבון OVA ו-30 מ"מ TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      הערה: 2.5 מ ג EndoGrade OVA (ליופילי) מומס 1 מ"ל PBS וכתוצאה מכך 2.5 מ"ג / מ"ל פתרון OVA.
    2. לדגור על OVA / TCEP-HCl וכתוצאה מכך בטמפרטורת החדר עבור 1.5 שעות.
      הערה: אין להרחיב שלב הדגירה הזה.
  2. כדי להפעיל αDEC-205 עבור הטיות, להמיס 2 מ"ג סולפו-SMCC ב 100 μL של מים אולטרה-תול.
    הערה: סולפו-SMCC רגיש להידרוליזה. לכן, כמויות גדולות יותר של סולפו-SMCC לא פתור צריך להיות מטופל במהירות או זמין 2 aliquots מ ג יש להשתמש.
    1. לדלל αDEC-205 ב PBS, כך 2.5 מ"ג כלולים 900 μL.
    2. לערבב 2.5 מ"ג של αDEC-205 (נפח 900 μL; מתקבל משלב 3.2.1.) ו 100 μL של סולפו-SMCC (הושג משלב 3.2.) בצינור 1.5 מ"ל, וכתוצאה מכך נפח כולל של 1 מ"ל.
    3. לדגור על פתרון αDEC-205/sulfo-SMCC למשך 30 דקות ב-37 °C (550 סל"ד) בבלוק חימום.
  3. בעקבות דגירה זו, עודף גופרתי-SMCC ו- TCEP-HCl מוסרים באופן מיידי מהפתרונות באמצעות עמודות התפלה (MWCO 7 kDa; נפח עמודות של 5 מ"ל).
    1. סובב את העמודים (MWCO 7 kDa) סגירה תחתונה, לשחרר את המכסה ולמקם את העמודה לתוך צינור חרוט 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי להסיר את הנוזל.
    3. מניחים את העמודה בצינור טרי ומסירים את המכסה. לטעון לאט את הנוגדן / sulfo-SMCC ואת OVA / TCEP-HCl, בהתאמה, למרכז מיטת השרף הקומפקטית של עמודה אחת כל אחד.
    4. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-1,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
    5. בטל את העמודות לאחר השימוש. הפתרונות המכילים נוגדנים ו- OVA מוכנים להטיה נמצאים בצינורות.
    6. מיד לערבב את שני הפתרונות על ידי pipetting עבור הטיות של αDEC-205 ו OVA.
    7. לדגור על תערובת αDEC-205 ו- OVA למשך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר ההטיות, עודף OVA לא מאוגד מוסר מהפתרון ואת αDEC-205/OVA מרוכז באמצעות רכז חלבון צנטריפוגלי (MWCO 150 kDa).
    1. יש לשטוף מראש את רכז החלבון הצנטריפוגלי (MWCO 150 kDa) על ידי צנרת של 12 מ"ל של PBS על העמוד וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב-2,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
      הערה: במידת הצורך, חזור על שלב צנטריפוגה (3.4.1.) עד שנפח של כ- 5 מ"ל יעבור דרך העמודה.
    2. לפני טעינת αDEC-205/OVA על רכז החלבון הצנטריפוגלי, שמור דגימה של 20 μL של αDEC-205/OVA לניתוח כתם מערבי. יש לאחסן את ה-aliquot הזה ב-4 °C (75 °F) עד לניתוח.
    3. העמיסו את ה-αDEC-205/OVA על רכז החלבון הצנטריפוגלי על ידי צנרת.
      הערה: יש להימנע מכל מגע עם מיטת החדר העליון של רכז הצנטריפוגלי.
    4. מלאו את הרכז ל-15 מ"ל עם PBS וצנטריפוגה של הרכז למשך 5 דקות ב-2,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
    5. שמור מדגם של הזרימה דרך (זרימה דרך I) לניתוח כתם מערבי ולהשליך את הזרימה הנותרת דרך.
    6. מלאו את הרכז ל-10 מ"ל עם PBS וצנטריפוגה של הרכז לפחות 8 דקות ב-2,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
    7. שמור מדגם עבור הזרימה השנייה דרך (זרימה דרך II) לניתוח כתם מערבי ולבטל את הזרימה הנותרת דרך.
    8. לאחר ההעשרה הרצויה מושגת (סביב 1.5 מ"ל של פתרון αDEC-205/OVA צריך להישאר בתא העליון) בעדינות לשאוף את המדגם המרוכז.
      הערה: אם יותר מדי נוזל נשאר בתא העליון, צנטריפוגה ניתן לחזור על עצמו אבל צריך להישמר קצר ככל האפשר.
  5. לקבוע את ריכוז החלבון של αDEC-205/OVA וכתוצאה מכך באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-וולטום. השתמש ב- PBS כריקים.
  6. סנן את יחידת המסנן αDEC-205/OVA באמצעות יחידת סינון מזרק של 0.22 מיקרומטר.
    הערה: לניתוח מאוחר יותר וניסויים ב- vivo, ניתן לאחסן את αDEC-205/OVA ב-4 °C (50°F) או -18 °C (70 °F).

4. אימות ההטיות הכימיות על ידי כתם מערבי

הערה: לאימות של הטיות כימיות מוצלחות, מבוצע ניתוח כתם מערבי המזהה OVA (4.2) או αDEC-205 (4.10). זיהוי של OVA (4.2.) או αDEC-205 (4.10.) צריך להתבצע במקביל. שייקר פלטפורמה מסלולית רצוי לשמש עבור כל שלבי הדגירה של ממברנות כתם המערבי כדי לאפשר הפצה אחידה של הפתרונות המתאימים.

  1. הכן ג'לים סטנדרטיים 10% SDS (נתרן דודסיל סולפט) עבור SDS-PAGE (נתרן דודסיל סולפט פולאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה).
  2. הכן את הדגימות עבור SDS-PAGE כדי לזהות OVA מצומד ולא מצומד ולהפעיל אלקטרופורזה ג'ל.
    1. לדלל כמויות שונות של מצמיד αDEC-205/OVA (למשל, 200, 100 ו-50 ננוגרם, של OVA טהור (למשל, 80, 70, 60, 50, 40 ו-30 ננוגרם), עליקוט של αDEC-205 (למשל, 100 ו-50 ננומטר), מדגם של αDEC-205/OVA מצומדים מהשלב 3.4.2. (לדוגמה, 125 ng) ו- aliquot של זרימה דרך I ו- II (שלבים 3.4.5. ו- 3.4.7., בהתאמה; אופציונלי) ב- 4 x מאגר מדגם SDS שאינו מפחית.
      הערה: ריכוזים שונים של מצומדים וחלבון נטענים כדי להבטיח כי הן OVA חינם, כמו גם את מצומד ניתן לזהות על אותו כתם.
    2. דנטורה את הדגימות ב 65 °C (55 °F) במשך 10 דקות ו 550 סל"ד בבלוק חימום.
  3. טענו את הדגימות ואת תקן החלבון לג'ל SDS והפעילו את SDS-PAGE.
  4. בצע תיקון סטנדרטי של החלבונים מג'ל SDS לממברנה PVDF (פוליווינילידן דיפלואוריד) המופעלת על ידי מתנול (75 דקות, 125 mA).
  5. לאחר סופג, לשים את הממברנה בצלחת מתאימה ולחסום את הממברנה על ידי pipetting 25 מ"ל של 4% אבקת שייק תחליף ארוחה / TBS-T (תמיסת מלח חוצצת טריס / 0.1% Tween 20) חסימת חוצץ לתוך המנה המכילה את הממברנה.
    1. לדגור על הממברנה בתמיסת החסימה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (70 °F).
  6. השלך את תמיסה חסימה ולהכתים את הממברנה עם ארנב αOVA הנוגדן העיקרי ב 2% תחליף ארוחה שייק אבקת / TBS-T חיץ נוגדנים (דילול 1:3,000) על ידי pipetting 15 מ"ל של פתרון נוגדנים ראשוני לממברנה בצלחת.
    1. לדגור על הממברנה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (השתמש בשייקר הפלטפורמה).
  7. יש להשליך את תמסת הנוגדנים ולשטוף את הממברנה בצלחת (השתמשו בשייקר הפלטפורמה).
    1. מוסיפים 25 מ"ל של TBS-T לממברנה ודגר במשך 5 דקות. בטל את הפתרון.
    2. הוסף 25 מ"ל של TBS-T/0.5 M NaCl לממברנה ודגר במשך 5 דקות. בטל את הפתרון.
    3. הוסף 25 מ"ל של TBS-T/0.5% טריטון X-100 לממברנה ודגר במשך 5 דקות. בטל את הפתרון.
    4. מוסיפים 25 מ"ל של TBS-T לממברנה ודגר במשך 5 דקות. בטל את הפתרון.
  8. להכתים את הממברנה עם עז αrabbit-IgG-HRPO (פרוקסידאז צנון סוס) נוגדן משני 2% אבקת שייק תחליף ארוחה / TBS-T חיץ נוגדנים (דילול 1:2,000) על ידי צנרת 15 מ"ל של פתרון נוגדנים משני לממברנה בצלחת.
    1. לדגור על הממברנה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (על שייקר הפלטפורמה).
  9. לשטוף את הממברנה שוב כמתואר בשלב 4.7.1.- 4.7.4. באמצעות שייקר הפלטפורמה. עבור קרום זה, הבא להמשיך עם שלב 4.16. (השלבים הבאים 4.10.- 4.15. (זיהוי של αDEC-205) יכול להתבצע במקביל לשלבים 4.2.- 4.9.).
  10. הכן את הדגימות לגילוי של αDEC-205 עבור SDS-PAGE ולהפעיל את אלקטרופורזה ג'ל.
    1. לדלל כמויות שונות של αDEC-205/OVA (למשל, 200, 100 ו 50 ננוגרם), של αDEC-205 לא מצומד (למשל, 250, 125, 62.5 ננוגרם), של OVA טהור (למשל, 80 ו -70 ננוגרם), מדגם של αDEC-205/OVA מהשלב 3.4.2. (לדוגמה, 125 ng) ו- aliquot של זרימה דרך I ו- II (שלבים 3.4.5. ו- 3.4.7., בהתאמה; אופציונלי) ב- 4 x מאגר מדגם SDS שאינו מפחית.
    2. דנטורה את הדגימות ב 65 °C (55 °F) במשך 10 דקות ו 550 סל"ד בבלוק חימום.
  11. טענו את הדגימות ואת תקן החלבון לג'ל SDS והפעילו אלקטרופורזה של ג'ל.
  12. בצע תיקון סטנדרטי של החלבונים מג'ל SDS לממברנה PVDF המופעלת על ידי מתנול (פוליווינילידן דיפלואוריד) (75 דקות, 125 mA).
  13. לאחר סופג, לשים את הממברנה בצלחת מתאימה ולחסום את הממברנה על ידי pipetting 25 מ"ל של 10% חסימת חוצץ (אבקת חלב / TBS-T) לתוך המנה המכילה את הממברנה.
    הערה: פתרונות החסימה שונים בין זיהוי αDEC-205 וזיהוי OVA (שלב 4.5).).
    1. לדגור על הממברנה בתמיסת החסימה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (באמצעות שייקר הפלטפורמה).
  14. השלך את פתרון החסימה והכתים את הממברנה עם עז αrat-IgG(H +L)-HRPO נוגדן ב 5% אבקת חלב / TBS-T חיץ נוגדנים (דילול 1:5,000) על ידי צנרת 15 מ"ל של פתרון נוגדנים לממברנה בצלחת.
    הערה: מאגרי הנוגדנים שונים בין זיהוי αDEC-205 לבין זיהוי OVA (שלבים 4.6./ 4.8.).
    1. לדגור על הממברנה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (באמצעות שייקר פלטפורמה).
  15. לשטוף את הממברנה ביסודיות בצלחת כמתואר בשלבים 4.7.1.- 4.7.4. (השתמש בשייקר הפלטפורמה).
  16. השתמש ריאגנט זיהוי מתאים לפתח את אות HRP ולזהות את chemiluminescence בחדר חשוך באמצעות סרט רנטגן או באמצעות מערכת הדמיה.

5. אימות ההטיות הכימיות על ידי אליסה

  1. בצע ELISA לאימות נוסף של הטיות כימיות מוצלחות וכתוצאה מכך αDEC-205/OVA.
  2. יש לצפות צלחת ELISA מתאימה 96-באר עם 100 μL / באר של 3 ng / μL ארנב αOVA נוגדן חוצץ ציפוי (0.1 M נתרן ביקרבונט (NaHCO3) pH 9.6 מדולל H2O).
    1. לדגור את הצלחת לילה ב 4 °C (5 °F).
  3. לאחר הציפוי, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS, למשל, באמצעות מכונת כביסה ELISA.
  4. לחסום את הצלחת על ידי pipetting 200 μL של חוצץ חסימה (10% FCS ב PBS) בכל באר של הצלחת ולדגירה את הצלחת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לדלל באופן סדרתי αDEC-205/OVA (הושג בשלב 3.6.) 1:2 בחסימת חוצץ (10% FCS ב- PBS) כדי להשיג דילול החל 6 מיקרוגרם / מ"ל עד 93.8 ng / mL αDEC-205/OVA ולהוסיף 100 μL / טוב של כמויות יורדות אלה של αDEC-205/OVA לבארות.
    1. לדגור על הצלחת במשך שעה אחד בטמפרטורת החדר.
  6. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS, למשל, באמצעות מכונת כביסה ELISA.
  7. הוסף 100 μL של העז αrat-IgG + IgM(H + L)-HRPO נוגדן (מדולל ל 1:2,000 חוצץ חסימה (10% FCS ב- PBS)) לכל באר של הצלחת.
    1. דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  8. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים באמצעות PBS, למשל באמצעות מכונת כביסה ELISA.
  9. הוסף 50 μL של מצע HRPO לבארות. בעת התבוננות תגובת צבע ברורה, לעצור את התגובה באמצעות תוספת של פתרון עצירה 150 μl (1M H2SO4) לבאר.
  10. לאחר 5 דקות, לקרוא ספיגה ב 450 ננומטר באמצעות קורא ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הטיות כימיות של αDEC-205 לחלבון OVA באמצעות פרוטוקול זה תאפשר בדרך כלל ייצור יעיל של αDEC-205/OVA עבור גישות פילוח ב- vivo DC. ישנן אסטרטגיות שונות כדי לאמת את הטכניקה עצמה כדי לבדוק את הפונקציונליות של מצומד הניב. ניתוח כתמים מערביים ו- ELISA משמשים לאימות הטיות מוצלחות ובמקביל לזהות OVA חופשי פוטנציאלי(איור 2). מחקרים במבחנה (איור 3) ובחיסוני ויוו (איור 4)מאשרים כריכה של ההטיה ל- DEC-205 ומיקוד של DC.

ניתוח כתם מערבי מקביל משמש לזיהוי OVA מצומד (איור 2A) והן αDEC-205 מצומדים (איור 2B). באופן ספציפי, האות החיובי עבור OVA ברמת המשקל המולקולרי של הנוגדן בכתם מאשר את הקשר של OVA ואת הנוגדן (איור 2A). יתר על כן, כתמים עבור OVA בניתוח כתם המערבי מאפשר זיהוי של עודף חינם OVA פוטנציאל עדיין נוכח ליד αDEC-205/OVA הניב בשלב 3.6., וזה לא המקרה עבור כתם מוצג (איור 2A). במקרה כמויות גדולות של OVA חינם מזוהים, שלבים 3.4.1. ל-3.4.8. של הפרוטוקול צריך לחזור על עצמו. משלים להכתמה עבור OVA (איור 2A), כתמים עבור αDEC-205 בניתוח כתם מערבי מאמת הטיות מוצלחות באמצעות עלייה במשקל המולקולרי בין "עירום" αDEC-205 לבין מצומד כפי שמוצג באיור 2B.

לצד סופג מערבי, גם ELISA ספציפי מאפשר אימות של ההטיה המוצלחת של αDEC-205 ל- OVA. בניגוד לנתחי כתם המערבי עם זאת, ELISA זה אינו מאפשר זיהוי של חינם ולא מצומד αDEC-205 או OVA. בשל ההתקנה של בדיקת ההטיה(איור 2C),אות חיובי מיוצר רק אם ההטיה הייתה יעילה. הקשר החיובי בין האות שזוהה (ספיגה ב-450 ננומטר) לבין כמות החלבון המנותחת מאמת את הדור המוצלח של αDEC-205/OVA באמצעות הטיות כימיות כפי שמוצג באיור 2D. יחד עם זאת, האות החיובי כבר הניב מ 9.38 ננוגרם של מצומד αDEC-205/OVA מדגים את הרגישות החזקה של שיטה זו (איור 2D). במקרה שאין עלייה בספיחה לכמויות הולכות וגדלות של ההסתה, ההטיות ככל הנראה לא היו מוצלחות. במקרה זה, גם ניתוחי הכתם המערבי יניבו תוצאות שליליות, כלומר, אין זיהוי של ההצטלבות בכתם מוכתם עבור OVA ולא עלייה במשקל המולקולרי בכתם מוכתם עבור αDEC-205.

בעוד כתמים מערביים ו ELISA בדיקות משמשים כדי להעריך את ההטיה והסרת אנטיגן חינם ככזה, ניתוחים פונקציונליים הבאים נדרשים כדי לאשר כריכה DEC-205 ומיקוד של DC. עד כאן ביצענו מחקרים במבחנה (איור 3)ובחיסוני ויוו (איור 4). עבור ניסויים אלה, נקבות 6-8 שבועות C57BL/6 ו 8-12 שבועות Balb / c עכברים התקבלו ממקורות מסחריים או גדלו במתקן בעלי החיים של מרכז הלמהולץ לחקר זיהומים (HZI) ושוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן. איור 3 מדגים בדיקות פונקציונליות לכריכה של מצומד של αDEC-205 וחלבון הליבה HCV (αDEC-205/Core) ל- CD11c+ תאים במבחנה. ציטומטריית הזרימה הראתה בבירור αDEC-205/Core כדי לאגד ביעילות את ה-CD11c+ תאים שמקורם במח העצם (איור 3A,B)וכן עכבר CD11c+ טחול מבודד טרי (נתונים שאינם מוצגים). בדיקות אלה ממחישות את ההטיה הכימית לא להפריע לקיבולת המחייבת של αDEC-205. זה מאושר עוד יותר על ידי ניתוחים אימונופלואורסצנטיים המציגים כריכה של αDEC-205/Core ל- MHC-II+ CD11c+ תאים ממוינים מתוך תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם (BMDC) (איור 3C).

בעבר, הראינו את מצומדי αDEC-205/OVA המיוצרים על ידי הפרוטוקול המודגם כדי לגרום ביעילות לתגובות חיסוניות ספציפיות ל- OVA ב- vivo בעכברים, המאשרים דור מוצלח של מצומדים כמו גם פילוח תפקודי של DC (איור 4)12,14. באופן ספציפי, חיסון תת עורי עם תגובות חיסוניות αDEC-205/OVA ביעילות המושרה הורמונליות ותאיות OVA. חשוב לציין, במודל אתגר אדנווירוס רקומביננטי זיהינו CD8+ תאי T אנטי ויראליים המסוגלים לחסל hepatocytes נגועים בווירוס, אשר יש השלכות חזקות על חיסונים המכוונים וירוסים hepatotropic12. יתר על כן, האינדוקציה היעילה ביותר של תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים אנטיגן מדגישה את הפוטנציאל של גישה זו עבור in vivo priming של חסינות antitumor. כמו כן, השתמשנו בהצלחה αDEC-205/OVA כדי לבדוק ולהשוות אדג'ובנטים שונים בהקשר של in vivo DC מיקוד14. בחיסון עם αDEC-205/OVA יחד עם שילוב אדג'ובנטי Poly(I:C) (חומצה פולינוזינית-פוליציטידילית) ו- CpG (אוליגודיאוקסינוקלאוטידים סינתטיים המכילים מוטיבים CPG ללא מורתיל) ראינו באופן כללי(איור 4A)ובמשך כמה נקודות זמן רמות IgG גבוהות משמעותית בהשוואה לחיסון עם OVA בלבד(איור 4B). יתר על כן, αDEC-205/OVA ביעילות המושרה CD4 ספציפי OVA+ כמו גם CD8+ תגובות תא T (איור 4C,D) ואת αDEC-205/ OVA המושרה CD8+ תגובת תא T חרג באופן משמעותי מזה שנגרם על ידי OVA לבד (איור 4D).

Figure 1
איור 1: מודל ההטיות הכימיות של αDEC-205 ו-OVA. בשלב הראשון, האמין העיקרי של αDEC-205 מגיב עם אסתר NHS של סולפו-SMCC crosslinker וכתוצאה מכך maleimide מופעל αDEC-205. לאחר הפחתת קשרים דיסולפידים של חלבון OVA באמצעות דגירה עם TCEP-HCl, αDEC-205 מופעל מגיב עם חלבון OVA מופחת TCEP-HCl כדי ליצור את αDEC-205/OVA נוגדן / נוגדן התיד. קיצורים: אסתר N-הידרוקסיסוקינימיד (אסתר NHS); סולפוסוצינימידיל 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-קרבוקסילאט (סולפו-SMCC); טריס (2-קרבוקסיתיל) פוספין הידרוכלוריד (TCEP-HCl). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אימות של αDEC-205/OVA מצומד כימית. כדי לאמת הטיות כימיות יעילות של αDEC-205 וחלבון OVA, ניתוח כתם מערבי (A,B)ו ELISA (C,D)מבוצעים. דוגמאות של αDEC-205/OVA, αDEC-205 וריכוזים שונים של חלבון OVA היו נתונים ל- SDS-PAGE (10%) וניתוח כתם מערבי לאחר מכן תוך שימוש בנוגדן ראשוני של ארנב αOVA ונוגדן עז αrabbit-IgG-HRPO המשני לזיהוי חלבון OVA (A) או αrat-IgG(H + L)-HRPO נוגדן לזיהוי αDEC-205 (B). (C)ייצוג סכמטי של ELISA לאימות של מצומד αDEC-205/OVA. נוגדן ציפוי הארנב αOVA נקשר αDEC-205/OVA באמצעות OVA מצומד. Goat αrat-IgG(H+L)-HRPO מזהה את החלק ה- αDEC-205 של ההצומדת הכבולה ואות חיובי ובכך מאשר הטיות יעילות. אליסהבוצעה כמתואר ב- (C). נותחו כמויות מדוללות באופן סדרתי (1:2) של αDEC-205/OVA (600 ננוגרם עד 9.38 ננוגרם). הנתונים מוצגים כממוצע של טריפליקאטים של תוכחת ייצוגית. קיצורים: חיסון הקשורים לאנזים (ELISA); פרוקסידאז צנון סוס (HRPO); אובלבומין (OVA); נתרן דודסיל סולפט פולאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE). לוחות א' ו-ב' שונו מוולקמר ואח'12. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: כריכה של αDEC-205/Core לתאים דנדריטיים שמקורם במח העצם (BMDC) על ידי מיקרוסקופיה של זרימה-ציטומטריה ואימונופלואורסצנטיות. כדי לנתח את הקיבולת של αDEC-205/Core לאגד את מולקולת היעד שלה DEC-205 על BMDCs במבחנה,   ניתוח מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) (A,B)ומיקרוסקופיה חיסונית (C) בוצעו. בקצרה, תאי מח עצם היו מבודדים מן הרגליים האחוריות של עכברי Balb / c נקבה (n = 3) 8-12 שבועות של גיל ותרבית בינוני RPMI בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% גלוטמין, 0.25 mM mercaptoethanol ו 5 ng / mL GM-CSF (גורם גירוי המושבה granulocyte-macrophage). ביום 6, BMDCs שאינם דבקים נקצרו בקפידה ושימשו לבדיקות מחייבות. (א,ב) מחשבי BMDCs שנוצרו במבחנה דוגרו עם 10 מיקרוגרם / מ"ל αDEC-205 / Core, αDEC-205 או בינוני (בקרה) עבור 1 שעות ב 4 °C (5 °F) ואחריו כתמים עם αCD11c תווית APC [שיבוט HL3]. זיהוי של αDEC-205/Core על פני השטח של BMDCs בוצע על ידי כתמים נוספים של התאים עם או PE-תווית עז αrat (A) או עכבר αHCV Core [שיבוט C7-50] ואחריו משני αmouse-IgG1-PE כתמים (B). היסטוגרמה מייצגת מציגה את אות PE ואת % התאים החיוביים PE של תאי CD11c+ מגודרים. (C)BMDCs שנוצרו במבחנה מעכברי Balb / c נאיביים מוינו עבור MHC-II+ ו- CD11c+ תאים ודגרו עם 10 מיקרוגרם / מ"ל αDEC-205 / Core עבור 1 שעות ב 4 °C (55 °F). αDEC-205/Core קשור לתא היה מוכתם באלכסה αrat-IgG עם עכבר αHCV Core [שיבוט C7-50] ואלכסה 488-זוג αmouse-IgG במשך 30 דקות ב 4 °C לאחר הכביסה. התאים היו דמיינו על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר). יכולת הכריכה של αDEC-205/Core ל- BMDCs אושרה על ידי שכבת-על של שני הכתמים (חיובי כפול = כתום). קיצורים: תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם (BMDC); מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS); גרנולוצייט-מקרופאג מושבה מגרה גורם (GM-CSF); וירוס הפטיטיס C (HCV). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תגובות הומוריסטיות ותאיות ספציפיות ל-OVA בעקבות חיסון עם αDEC-205/OVA. הפונקציונליות של αDEC-205/OVA למקד DC ב vivo הוכח באמצעות ניסויי חיסון כפי שפורסם בעבר Volckmar ואח'12. בקצרה, נקבה בת 6-8 שבועות C57BL/6 עכברים (n=5) היו מחוסנים תת עורית בימים 0, 14 ו -28 עם 30 מיקרוגרם αDEC-205/OVA מצומדים יחד עם האדג'ובנטים 50 מיקרוגרם פולי (I:C)/50 מיקרוגרם CpG, 30 מיקרוגרם αDEC-205 לבד או 7 מיקרוגרם חלבון OVA לבד בנפח כולל של 50 μL PBS לכל חיה. בקרות נוספות טופלו עם PBS בלבד. (א,ב) כדי לעקוב אחר התגובה החיסונית ההומוריאלית, עכברים מחוסנים היו מרדים קלות באמצעות שאיפת איזופלוראן ודגימות דם נאספו מהסינוס הרטרו-מסלולי ביום 0, 13 ו -27 ועל ידי ניקוב לב ביום 42. סרה הוכנו כמתואר ונבחנו לנוכחות של IgG ספציפי OVA על ידי ELISA12. טיטרים של נקודות קצה התבטאו כערך ההדדי של דילול הסרום האחרון שהניב ספיגה פעמיים מעל הערכים של פקדים שליליים. התוצאות נאספו משלושה ניסויים עצמאיים. (A)קינטי של OVA ספציפי סרום IgG titers המוצגים כמו הקבוצה מתכוונת. (B)Titer IgG ספציפי OVA ביום 27 ויום 42 מוצג עבור עכברים בודדים יחד עם ממוצע הקבוצה. סטטיסטיקה: מבחן T דו-צדדי לא מנודה. (C,D) האינדוקציה של תגובות חיסוניות תאיות נותחה על ידי נקודה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISPOT) בדיקות באמצעות ערכת הזיהוי IFNγ murine ביום 42 כפי שפורסם בעבר12. טחול מבודד מעכברים מחוסנים אוגדו עבור קבוצות הניסוי ומספר יחידות יוצרות ספוט IFNγ/106 תאים בעקבות גירוי עם 5 מ"ג / מ"ל CD4+ (C) או CD8+ פפטיד OVA (D) נותח (פפטידים OVA: CD4323–339 (ISQAVHAAHAHAEINEAGR) ו- CD8257-264 (סיינפקל)). פסים מייצגים את ה- SEM ± הממוצע (n = 5, משולש מדגימות במאגר). סטטיסטיקה: ANOVA בכיוון אחד עם מבחן ההשוואות המרובות של Dunnett (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). קיצורים: רצפי ציטוצין-פוספט-גואנין אוליגונוקלאוטידים (CpG), בדיקת חיסונים הקשורה לאנזימים (ELISA), נקודה חיסונית הקשורה לאנזימים (ELISPOT), אובלבומין (OVA), תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), חומצה פולינוזינית-פוליציטידילית (Poly(I:C)). נתון זה שונה מוולקמר ואח '.12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטיות כימיות של נוגדן ספציפי לקולטן אנדוציטוזיס ואנטיגן חלבונים מספקות גישה יעילה, וחשובה, גם גמישה עבור in vivo DC פילוח במודלים עכבר פרה קליני. עם הפרוטוקול שלנו אנו מספקים גישה יעילה להטיה מוצלחת של מודל אנטיגן OVA לנוגדן IgG ספציפי DEC-205.

בפרוטוקול שלנו, αDEC-205 מטוהר מקו התא היברידי ובעבר, טיהרנו את הנוגדן באמצעות חלבון G ספרוז כמתואר. ראוי לציין, השתמשנו גם FPLC כדי לטהר αDEC-205 במחקרים מאוחרים יותר, ההטיות הכימיות הבאות היו יעילות גם כן. הצעדים הקריטיים להטיה כימית יעילה הם ראשוניות של הנוגדן והחלבון. ביצענו את השלבים הבאים מפרוטוקולים זמינים שונים כדי לבצע סוף סוף דגירה של הנוגדן עם חוצה סולפו-SMCC והפחתת החלבון באמצעות TCEP-HCl. באופן ספציפי, בשלב זה השלבים הקריטיים הם הכנה טרייה של TCEP-HCl (שלב 3.1.) ומשך הדגירה של TCEP-HCl עם החלבון, אשר לא צריך להיות מורחב (שלב 3.1.2.). יתר על כן, מאגר החלבון המשמש להפחתת איגרות החוב הדיסולפידיות באמצעות TCEP-HCl הוא קריטי, שכן הוא יכול להשפיע לרעה על הפחתה על ידי TCEP-HCl. כמו כן, חשוב לערבב מיד את הנוגדן הפעיל ואת החלבון המופחת (שלב 3.3.6.) כדי להבטיח תנאי תגובה אופטימליים להטיות. בידינו, גישה זו הניבה את התוצאות היעילות והאמינות ביותר לגבי הטיות. צעד קריטי נוסף לגישות ויוו הבאות הוא הסרת OVA לא מאוגד מן מצומד αDEC-205/OVA. כדי לאמת שלב זה, ביצענו אופטימיזציה של ניתוחי כתם מערביים וממליצים על זיהוי הן של αDEC-205 הצומד והן של חלבון OVA מצומד(איור 2A ו- B). במקרה OVA מאוגד קיים בתמיסה מצומדת הסופית, סופג וזיהוי ריכוזים ידועים של OVA (כמו באיור 2A) יסייע להעריך את כמות OVA לא מאוגד ביחס לכמות הכוללת של חלבון טעון עבור SDS-PAGE. אם ההטיה לא הייתה יעילה, פתרון הבעיות אמור להתייחס ליחס האנטיגן/נוגדן המשמש להטיה. במקרה שההטיה הייתה יעילה כפי שזוהתה על ידי ELISA, אך לא ניתן לזהותה על ידי ניתוח כתם מערבי, חווינו את ריכוזי הנוגדנים בניתוחי הכתם המערביים (שלבים 4.6., 4.8., 4.14.) הגורם הקריטי ביותר.

המגבלה העיקרית של הגישה שלנו היא יעילות הטיות משתנה לפעמים שבה אין מתאם קבוע בין מספר מולקולות הנוגדנים לבין כמות החלבון הזוגי. עם זאת, אנו מאמינים וחווים כי הפרוטוקול המודגם באופן אמין מאפשר מחקרים הבאים vivo של פילוח DC מניב תוצאות לשחזור. יתר על כן, בעוד באופן עקרוני בפרוטוקול שלנו הן αDEC-205, כמו גם חלבון OVA ניתן להחליף נוגדנים חלופיים אנטיגנים עבור מחקרים ב- vivo של תחומי עניין שונים, צעדים בודדים של ההטיה הכימית יצטרכו להיות אופטימיזציה חדשה עבור הרכיבים החדשים. זה חל בעיקר על יחס נוגדן / אנטיגן אופטימלי והוא יכול להיות תלוי למשל בנגישות של שאריות Cys מופחת. בגישות שלנו, היחסים האופטימליים שהביאו לתגובות הטיות מוצלחות היו 1:5 עבור OVA ל- αDEC-205 ו- 1.35:1 לחלבוני HCV NS3 (חלבון לא מבני 3) וליבה ל- αDEC-205. עבור כל מצומד, יש להחריג השפעות שליליות של ההטיה או ההטיה ככזו על יכולת כריכת האנטיגן של הנוגדן. שימו לב, הטיות של פפטידים אימונוגניים במקום חלבונים באורך מלא היא פחות בעייתית בהקשר זה. עם זאת, חלבונים מספקים מגוון אנטיגן גבוה יותר בחיסון שלאחר מכן. גישות היתוך גנטי מציגות חלופה להטיה כימית ויש להן גם יתרונות ברורים1. בסופו של דבר, הבחירה באסטרטגיה לקשר נוגדנים ואנטיגנים למיקוד DC תהיה תלויה במשאבים, במיקוד המחקר וביישומים הצפויים של הצומדים. אנו מאמינים שהגמישות היחסית לגבי נוגדנים ואנטיגנים מהווה יתרון מרכזי בהטיה כימית ואכן השתמשנו בפרוטוקול המתואר כאן להטיה כימית יעילה של αDEC-205 לחלבונים שונים של נגיף הפטיטיס C (HCV)(איור 3 ונתונים שאינם מוצגים).

בסך הכל, אנו מאמינים כי הטיות כימיות של נוגדנים ספציפיים קולטן אנדוציאטוזיס לאנטיגנים חלבון כגון αDEC-205/OVA מציגה כלי גמיש ואמין כדי ליצור הטיות נוגדנים / אנטיגן בעלי ערך יוצא דופן בחקר גישות פילוח DC, כולל אלה שמטרתם גרימת חסינות אנטיטומור, במיוחד במודלים חייתיים פרה-אקליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לס. פרטין על הסיוע הטכני המומחה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של איגוד הלמהולץ של מרכזי מחקר גרמניים (HGF) שניתן כחלק מברית הלמהולץ 'אימונותרפיה של סרטן' (HCC_WP2b).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody buffer 2 % 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 % 5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA) 10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 % 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 % 10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25 Greiner Bio-One 690175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75 Greiner Bio-One 658175 we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175 Greiner Bio-One 661175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa Sartorius VS2001 Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml Thermo Fisher Scientific 88532 Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottles Nalgene 525-2314 PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA) 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa Thermo Fisher Scientific 89891 Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate) Sigma-Aldrich/Merck T8665-100ML 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate) Roche/Merck 12 015 200 01 Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa SERVA Electrophoresis 44110 Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate Thermo Fisher Scientific 442404 MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum PAN-BIOtech P40-47500 FBS Good forte
ISF-1 medium Biochrom/bioswisstec F 9061-01
milk powder Carl Roth T145.2 powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma ATCC HB-290 if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x  for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin Hyglos (via BioVendor) 321000 EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles Nunc In Vitro 734-2394 standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator strips Merck 109535 pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  112-035-062 obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA) Jackson ImmunoResearch  112-035-068 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  111-035-045  obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA) Abcam ab181688 used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) OriGene R1101 used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column Merck/Millipore P3296 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane Merck/Millipore IPVH00010 immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug Omnilab 5230217 DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube Omnilab 5430925 DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA) 1M H2SO4
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific 22322 Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm  Merck/Millipore SLGV033RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 ml Omnilab Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas B. Braun Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl Thermo Fisher Scientific A35349
tubing connector Omnilab Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  3. Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
  4. Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
  5. Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
  6. Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
  7. Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
  8. Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
  9. Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
  10. Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
  11. Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
  12. Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
  13. Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
  14. Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).

Tags

חקר הסרטן גיליון 168 מיקוד תאים דנדריטיים תאים דנדריטיים DEC-205 אספקת אנטיגן הטיות אנטיגן הטיות כימיות אנדוציטוזיס בתיווך נוגדנים חיסון חסינות אנטי-אטומית
הטיות כימיות של נוגדן מטוהר מכוון DEC-205 עם חלבון באורך מלא למיקוד תאים דנדריטיים של עכבר <em>במבחנה</em> וב- <em>In Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T.,… More

Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T., Frentzel, S., Erck, C., van Ham, M., Stegemann-Koniszewski, S., Bruder, D. Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (168), e62018, doi:10.3791/62018 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter