Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Kemisk bøjning af et renset DEC-205-rettet antistof med protein i fuld længde til målretning af musededritiske celler In Vitro og In Vivo

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/62018
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1, 1,2, 4, 4, *1,2,5, *1,2
1Immune Regulation Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Infection Immunology Group, Institute of Medical Microbiology, Infection Prevention and Control, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 3Institute for Molecular and Clinical Immunology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 4Cellular Proteome Research, Helmholtz Centre for Infection Research, 5Experimental Pneumology, University Hospital of Pneumology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en protokol for den kemiske bøjning af modellen antigen ovalbumin til en endokytose receptor-specifikke antistof for in vivo dendritiske celle målretning. Protokollen omfatter rensning af antistoffet, kemisk bøjning af antigen, samt rensning af konjugaten og verifikation af effektiv bøjning.

Abstract

Målrettet antigen levering til cross-præsentere dendritiske celler (DC) in vivo effektivt inducerer T effektor celle svar og viser en værdifuld tilgang i vaccine design. Antigen leveres til DC via antistoffer, der er specifikke for endoytosereceptorer som DEC-205, der fremkalder optagelse, behandling og MHC-klasse I- og II-præsentation.

Effektiv og pålidelig bøjning af det ønskede antigen til et passende antistof er et kritisk skridt i DC-målretning og afhænger blandt andet af antigens format. Kemisk bøjning af protein i fuld længde til rensede antistoffer er en mulig strategi. Tidligere har vi med succes etableret krydsbinding af modellen antigen ovalbumin (OVA) og et DEC-205-specifikt IgG2a-antistof (αDEC-205) til in vivo DC-målretningsundersøgelser hos mus. Det første trin i protokollen er rensning af antistoffet fra supernatanten af NLDC (ikke-lymfoide dendritiske celler)-145 hybridoma ved affinitetskromatografi. Det rensede antistof aktiveres til kemisk bøjning ved sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylat), mens samtidig sulfhydryl-grupperne af OVA-proteinet eksponeres gennem inkubation med TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) fosphinhydrochlorid). Overskydende TCEP-HCl og sulfo-SMCC fjernes, og antigen blandes med det aktiverede antistof til natkobling. Den resulterende αDEC-205/OVA konjugat er koncentreret og befriet fra ubundet OVA. Vellykket bøjning af OVA til αDEC-205 verificeres ved western blotanalyse og enzymrelateret immunosorbentanalyse (ELISA).

Vi har med succes brugt kemisk crosslinked αDEC-205/OVA til at fremkalde cytotoksiske T-celleresponser i leveren og til at sammenligne forskellige adjuvanser for deres potentielle inducerende humoristiske og cellulære immunitet efter in vivo målretning af DEC-205+ DC. Ud over, at sådanne kemisk koblet antistof / antigen konjugates tilbyde værdifulde værktøjer til effektiv induktion af vaccinen reaktioner på tumor antigener og har vist sig at være overlegen i forhold til klassisk immunisering tilgange vedrørende forebyggelse og behandling af forskellige typer af tumorer.

Introduction

Dendritiske celler (DC) er centrale aktører i immunsystemet. De er en forskelligartet gruppe af celler specialiseret i antigen-præsentation og deres vigtigste funktion er at bygge bro medfødte og adaptive immunitet1,2. Det er vigtigt, at DC ikke kun spiller en vigtig rolle i effektive og specifikke patogenstyrede reaktioner, men er også involveret i mange aspekter af antitumorimmunitet1,3.

På grund af deres eksklusive rolle i værtsimmunitet kom DC i fokus som målceller til vaccination4. En tilgang er at målrette antigener til DC in vivo at fremkalde antigen-specifikke immunrespons og i løbet af de sidste år, et stort antal undersøgelser er blevet dedikeret til at definere egnede receptorer og målretning strategier1,4. Et eksempel er C-type lectin receptor DEC-205, som kan målrettes af DEC-205-specifikke antistoffer til at fremkalde endokytose. Det er vigtigt, dec-205 målretning i kombination med egnede adjuvanser har vist sig effektivt at fremkalde langlivede og beskyttende CD4+ og CD8+ T-celler, samt antistofresponser, også mod tumorantigener3,5,6,7,8,9.

Der er en række undersøgelser , der viser konjugeret antigener målrettet DC at være overlegen i forhold til gratis ukonjugeret antigen3,5,10,11,12. Dette gør bøjning af antigen til de respektive DC målretning moiety et centralt skridt i DC målretning tilgange. I tilfælde af DC-målretning via antistoffer eller antistoffragmenter kan antigener enten være kemisk eller genetisk forbundet, og begge strategier giver sine egne (dis)fordele1. På den ene side, i genetisk manipuleret antistof-antigen konstruktioner er der en kontrol over antigen dosis samt placeringen giver overlegen sammenlignelighed mellem parti1. Samtidig kræver kemisk bøjning imidlertid mindre forberedelse og giver mere fleksibilitet, især når man forsøger at teste og sammenligne forskellige antigener og/eller vaccinationsstrategier i eksperimentelle og prækliniske modeller.

Her præsenterer vi en protokol for effektiv og pålidelig kemisk bøjning af ovalbumin (OVA) som et modelproteinantigen til et DEC-205-specifikt IgG2a-antistof (αDEC-205), der er egnet til in vivo DC-målretning hos mus. Først renses αDEC-205 fra NLDC-145 hybridomaceller13. For kemisk bøjning anvendes den heterobiologiske crosslinker sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylat (sulfo-SMCC), som indeholder NHS (N-hydroxysuccinimid) ester- og maleimidegrupper, hvilket muliggør kovalent bøjning af amin- og sulfhydrylholdige molekyler. Specifikt reagerer de primære aminer af antistoffet i første omgang med sulfo-SMCC, og den resulterende maleimideaktiverede αDEC-205 reagerer derefter med det sulfhydrylholdige OVA-protein reduceret gennem TCEP-HCl (Tris(2-carboxyethyl) fosphinhydrochlorid). Det endelige produkt er kemisk konjugeret αDEC-205/OVA (Figur 1). Ud over kemisk bøjning selv beskriver vores protokol fjernelse af overskydende OVA fra konjugaten samt verifikation af vellykket bøjning gennem western blotanalyse og en specifik enzymrelateret immunosorbentanalyse. Vi har med succes anvendt denne tilgang i fortiden til kemisk konjugat OVA og andre proteiner eller immunogene peptider til αDEC-205. Vi demonstrerer effektiv binding til CD11c+ celler in vitro samt effektiv induktion af cellulær og humoristisk immunitet in vivo.

Bestemt, der er ulemper ved denne metode, såsom i lot-to-lot sammenlignelighed og i den nøjagtige dosering af antigen inden for den endelige konjugat. Ikke desto mindre giver kemisk bøjning eksperimentel fleksibilitet i valget af antistoffet og proteinantigen sammenlignet med genetisk manipulerede konstruktioner. Derfor mener vi, at denne tilgang er særlig værdifuld i evalueringen af forskellige antigener for deres effektivitet i DC målretning i prækliniske musemodeller, især også i forbindelse med specifikke antitumor immunresponser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de beskrevne dyreforsøg blev godkendt af den lokale myndighed (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; sagsnummer 33.12-42502-04-10/0108) og blev udført i henhold til de nationale og institutionelle retningslinjer.

1. Produktion af αDEC-205 fra hybridoma cellelinjen NLDC-145

  1. Til antistofproduktion optøs kryopreserverede NLDC-145-celler, der producerer αDEC-205 ved 37 °C i et vandbad. Udvide cellerne ved 37 °C og 5% CO2. To 75 cm2 flasker vil være nødvendige for at gå videre til antistofproduktion. Cellekulturprocedurer bør udføres i et sikkerhedskabinet for at sikre sikre arbejdsforhold og forhindre forurening af kulturerne.
    1. Resuspend 1 mL af optøede celler (1 x 106 - 5 x 106 celler/mL) i 9 mL ISF-1 medium suppleret med 1% penicillin/streptomycin (forvarmet til 37 °C) i en cellekultur kolbe (25 cm2). Kolben placeres vandret i en cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2.
    2. Kultur cellerne ved 37 °C og 5% CO2, indtil 70% sammenløb. Dette bør normalt opnås efter 24 - 48 timer.
    3. Når cellerne er 70% sammenflydende, overføre den komplette NLDC-145 celle suspension (10 mL) i en 15 mL koniske centrifuge rør ved hjælp af en pipette controller med en pipette i et volumenområde fra 1-10 mL. Pellet cellerne ved centrifugering ved 250 x g i 10 min ved stuetemperatur.
    4. Forvarm ISF-1 medium til 37 °C i et vandbad og genbruges pellet i 12 mL ISF-1 medium suppleret med 1% penicillin/streptomycin. Den ophængte celleaffjedring overføres til en frisk cellekulturkolbe (75 cm2).
    5. Kultur og udvid cellerne i ISF-1 medium suppleret med 1% penicillin /streptomycin ved 37 °C og 5% CO2, indtil 70% sammenløb og 99% levedygtige. Dette bør normalt opnås efter 48 - 72 timer.
    6. Opdel cellerne til to 75 cm2 kolber. For at gøre dette skal du først skylle cellekulturflaskebunden /kulturoverfladen med celleaffjedringen for at fjerne alle NLDC-145-celler fra overfladen. Overfør 6 mL af NLDC-145 celleaffjedringen hver til en af to friske 75 cm2 flasker og tilsæt forvarmet ISF-1 medium suppleret med 1% penicillin /streptomycin op til 12 mL.
      BEMÆRK: Forny ikke cellekulturmediet, da NLDC-145-cellerne vil have konditioneret mediet. Overfør cellerne sammen med deres medium og fyld kulturen op til det ønskede volumen med frisk medium. Dette er afgørende for NLDC-145-cellernes levedygtighed og maksimale antistofproduktion.
    7. Udvid cellekulturerne ved 37 °C og 5% CO2, indtil ca. 70% sammenløb, som generelt opnås efter 48 - 72 timer.
    8. Når cellerne er 70% sammenflydende, overføres 10 mL af den udvidede NLDC-145 celleaffjedring fra hver af de 75 cm2 flasker til en PETG (polyethylen terephthalatglykol) rulleflaske (1.050 cm2). Til dette skal du skylle cellekulturkolbebunden/kulturoverfladen med celleaffjedringen for at fjerne alle celler fra overfladen ved hjælp af en pipettecontroller og 10 mL pipette.
    9. Der tilsættes 140 mL ISF-1 medium suppleret med 1% penicillin/streptomycin (forvarmet til 37 °C) direkte ud af den mellemstore flaske til hver af de NLDC-145, der indeholder rulleflasker, der fylder dem op til 150 mL-mærket.
      BEMÆRK: Se bemærkningen i trin 1.1.6.
    10. Vals rulleflaskerne ved 37 °C, 5% CO2 og 25 runder/min i tre dage.
    11. Der tilsættes 150 mL ISF-1 medium suppleret med 1% penicillin/streptomycin (forvarmet til 37 °C) til hver af de NLDC-145, der indeholder rulleflasker, der fylder dem op til 300 mL-mærket.
    12. Kultur rulleflaskerne, der nu indeholder 300 mL kultur hver ved 37 °C, 5% CO2 og 25 runder/min i yderligere tre dage.
    13. Der tilsættes yderligere 100 mL ISF-1 medium suppleret med 1% penicillin/streptomycin (forvarmet til 37 °C) til hver af de NLDC-145, der indeholder rulleflasker, hvorved de fyldes op til 400 mL-mærket.
    14. Kultur rulleflaskerne, der nu indeholder 400 mL-kultur hver ved 37 °C, 5% CO2 og 25 runder/min i yderligere syv dage.
      BEMÆRK: I løbet af denne uge bliver kulturen meget tæt (op til 95% tæthed) og levedygtigheden falder (ned til så lidt som 50%), hvilket muliggør maksimal antistoffrigivelse.
  2. Til rensning af αDEC-205 fra kultur supernatant hæld NLDC-145 celle suspension (fra begge rulleflasker) direkte til 500 mL autoklavet centrifugering flasker.
    BEMÆRK: Der skal indsamles et samlet volumen på 800 mL kultur.
    1. Centrifuge kulturen i 30 min ved 8.600 x g og 4 °C for at fjerne celler og snavs.
    2. Saml supernatants, kassere pellets og samle supernatants i en steril reagens flaske.
      BEMÆRK: Rensning af αDEC-205 kan påbegyndes med det samme (trin 2.), eller supernatanten kan opbevares på kort sigt ved 4 °C.

2. Rensning af αDEC-205 antistof fra NLDC-145 celle supernatant

BEMÆRK: Fra NLDC-145 celle supernatant, αDEC-205 renses ved hjælp af et protein G Sepharose kolonne (genanvendelig). Søjledimensionerne er 15 mm x 74 mm og 5 mL protein G Sepharose er pakket pr. Kolonne.

  1. Til fremstilling og vask af proteinet G Sepharose kolonne, sætte en lufttæt gummi stik på den øverste åbning af proteinet G Sepharose kolonne. Punktere gummistikket med to sterile kanyler (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
    1. Tilslut en 10 mL sprøjte til en af de to kanyler og et fleksibelt siliciumrør (ca. 100 cm langt, 2,5 - 3 mm i diameter) med et slangestik til den anden kanyle.
      BEMÆRK: Sprøjten / gummistikkonstruktionen kan genbruges og giver et vakuum, der resulterer i en kontinuerlig strøm af den store mængde kultur supernatant til proteinet G Sepharose kolonne. Til dette formål trækkes sprøjtens stempel lidt tilbage for at sikre kontinuerlig væskestrøm i de følgende trin.
    2. Kolonnen vaskes med 50 ml 0,1 M istidseddike (pH 2) for at fjerne potentielt resterende antistof fra tidligere antistofrensning. Sæt enden af siliciumrøret i den 0,1 M iskolde eddikesyre (pH 2) fyldte reagensflaske. Som følge af det inducerede vakuum løber 50 ml af den istidseddike (pH 2) dråbevis gennem proteinet G Sepharose kolonnen.
      BEMÆRK: 0,1 M istidseddike (pH 2) skal opbevares i en reagensflaske eller fyldes frisk i et bægerglas.
    3. Vask kolonnen med 100-200 mL fosfat-buffered saltvand (PBS). Sæt enden af siliciumrøret i en PBS fyldt reagensflaske eller bægerglas. Lad 100-200 mL PBS løbe dropwise gennem proteinet G Sepharose kolonne.
  2. Ved antistofrensning fra NLDC-145-supernatanten skal 800 mL af NLDC-145 supernatanten (fremstillet fra trin 1.2.2.) indlæses på kolonnen. Sæt enden af siliciumrøret i NLDC-145 supernatant fyldt reagensflaske. Lad 800 mL NLDC-145 supernatant køre dropwise gennem kolonnen.
    1. Vask kolonnen med 500 mL PBS. Sæt enden af siliciumrøret i en PBS fyldt reagensflaske eller bægerglas. Lad 500 mL PBS køre dropwise gennem kolonnen.
    2. Ved udløsning anvendes 20 1,5 mL rør og pipette 100 μL på 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) i hvert 1,5 mL rør. Gummistikket tages ud af kolonnen og pipetten 1 mL på 0,1 M glycin (pH 3) til det øverste kammer i proteinet G Sepharose kolonnen for at fjerne antistoffet fra kolonnen. Saml gennemstrømningen direkte som eluate i et af de forberedte 1,5 ML rør.
    3. Elutionstrinnet (2.2.2.) gentages for alle 20 rør (1,5 mL).
    4. Den optiske massefylde af alle elutionfraktioner bestemmes ved 280 nm (OD280) ved hjælp af et spektrofotometer for at identificere de antistofholdige fraktioner.
      BEMÆRK: Brug den første elution brøk som tom.
    5. Pulje alle brøker med en OD280 større end 0,5 (ca. 10 fraktioner).
    6. Proteinet G Sepharosesøjlen fyldes med 20 % ethanol ved 4 °C.
  3. Dialyze de samlede elutions mod 1000 mL PBS (i en 2000 mL bæger) ved 4 ° C natten over ved hjælp af dialyse slanger med en molekylvægt afskåret (MWCO) på 12 - 14 kDa.
    1. Skær dialyseslangen i stykker på 20 cm. Kog dialyseslangen i 500-800 mL på 10 mM EDTA (pH 7.5) i 30 min i et bægerglas ved hjælp af en kogeplade for at fjerne forurening. Kassér 10 mM EDTA (pH 7.5) opløsningen, og kog dialyseslangen i deioniseret vand i 10 min.
      BEMÆRK: Dialyseslangen kan bruges direkte eller opbevares i 0,01 % natriumard (NaN3)/H2O-opløsning ved 4 °C indtil næste brug.
    2. Luk bunden af dialyseslangen med en passende dialyserørslukning/enkeltdels, hængslet klemme, og rør forsigtigt antistofelutionen ind i dialyseslangen. Luk toppen af dialyseslangen med en anden klemme.
    3. Fastgør den øverste klemme af dialyseslangen til et flydende stativ, sæt den sammen med en magnetisk rørestang i PBS-fyldt bægerglas og læg bægerglasset på en magnetisk omrører.
    4. Dialyze natten over omrøring ved 4 °C.
  4. For at øge koncentrationen af αDEC-205 skal du indlæse det komplette dialyse til en centrifugalkoncentrator med 10 kDa MWCO. Åbn en klemme af slangen og rør forsigtigt den komplette dialyse ud af dialyseslangen ind i centrifugalkoncentratoren (10 kDa MWCO).
    BEMÆRK: Rør ikke koncentratorbunden med pipettespidsen.
    1. Centrifuge i 30 min ved 693 x g (2.000 omdr./min. og 4 °C.
    2. Centrifugalkoncentratoren med 10 mL PBS og centrifuge ved 693 x g (2.000 omdr./min.) og 4 °C, indtil det sidste volumen af antistofopløsningen er tilbage er 1-1,5 mL.
      BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, gentages centrifugeringstrinnet på 2.4.1. for at tilpasse sig det ønskede beløb.
    3. Ved hjælp af et spektrofotometer bestemmes den optiske tæthed af den koncentrerede αDEC-205-opløsning ved 280 nm (OD280). Brug PBS som tom.
    4. Koncentrationen af αDEC-205 beregnes ved hjælp af følgende formel:
      koncentration [mg/mL] = OD280/1,4.
    5. αDEC-205-opløsningen filtreres med en 0,22 μm sprøjtefilterenhed.
      BEMÆRK: Rensning af αDEC-205 fra NLDC-145 hybridoma celle supernatant kan også opnås ved FPLC (hurtig protein flydende kromatografi). Renset αDEC-205 kan opbevares ved 4 °C eller ved -18 °C til langtidsopbevaring.

3. Kemisk bøjning af OVA til αDEC-205

BEMÆRK: Der kræves et forhold på 0,5 mg OVA-protein til 2,5 mg αDEC-205 (1:5) for optimal kemisk bøjning. Dette forhold kan dog variere for andre proteiner og antistoffer og skal optimeres til alternative konjugates. Reduktion af OVA-proteinets disulfidbindinger sker gennem inkubation med 30 mM TCEP-HCl, hvilket udsætter sulfhydrylgrupperne for kemisk bøjning for αDEC-205 og 240 μl TCEP-HCl er nødvendige i trin 3.2. Begge trin, TCEP-induceret reduktion af OVA (trin 3.1.) og sulfo-SMCC-aktivering af αDEC-205 (trin 3.2.), bør fortrinsvis udføres parallelt.

  1. Friskforberedt en 125 mM TCEP-HCl-opløsning (pH 7.0). Den ønskede mængde TCEP-HCl afvejes, og TCEP-HCl opløses i 0,9 M Tris-basen (pH 8.8). Brug pH-indikatorstrimler til at teste pH-pH'en for 125 mM TCEP-HCl-opløsningen (som skal være neutral) og juster pH'en med Tris-basen (pH 8.8).
    1. Pipette 200 μL OVA proteinopløsning (indeholdende 0,5 mg OVA) i et sterilt rør på 1,5 mL. Der tilsættes 240 μl 125 mM TCEP-HCl og 560 μL sterilt ultrapurt vand til OVA-proteinet ved hjælp af en pipette til en endelig koncentration på 0,5 mg/mL OVA-protein og 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      BEMÆRK: 2,5 mg EndoGrade OVA (lyophilized) opløses i 1 mL PBS, hvilket resulterer i en 2,5 mg/mL OVA-opløsning.
    2. Inkuberes den resulterende OVA/TCEP-HCl ved stuetemperatur i 1,5 timer.
      BEMÆRK: Forlæng ikke dette inkubationstrin.
  2. For at aktivere αDEC-205 til bøjning opløses 2 mg sulfo-SMCC i 100 μL ultrapurt vand.
    BEMÆRK: Sulfo-SMCC er modtagelig for hydrolyse. Derfor bør større mængder af uopløst sulfo-SMCC håndteres hurtigt eller tilgængelige 2 mg aliquots bør anvendes.
    1. Fortynd αDEC-205 i PBS, således at der er indeholdt 2,5 mg i 900 μL.
    2. Bland 2,5 mg αDEC-205 (900 μL volumen, fremstillet af trin 3.2.1.) og 100 μL sulfo-SMCC (fremstillet fra trin 3.2.) i et 1,5 mL rør, hvilket resulterer i et samlet volumen på 1 mL.
    3. Inkuberes αDEC-205/sulfo-SMCC-opløsningen i 30 min ved 37 °C og 550 omdr./min.
  3. Efter disse inkubationer fjernes overskydende sulfo-SMCC og TCEP-HCl straks fra opløsningerne ved hjælp af afsaltningskolonner (MWCO 7 kDa; 5 mL kolonnevolumen).
    1. Drej kolonnerne (MWCO 7 kDa) bundlukning, løsn hætten og læg kolonnen i et 15 mL konisk rør.
    2. Centrifuge i 2 min ved 1.000 x g ved stuetemperatur for at fjerne væsken.
    3. Placer kolonnen i et nyt rør og fjern hætten. Læg langsomt henholdsvis antistoffet/sulfo-SMCC og OVA/TCEP-HCl til midten af den kompakte harpiksbund på en kolonne hver.
    4. Centrifuge i 2 min ved 1.000 x g ved stuetemperatur.
    5. Kassér kolonnerne efter brug. De opløsninger, der indeholder antistof og OVA, der er klargjort til bøjning, er i rørene.
    6. Bland straks begge opløsninger ved pipetter til bøjning af αDEC-205 og OVA.
    7. Inkuber den resulterende αDEC-205 og OVA blanding natten over ved 4 °C.
  4. Efter bøjning fjernes overskydende ubundet OVA fra opløsningen, og den koblede αDEC-205/OVA koncentreres ved hjælp af en centrifugalproteinkoncentrator (MWCO 150 kDa).
    1. Skyl centrifugalproteinkoncentratoren (MWCO 150 kDa) ved at pipettere 12 mL PBS på kolonnen og centrifugering i 2 min ved 2.000 x g ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, gentages centrifugeringstrinnet (3.4.1.), indtil et volumen på ca. 5 mL er gået gennem kolonnen.
    2. Før αDEC-205/OVA anbringes på centrifugalproteinkoncentratoren, skal du gemme en 20 μL-prøve af den ikke-koncentrerede αDEC-205/OVA til western blot-analyse. Opbevar denne aliquot ved 4 °C indtil analyse.
    3. Læg αDEC-205/OVA på centrifugalproteinkoncentratoren ved pipettering.
      BEMÆRK: Undgå enhver kontakt med sengen i centrifugalkoncentratorens øverste kammer.
    4. Fyld koncentratoren til 15 mL med PBS og centrifuge koncentratoren i 5 min ved 2.000 x g ved stuetemperatur.
    5. Gem en prøve af flow-through (flow-through I) for western blot analyse og kassere resterende flow-through.
    6. Fyld koncentratoren til 10 mL med PBS og centrifuge koncentratoren i mindst 8 min ved 2.000 x g ved stuetemperatur.
    7. Gem en prøve til den anden gennemstrømning (flow-through II) til analyse af western blot, og kassér den resterende gennemstrømning.
    8. Når den ønskede berigelse er opnået (ca. 1,5 mL af αDEC-205/OVA-opløsningen skal efterlades i det øverste kammer), skal du forsigtigt aspirere den koncentrerede prøve.
      BEMÆRK: Hvis der er for meget væske tilbage i det øverste kammer, kan centrifugering gentages, men skal holdes så kort som muligt.
  5. Bestem proteinkoncentrationen af det resulterende αDEC-205/OVA ved hjælp af et mikrovolumspektrofotometer. Brug PBS som tom.
  6. Filtrer αDEC-205/OVA ved hjælp af en 0,22 μm sprøjtefilterenhed.
    BEMÆRK: Til senere analyse- og in vivoforsøg kan αDEC-205/OVA opbevares ved 4 °C eller -18 °C.

4. Verifikation af den kemiske bøjning ved western blot

BEMÆRK: Til verifikation af vellykket kemisk bøjning udføres western blot-analyse, der registrerer enten OVA (4.2) eller αDEC-205 (4.10). Påvisning af OVA (4.2.) eller αDEC-205 (4.10.) skal udføres parallelt. En orbital platform shaker skal fortrinsvis anvendes til alle inkubationstrin i de vestlige blotmembraner for at muliggøre ensartet fordeling af de respektive opløsninger.

  1. Tilbered standard 10% SDS (natrium dodecyl sulfat) geler til SDS-PAGE (natrium dodecyl sulfat polyacrylamidgelelektroforese).
  2. Forbered prøverne til SDS-PAGE for at detektere konjugeret og ikke-konjugeret OVA og køre gelelektroforese.
    1. Fortynde forskellige mængder koblet αDEC-205/OVA (f.eks. 200, 100 og 50 ng), af ren OVA (f.eks. 80, 70, 60, 50, 40 og 30 ng), en aliquot af ikke-konjugeret αDEC-205 (f.eks. 100 og 50 ng), en prøve af ikke-koncentreret αDEC-205/OVA konjuger fra trin 3.4.2. (f.eks. 125 ng) og en aliquot af flow-through I og II (trin 3.4.5. og 3.4.7., valgfrit) i 4 x ikke-reducerende SDS-prøvebuffer.
      BEMÆRK: Forskellige koncentrationer af konjugat og protein er indlæst for at sikre, at både gratis OVA samt konjugaten kan påvises på samme skamplet.
    2. Denature prøverne ved 65 °C i 10 min og 550 omdrejninger i en varmeblok.
  3. Læg prøverne og en proteinstandard på en SDS gel og kør SDS-PAGE.
  4. Udfør standard blotting af proteinerne fra SDS gel til en methanol-aktiveret PVDF (polyvinyliden difluorid) membran (75 min, 125 mA).
  5. Efter blotting sættes membranen i en passende skål og membranen ved at pipetter 25 mL 4% måltidserstatnings shakepulver/TBS-T (Tris-buffered saltvand/0,1% Tween 20) blokeringsbuffer ind i fadet, der indeholder membranen.
    1. Inkuberes membranen i blokeringsopløsningen i 60 min ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
  6. Kassér blokeringsopløsningen, og membranen pletters med kaninen αOVA primære antistof i 2% måltid udskiftning shake pulver / TBS-T antistof buffer (fortynding 1:3,000) ved pipetter 15 gtL primær antistofopløsning til membranen i fadet.
    1. Inkuberes membranen i 45 min ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C (brug platformsrystelsern).
  7. Kassér antistofopløsningen og vask membranen i fadet (brug platformsrystelsern).
    1. Tilsæt 25 mL TBS-T til membranen og inkuber i 5 min. Kassér opløsningen.
    2. Der tilsættes 25 mL TBS-T/0,5 M NaCl til membranen og inkuberes i 5 min. Kassér opløsningen.
    3. Tilsæt 25 mL TBS-T/0,5% Triton X-100 til membranen og inkuber i 5 min. Kassér opløsningen.
    4. Tilsæt 25 mL TBS-T til membranen og inkuber i 5 min. Kassér opløsningen.
  8. Membranen med ged αrabbit-IgG-HRPO (heste radise peroxidase) sekundært antistof i 2% måltid udskiftning ryste pulver/ TBS-T antistof buffer (fortynding 1:2,000) ved pipettering 15 mL af sekundær antistofopløsning til membranen i fadet.
    1. Inkuberes membranen i 45 min ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C (på platform shaker).
  9. Membranen vaskes igen som beskrevet i trin 4.7.1.- 4.7.4. ved hjælp af platforms shakeren. For denne membran fortsætter næste med trin 4.16. (følgende trin 4.10.- 4.15. (påvisning af αDEC-205) kan udføres parallelt med trin 4.2.- 4.9.).
  10. Forbered prøverne til påvisning af αDEC-205 til SDS-PAGE og kør gelelektroforesen.
    1. Fortynde forskellige mængder αDEC-205/OVA (f.eks. 200, 100 og 50 ng), af den ikke-konjugerede αDEC-205 (f.eks. 250, 125, 62,5 ng), af ren OVA (f.eks. 80 og 70 ng), en prøve af ikke-koncentreret αDEC-205/OVA fra trin 3.4.2. (f.eks. 125 ng) og en aliquot af flow-through I og II (trin 3.4.5. og 3.4.7., valgfrit) i 4 x ikke-reducerende SDS-prøvebuffer.
    2. Denature prøverne ved 65 °C i 10 min og 550 omdrejninger i en varmeblok.
  11. Læg prøverne og en proteinstandard på en SDS gel og kør gelelektroforese.
  12. Udfør standard blotting af proteinerne fra SDS gel til en methanol aktiveret PVDF (polyvinylidene difluorid) membran (75 min, 125 mA).
  13. Efter blotting sættes membranen i en passende skål og membranen blokeres ved at pipettere 25 mL 10% blokerende buffer (mælkepulver/TBS-T) i fadet, der indeholder membranen.
    BEMÆRK: Blokeringsløsningerne varierer mellem αDEC-205 og OVA-detektion (trin 4.5.).
    1. Inkuberes membranen i blokeringsopløsningen i 60 min ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C (ved brug af platformsrystelserne).
  14. Kassér blokeringsopløsningen, og farvningen af membranen med gede αrat-IgG(H+L)-HRPO-antistof i 5 % mælkepulver/TBS-T antistofbuffer (fortynding 1:5.000) ved pipettering af 15 mL antistofopløsning til membranen i fadet.
    BEMÆRK: Antistofbuffere varierer mellem αDEC-205-detektion og OVA-detektion (trin 4.6./ 4.8.).
    1. Inkuberes membranen i 45 min ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C (ved hjælp af platformsrystelsern).
  15. Membranen vaskes grundigt i fadet som beskrevet i trin 4.7.1.- 4.7.4. (brug platform shaker).
  16. Brug et passende detektionsreagens til at udvikle HRP-signalet og registrere chemiluminescensen i et mørkt rum ved hjælp af røntgenfilm eller via et billedsystem.

5. ELISA's kontrol af elisa's kemiske bøjning

  1. Udfør ELISA til yderligere verifikation af vellykket kemisk bøjning, der resulterer i αDEC-205/OVA.
  2. En passende ELISA-plade på 96 brønd med 100 μL/brønd på 3 ng/μL kanin αOVA-antistof i belægningsbuffer (0,1 M natriumbicarbonat (NaHCO3) pH 9,6 fortyndet i H2O).
    1. Pladen inkuberes natten over ved 4 °C.
  3. Efter belægningen vaskes pladen tre gange med PBS, f.eks. ved hjælp af en ELISA-skive.
  4. Bloker pladen ved at pipettere 200 μL af blokerende buffer (10% FCS i PBS) i hver brønd af pladen og inkubere pladen i 30 min ved stuetemperatur.
  5. Serielt fortyndet αDEC-205/OVA (fremstillet af trin 3.6.) 1:2 i blokeringsbuffer (10% FCS i PBS) for at opnå fortyndinger fra 6 μg/mL ned til 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA og tilsættes 100 μL/brønd af disse faldende mængder af αDEC-205/OVA til brøndene.
    1. Inkuber pladen i 1 time ved stuetemperatur.
  6. Vask pladen tre gange med PBS, f.eks. ved hjælp af en ELISA-skive.
  7. 100 μL af gedebukse αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO antistof (fortyndet til 1:2.000 i blokerende buffer (10% FCS i PBS)) til hver brønd af pladen.
    1. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  8. Vask pladen tre gange ved hjælp af PBS, f.eks. ved hjælp af en ELISA-skive.
  9. Der tilsættes 50 μL HRPO-substrat til brøndene. Når du observerer en klar farvereaktion, skal reaktionen stoppes ved tilsætning af 150 μl stopopløsning (1M H2SO4) pr. brønd.
  10. Efter 5 min, læse absorption ved 450 nm ved hjælp af en ELISA-læser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kemisk konjugation af αDEC-205 til OVA-protein ved hjælp af denne protokol vil typisk muliggøre effektiv generering af αDEC-205/OVA til in vivo DC-målretningsmetoder. Der er forskellige strategier til at kontrollere selve teknikken og teste funktionaliteten af den udbyttede konjugat. Western blot-analyse og ELISA anvendes til at verificere vellykket bøjning og samtidig opdage potentielt venstre gratis OVA (figur 2). In vitro-bindende undersøgelser (figur 3) og in vivovacciniseringer ( figur4) bekræfter bindingen af konjugaten til DEC-205 og målretning af DC.

Parallel western blot-analyse bruges til at detektere både den konjugerde OVA (figur 2A) samt konjugeret αDEC-205 (Figur 2B). Specifikt bekræfter det positive signal for OVA på niveauet af antistoffets molekylvægt i bloten association af OVA og antistoffet (Figur 2A). Desuden gør farvning for OVA i den vestlige blotanalyse det muligt at påvise overskydende frie OVA, der potentielt stadig er til stede ved siden af αDEC-205/OVA, der blev givet i trin 3.6., hvilket ikke er tilfældet for den viste blot (figur 2A). Hvis der opdages store mængder gratis OVA, trin 3.4.1. til 3.4.8. af protokollen bør gentages. Som supplement til farvningen af OVA (figur 2A) verificeres farvning til αDEC-205 i western blot-analyse vellykket bøjning gennem en stigning i molekylvægten mellem "nøgen" αDEC-205 og konjugaten som vist i figur 2B.

Ved siden af vestlige blotting, også en specifik ELISA tillader kontrol af en vellykket bøjning af αDEC-205 til OVA. I modsætning til de vestlige blotanalyser tillader denne ELISA dog ikke påvisning af fri og ikke-konjugeret αDEC-205 eller OVA. På grund af analyseopsætningen (Figur 2C) frembringes der kun et positivt signal, hvis bøjningen var effektiv. Den positive sammenhæng mellem det fundne signal (absorption ved 450 nm) og den analyserede mængde protein verificerer den vellykkede generering af αDEC-205/OVA gennem kemisk bøjning som vist i figur 2D. Samtidig viser det positive signal, der allerede er givet fra 9,38 ng i αDEC-205/OVA-konjugaten, at denne metode er stærk (figur 2D). Hvis der ikke er nogen stigning i adsorption for stigende mængder af konjugaten, var bøjningen formodentlig ikke vellykket. I dette tilfælde ville også de vestlige blotanalyser give negative resultater, dvs. ingen påvisning af konjugaten i pletten, der er plettet for OVA, og ingen stigning i molekylvægten i pletten, der er plettet til αDEC-205.

Mens den vestlige blot og ELISA assays bruges til at evaluere bøjning og fjernelse af frie antigen som sådan, efterfølgende funktionelle analyser er nødvendige for at bekræfte bindende for DEC-205 og målretning af DC. Med henblik herpå har vi udført in vitro-bindende undersøgelser (figur 3) og in vivovacciniseringer ( Figur4). Til disse forsøg blev kvindelige 6-8 ugerS C57BL/6 og 8-12 ugers Balb/c mus fremstillet af kommercielle kilder eller opdrættet på dyreanlægget i Helmholtz Centre for Infection Research (HZI) og blev anbragt under særlige patogenfrie forhold. Figur 3 viser funktionelle analyser til binding af en konjugat af αDEC-205 og HCV Core protein (αDEC-205/Core) til CD11c+ celler in vitro. Flowcytometri viste tydeligt αDEC-205/Core til effektivt at binde knoglemarvsafledte CD11c+ celler (Figur 3A,B) samt frisk isolerede mus CD11c+ splenocytter (data ikke vist). Disse analyser viser, at den kemiske bøjning ikke forstyrrer bindingskapaciteten i αDEC-205. Dette bekræftes yderligere af immunofluorescenceanalyser, der viser binding af αDEC-205/Core til MHC-II+ CD11c+ celler sorteret fra in vitrogenererede knoglemarvsbaserede dendritiske celler (BMDC) (Figur 3C).

Tidligere har vi vist de αDEC-205/OVA konjuger produceret af den demonstrerede protokol til effektivt at fremkalde OVA-specifikke immunresponser in vivo hos mus, der bekræfter vellykket generering af konjugaten samt funktionel målretning af DC (Figur 4)12,14. Specifikt fremkaldte subkutan vaccination med αDEC-205/OVA effektivt humoristiske og cellulære OVA-specifikke immunresponser. Vigtigere, i en rekombinant adenovirus udfordring model vi opdaget antivirale CD8+ T-celler i stand til at fjerne virus-inficerede hepatocytter, som har stærke konsekvenser for vacciner rettet mod hepatotropiske vira12. Desuden understreger den meget effektive induktion af antigenspecifikke cytotoksiske T-celler potentialet i denne tilgang til in vivo priming af antitumorimmunitet. Vi har også med succes brugt αDEC-205/OVA til at teste og sammenligne forskellige adjuvanser i forbindelse med in vivo DC rettet mod14. Ved vaccination med αDEC-205/OVA sammen med adjuvanskombinationen Poly(I:C) (polyinosinisk polycytidylicsyre) og CpG (syntetiske oligodeoxynukleotider, der indeholder umethylerede CpG-motiver), observerede vi generelt (figur 4A) og i nogen tid betydeligt højere OVA-specifikke IgG-niveauer sammenlignet med vaccination med OVA alene (figur 4B). Desuden fremkaldte αDEC-205/OVA effektivt OVA-specifikke CD4+ samt CD8+ T-celleresponser (figur 4C, D) og αDEC-205/OVA-induceret CD8+ T-cellerespons oversteg signifikant det, der blev fremkaldt af OVA alene (figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Model for den kemiske bøjning af αDEC-205 og OVA. I første trin reagerer den primære amin af αDEC-205 med NHS ester af crosslinker sulfo-SMCC, hvilket resulterer i maleimid aktiveret αDEC-205. Efter reduktion af OVA-proteinets disulfidbindinger gennem inkubation med TCEP-HCl reagerer den maleimideaktiverede αDEC-205 med TCEP-HCl-reduceret OVA-proteinet for at danne αDEC-205/OVA antistof/antigenkonjugat. Forkortelser: N-hydroxysuccinimide ester (NHS ester); sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylat (sulfo-SMCC); Tris(2-carboxysethyl)fosfinhydrochlorid (TCEP-HCl). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kontrol af den kemisk konjugeret αDEC-205/OVA. For at kontrollere en effektiv kemisk bøjning af αDEC-205 og OVA-proteinet udføres western blot-analyse (A,B) og ELISA (C,D). Prøver af αDEC-205/OVA, αDEC-205 og forskellige koncentrationer af OVA-protein blev udsat for SDS-PAGE (10%) og efterfølgende vestlig blotanalyse ved hjælp af et kanin αOVA primært antistof og en ged αrabbit-IgG-HRPO sekundært antistof til påvisning af OVA-protein (A) eller en ged αrat-IgG(H+L)-HRPO antistof til påvisning af αDEC-205 (B). (C) Elisa's skematiske repræsentation med henblik på verifikation af αDEC-205/OVA-konjugaten. Kaninen αOVA belægning antistof binder αDEC-205/OVA via konjugeret OVA. Gede αrat-IgG(H+L)-HRPO genkender αDEC-205-delen af den bundne konjugat, og et positivt signal bekræfter således en effektiv bøjning. (D) ELISA blev udført som beskrevet i (C). Serieudvandede mængder (1:2) af αDEC-205/OVA (600 ng til 9,38 ng) blev analyseret. Data er vist som gennemsnittet af triplikater af en repræsentativ analyse. Forkortelser: enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA); heste radiseperoxidase (HRPO); ovalbumin (OVA); natrium dodecyl sulfat polyacrylamidgel elektroforese (SDS-PAGE). Panel A og B er blevet ændret fra Volckmar et al.12. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Binding af αDEC-205/Core til knoglemarvsbaserede dendritiske dendritiske celler (BMDC) ved flowcytometri og immunofluorescencemikroskopi. For at analysere kapaciteten af αDEC-205/Core til at binde sit målmolekyle DEC-205 på BMDCs in vitro,   fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyse (A, B) og immunofluorescence mikroskopi (C) blev udført. Kort sagt blev knoglemarvsceller isoleret fra bagbenene på kvindelige Balb/c mus (n=3) 8-12 uger og dyrkede i RPMI-medium suppleret med 1% penicillin/streptomycin, 1% glutamin, 0,25 mM mercaptoethanol og 5 ng/mL GM-CSF (granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor). På dag 6 blev de ikke-klæbende BMDC'er omhyggeligt høstet og brugt til binding af analyss. (A,B) In vitro-genererede BMDC'er blev inkuberet med 10 μg/mL αDEC-205/Core, αDEC-205 eller medium (control) i 1 time ved 4 °C efterfulgt af farvning med APC-mærket αCD11c [klon HL3]. Påvisning af bundet αDEC-205/Core på overfladen af BMDC'er blev udført ved yderligere farvning af cellerne med enten PE-mærket ged αrat (A) eller mus αHCV Core [klon C7-50] efterfulgt af sekundær αmouse-IgG1-PE farvning (B). Repræsentative histogrammer viser PE-signalet og % PE-positive celler i de indhegnede CD11c+ celler. (C) BMDC'er genereret in vitro fra naive Balb/c mus blev sorteret for MHC-II+ og CD11c+ celler og blev inkuberet med 10 μg/mL αDEC-205/Core i 1 time ved 4 °C. Cell-bundet αDEC-205/Core var plettet med Alexa 594-koblet αrat-IgG eller med mus αHCV Core [klon C7-50] og Alexa 488-koblet αmouse-IgG i 30 min ved 4 ° C efter vask. Cellerne blev visualiseret ved immunofluorescencemikroskopi (skalastang = 20 μm). Bindingskapaciteten for αDEC-205/Core til BMDC'er blev bekræftet af en overlejring af begge farvninger (dobbelt positiv = orange). Forkortelser: knoglemarvsbaserede dendritiske celler (BMDC); fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF); hepatitis C-virus (HCV). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: OVA-specifikke humoristiske og cellulære immunresponser efter immunisering med αDEC-205/OVA. Funktionaliteten af αDEC-205/OVA til at målrette DC in vivo blev bevist gennem immunisering eksperimenter som tidligere offentliggjort i Volckmar et al.12. Kort fortalt blev hun 6-8 uger gamle C57BL/6 mus (n=5) subkutant immuniseret på dag 0, 14 og 28 med 30 μg αDEC-205/OVA konjugerer sammen med adjuvanserne 50 μg Poly(I:C)/50 μg CpG, 30 μg αDEC-205 alene eller 7 μg OVA-protein alene i et samlet volumen på 50 μL PBS pr. dyr. Yderligere kontroller blev behandlet med PBS alene. (A,B) For at overvåge det humoristiske immunrespons blev vaccinerede mus let bedøvet gennem isoflurane indånding, og blodprøver blev indsamlet fra retro-orbital sinus på dag 0, 13 og 27 og ved hjertepunktur på dag 42. Sera blev fremstillet som beskrevet og analyseret for tilstedeværelsen af OVA-specifikke IgG ved ELISA12. Endpoint titers blev udtrykt som den gensidige værdi af den sidste serumfortynding, der gav en absorbans to gange over værdierne af negative kontroller. Resultaterne er udarbejdet ud fra tre uafhængige eksperimenter. (A) Kinetisk af OVA-specifikke total serum IgG titere vist som gruppen gennemsnit. (B) OVA-specifik IgG-titer på dag 27 og dag 42 vist for individuelle mus sammen med gruppeforente. Statistik: ulønnet tosidet t-test. (C,D) Induktionen af cellulære immunresponser blev analyseret af enzym-linked immunosorbent spot (ELISPOT) assays ved hjælp af murine IFNγ detektion kit på dag 42 som tidligere offentliggjort12. Isolerede splenocytter fra immuniserede mus blev samlet til forsøgsgrupperne, og antallet af IFNγ-spotdannende enheder/106 celler efter stimulering med 5 mg/mL CD4+ (C) eller CD8+ OVA peptid (D) blev analyseret (OVA peptider: CD4323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) og CD8257-264 (SIINFEKL)). Søjler repræsenterer middelværdien ± SEM (n=5, triplikater fra grupperede prøver). Statistik: envejs ANOVA med Dunnett's flere sammenligninger test (** p<0,01, *** p<0.001, **** p<0.0001). Forkortelser: cytosine-fosfat-guanine oligonucleotidsekvenser (CpG), enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA), enzymbundet immunosorbentplet (ELISPOT), ovalbumin (OVA), fosfatbuffered saltvand (PBS), polyinosinisk-polycytidylic syre (Poly(I:C)). Dette tal er blevet ændret fra Volckmar et al.12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kemisk konjugation af et endodotosereceptorspecifikt antistof og et proteinantigen giver en effektiv og, vigtigst af alt, også fleksibel tilgang til in vivo DC-målretning i prækliniske musemodeller. Med vores protokol giver vi en effektiv tilgang til en vellykket bøjning af modellen antigen OVA til et DEC-205-specifikt IgG-antistof.

I vores protokol renses αDEC-205 fra en hybridoma-cellelinje, og tidligere har vi renset antistoffet ved hjælp af protein G sepharose som beskrevet. Bemærk, at vi også har brugt FPLC til at rense αDEC-205 i senere undersøgelser, og efterfølgende kemisk bøjning var ligeledes effektiv. De kritiske trin for effektiv kemisk bøjning er priming af både antistoffet og proteinet. Vi har optimeret disse trin fra forskellige tilgængelige protokoller til endelig at udføre inkubation af antistoffet med crosslinker sulfo-SMCC og reduktion af proteinet gennem TCEP-HCl. På dette tidspunkt er de kritiske trin det friske præparat af TCEP-HCl (trin 3.1.) og varigheden af inkubationen af TCEP-HCl med proteinet, som ikke bør forlænges (trin 3.1.2.). Desuden er den proteinbuffer, der anvendes til reduktion af disulfidbindingerne gennem TCEP-HCl, kritisk, da den kan påvirke TCEP-HCl's reduktion negativt. Det er også vigtigt straks at blande det aktiverede antistof og det reducerede protein (trin 3.3.6.) for at sikre optimale reaktionsforhold for bøjningen. I vores hænder gav denne tilgang de mest effektive og pålidelige resultater med hensyn til bøjning. Et andet kritisk skridt for efterfølgende in vivo-tilgange er fjernelsen af ubundet OVA fra αDEC-205/OVA-konjugaten. For at kontrollere dette trin har vi optimeret western blot-analyser og anbefaler påvisning af både den konjugerde αDEC-205 samt det konjugerde OVA-protein (Figur 2A og B). Hvis ubundet OVA er til stede i den endelige konjugatopløsning, vil blotting og detektering af kendte koncentrationer af OVA (som i figur 2A)bidrage til at estimere mængden af ubundet OVA i forhold til den samlede mængde protein, der er indlæst til SDS-PAGE. Hvis bøjningen var ineffektiv, skulle fejlfindingen tage fat på det antigen/antistofforhold, der anvendes til bøjningen. I tilfælde af bøjning var effektiv som opdaget af ELISA, men kan ikke påvises ved vestlig blot analyse, har vi oplevet antistofkoncentrationerne i de vestlige blot-analyser (trin 4.6., 4.8., 4.14.) den mest kritiske faktor.

Den største begrænsning af vores tilgang er en til tider varierende bøjningseffektivitet, hvor der ikke er nogen fast sammenhæng mellem antallet af antistofmolekyler og mængden af koblet protein. Ikke desto mindre mener og har vi oplevet, at den demonstrerede protokol pålideligt tillader efterfølgende in vivo-undersøgelser af DC-målretning, der giver reproducerbare resultater. Mens både αDEC-205 og OVA-proteinet i princippet i vores protokol kan udveksles til alternative antistoffer og antigener til in vivo-undersøgelser af forskellige interesser, skal de enkelte trin i den kemiske bøjning for nylig optimeres til de nye komponenter. Dette gælder primært for det optimale antistof/antigenforhold og kan f.eks. afhænge af tilgængeligheden af redukible Cys-rester. I vores tilgange var de optimale nøgletal, der resulterede i vellykkede bøjningsreaktioner, 1:5 for OVA til αDEC-205 og 1.35:1 for HCV-proteinerne NS3 (ikke-strukturelt protein 3) og Core til αDEC-205. For hver konjugat skal negative virkninger af krydslinkeren eller bøjningen som sådan på antigenbindingsevnen af antistoffet udelukkes. Bemærk, at bøjning af immunogene peptider i stedet for proteiner i fuld længde er mindre problematiske i denne henseende. Men proteiner giver højere antigen mangfoldighed i efterfølgende immunisering. Genetiske fusionsmetoder viser et alternativ til kemisk bøjning og har også klare fordele1. I sidste ende vil valget af strategien om at forbinde antistoffer og antigener til DC-målretning afhænge af ressourcer, forskningsfokus og forventede anvendelser af konjugaterne. Vi mener, at den relative fleksibilitet med hensyn til antistoffer og antigener viser en stor fordel ved kemisk bøjning, og vi har faktisk brugt den protokol, der er beskrevet her, til effektiv kemisk bøjning af αDEC-205 til forskellige proteiner af hepatitis C-virus (HCV) (Figur 3 og data, der ikke er vist).

Samlet set mener vi, at kemisk bøjning af endokritose-receptor specifikke antistoffer mod proteinantigener som i αDEC-205/OVA viser et fleksibelt og pålideligt værktøj til at generere antistof / antigenkonjugere af ekstraordinær værdi i at studere DC-målretningsmetoder, herunder dem, der sigter mod at fremkalde antitumorimmunitet, især i prækliniske dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker S. Prettin for ekspert teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Helmholtz Association of German Research Centers (HGF), der blev leveret som en del af Helmholtz Alliance ''Immunterapi af kræft" (HCC_WP2b).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody buffer 2 % 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 % 5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA) 10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 % 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 % 10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25 Greiner Bio-One 690175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75 Greiner Bio-One 658175 we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175 Greiner Bio-One 661175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa Sartorius VS2001 Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml Thermo Fisher Scientific 88532 Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottles Nalgene 525-2314 PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA) 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa Thermo Fisher Scientific 89891 Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate) Sigma-Aldrich/Merck T8665-100ML 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate) Roche/Merck 12 015 200 01 Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa SERVA Electrophoresis 44110 Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate Thermo Fisher Scientific 442404 MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum PAN-BIOtech P40-47500 FBS Good forte
ISF-1 medium Biochrom/bioswisstec F 9061-01
milk powder Carl Roth T145.2 powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma ATCC HB-290 if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x  for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin Hyglos (via BioVendor) 321000 EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles Nunc In Vitro 734-2394 standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator strips Merck 109535 pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  112-035-062 obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA) Jackson ImmunoResearch  112-035-068 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  111-035-045  obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA) Abcam ab181688 used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) OriGene R1101 used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column Merck/Millipore P3296 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane Merck/Millipore IPVH00010 immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug Omnilab 5230217 DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube Omnilab 5430925 DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA) 1M H2SO4
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific 22322 Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm  Merck/Millipore SLGV033RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 ml Omnilab Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas B. Braun Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl Thermo Fisher Scientific A35349
tubing connector Omnilab Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  3. Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
  4. Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
  5. Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
  6. Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
  7. Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
  8. Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
  9. Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
  10. Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
  11. Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
  12. Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
  13. Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
  14. Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).

Tags

Kræftforskning Udgave 168 dendritisk cellemålretning dendritiske celler DEC-205 antigenlevering antigenkonjugation kemisk bøjning antistofmedieret endokytose vaccination antitumorimmunitet
Kemisk bøjning af et renset DEC-205-rettet antistof med protein i fuld længde til målretning af musededritiske celler <em>In Vitro</em> og <em>In Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T.,… More

Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T., Frentzel, S., Erck, C., van Ham, M., Stegemann-Koniszewski, S., Bruder, D. Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (168), e62018, doi:10.3791/62018 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter