Summary
We beschrijven een protocol voor de chemische conjugatie van het modelantigeen ovalbumine naar een endocytosereceptorspecifiek antilichaam voor in vivo dendritische celtargeting. Het protocol omvat zuivering van het antilichaam, chemische conjugatie van het antigeen, evenals zuivering van het conjugaat en de verificatie van efficiënte conjugatie.
Abstract
Gerichte antigeenafgifte aan cross-presenterende dendritische cellen (DC) in vivo induceert efficiënt T-effectorcelresponsen en toont een waardevolle benadering in vaccinontwerp. Antigeen wordt aan DC geleverd via antilichamen die specifiek zijn voor endocytosereceptoren zoals DEC-205 die opname, verwerking en MHC klasse I- en II-presentatie induceren.
Efficiënte en betrouwbare conjugatie van het gewenste antigeen naar een geschikt antilichaam is een cruciale stap in DC-targeting en hangt onder andere af van het formaat van het antigeen. Chemische conjugatie van eiwit over de volledige lengte naar gezuiverde antilichamen is een mogelijke strategie. In het verleden hebben we met succes cross-linking vastgesteld van het modelantigeen ovalbumine (OVA) en een DEC-205-specifiek IgG2a-antilichaam (αDEC-205) voor in vivo DC-targetingstudies bij muizen. De eerste stap van het protocol is de zuivering van het antilichaam uit het supernatant van de NLDC (non-lymphoid dendrittic cells)-145 hybridoma door affiniteitschromatografie. Het gezuiverde antilichaam wordt geactiveerd voor chemische conjugatie door sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexaan-1-carboxylaat) terwijl tegelijkertijd de sulfhydryl-groepen van het OVA-eiwit worden blootgesteld door incubatie met TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrochloride). Overtollige TCEP-HCl en sulfo-SMCC worden verwijderd en het antigeen wordt gemengd met het geactiveerde antilichaam voor nachtelijke koppeling. Het resulterende αDEC-205/OVA-conjugaat is geconcentreerd en bevrijd van ongebonden OVA. Succesvolle conjugatie van OVA naar αDEC-205 wordt geverifieerd door western blot-analyse en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We hebben met succes chemisch gekruist αDEC-205/OVA gebruikt om cytotoxische T-celresponsen in de lever te induceren en om verschillende adjuvantia te vergelijken op hun potentieel bij het induceren van humorale en cellulaire immuniteit na in vivo targeting van DEC-205+ DC. Daarnaast bieden dergelijke chemisch gekoppelde antilichaam / antigeenconjugaten waardevolle hulpmiddelen voor de efficiënte inductie van vaccinresponsen op tumorantigenen en is bewezen superieur te zijn aan klassieke immunisatiebenaderingen met betrekking tot de preventie en therapie van verschillende soorten tumoren.
Introduction
Dendritische cellen (DC) zijn centrale spelers van het immuunsysteem. Ze zijn een diverse groep cellen gespecialiseerd in antigeen-presentatie en hun belangrijkste functie is het overbruggen van aangeboren en adaptieve immuniteit1,2. Belangrijk is dat DC niet alleen een belangrijke rol speelt bij efficiënte en specifieke pathogeengerichte reacties, maar ook betrokken is bij vele aspecten van antitumorimmuniteit1,3.
Vanwege hun exclusieve rol in gastheerimmuniteit kwam DC in beeld als doelcellen voor vaccinatie4. Een benadering is om antigenen in vivo op DC te richten om antigeenspecifieke immuunresponsen te induceren en in de afgelopen jaren is een groot aantal studies gewijd aan het definiëren van geschikte receptoren en targetingstrategieën1,4. Een voorbeeld is de C-type lectinereceptor DEC-205, die kan worden aangevallen door DEC-205-specifieke antilichamen om endocytose te induceren. Belangrijk is dat dec-205-targeting in combinatie met geschikte adjuvantia efficiënt langlevende en beschermende CD4+ en CD8+ T-cellen induceert, evenals antilichaamresponsen, ook tegen tumorantigenen3,5,6,7,8,9.
Er zijn een aantal studies die aantonen dat geconjugeerde antigenen gericht op DC superieur zijn aan vrij niet-geconjugeerd antigeen3,5,10,11,12. Dit maakt de vervoeging van het antigeen met het respectieve DC-targetinggedeelte een centrale stap in DC-targetingbenaderingen. In het geval van DC-targeting via antilichamen of antilichaamfragmenten kunnen antigenen chemisch of genetisch verbonden zijn en beide strategieën bieden hun eigen (dis)voordelen1. Aan de ene kant is er in genetisch gemanipuleerde antilichaam-antigeenconstructies een controle over de antigeendosis en de locatie die superieure vergelijkbaarheid tussen loten1biedt . Tegelijkertijd heeft chemische conjugatie echter minder voorbereiding nodig en biedt het meer flexibiliteit, vooral bij het testen en vergelijken van verschillende antigenen en / of vaccinatiestrategieën in experimentele en preklinische modellen.
Hier presenteren we een protocol voor de efficiënte en betrouwbare chemische conjugatie van ovalbumine (OVA) als modeleiwitantigeen tegen een DEC-205-specifiek IgG2a-antilichaam (αDEC-205) geschikt voor in vivo DC-targeting bij muizen. Ten eerste wordt αDEC-205 gezuiverd uit NLDC-145 hybridomacellen13. Voor chemische conjugatie wordt de heterobifunctionele crosslinker sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC), die NHS (N-hydroxysuccinimide) ester- en maleimidegroepen bevat, gebruikt, waardoor covalente conjugatie van amine- en sulhydrylbevattende moleculen mogelijk is. In het bijzonder reageren de primaire amines van het antilichaam in eerste instantie met sulfo-SMCC en de resulterende maleimide-geactiveerde αDEC-205 reageert vervolgens met het sulfhydryl-bevattende OVA-eiwit gereduceerd door TCEP-HCl (Tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrochloride). Het eindproduct is chemisch geconjugeerd αDEC-205/OVA(figuur 1). Naast chemische conjugatie zelf, beschrijft ons protocol de verwijdering van overtollige OVA uit het conjugaat, evenals de verificatie van succesvolle conjugatie door middel van western blot-analyse en een specifieke enzymgebonden immunosorbent-assay. We hebben deze aanpak in het verleden met succes toegepast om OVA en andere eiwitten of immunogene peptiden chemisch te conjugeren aan αDEC-205. We tonen efficiënte binding aan CD11c+ cellen in vitro, evenals de efficiënte inductie van cellulaire en humorale immuniteit in vivo.
Zeker, er zijn nadelen aan deze methode, zoals in lot-to-lot vergelijkbaarheid en in de exacte dosering van het antigeen binnen het uiteindelijke geconjugeerde. Niettemin biedt chemische conjugatie experimentele flexibiliteit in de keuze van het antilichaam en het eiwitantigeen in vergelijking met genetisch gemanipuleerde constructies. Daarom geloven we dat deze aanpak vooral waardevol is bij het evalueren van verschillende antigenen voor hun efficiëntie in DC-targeting in preklinische muismodellen, belangrijk ook in de context van specifieke antitumor immuunresponsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de lokale overheidsinstantie (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; dossiernummer 33.12-42502-04-10/0108) en werden uitgevoerd volgens de nationale en institutionele richtlijnen.
1. Productie van αDEC-205 uit de hybridoma cellijn NLDC-145
- Voor de productie van antilichamen ontdooien gecryopreserveerde NLDC-145-cellen die αDEC-205 produceren bij 37 °C in een waterbad. Zet de cellen uit bij 37 °C en 5% CO2. Twee 75 cm2 flessen zullen nodig zijn om over te gaan tot de productie van antilichamen. Celkweekprocedures moeten in een veiligheidskast worden uitgevoerd om veilige werkomstandigheden te garanderen en besmetting van de culturen te voorkomen.
- Resuspend 1 ml ontdooide cellen (1 x 106 - 5 x 106 cellen / ml) in 9 ml ISF-1 medium aangevuld met 1% penicilline / streptomycine (voorverwarmd tot 37 °C) in een celkweekkolf (25 cm2). Plaats de kolf horizontaal in een celkweekincubator bij 37 °C, 5 % CO2.
- Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2, tot 70% samenvloeiing. Dit moet normaal gesproken na 24 - 48 uur worden bereikt.
- Zodra de cellen voor 70% confluent zijn, brengt u de volledige NLDC-145-celsuspensie (10 ml) over in een conische centrifugebuis van 15 ml met behulp van een pipetregelaar in een volumebereik van 1-10 ml. Pellet de cellen door centrifugeren bij 250 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwarm ISF-1 medium voor tot 37 °C in een waterbad en resuspend de pellet in 12 ml ISF-1 medium aangevuld met 1% penicilline/streptomycine. Breng de geresuspendeerde celsuspensie over in een verse celkweekkolf (75 cm2).
- Kweek en breid de cellen uit in ISF-1 medium aangevuld met 1% penicilline/streptomycine bij 37 °C en 5% CO2, tot 70% confluent en 99% levensvatbaar. Dit moet normaal gesproken na 48 - 72 uur worden bereikt.
- Splits de cellen in twee kolven van 75 cm2. Om dit te doen, spoelt u eerst de bodem/het kweekoppervlak van de celkweekkolf met de celsuspensie om alle NLDC-145-cellen van het oppervlak te verwijderen. Breng 6 ml van de NLDC-145 celsuspensie elk over in een van de twee verse flessen van 75 cm2 en voeg voorverwarmd ISF-1 medium aangevuld met 1% penicilline / streptomycine toe tot 12 ml.
OPMERKING: Vernieuw het celkweekmedium niet, omdat de NLDC-145-cellen het medium hebben geconditioneerd. Breng de cellen samen met hun medium over en vul de cultuur tot het gewenste volume met vers medium. Dit is cruciaal voor de levensvatbaarheid en maximale antilichaamproductie door de NLDC-145 cellen. - Zet de celculturen uit bij 37 °C en 5% CO2, tot ongeveer 70% confluent dat over het algemeen wordt bereikt na 48 - 72 uur.
- Zodra de cellen voor 70% confluent zijn, brengt u 10 ml van de geëxpandeerde NLDC-145 celsuspensie van elk van de 75 cm2 flessen over in één PETG (polyethyleentereftalaatglycol) rolfles (1.050 cm2). Spoel hiervoor de bodem/het kweekoppervlak van de celkkolf met de celsuspensie om alle cellen van het oppervlak te verwijderen met behulp van een pipetcontroller en een pipet van 10 ml.
- Voeg 140 ml ISF-1 medium aangevuld met 1% penicilline/streptomycine (voorverwarmd tot 37 °C) direct uit de mediumfles toe aan elk van de NLDC-145 bevattende rolflessen die ze vullen tot de 150 ml.
OPMERKING: Zie opmerking in stap 1.1.6. - Kweek de rolflessen bij 37 °C, 5% CO2 en 25 rondjes/min gedurende drie dagen.
- Voeg 150 ml ISF-1 medium aangevuld met 1% penicilline/streptomycine (voorverwarmd tot 37 °C) toe aan elk van de NLDC-145 bevattende rolflessen die ze vullen tot de 300 ml.
- Kweek de rolflessen die nu 300 ml cultuur bevatten bij 37 °C, 5% CO2 en 25 rondjes/min gedurende nog eens drie dagen.
- Voeg nog eens 100 ml ISF-1 medium aangevuld met 1% penicilline/streptomycine (voorverwarmd tot 37 °C) toe aan elk van de NLDC-145 bevattende rolflessen en vul ze zo tot 400 ml.
- Kweek de rolflessen die nu 400 ml cultuur bevatten bij 37 °C, 5% CO2 en 25 rondjes/min gedurende nog eens zeven dagen.
OPMERKING: Tijdens deze week wordt de cultuur zeer dicht (tot 95% dichtheid) en neemt de levensvatbaarheid af (tot slechts 50%), waardoor maximale antilichaamafgifte mogelijk is.
- Voor de zuivering van αDEC-205 uit het kweeksupernatant giet je de NLDC-145 celsuspensie (uit beide rolflessen) rechtstreeks naar 500 ml geautoclaveerde centrifugatieflessen.
OPMERKING: Een totaal volume van 800 ml cultuur moet worden verzameld.- Centrifugeer de cultuur gedurende 30 minuten bij 8.600 x g en 4 °C om cellen en vuil te verwijderen.
- Verzamel de supernatanten, gooi de pellets weg en bundel de supernatanten in een steriele reagensfles.
OPMERKING: De zuivering van αDEC-205 kan onmiddellijk worden gestart (stap 2.) of het supernatant kan op korte termijn bij 4 °C worden bewaard.
2. Zuivering van het αDEC-205 antilichaam uit het NLDC-145 cel supernatant
OPMERKING: Uit het NLDC-145 cel supernatant wordt αDEC-205 gezuiverd met behulp van een eiwit G Sepharose kolom (herbruikbaar). De kolomafmetingen zijn 15 mm x 74 mm en per kolom is 5 ml eiwit G Sepharose verpakt.
- Voor de bereiding en het wassen van de eiwit G Sepharose kolom, plaats een luchtdichte rubberen plug op de bovenste opening van de eiwit G Sepharose kolom. Prik de rubberen plug door met twee steriele canules (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
- Sluit een spuit van 10 ml aan op een van de twee canules en een flexibele siliconen buis (ongeveer 100 cm lang, 2,5 - 3 mm diameter) met een buisconnector op de tweede canule.
OPMERKING: De constructie van de spuit/rubberen plug is herbruikbaar en zorgt voor een vacuüm, wat resulteert in een continue stroom van het grote volume cultuur dat bovennatuurlijk is voor de eiwit G Sepharose-kolom. Trek hiertoe de zuiger van de spuit iets terug om een continue vloeistofstroom te garanderen in de volgende stappen. - Was de kolom met 50 ml 0,1 M ijsazijn (pH 2) om mogelijk achtergebleven antilichamen van een eerdere antilichaamzuivering te verwijderen. Doe het uiteinde van de siliconen buis in de 0,1 M ijsazijn (pH 2) gevulde reagensfles. Als gevolg van het geïnduceerde vacuüm loopt 50 ml van het 0,1 M ijsazijn (pH 2) druppelsgewijs door de eiwit G Sepharose-kolom.
OPMERKING: 0,1 M ijsazijn (pH 2) moet worden bewaard in een reagensfles of vers worden gevuld in een bekerglas. - Was de kolom met 100-200 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Doe het uiteinde van de siliconen buis in een pbs gevulde reagensfles of beker. Laat 100-200 ml PBS druppelsgewijs door de kolom eiwit G Sepharose lopen.
- Sluit een spuit van 10 ml aan op een van de twee canules en een flexibele siliconen buis (ongeveer 100 cm lang, 2,5 - 3 mm diameter) met een buisconnector op de tweede canule.
- Voor antilichaamzuivering uit het NLDC-145 supernatant laadt u 800 ml van het NLDC-145 supernatant (verkregen uit stap 1.2.2.) op de kolom. Doe het uiteinde van de siliconen buis in de NLDC-145 supernatant gevulde reagensfles. Laat 800 ml NLDC-145 supernatant druppelsgewijs door de kolom lopen.
- Was de kolom met 500 ml PBS. Doe het uiteinde van de siliconen buis in een PBS gevulde reagensfles of beker. Laat 500 ml PBS druppelsgewijs door de kolom lopen.
- Gebruik voor de elutie 20 buizen van 1,5 ml en pipetteer 100 μl van 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) in elke buis van 1,5 ml. Verwijder de rubberen plug uit de kolom en pipetteer 1 ml van 0,1 M glycine (pH 3) naar de bovenste kamer van de kolom van het eiwit G Sepharose om het antilichaam uit de kolom te elueren. Verzamel de doorstroom direct als eluaat in een van de voorbereide buizen van 1,5 ml.
- Herhaal de elutiestap (2.2.2.) voor alle 20 buizen (1,5 ml).
- Bepaal de optische dichtheid van alle elutiefracties bij 280 nm (OD280) met behulp van een spectrofotometer om de antilichaambevattende fracties te identificeren.
OPMERKING: Gebruik de eerste elutiedractie als blanco. - Pool alle fracties met een OD280 groter dan 0,5 (ongeveer 10 fracties).
- Bewaar de eiwit G Sepharose kolom gevuld met 20% ethanol bij 4 °C.
- Dialyseer de gepoolde elutie tegen 1000 ml PBS (in een bekerglas van 2000 ml) bij 4 °C 's nachts met behulp van dialysebuizen met een afsnijding van het molecuulgewicht (MWCO) van 12 - 14 kDa.
- Snijd de dialysebuis in stukjes van 20 cm. Kook de dialysebuis in 500-800 ml van 10 mM EDTA (pH 7,5) gedurende 30 minuten in een bekerglas met behulp van een hete plaat om verontreiniging te verwijderen. Gooi de 10 mM EDTA (pH 7,5) oplossing weg en kook de dialysebuis gedurende 10 minuten in gedeïoniseerd water.
OPMERKING: De dialyseslang kan direct worden gebruikt of worden opgeslagen in 0,01% natriumazide (NaN3)/H2O-oplossing bij 4 °C tot het volgende gebruik. - Sluit de bodem van de dialysebuis met een geschikte dialysebuissluiting/scharnierende klem uit één stuk en pipetteer voorzichtig de antilichaamelutie in de dialyseslang. Sluit de bovenkant van de dialysebuis met een tweede klem.
- Bevestig de bovenste klem van de dialysebuis op een zwevende standaard, zet deze samen met een magnetische roerstaaf in het pbs gevulde bekerglas en plaats het bekerglas op een magneetroerder.
- Dialyseer 's nachts roerend bij 4 °C.
- Snijd de dialysebuis in stukjes van 20 cm. Kook de dialysebuis in 500-800 ml van 10 mM EDTA (pH 7,5) gedurende 30 minuten in een bekerglas met behulp van een hete plaat om verontreiniging te verwijderen. Gooi de 10 mM EDTA (pH 7,5) oplossing weg en kook de dialysebuis gedurende 10 minuten in gedeïoniseerd water.
- Om de concentratie van αDEC-205 te verhogen, laadt u het volledige dialysaat op een centrifugaalconcentrator met 10 kDa MWCO. Open een klem van de buis en pipetteer voorzichtig het volledige dialysaat uit de dialysebuis in de centrifugaalconcentrator (10 kDa MWCO).
OPMERKING: Raak de bodem van de concentrator niet aan met de pipetpunt.- Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 693 x g (2.000 tpm) en 4 °C.
- Laad de centrifugaalconcentrator met 10 ml PBS en centrifugeer bij 693 x g (2.000 tpm) en 4 °C totdat het uiteindelijke volume antilichaamoplossing dat overblijft 1-1,5 ml is.
OPMERKING: Herhaal indien nodig de centrifugatiestap van 2.4.1. om aan te passen aan de gewenste hoeveelheid. - Bepaal met behulp van een spectrofotometer de optische dichtheid van de geconcentreerde αDEC-205-oplossing bij 280 nm (OD280). Gebruik PBS als leeg.
- Bereken de concentratie van αDEC-205 met behulp van de volgende formule:
concentratie [mg/ml] = OD280/1,4. - Filtreer de αDEC-205-oplossing met behulp van een spuitfiltereenheid van 0,22 μm.
OPMERKING: Zuivering van αDEC-205 uit het NLDC-145 hybridoma cel supernatant kan ook worden bereikt door FPLC (snelle eiwitvloeistofchromatografie). Gezuiverd αDEC-205 kan worden bewaard bij 4 °C of bij -18 °C voor langdurige opslag.
3. Chemische conjugatie van OVA naar αDEC-205
OPMERKING: Een verhouding van 0,5 mg OVA-eiwit tot 2,5 mg αDEC-205 (1:5) is vereist voor optimale chemische conjugatie. Deze verhouding kan echter variëren voor andere eiwitten en antilichamen en moet worden geoptimaliseerd voor alternatieve conjugaten. Reductie van de disulfidebindingen van het OVA-eiwit wordt uitgevoerd door incubatie met 30 mM TCEP-HCl, waardoor de sulfhydryl-groepen voor chemische conjugatie worden blootgesteld aan αDEC-205 en 240 μl TCEP-HCl zijn nodig in stap 3.2. Beide stappen, TCEP-geïnduceerde reductie van OVA (stap 3.1.) en sulfo-SMCC-activering van αDEC-205 (stap 3.2.), moeten bij voorkeur parallel worden uitgevoerd.
- Bereid vers een TCEP-HCl-oplossing van 125 mM (pH 7,0). Weeg de gewenste hoeveelheid TCEP-HCl af en los de TCEP-HCl op in 0,9 M Tris-basis (pH 8,8). Gebruik pH-indicatorstrips om de pH van de 125 mM TCEP-HCl-oplossing te testen (die neutraal moet zijn) en pas de pH aan met Tris-basis (pH 8,8).
- Pipetteer 200 μL OVA-eiwitoplossing (met 0,5 mg OVA) in een steriele buis van 1,5 ml. Voeg 240 μl 125 mM TCEP-HCl en 560 μL steriel ultrapuur water toe aan het OVA-eiwit met behulp van een pipet tot een eindconcentratie van 0,5 mg/ml OVA-eiwit en 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
OPMERKING: 2,5 mg EndoGrade OVA (gelyofiliseerd) wordt opgelost in 1 ml PBS, wat resulteert in een OVA-oplossing van 2,5 mg /ml. - Incubeer de resulterende OVA/TCEP-HCl bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur.
OPMERKING: Verleng deze incubatiestap niet.
- Pipetteer 200 μL OVA-eiwitoplossing (met 0,5 mg OVA) in een steriele buis van 1,5 ml. Voeg 240 μl 125 mM TCEP-HCl en 560 μL steriel ultrapuur water toe aan het OVA-eiwit met behulp van een pipet tot een eindconcentratie van 0,5 mg/ml OVA-eiwit en 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
- Om αDEC-205 voor conjugatie te activeren, lost u 2 mg sulfo-SMCC op in 100 μL ultrapuur water.
OPMERKING: Sulfo-SMCC is gevoelig voor hydrolyse. Daarom moeten grotere hoeveelheden onopgeloste sulfo-SMCC snel worden behandeld of moet de beschikbare aliquots van 2 mg worden gebruikt.- Verdun αDEC-205 in PBS zodat 2,5 mg in 900 μL zit.
- Meng 2,5 mg αDEC-205 (900 μL volume; verkregen uit stap 3.2.1.) en 100 μL sulfo-SMCC (verkregen uit stap 3.2.) in een buis van 1,5 ml, resulterend in een totaal volume van 1 ml.
- Incubeer de αDEC-205/sulfo-SMCC-oplossing gedurende 30 minuten bij 37 °C en 550 tpm in een verwarmingsblok.
- Na deze incubaties worden overtollige sulfo-SMCC en TCEP-HCl onmiddellijk uit de oplossingen verwijderd met behulp van ontzoutingskolommen (MWCO 7 kDa; 5 ml kolomvolume).
- Draai de onderste sluiting van de kolommen (MWCO 7 kDa) af, maak de dop los en plaats de kolom in een conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g bij kamertemperatuur om de vloeistof te verwijderen.
- Plaats de kolom in een verse tube en verwijder de dop. Laad langzaam het antilichaam/sulfo-SMCC en de OVA/TCEP-HCl naar het midden van het compacte harsbed van elk één kolom.
- Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g bij kamertemperatuur.
- Gooi de kolommen na gebruik weg. De oplossingen die antilichaam en OVA bevatten die zijn voorbereid voor conjugatie bevinden zich in de buisjes.
- Meng beide oplossingen onmiddellijk door pipetteren voor conjugatie van αDEC-205 en OVA.
- Incubeer het resulterende αDEC-205 en OVA mengsel gedurende een nacht bij 4°C.
- Na conjugatie wordt overtollig ongebonden OVA uit de oplossing verwijderd en wordt het gekoppelde αDEC-205/OVA geconcentreerd met behulp van een centrifugale eiwitconcentrator (MWCO 150 kDa).
- Spoel de centrifugaaleiwitconcentrator (MWCO 150 kDa) voor door 12 ml PBS op de kolom te pipetteren en gedurende 2 minuten te centrifugeren bij 2.000 x g bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Herhaal indien nodig de centrifugatiestap (3.4.1.) totdat een volume van ongeveer 5 ml door de kolom is gegaan. - Voordat u de αDEC-205/OVA op de centrifugale eiwitconcentrator laadt, slaat u een monster van 20 μL van de niet-geconcentreerde αDEC-205/OVA op voor western blot-analyse. Bewaar dit aliquot bij 4 °C tot de analyse.
- Laad de αDEC-205/OVA op de centrifugale eiwitconcentrator door te pipetteren.
OPMERKING: Vermijd elk contact met het bed van de bovenste kamer van de centrifugaalconcentrator. - Vul de concentrator tot 15 ml met PBS en centrifugeer de concentrator gedurende 5 minuten bij 2.000 x g bij kamertemperatuur.
- Sla een monster van de doorstroom (doorstroom I) op voor western blot-analyse en gooi de resterende doorstroming weg.
- Vul de concentrator tot 10 ml met PBS en centrifugeer de concentrator gedurende ten minste 8 minuten bij 2.000 x g bij kamertemperatuur.
- Bewaar een monster voor de tweede doorstroom (doorstroom II) voor western blot-analyse en gooi de resterende doorstroming weg.
- Zodra de gewenste verrijking is bereikt (ongeveer 1,5 ml van de αDEC-205/OVA-oplossing moet in de bovenste kamer worden gelaten), zuigt u het geconcentreerde monster voorzichtig op.
OPMERKING: Als er te veel vloeistof in de bovenste kamer achterblijft, kan de centrifugatie worden herhaald, maar moet deze zo kort mogelijk worden gehouden.
- Spoel de centrifugaaleiwitconcentrator (MWCO 150 kDa) voor door 12 ml PBS op de kolom te pipetteren en gedurende 2 minuten te centrifugeren bij 2.000 x g bij kamertemperatuur.
- Bepaal de eiwitconcentratie van de resulterende αDEC-205/OVA met behulp van een microvolumespectrofotometer. Gebruik PBS als leeg.
- Filtreer de αDEC-205/OVA met behulp van een spuitfiltereenheid van 0,22 μm.
OPMERKING: Voor latere analyse en in vivo experimenten kan αDEC-205/OVA worden bewaard bij 4 °C of -18 °C.
4. Verificatie van de chemische conjugatie door western blot
OPMERKING: Voor verificatie van succesvolle chemische conjugatie wordt western blot-analyse uitgevoerd waarbij OVA (4.2) of αDEC-205 (4.10) wordt gedetecteerd. Detectie van OVA (4.2.) of αDEC-205 (4.10.) moet parallel worden uitgevoerd. Een orbitale platformschudder moet bij voorkeur worden gebruikt voor alle incubatiestappen van de western blot-membranen om een uniforme verdeling van de respectieve oplossingen mogelijk te maken.
- Bereid standaard 10% SDS (natrium dodecylodeylsulfaat) gels voor SDS-PAGE (natrium dodecylcylaat polyacrylamide gel elektroforese).
- Bereid de monsters voor op SDS-PAGE om geconjugeerde en niet-geconjugeerde OVA te detecteren en gel-elektroforese uit te voeren.
- Verdun verschillende hoeveelheden gekoppeld αDEC-205/OVA (bijv. 200, 100 en 50 ng), van zuiver OVA (bijv. 80, 70, 60, 50, 40 en 30 ng), een aliquot van niet-geconjugeerde αDEC-205 (bijv. 100 en 50 ng), een monster van niet-geconcentreerd αDEC-205/OVA-geconjugeerd uit stap 3.4.2. (bv. 125 ng) en een aliquot van doorstroom I en II (respectievelijk stappen 3.4.5 en 3.4.7; facultatief) in 4 x niet-reducerende SDS-monsterbuffer.
OPMERKING: Verschillende concentraties van geconjugeerd en eiwit worden geladen om ervoor te zorgen dat zowel vrije OVA als het conjugaat op dezelfde vlek kunnen worden gedetecteerd. - Denatureer de monsters bij 65 °C gedurende 10 minuten en 550 tpm in een verwarmingsblok.
- Verdun verschillende hoeveelheden gekoppeld αDEC-205/OVA (bijv. 200, 100 en 50 ng), van zuiver OVA (bijv. 80, 70, 60, 50, 40 en 30 ng), een aliquot van niet-geconjugeerde αDEC-205 (bijv. 100 en 50 ng), een monster van niet-geconcentreerd αDEC-205/OVA-geconjugeerd uit stap 3.4.2. (bv. 125 ng) en een aliquot van doorstroom I en II (respectievelijk stappen 3.4.5 en 3.4.7; facultatief) in 4 x niet-reducerende SDS-monsterbuffer.
- Laad de monsters en een eiwitstandaard op een SDS-gel en voer SDS-PAGE uit.
- Voer standaard blotting uit van de eiwitten uit de SDS-gel naar een methanol-geactiveerd PVDF-membraan (polyvinylideendifluoride) (75 min, 125 mA).
- Plaats na het dempen het membraan in een geschikte schaal en blokkeer het membraan door 25 ml 4% maaltijdvervangend shakepoeder / TBS-T (Tris-gebufferde zoutoplossing / 0,1% Tween 20) blokkerende buffer in de schaal met het membraan te pipetteren.
- Incubeer het membraan in de blokkerende oplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
- Gooi de blokkerende oplossing weg en kleur het membraan met het primaire antilichaam van konijn αOVA in 2% maaltijdvervangend shakepoeder/TBS-T-antilichaambuffer (verdunning 1:3.000) door 15 ml primaire antilichaamoplossing te pipetteren tegen het membraan in de schaal.
- Incubeer het membraan gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C (gebruik de platform shaker).
- Gooi de antilichaamoplossing weg en was het membraan in de schaal (gebruik de platformschudder).
- Voeg 25 ml TBS-T toe aan het membraan en incubeer gedurende 5 minuten. Gooi de oplossing weg.
- Voeg 25 ml TBS-T/0,5 M NaCl toe aan het membraan en incubeer gedurende 5 minuten. Gooi de oplossing weg.
- Voeg 25 ml TBS-T/0,5% Triton X-100 toe aan het membraan en incubeer gedurende 5 minuten. Gooi de oplossing weg.
- Voeg 25 ml TBS-T toe aan het membraan en incubeer gedurende 5 minuten. Gooi de oplossing weg.
- Kleur het membraan met het secundaire antilichaam αrabbit-IgG-HRPO (paardenradijsperoxidase) in 2% maaltijdvervangend shakepoeder/TBS-T-antilichaambuffer (verdunning 1:2.000) door 15 ml secundaire antilichaamoplossing te pipetteren tegen het membraan in de schaal.
- Incubeer het membraan gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C (op de platformschudder).
- Was het membraan opnieuw zoals beschreven in stap 4.7.1.- 4.7.4. met behulp van de platform shaker. Ga voor dit membraan verder met stap 4.16. (de volgende stappen 4.10.- 4.15. (detectie van αDEC-205) kan parallel aan stap 4.2.- 4.9.) worden uitgevoerd.
- Bereid de monsters voor op de detectie van αDEC-205 voor SDS-PAGE en voer de gel-elektroforese uit.
- Verdun verschillende hoeveelheden αDEC-205/OVA (bijv. 200, 100 en 50 ng), van de niet-geconjugeerde αDEC-205 (bijv. 250, 125, 62,5 ng), van zuiver OVA (bijv. 80 en 70 ng), een monster van niet-geconcentreerde αDEC-205/OVA uit stap 3.4.2. (bv. 125 ng) en een aliquot van doorstroom I en II (respectievelijk stappen 3.4.5 en 3.4.7; facultatief) in 4 x niet-reducerende SDS-monsterbuffer.
- Denatureer de monsters bij 65 °C gedurende 10 minuten en 550 tpm in een verwarmingsblok.
- Laad de monsters en een eiwitstandaard op een SDS-gel en voer gel-elektroforese uit.
- Voer standaard blotting uit van de eiwitten uit de SDS-gel naar een methanol geactiveerd PVDF (polyvinylideendifluoride) membraan (75 min, 125 mA).
- Plaats na het dempen het membraan in een geschikte schaal en blokkeer het membraan door 25 ml 10% blokkerende buffer (melkpoeder / TBS-T) in de schaal met het membraan te pipetteren.
OPMERKING: De blokkeringsoplossingen verschillen tussen αDEC-205 en OVA-detectie (stap 4.5.).- Incubeer het membraan in de blokkerende oplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C (met behulp van de platformschudder).
- Gooi de blokkerende oplossing weg en kleur het membraan met het geitenαrat-IgG(H+L)-HRPO-antilichaam in 5% melkpoeder/TBS-T antilichaambuffer (verdunning 1:5.000) door 15 ml antilichaamoplossing te pipetteren tegen het membraan in de schaal.
OPMERKING: De antilichaambuffers verschillen tussen αDEC-205-detectie en OVA-detectie (stappen 4.6./ 4.8.).- Incubeer het membraan gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C (met behulp van de platform shaker).
- Was het membraan grondig in de schaal zoals beschreven in stappen 4.7.1.- 4.7.4. (gebruik de platform shaker).
- Gebruik een geschikt detectiereagens om het HRP-signaal te ontwikkelen en de chemiluminescentie in een donkere kamer te detecteren met behulp van röntgenfilm of via een beeldvormingssysteem.
5. Controle van de chemische conjugatie door ELISA
- Elisa uitvoeren voor verdere verificatie van succesvolle chemische conjugatie resulterend in αDEC-205/OVA.
- Bekleed een geschikte ELISA-plaat met 96 putten met 100 μL/put van 3 ng/μL konijn αOVA-antilichaam in coatingbuffer (0,1 M natriumbicarbonaat (NaHCO3) pH 9,6 verdund in H2O).
- Incubeer de plaat een nacht bij 4 °C.
- Was de plaat na het coaten drie keer met PBS, bijvoorbeeld met behulp van een ELISA-wasmachine.
- Blokkeer de plaat door 200 μL blokkeerbuffer (10% FCS in PBS) in elke put van de plaat te pipetteren en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdun αDEC-205/OVA (verkregen uit stap 3.6.) 1:2 in blokkeringsbuffer (10% FCS in PBS) om verdunningen te verkrijgen variërend van 6 μg/ml tot 93,8 ng/ml αDEC-205/OVA en voeg 100 μL/put van deze afnemende hoeveelheden αDEC-205/OVA toe aan de putten.
- Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de plaat drie keer met PBS, bijvoorbeeld met behulp van een ELISA-ring.
- Voeg 100 μL van het geitenαrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO-antilichaam (verdund tot 1:2.000 in blokkerende buffer (10% FCS in PBS)) toe aan elke put van de plaat.
- Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de plaat drie keer met PBS, bijvoorbeeld met een ELISA-wasmachine.
- Voeg 50 μL HRPO-substraat toe aan de putjes. Wanneer u een heldere kleurreactie waarneemt, stop de reactie door toevoeging van 150 μl stopoplossing (1M H2SO4) per put.
- Lees na 5 minuten de absorptie bij 450 nm af met behulp van een ELISA-lezer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chemische conjugatie van αDEC-205 naar OVA-eiwit met behulp van dit protocol zal doorgaans een efficiënte generatie van αDEC-205/OVA mogelijk maken voor in vivo DC-targetingbenaderingen. Er zijn verschillende strategieën om de techniek zelf te verifiëren en de functionaliteit van het opbrengstconjugaat te testen. Western blot-analyse en ELISA worden gebruikt om succesvolle conjugatie te verifiëren en tegelijkertijd potentieel achtergebleven OVA te detecteren(figuur 2). In vitro bindingsstudies (figuur 3) en in vivo immunisaties (figuur 4) bevestigen de binding van het conjugaat aan DEC-205 en de targeting van DC.
Parallelle western blot-analyse wordt gebruikt om zowel de geconjugeerde OVA (figuur 2A) als de geconjugeerde αDEC-205 (figuur 2B) te detecteren. In het bijzonder bevestigt het positieve signaal voor OVA op het niveau van het molecuulgewicht van het antilichaam in de vlek de associatie van OVA en het antilichaam (figuur 2A). Bovendien maakt kleuring voor OVA in de western blot-analyse de detectie mogelijk van overtollige vrije OVA die mogelijk nog steeds aanwezig is naast de αDEC-205/OVA die in stap 3.6. is opgeleverd, wat niet het geval is voor de getoonde vlek (Figuur 2A). In het geval dat grote hoeveelheden vrije OVA worden gedetecteerd, stap 3.4.1. tot 3.4.8. van het protocol moet worden herhaald. Complementair aan de kleuring voor OVA (figuur 2A), verifieert kleuring voor αDEC-205 in western blot-analyse succesvolle conjugatie door een toename van het molecuulgewicht tussen "naakt" αDEC-205 en het geconjugeerde zoals weergegeven in figuur 2B.
Naast western blotting maakt ook een specifieke ELISA verificatie mogelijk van de succesvolle conjugatie van αDEC-205 naar OVA. In tegenstelling tot de western blot-analyses laat deze ELISA echter geen detectie van vrije en niet-geconjugeerde αDEC-205 of OVA toe. Door de assay-opstelling(figuur 2C)wordt alleen een positief signaal geproduceerd als de conjugatie efficiënt was. De positieve associatie tussen het gedetecteerde signaal (absorptie bij 450 nm) en de geanalyseerde hoeveelheid eiwit verifieert de succesvolle generatie van αDEC-205 /OVA door chemische conjugatie zoals weergegeven in figuur 2D. Tegelijkertijd toont het positieve signaal dat al is verkregen uit 9,38 ng van het αDEC-205/OVA-conjugaat de sterke gevoeligheid van deze methode aan (figuur 2D). In het geval dat er geen toename is van adsorptie voor toenemende hoeveelheden van het geconjugeerde, was de conjugatie vermoedelijk niet succesvol. In dit geval zouden ook de western blot-analyses negatieve resultaten opleveren, d.w.z. geen detectie van het conjugaat in de vlek gekleurd voor OVA en geen toename van het molecuulgewicht in de vlek gekleurd voor αDEC-205.
Terwijl de western blot- en ELISA-assays worden gebruikt om de conjugatie en de verwijdering van vrij antigeen als zodanig te evalueren, zijn daaropvolgende functionele analyses nodig om de binding aan DEC-205 en de targeting van DC te bevestigen. Hiertoe hebben we in vitro bindingsstudies(figuur 3)en in vivo immunisaties(figuur 4)uitgevoerd. Voor deze experimenten werden vrouwelijke 6-8 weken C57BL/6 en 8-12 weken Balb/c muizen verkregen uit commerciële bronnen of gefokt in de dierenfaciliteit van het Helmholtz Centre for Infection Research (HZI) en werden gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden. Figuur 3 toont functionele assays voor de binding van een conjugaat van αDEC-205 en het HCV Core-eiwit (αDEC-205/Core) aan CD11c+ cellen in vitro. Flowcytometrie toonde duidelijk aan dat αDEC-205/Core efficiënt beenmerg afgeleide CD11c+ cellen bindt (Figuur 3A, B) evenals vers geïsoleerde muis CD11c+ splenocyten (gegevens niet getoond). Deze testen tonen aan dat de chemische conjugatie de bindingscapaciteit van αDEC-205 niet verstoort. Dit wordt verder bevestigd door immunofluorescentieanalyses die de binding van αDEC-205/Core aan MHC-II+ CD11c+ cellen laten zien, gesorteerd uit in vitro gegenereerde beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC) (figuur 3C).
In het verleden hebben we de αDEC-205/OVA-conjugaten aangetoond die door het aangetoonde protocol worden geproduceerd om efficiënt OVA-specifieke immuunresponsen in vivo bij muizen te induceren, wat een succesvolle generatie van het conjugaat en functionele targeting van DC bevestigt (Figuur 4)12,14. In het bijzonder induceerde subcutane vaccinatie met αDEC-205/OVA efficiënt humorale en cellulaire OVA-specifieke immuunresponsen. Belangrijk is dat we in een recombinant adenovirus-uitdagingsmodel antivirale CD8+ T-cellen hebben gedetecteerd die in staat zijn om met virus geïnfecteerde hepatocyten te elimineren, wat sterke implicaties heeft voor vaccins gericht op hepatotrope virussen12. Bovendien onderstreept de zeer effectieve inductie van antigeenspecifieke cytotoxische T-cellen het potentieel van deze aanpak voor de in vivo priming van antitumorimmuniteit. Ook hebben we met succes αDEC-205/OVA gebruikt om verschillende adjuvantia te testen en te vergelijken in de context van in vivo DC targeting14. Bij vaccinatie met αDEC-205/OVA samen met de adjuvante combinatie Poly(I:C) (polyinosinisch-polycytylzuur) en CpG (synthetische oligodeoxynucleotiden die niet-gemethyleerde CpG-motieven bevatten) zagen we in het algemeen (figuur 4A) en gedurende sommige tijdspunten significant hogere OVA-specifieke IgG-niveaus in vergelijking met vaccinatie met alleen OVA (figuur 4B). Bovendien induceerde αDEC-205/OVA efficiënt OVA-specifieke CD4+ evenals CD8+ T-celresponsen (figuur 4C, D) en de αDEC-205/ OVA-geïnduceerde CD8+ T-celrespons was aanzienlijk groter dan die geïnduceerd door OVA alleen (figuur 4D).
Figuur 1: Model van de chemische conjugatie van αDEC-205 en OVA. In een eerste stap reageert het primaire amine van αDEC-205 met de NHS-ester van de crosslinker sulfo-SMCC, wat resulteert in maleimide geactiveerd αDEC-205. Na reductie van de disulfidebindingen van het OVA-eiwit door incubatie met TCEP-HCl, reageert het door maleimide geactiveerde αDEC-205 met het TCEP-HCl-gereduceerde OVA-eiwit om het αDEC-205/OVA-antilichaam/antigeenconjugaat te vormen. Afkortingen: N-hydroxysuccinimide ester (NHS ester); sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC); Tris(2-carboxysethyl)fosfinehydrochloride (TCEP-HCl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verificatie van het chemisch geconjugeerde αDEC-205/OVA. Om de effectieve chemische conjugatie van αDEC-205 en het OVA-eiwit te verifiëren, worden western blot-analyse (A, B) en ELISA (C, D) uitgevoerd. Monsters van αDEC-205/OVA, αDEC-205 en verschillende concentraties OVA-eiwit werden onderworpen aan SDS-PAGE (10%) en daaropvolgende western blot-analyse met behulp van een konijn αOVA primair antilichaam en een geit αrabbit-IgG-HRPO secundair antilichaam om OVA-eiwit (A) of een geit αrat-IgG (H + L) - HRPO-antilichaam te detecteren om αDEC-205 (B) te detecteren. (C) Schematische weergave van de ELISA voor de verificatie van het αDEC-205/OVA-conjugaat. Het konijn αOVA coating antilichaam bindt αDEC-205/OVA via de geconjugeerde OVA. Goat αrat-IgG(H+L)-HRPO herkent de αDEC-205 fractie van het gebonden geconjugeerde en een positief signaal bevestigt dus effectieve conjugatie. (D) ELISA werd uitgevoerd zoals beschreven in (C). Serieel verdunde hoeveelheden (1:2) αDEC-205/OVA (600 ng tot 9,38 ng) werden geanalyseerd. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van drielicaten van een representatieve assay. Afkortingen: enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); paardenradijsperoxidase (HRPO); ovalbumine (OVA); natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE). Panelen A en B zijn aangepast van Volckmar et al.12. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Binding van αDEC-205/Core aan beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC) door flowcytometrie en immunofluorescentiemicroscopie. Om de capaciteit van αDEC-205/Core te analyseren om zijn doelmolecuul DEC-205 in vitroop BMDC's te binden, werden fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) analyse (A, B) en immunofluorescentiemicroscopie (C) uitgevoerd. Kortom, beenmergcellen werden geïsoleerd uit de achterpoten van vrouwelijke Balb / c-muizen (n = 3) van 8-12 weken oud en gekweekt in RPMI-medium aangevuld met 1% penicilline / streptomycine, 1% glutamine, 0,25 mM mercaptoethanol en 5 ng / ml GM-CSF (granulocyte-macrofaagkoloniestimulerende factor). Op dag 6 werden de niet-adherente BMDC's zorgvuldig geoogst en gebruikt voor bindende analyses. (A,B) In vitro gegenereerde BMDC's werden geïncubeerd met 10 μg/ml αDEC-205/Core, αDEC-205 of medium (controle) gedurende 1 uur bij 4 °C gevolgd door kleuring met APC-gelabelde αCD11c [kloon HL3]. Detectie van gebonden αDEC-205/Core op het oppervlak van BMDC's werd uitgevoerd door de cellen extra te kleuren met PE-gelabelde geitenαrat (A) of muis αHCV Core [kloon C7-50] gevolgd door secundaire αmouse-IgG1-PE-kleuring (B). Representatieve histogrammen tonen het PE-signaal en % PE-positieve cellen van de gated CD11c+ cellen. BMDC'sdie in vitro werden gegenereerd door naïeve Balb/c-muizen werden gesorteerd op MHC-II+ en CD11c+ cellen en werden geïncubeerd met 10 μg/ml αDEC-205/Core gedurende 1 uur bij 4 °C. Celgebonden αDEC-205/Core werd gekleurd met Alexa 594-gekoppelde αrat-IgG of met muis αHCV Core [kloon C7-50] en Alexa 488-gekoppelde αmouse-IgG gedurende 30 minuten bij 4 °C na het wassen. De cellen werden gevisualiseerd door immunofluorescentiemicroscopie (schaalbalk = 20 μm). De bindingscapaciteit van αDEC-205/Core aan BMDC's werd bevestigd door een overlay van beide vlekken (dubbel positief = oranje). Afkortingen: beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC); fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS); granulocyt-macrofaag kolonie stimulerende factor (GM-CSF); hepatitis C-virus (HCV). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: OVA-specifieke humorale en cellulaire immuunresponsen na immunisatie met αDEC-205/OVA. De functionaliteit van αDEC-205/OVA om DC in vivo te targeten werd bewezen door immunisatie-experimenten zoals eerder gepubliceerd in Volckmar et al.12. Kortom, vrouwelijke 6-8 weken oude C57BL/6 muizen (n=5) werden subcutaan geïmmuniseerd op dag 0, 14 en 28 met 30 μg αDEC-205/OVA-conjugaat samen met de adjuvantia 50 μg Poly(I:C)/50 μg CpG, 30 μg αDEC-205 alleen of 7 μg OVA-eiwit alleen in een totaal volume van 50 μL PBS per dier. Verdere controles werden behandeld met PBS alleen. (A,B) Om de humorale immuunrespons te controleren, werden gevaccineerde muizen licht verdoofd door isofluraaninhalatie en bloedmonsters werden verzameld uit de retro-orbitale sinus op dag 0, 13 en 27 en door hartpunctie op dag 42. Sera werden bereid zoals beschreven en getest op de aanwezigheid van OVA-specifieke IgG door ELISA12. Eindpunttiters werden uitgedrukt als de wederkerige waarde van de laatste serumverdunning die een absorptie opleverde die twee keer boven de waarden van negatieve controles lag. De resultaten zijn samengesteld uit drie onafhankelijke experimenten. (A) Kinetiek van OVA-specifieke totale serum-IgG-titers weergegeven als het groepsgemiddelde. (B) OVA-specifieke IgG-titer op dag 27 en dag 42 getoond voor individuele muizen samen met het groepsgemiddelde. Statistieken: ongepaarde tweezijdige t-test. (C,D) De inductie van cellulaire immuunresponsen werd geanalyseerd door enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT) assays met behulp van de murine IFNγ detectiekit op dag 42 zoals eerder gepubliceerd12. Geïsoleerde splenocyten van geïmmuniseerde muizen werden gepoold voor de experimentele groepen en het aantal IFNγ-spotvormende eenheden / 106 cellen na stimulatie met 5 mg / ml CD4+ (C) of CD8+ OVA-peptide (D) werd geanalyseerd (OVA-peptiden: CD4323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) en CD8257-264 (SIINFEKL)). Staven vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM (n=5, drievoudige van gepoolde monsters). Statistieken: eenrichtings-ANOVA met dunnett's meervoudige vergelijkingstest (**p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001). Afkortingen: cytosine-fosfaat-guanine oligonucleotidesequenties (CpG), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT), ovalbumine (OVA), phosphate-buffered saline (PBS), polyinosinic-polycytidylic acid (Poly(I:C)). Dit cijfer is gewijzigd van Volckmar et al.12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chemische conjugatie van een endocytosereceptorspecifiek antilichaam en een eiwitantigeen biedt een efficiënte en, belangrijker nog, ook flexibele aanpak voor in vivo DC-targeting in preklinische muismodellen. Met ons protocol bieden we een efficiënte aanpak voor de succesvolle conjugatie van het modelantigeen OVA naar een DEC-205-specifiek IgG-antilichaam.
In ons protocol wordt αDEC-205 gezuiverd uit een hybridoma cellline en in het verleden hebben we het antilichaam gezuiverd met behulp van eiwit G sepharose zoals beschreven. Van belang is dat we ook FPLC hebben gebruikt om αDEC-205 in latere studies te zuiveren en de daaropvolgende chemische conjugatie was eveneens efficiënt. De kritische stappen voor efficiënte chemische conjugatie zijn de priming van zowel het antilichaam als het eiwit. We hebben deze stappen geoptimaliseerd vanuit verschillende beschikbare protocollen om uiteindelijk incubatie van het antilichaam met de crosslinker sulfo-SMCC en reductie van het eiwit door TCEP-HCl uit te voeren. Specifiek, op dit punt zijn de kritieke stappen de verse bereiding van TCEP-HCl (stap 3.1.) en de duur van de incubatie van TCEP-HCl met het eiwit, die niet mag worden verlengd (stap 3.1.2.). Bovendien is de eiwitbuffer die wordt gebruikt voor de reductie van de disulfidebindingen via TCEP-HCl van cruciaal belang, omdat het de reductie door TCEP-HCl negatief kan beïnvloeden. Ook is het belangrijk om het geactiveerde antilichaam en het gereduceerde eiwit (stap 3.3.6.) onmiddellijk te mengen om optimale reactieomstandigheden voor de conjugatie te garanderen. In onze handen leverde deze aanpak de meest efficiënte en betrouwbare resultaten op met betrekking tot vervoeging. Een andere cruciale stap voor latere in vivo benaderingen is de verwijdering van ongebonden OVA uit het αDEC-205/OVA-conjugaat. Om deze stap te verifiëren, hebben we western blot-analyses geoptimaliseerd en raden we detectie aan van zowel het geconjugeerde αDEC-205 als het geconjugeerde OVA-eiwit(figuur 2A en B). In het geval dat ongebonden OVA aanwezig is in de uiteindelijke geconjugeerde oplossing, zal het dempen en detecteren van bekende concentraties van OVA (zoals in figuur 2A)helpen bij het schatten van de hoeveelheid ongebonden OVA in verhouding tot de totale hoeveelheid eiwit geladen voor de SDS-PAGE. Als conjugatie inefficiënt was, moet het oplossen van problemen de antigeen / antilichaamverhouding aanpakken die wordt gebruikt voor de conjugatie. In het geval dat conjugatie effectief was zoals gedetecteerd door ELISA, maar niet kan worden gedetecteerd door western blot-analyse, hebben we de antilichaamconcentraties in de western blot-analyses (stappen 4.6., 4.8., 4.14.) als de meest kritische factor ervaren.
De belangrijkste beperking van onze aanpak is een soms variërende conjugatie-efficiëntie waarbij er geen vaste correlatie is tussen het aantal antilichaammoleculen en de hoeveelheid gekoppeld eiwit. Niettemin geloven en hebben we ervaren dat het aangetoonde protocol op betrouwbare wijze latere in vivo studies van DC-targeting mogelijk maakt die reproduceerbare resultaten opleveren. Bovendien, terwijl in principe in ons protocol zowel αDEC-205 als het OVA-eiwit kunnen worden uitgewisseld voor alternatieve antilichamen en antigenen voor in vivo studies van verschillende belangen, zullen individuele stappen van de chemische conjugatie nieuw moeten worden geoptimaliseerd voor de nieuwe componenten. Dit geldt vooral voor de optimale antilichaam/antigeenverhouding en kan bijvoorbeeld afhankelijk zijn van de toegankelijkheid van reduceerbare Cys-residuen. In onze benaderingen waren de optimale verhoudingen die resulteerden in succesvolle conjugatiereacties 1:5 voor OVA tot αDEC-205 en 1,35:1 voor de HCV-eiwitten NS3 (niet-structureel eiwit 3) en Core tot αDEC-205. Voor elk geconjugeerd moeten negatieve effecten van de crosslinker of de conjugatie als zodanig op het antigeenbindend vermogen van het antilichaam worden uitgesloten. Van belang is dat conjugatie van immunogene peptiden in plaats van eiwitten over de volledige lengte in dit opzicht minder problematisch is. Eiwitten zorgen echter voor een hogere antigeendiversiteit bij daaropvolgende immunisatie. Genetische fusiebenaderingen tonen een alternatief voor chemische conjugatie en hebben ook duidelijke voordelen1. Uiteindelijk zal de keuze van de strategie om antilichamen en antigenen te koppelen voor DC-targeting afhangen van de middelen, de onderzoeksfocus en de verwachte toepassingen van de conjugaten. Wij zijn van mening dat de relatieve flexibiliteit met betrekking tot antilichamen en antigenen een groot voordeel van chemische conjugatie vertoont en we hebben inderdaad het hier beschreven protocol gebruikt voor de efficiënte chemische conjugatie van αDEC-205 naar verschillende eiwitten van het hepatitis C-virus (HCV)(Figuur 3 en gegevens niet weergegeven).
Over het algemeen zijn we van mening dat chemische conjugatie van endocytose-receptorspecifieke antilichamen tegen eiwitantigenen zoals in αDEC-205 / OVA een flexibel en betrouwbaar hulpmiddel is om antilichaam / antigeenconjugaten van uitzonderlijke waarde te genereren bij het bestuderen van DC-targetingbenaderingen, ook inclusief die gericht op het induceren van antitumorimmuniteit, vooral in preklinische diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken S. Prettin voor deskundige technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) die werd verstrekt als onderdeel van de Helmholtz Alliance ''Immunotherapy of Cancers" (HCC_WP2b).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al.
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
