Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Published: April 11, 2021 doi: 10.3791/62020
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 1
1Department of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, 2Institute of Functional Genomics, M.V. Lomonosov Moscow State University, 3National Research Centre "Kurchatov Institute"

Summary

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

Abstract

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אוקריוטיים המסוגלים להנשמה אירובית. הם מכילים גנום מעגלי ומנגנון ביטוי גנים. גנום מיטוכונדריאלי של שמרי אופה מקודד שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p. מטרת השיטה המתוארת כאן היא לתייג במיוחד חלבונים אלה עם 35S methionine, להפריד אותם על ידי אלקטרופורזה לדמיין את האותות כמו להקות נפרדות על המסך. ההליך כרוך במספר שלבים. ראשית, תאי שמרים מתרבתים במדיום המכיל גלקטוז עד שהם מגיעים לשלב הצמיחה הלוגריתמי המאוחר. לאחר מכן, טיפול ציקלוהקסימיד חוסם תרגום ציטופלסמי ומאפשר 35S שילוב מתיון רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. לאחר מכן, כל החלבונים מופקים מתאי שמרים ומופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד. לבסוף, הג'ל מיובש ומדגיר עם מסך זרחן האחסון. המסך נסרק על זרחן החושף את הלהקות. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעור הביוסינתזה של פוליפפטיד יחיד במיטוכונדריה של זן שמרים מוטציה לעומת סוג הבר, אשר שימושי לחקר פגמים ביטוי גנים מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה מספק מידע רב ערך על קצב התרגום של כל mRNAs המיטוכונדריה שמרים. עם זאת, הוא דורש מספר בקרות וניסויים נוספים כדי להסיק מסקנות נכונות.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים מעורבים עמוק בחילוף החומרים של תא אוקריוטי. שרשרת העברת האלקטרונים שלהם מספקת לתא ATP, המטבע האנרגטי העיקרי המשמש במסלולים ביוכימיים מרובים. חוץ מזה, הם מעורבים אפופטוזיס, חומצת שומן סינתזה heme, ותהליכים אחרים. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא מקור ידוע של מחלה אנושית1. זה יכול לנבוע מוטציות בגנים גרעיניים או מיטוכונדריאליים קידוד רכיבים מבניים או רגולטוריים של organelles2. שמרי בייקר Saccharomyces cerevisiae הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר ביטוי גנים מיטוכונדריאלי בשל מספר סיבות. ראשית, הגנום שלהם רצף לחלוטין3, מבואר היטב, וסכום גדול של נתונים כבר זמין בספרות הודות להיסטוריה הארוכה של חקירות שבוצעו עם האורגניזם הזה. שנית, המניפולציות עם הגנום הגרעיני שלהם הן מהירות וקלות יחסית בגלל קצב הצמיחה המהיר שלהם ומערכת רקומביניזציה הומולוגית יעילה מאוד. שלישית, שמרי האופה S. cerevisiae הוא אחד האורגניזמים הבודדים שעבורם המניפולציות עם הגנום המיטוכונדריאלי מפותחות. לבסוף, שמרי האופה הוא אורגניזם פקולטטיבי אווירוב-אנארוב, המאפשר בידוד וחקר של מוטציות פגומות בדרכי הנשימה, שכן הם יכולים לגדול במדיה המכילה מקורות פחמן מותססים.

אנו מתארים את השיטה ללמוד ביטוי גנים מיטוכונדריאלי של שמרי אופה S. cerevisiae ברמה התרגומית4. העיקרון העיקרי שלה מגיע מכמה תצפיות. ראשית, הגנום המיטוכונדריאלי של השמרים מקודד רק שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p5. מספר זה קטן, וניתן להפריד את כולם על ידי אלקטרופורזה על ג'ל יחיד בתנאים המתאימים. שנית, ריבוזומים מיטוכונדריאליים שייכים למעמד הפרוקריוטי ולא לאוקריוטיקה6, ולכן הרגישות לאנטיביוטיקה שונה עבור ריבוזומים ציטופלזמים ומיטוכונדריאליים. זה מאפשר עיכוב של תרגום ציטופלסמי עם ציקלוהקסימיד, מתן התנאים כאשר חומצת אמינו שכותרתו(35S-מתיונין) משולב רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. כתוצאה מכך, הניסוי מספק מידע על קצב שילוב חומצות האמינו בחלבונים המיטוכונדריים מסונתז דה נובו, המשקף את היעילות הכוללת של תרגום מיטוכונדריאלי עבור כל אחד משמונת המוצרים

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תרבות שמרים

  1. שמרים פס מתרבויות מלאי קפוא על צלחות טריות עם המדיום המתאים. שים את הצלחות באינקובטור תרבות ב 30 מעלות צלזיוס עבור 24-48 שעות.
    הערה: תן למוטנטים הרגישים לטמפרטורה לגדול בטמפרטורה המתירנית.
  2. לחסן תרביות שמרים ב 2 מ"ל של מדיום YPGal (2% פפטון, 1% תמצית שמרים, 2% גלקטוז) מן הפס הטרי ב 15 מ"ל צינורות לדגר אותם לילה נסער ב 200 סל"ד ב 30 °C (60 °F).
  3. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באורך גל של 600 ננומטר (OD600).
  4. קח את הנפח המתאים 0.2 יחידות ספיגה בצינורות סטריליים, כדוריות שמרים תאים ב 9,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר, ולזרוק את supernatant.
  5. לשטוף תאים עם 0.5 מ"ל של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך 5 s. כדורי שמרים תאים ב 9,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. לדלל תאים ב 2 מ"ל של מדיום YPGal טרי.
  6. דגירה ב 200 סל"ד ו 30 °C (60 °F) עד OD600 מגיע 1.5-1.9 ערכים.
    הערה: שיעורי הצמיחה של שמרים משתנים, לכן היו מוכנים לחכות. סביר לעשות צעדים 1.3-1.6 מוקדם בבוקר. זה בדרך כלל לוקח 4-5 שעות, אבל יכול לקחת יותר זמן.

2. התאגדות איזוטופ רדיואקטיבי

  1. העבר את נפח התרבות המקביל ליחידה אופטית אחת בצינור מיקרוצנטריפוגה. לסובב את הצינורות ב 3,000 x g במשך 1 דקות ולהשליך את supernatant. לשטוף עם 0.5 מ"ל של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך 5 s.
    1. כדורי שמרים תאים ב 9,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. הושהה מחדש של תאי שמרים ב- 0.5 מ"ל של מאגר תרגום סטרילי. מניחים את ההשעיה בצינור 15 מ"ל.
      הערה: מאגר תרגום הוא פתרון המכיל 2% גלקטוז (w /v) ו 50 מ"מ אשלגן פוספט עם pH 6.0.
  2. הוסף ציקלוהקסימיד להשעיית התא עד ריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל. דגירה במשך 5 דקות נסער ב 200 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס כדי לעכב תרגום ציטוזולי.
    הערה: פתרון ציקולוהקסימיד (20 מ"ג / מ"ל, באתנול) צריך להיות מוכן טרי לפני הניסוי. כלורמפניקול יכול להיות מוחלף בהצלחה עם אניסומיצין באותו ריכוז7.
  3. הוסף 25-30 μCi של 35S-methionine להשעיית התא דגירה במשך 30 דקות נסער ב 200 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להשתמש גם בתערובת של 35S-מת'ונין ו-35S-ציסטאין. תוצאות S-methionine טהורות באות החזק ביותר ויחס האות לרעש הטוב ביותר. בדרך כלל, מתונין יעיל יותר ציסטאין כי התוכן של חומצת אמינו זו בחלבונים המיטוכונדריים הוא גבוה יותר. עם זאת, תערובת EasyTag של 35S-methionine וציסטאין הוא פחות יקר ונותן תוצאותדומות 7.
    התראה: 35S-מתונין הוא רדיואקטיבי. פעל בהתאם לנוהלי הבטיחות הרגילים לטיפול בחומרים רדיואקטיביים.
    הערה: ידוע כי שילוב הרדיואקטיביות מגיע למגבלה שבגללה רמת האותות הכוללת לאורך זמן. ברגע שמגבלה זו מגיעה, כמעט בלתי אפשרי לקבוע את התעריפים שבאמצעותם מוצרי התרגום השונים מסונתזים. כדי לנתח את קצב התרגום המיטוכונדריאלי, זה הכרחי להיות במצב שבו עוצמת האות עולה עם זמן הדגירה עם 35S-methionine באופן ליניארי. עבור זנים נפוצים מסוג פראי במעבדה, האות כבר רווי לזמני דגירה קצרים בהרבה מ-30 דקות. מוטנטים תרגום יכולים להתנהג בצורה שונה מאוד. יש לבצע קורס זמן כדי לבסס את הקינטיקה של שילוב רדיואקטיביות ובכך את שיעור התרגום, לפחות בעת עבודה עם זן חדש. בשביל זה, אנו ממליצים לקחת דגימות עם מרווח של כמה דקות (למשל, 2.5, 5.0, 7,5, 10, ו 20 דקות).
  4. הוסף מתונין "קר" ללא תווית (הריכוז הסופי צריך להיות 20 מ"מ) ו puromycine (הריכוז הסופי צריך להיות 1-10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי לעצור את התיוג. דגירה במשך 10 דקות נסער ב 200 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס.
    הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לתת ריבוזומים זמן לסיים לתרגם את הפפטידים. אחרת, כל הפוליפפטידים קצרים יותר מאורך מלא יזוהו בגודל שונה. ניסוי קורס זמן (דופק-מרדף) יכול להיעשות בשלב זה כדי לקבוע את היציבות של מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. בשביל זה, להמשיך את הדגירה לוקח דגימות עם מרווח של 30 דקות (למשל, 30, 60, 90, ו 120 דקות).

3. תמוגה של תאי שמרים ומיצוי חלבונים

  1. לאסוף תאי שמרים על ידי צנטריפוגה ב 9,000 x g עבור 30 s. לשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך 5 s. כדורי שמרים תאים ב 9,000 x גרם עבור 30 s בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט.
    הערה. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. אחסן את הדגימות ב- -20 °C (69 °F).
  2. הוסף 75 μL של מאגר תמוגה לכדור ומערבולת במשך 5-10 s.
    הערה: מאגר תמוגה הוא פתרון של 1.8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol, ו 1 mM PMSF במים. הימנע דגירה מוגזמת עם מאגר תמוגה המוביל הידרוליזה אלקליין של חלבונים. המשך מיד לשלב 3.3.
  3. הוסף 500 μL של 0.5 M Tris-HCl מאגר עם pH 6.8. וורטקס לזמן קצר.

4. משקעים של חלבונים

התראה: מתנול וכלורופורם הם ממיסים אורגניים. בצע את נוהלי הבטיחות הרגילים לטיפול בחומרים אורגניים.

  1. הוסף 600 μL של מתנול לדגימה. וורטקס במשך 5 שניות.
  2. הוסף 150 μL של כלורופורם לדגימה. וורטקס במשך 5 שניות.
  3. צנטריפוגה הדגימות במשך 2 דקות ב 12,000 x g. השלך בזהירות את השלב העליון עם סמפלר.
  4. הוסף 600 μL של מתנול לדגימה. מערבבים בזהירות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.
  5. צנטריפוגה הדגימות במשך 2 דקות ב 12,000 x g. השלך את הסופרנט.
  6. אוויר לייבש את גלולה במשך 2 דקות ב 80 מעלות צלזיוס.
    הערה: כל הנוזל צריך להתאדות. קיים סיכון להפרדה חריגה של חלבונים בג'ל אם גלולה היה מיובש מספיק. עם זאת, לא ניתן לייבש יתר על הערך את גלולה, כך שזה יכול אפילו להיות מאוחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. ממיסים חלבונים משקעים ב-60 מיקרו-μL של מאגר מדגם 1x Laemmli.
  8. מחממים במשך 10 דקות ב 40 מעלות צלזיוס.
    הערה: הימנע רותחים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס, כי זה גורם לצבירה. אם הצבירה עדיין נוצרת, סובב את הדגימות במהירות של 12,000 x g למשך 2 דקות ואסוף את ה- supernatant. ניתן לאחסן דגימות ב- -20 °C (69 °F). ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

5. עמוד SDS

  1. יצוק 17.5% Laemmli SDS-פוליאקרילאמיד ג'ל.
    הערה: 6 M אוריאה ניתן להוסיף את הג'ל כדי לפתור טוב יותר atp8 ו atp9. ג'לים הדרגתיים של 15%-20% יכולים גם לתת רזולוציה טובה יותר.
  2. טען 15 μL (40-50 מיקרוגרם) של כל מדגם בכיסים.
    הערה: אין צורך למדוד ריכוז חלבון אם ערכי OD600 היו קרובים בשלב 1.6. אם לא, למדוד ריכוזי חלבון באמצעות מבחני עם ריאגנטים תואמי דטרגנט.
  3. מפעילים את הג'ל בחדר קר עד שהצבע הכחול מגיע לכ-65% מאורך הג'ל.
    הערה: עבור המערכת בשימוש (למשל, Protean II xi תא), אנו משתמשים בכל אחד משני המצבים: 16-17 שעות ב 5 V / cm או 5 שעות ב 15 V / cm. אין חלבונים לרוץ מהר יותר מאשר צבע כחול ברומופנול, אבל ריצות ארוכות יכול לגרום טשטוש של אותות atp8 ו- atp9.
  4. הכתימו את הג'ל בכחול בוהק של Coomassie ובצעו סריקה או תמונה, הנדרשת כבקרת טעינה.
    הערה: דרך חלופית לעשות בקרת טעינה היא immunoblotting עם נוגדן לגן "שמירה על הבית" המיטוכונדריאלי, למשל, פורין 1.

6. אוטורדיוגרפיה

  1. יבש את הג'ל במייבש ג'ל. שמור אותו בקלטת עם מסך זרחן אחסון למשך 3-5 ימים.
    הערה: חלופה להקרנת הג'ל המיובש היא העברת חלבונים לקרום ניטרוסלולוז על ידי נפיחות אלקטרו והקרנתו לאחר מכן. התוצאה היא אותות חזקים יותר ולהקות חדות יותר.
  2. סרוק את המסך על זרחן.
    הערה: כחלופה להדמיית זרחן, ניתן להשתמש בסרט רנטגן גם כדי לחשוף את האותות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, הקצינו מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי משני זני S. cerevisiae: סוג הבר (WT) ומוטנט הנושא מחיקה של הגן AIM23 (AIM23Δ), קידוד גורם ייזום תרגום מיטוכונדריאלי 3 (טבלה 1)8. מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי סומנו באופן רדיואקטיבי והופרדו ב- SDS-PAAG9. הדגימות נאספו כל 2.5 דקות לפני הרוויה כדי לבנות קורס זמן (איור 1A). הג'ל היה מוכתם, מיובש ומוקרן לאחר התערוכה בת 5 הימים (איור 1A).

במקרה של ניסוי מוצלח, התמונה מדגימה שמונה להקות שהוקצו על פי התבנית הסטנדרטית4. עם זאת, העוצמות של להקות בודדות יכולות להיות משתנות מאוד בהתאם למתח ולתנאים הניסיוניים. כל להקה מתאימה למוצר תרגום אחד. הנתונים (איור 1A) מצביעים על כך שזן AIM23Δ מסוגל לסינתזת חלבונים מיטוכונדריאליים מכיוון שכל המוצרים המופיעים ב- WT נראים במוטנט זה. עם זאת, העוצמות של הלהקות שונות מה- WT, כלומר המחיקה של AIM23 משפיעה על ביטוי הגן המיטוכונדריאלי8. הכתם הכחול המבריק של קומאסי משמש כבקרת טעינה.

ניתן לכמת את הנתונים המתקבלים (איור 1B) כדי לזהות הבדלים בין זנים או תנאים ניסיוניים באמצעות תוכנת ImageJ10 או ImageQuant. עבור זה, היחסים של האות המתאים לכל מוצר לאות הכולל מחושבים. ערכים ממוצעים וסטיות תקן מחושבים בשלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות.

הקינטיקה של תחלופת חלבונים מסונתזת נחקרת בניסוי מרדף דופק(איור 1C). דגימות נאספות בנקודות הזמן שצוינו לאחר תגובת התיוג נעצרת על ידי מתיונין קר ו puromycine בשלב 2.4. בקרה זו נחוצה כדי להעריך את יציבות המוצרים מכיוון שעוצמת האות היא תוצאה של שני תהליכים מנוגדים: סינתזה של שרשראות חדשות והשפלת חלבונים. חיסון עם נוגדנים נגד פורין 1 הוא בקרת טעינה.

Figure 1
איור 1: תיוג רדיואקטיבי מייצג של מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי שמרים. (A)קורס זמן של 35S-methionine שילוב חלבונים מסונתז מיטוכונדריאלי בתאי שמרים חיים של WT וזנים AIM23Δ. מכתים כחולים מבריקים של קומאסי הם פקד טעינה. (B) רמות של חלבונים מקודדים המיטוכונדריה לאחר 5 דקות תיוג עם 35S-מתונין. הביטוי היחסי מנורמל לביטוי הכולל של גנים של חלבונים מקודדים מיטוכונדרית. קווי שגיאה מציינים את סטיית התקן של הממוצע של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. (C)מחזור של חלבונים מסונתזים מיטוכונדרית בסוג הבר וזנים Aim23Δ. התיוג הופסק והדגימות נאספו בנקודות הזמן שצוינו. חיסון עם נוגדן אנטי פורין 1 הוא בקרת טעינה. (D)ניסוי תת אופטימלי עם 35S-מתונין ישן, רדיואוטוגרפיה. איור 1A, B, C מותאמיםמ-8 עם שינויים קלים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

זן גנוטיפ (סוג)
WT (נ) מאטה מאל
Δ AIM23 MATα מאל, AIM23::KanMX4

שולחן 1. גנוטיפים של זני S. cerevisiae

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חקירות של ביטוי גנים תופסות חלק מרכזי במדעי החיים המודרניים. פותחו שיטות רבות המספקות תובנות על תהליך מורכב זה. כאן, תיארנו את השיטה המאפשרת גישה לביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה S. cerevisiae של בייקר. זה מיושם בדרך כלל כדי להשוות יעילות תרגום של mRNAs במיטוכונדריה של זן שמרים מוטנטים לעומת סוג פראי כדי לגשת להשלכות של המוטציה הנחקרת. זהו אחד הניסויים הבסיסיים שהחוקרים עורכים כאשר הם חוקרים את הפונקציה המיטוכונדריאלית של תאי שמרים הנושאים את המוטציה המוצעת להשפיע על המיטוכונדריה8,11,12,13. זה משולב לעתים קרובות עם המדידות של קצב צריכת חמצן ופוטנציאל קרום המיטוכונדריה. עם זאת, המידע שהוא מספק אינו מספיק כדי להבחין איזה שלב של ביטוי גנים מושפע. קבוצה של ניסויים נוספים נדרשת כדי לגלות את זה. ראשית, כתמים צפוניים או הערכת RT-qPCR של mRNAs מיטוכונדריאלי יש צורך להעריך את שלב שעתוק. שנית, כתם מערבי של סך תמציות חלבון עם נוגדנים ספציפיים צריך להיעשות כדי להעריך את רמת החלבון. שלישית, הדופק של שכותרתו 35S-methionine (חם) צריך להימשך עם תוספת של מתיונין (קר) ללא תווית (מרדף) וכמה נקודות זמן יש לאסוף ולנתח על הג'ל כדי לחקור את היציבות של החלבונים.

ניתוח מדויק של ביטוי גנים מיטוכונדריאלי באמצעות תיוג דופק 35S דורש תגובות בקרה, במיוחד כאשר החוקר חסר את הניסיון בטיפול בו או עובד עם זן שמרים חדש או מוטציה. במקרים אלה, שליטה שלילית טובה היא זן rho0 נטול DNA מיטוכונדריאלי. זה מראה עיכוב cycloheximide יעיל של תרגום ציטוזולי ומאשר כי דפוס הפסים הוא תרגום מיטוכונדריאלי ספציפי. אם זן rho 0 אינו זמין, אנו מציעים לכלול כלוראמפניקול יחד עם ציקלוהקסימיד כדי לעכב את כל סינתזת החלבון כדי לאשר יעילות ציקלוהקסימיד וספציפיות של דפוס הפסים.

השינוי הקרוב ביותר בפרוטוקול הוא מרדף הדופק כאשר התרבות דגירה בשייקר (שלב 2.4) זמן רב יותר ממה שהוצע בניסוי הדופק(איור 1C). הוא משמש כדי ללמוד את המחזור והיציבות של מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. יש שינוי נוסף של השיטה כאשר תיוג רדיואקטיבי נעשה organello, לא vivo4. זה מרמז על בידוד של המיטוכונדריה מתאי שמרים. שינוי זה הוא מהיר יותר אם המיטוכונדריה הקפואה היו מצוידים בעבר aliquots. יתרון נוסף הוא היעדר טיפול ציקלוהקסימיד, אשר משפיע על היבטים שונים של חילוף החומרים התאי. עם זאת, בידוד המיטוכונדריה והפשרתם בהקפאה עלולים להטריד את מתחמי התרגום באיברונים המספקים תמונה מלאכותית. שינוי חשוב נוסף של הפרוטוקול יכול להיעשות לאחר ההפרדה של מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי בג'ל polyacrylamide (שלב 5). במקום קומאסי כחול מבריק מכתים ויבש את הג'ל, החלבון יכול להיות מועבר לקרום nitrocellulose על ידי אלקטרו-סופג. התוצאה היא אותות חזקים וחדים יותר. הסיבה העיקרית היא כי 35S נרקב על ידי פליטה של חלקיקי בטא עם חדירה קצרה מאוד, כך האות מוקרן בקלות בגישה זו. ניתן גם לשנות את התנאים האלקטרופורטיים כדי לספק רזולוציה טובה יותר. נקודה אחת היא להוסיף 6M אוריאה בג'ל, אשר משפר את ההפרדה של atp8 ו atp914. דרך נוספת היא שימוש הדרגתי 15%-20% ג'לים.

פרופיל תרגום15 היא השיטה המשמשת לצלול עמוק יותר לתוך השינויים של תרגום מיטוכונדריאלי. בהשוואה לתיוג רדיואקטיבי, הוא מאפשר יצירת עמדות של ריבוזומים מיטוכונדריים על mRNA, מה שמאפשר למצוא את הצעד המדויק (חניכה, התארכות או סיום) להיות מושפע. עם זאת, פרופיל הוא הרבה יותר יקר, מסובך, וגוזל זמן. באופן רציונלי זה יכול להיעשות לאחר ניסוי שילוב התווית, לא להיפך. לאחרונה, גישה חדשנית לניטור תרגום מיטוכונדריאלי שמרים פותחה16. זה מונע טיפול עם ציקלוהקסימיד, וזה יתרון כי טיפול כזה משפיע על חילוף החומרים הסלולר ואת מסלולי איתות. במקום שילוב של חומצות אמינו המסומנות רדיואקטיבית, היא משתמשת בהחדרה של גן מקודד מחדש עבור GFP מקופל במיוחד (SfGFP) בגנום המיטוכונדריאלי של השמרים, המאפשר מדידה ישירה של תרגום מיטוכונדריאלי באמצעות ציטומטריית זרימה. עם זאת, היישום של גישה זו דורש זן שמרים מיוחד עם DNA מיטוכונדריאלי שונה המכיל רצף קידוד sfGFP ממוקם בין 5 '- ו 3 '- רצפי אגף של גן מיטוכונדריאלי מסוים.

ניסוי שילוב התוויות כולל מספר שלבים קריטיים, שלא ניתן לסכן בניסוי מוצלח. ראשית, יש להשתמש בתרבויות שמרים טריים (שלב 1.1). שמירה על שמרים על הצלחות יותר מחודש אחד לא מומלץ; אחרת, הם יכולים להתנהג באופן בלתי צפוי במהלך ההסתעפות הזו. שנית, פתרון ציקלוהקסימיד צריך להיות מוכן טרי לפני הניסוי ומאוחסן קפוא לא יותר משבוע אחד (שלב 2.1). הפתרון הישן מאבד את יכולתו לעכב תרגום ציטופלסמי וכתוצאה מכך דפוס רצועה חריג לחלוטין ברדיואוטוגרפיה. שלישית, 35S-methionine צריך להיות טרי ופעיל (שלב 2.2), אחרת, העוצמות של הלהקות יהיו חלשות (איור 1D). שימוש ריאגנט שעבר ארבעה מחצית חיים (4 x 87.4 ימים) אינו מומלץ. הימנע רותחים דגימות חלבון ב 95 מעלות צלזיוס כמו מדריכי הכנה מדגם סטנדרטי מציע (שלב 4.8) כי חלבונים מיטוכונדריאליים הם הידרופוביים מאוד נוטה צבירה.

ישנן מספר בעיות נפוצות שניתן לחוות בהתמודדות עם שיטה זו. הראשון הוא האינטנסיביות החלשה של הלהקות ברדיואוטוגרפיה. כדי לתקן את זה לוודא, כי טרי 35S-methionine משמש, כמות מספקת של תאי שמרים נלקח, ואת החלבונים אינם צוברים בכיסים על הג'ל, אשר ניתן לשלוט על ידי כתמי Coomassie. שמור את הג'ל המיובש עם המסך במשך לא פחות מ 3 ימים. הבעיה השנייה היא תבנית הרצועה השגויה. אם הוא נתקל, ודא כי צלחות שמרים טריים ציקלוהקסימיד מוכן טרי משמשים. זכור כי עוצמות יחסיות של הלהקות יכול להשתנות במידה רבה זנים שונים שמרים ותנאי אלקטרופורזה. זה לא הגיוני לטעון את סולם משקל מולקולרי חלבון על הג'ל מאז מוצרי תרגום המיטוכונדריה לעולם אינם מופרדים על פי ההמונים המולקולריים שלהם בהליך זה כי הם הידרופוביים מאוד. לכן, קוקס I (58 kDa) נודד מהר יותר Var 1 (47 kDa). בהתאם לתנאי החיץ, החלבונים יכולים אפילו להחליף עמדות עם אחד השכנים. הבעיה הנפוצה השלישית היא התמונה המטושטשת ללא רצועות חדות שנצפו לאחר כתמי קומאסי. זה מציין את הטעויות בליהוק של הג'ל, הרכב חיץ שגוי, או השפלה של חלבונים בדגימות. מומלץ להכין מאגרי ג'ל חדשים ומאגר פועל בזהירות בדיקת הרכב וערכי ה- pH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי הקרן הרוסית למחקר בסיסי, מענק מספר 18-29-07002. P.K. נתמך על ידי הקצאת המדינה של משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מספר מענק AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. נתמך על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מענק מספר 075-15-2019-1659 (תוכנית מרכז Kurchatov לחקר הגנום). העבודה נעשתה בחלקה על הציוד שנרכש במסגרת תוכנית הפיתוח של אוניברסיטת מוסקבה. I.C., S.L., ו M.V.B נתמכו בנוסף על ידי אוניברסיטת מוסקבה סטייט מענק "בית הספר המדעי המוביל תיבת נח".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Acrylamide Sigma-Aldrich A9099
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
Bacteriological agar Sigma-Aldrich A5306 
Biowave Cell Density Meter CO8000 BIOCHROM US BE 80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes Sigma-Aldrich Z330361
chloroform Sigma-Aldrich 288306 
cycloheximide Sigma-Aldrich C1988 
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G5388 
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021 
digital block heater Thermo Scientific 88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution Perkin Elmer NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425 Thermo Scientific 13-864-457
GE Storage Phosphor Screens Sigma-Aldrich GE29-0171-33
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 
methanol Sigma-Aldrich 34860 
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological Millipore 91249 
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626 
Pierce 660nm Protein Assay Kit Thermo Scientific 22662
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Protean II xi cell Bio-Rad 1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger Sigma-Aldrich P8833
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Storm 865 phosphor imager GE Healthcare
Trizma base Sigma-Aldrich 93352 
Vacuum Heated Gel Dryer Cleaver Scientific CSL-GDVH
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
  2. Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
  3. Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-563 (1996).
  4. Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
  5. Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
  6. Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
  7. Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
  8. Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
  12. Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
  13. Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
  14. Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
  15. Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
  16. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).

Tags

ביוכימיה גיליון 170
תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב <em>Cerevisiae שמרים</em> של בייקר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chicherin, I. V., Levitskii, S. A.,… More

Chicherin, I. V., Levitskii, S. A., Baleva, M. V., Krasheninnikov, I. A., Patrushev, M. V., Kamenski, P. A. Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (170), e62020, doi:10.3791/62020 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter