Summary
Bakers jäst mitokondriella genom kodar för åtta polypeptider. Målet med det nuvarande protokollet är att märka dem alla och därefter visualisera dem som separata band.
Abstract
Mitokondrier är viktiga organeller av eukaryota celler som kan aeroba andning. De innehåller cirkulärt genom och genuttrycksapparatur. Ett mitokondriellt genom av bagerijäst kodar för åtta proteiner: tre underenheter av cytokrom c oxidas (Cox1p, Cox2p och Cox3p), tre underenheter av ATP-syntasen (Atp6p, Atp8p och Atp9p), en underavdelning till ubiquinol-cytokrom c oxidoreduktasenzymet, cytokrom b (Cytb) och mitokondriellt ribosomprotein Var1p. Syftet med metoden som beskrivs här är att specifikt märka dessa proteiner med 35S metionin, separera dem med elektrofores och visualisera signalerna som diskreta band på skärmen. Förfarandet omfattar flera steg. Först odlas jästceller i ett galaktosinnehållande medium tills de når det sena logaritmiska tillväxtstadiet. Därefter blockerar cykloheximidbehandling cytoplasmisk översättning och tillåter endast 35S metionininkorporation i mitokondriella översättningsprodukter. Sedan extraheras alla proteiner från jästceller och separeras med polyakrylamidgelelektrofores. Slutligen torkas och inkuberas gelén med lagringsfosforskärmen. Skärmen skannas på en fosforimager som avslöjar banden. Metoden kan tillämpas för att jämföra biosyntesen av en enda polypeptid i mitokondrierna hos en mutantjäststam jämfört med den vilda typen, vilket är användbart för att studera mitokondriella genuttrycksdefekter. Detta protokoll ger värdefull information om översättningshastigheten för alla jäst mitokondriella mRNAs. Det krävs dock flera kontroller och ytterligare experiment för att dra lämpliga slutsatser.
Introduction
Mitokondrier är de organeller som är djupt involverade i metabolismen av en eukaryota cell. Deras elektronöverföringskedja förser cellen med ATP, den viktigaste energiska valutan som används i flera biokemiska vägar. Dessutom är de involverade i apoptos, fettsyra och hemsyntes och andra processer. Dysfunktion av mitokondrier är en välkänd källa till mänsklig sjukdom1. Det kan bero på mutationer i nukleära eller mitokondriella gener som kodar strukturella eller regulatoriska komponenter i organellerna2. Bakers jäst Saccharomyces cerevisiae är en utmärkt modellorganism för att studera mitokondriell genuttryck på grund av flera skäl. För det första är deras arvsmassa heltsekvenserad 3, väl kommenterad, och en stor mängd data finns redan i litteraturen tack vare den långa historien av undersökningar som utförs med denna organism. För det andra är manipuleringarna med sitt kärngenom relativt snabba och enkla på grund av deras snabba tillväxttakt och mycket effektiva homologa rekombinationssystem. För det tredje är bagerijäst S. cerevisiae en av de få organismer för vilka manipuleringarna med mitokondriella genom utvecklas. Slutligen är bagerijäst en aerobe-anaerobe facultative organism, som tillåter isolering och studier av luftvägarna defekta mutanter, eftersom de kan växa i medier som innehåller fermenterbara kolkällor.
Vi beskriver metoden att studera mitokondriell gen uttryck av bageri jäst S. cerevisiae på translationell nivå4. Dess huvudprincip kommer från flera observationer. För det första kodar jäst mitokondriellt genom endast åtta proteiner: tre underenheter av cytokrom c oxidas (Cox1p, Cox2p och Cox3p), tre underenheter av ATP-syntasen (Atp6p, Atp8p och Atp9p), en underavdelning till ubiquinol-cytokrom c oxidoreduktasenzymet, cytokrom b (Cytb) och mitokondriellt ribosomprotein Var1p5. Detta antal är litet, och alla kan separeras med elektrofores på en enda gel under lämpliga förhållanden. För det andra tillhör mitokondriella ribosomer den prokaryota klassen snarare än eukaryota6, och därför är känsligheten för antibiotika annorlunda för jästcytoplasmiska och mitokondriella ribosomer. Det möjliggör hämning av cytoplasmisk översättning med cykloheximid, vilket ger villkoren när den märktaaminosyran (35S-metionin) endast ingår i mitokondriella översättningsprodukter. Som ett resultat ger experimentet information om frekvensen av aminosyrainkorporering i mitokondriella proteiner syntetiserade de novo, vilket återspeglar den totala effektiviteten av mitokondriell översättning för var och en av de åtta produkterna
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av jästkultur
- Strimma jäst från de frysta lagerkulturerna på färska tallrikar med lämpligt medium. Sätt plattorna i en kulturinkubator vid 30 °C i 24–48 timmar.
OBS: Låt de temperaturkänsliga mutanterna växa vid den tillåtna temperaturen. - Inokulera jästkulturer i 2 ml YPGal medium (2% pepton, 1% jästextrakt, 2% galaktos) från den färska strecket i 15 ml-rör och inkubera dem över natten som agiterar vid 200 varv/min vid 30 °C.
- Mät kulturens optiska densitet vid en våglängd på 600 nm (OD600).
- Ta volymen motsvarande 0,2 absorbansenheter i sterila rör, pelletsjästceller vid 9 000 x g i 30 s vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Tvätta celler med 0,5 ml sterilt vatten genom att virvla i 5 s. Pelletsjästceller vid 9 000 x g i 30 s vid rumstemperatur och kassera supernaten. Späd celler i 2 ml färskt YPGal-medium.
- Inkubera agiterande vid 200 varv/min och 30 °C tills OD600 når 1,5–1,9 värden.
OBS: Jästtillväxten varierar, så var beredd att vänta. Det är rimligt att göra steg 1.3–1.6 tidigt på morgonen. Det tar vanligtvis 4-5 h, men kan ta längre tid.
2. Radioaktiv isotopinkorporering
- Överför odlingsvolymen motsvarande en optisk enhet i ett mikrocentrifugrör. Snurra rören på 3 000 x g i 1 minut och kassera supernaten. Tvätta med 0,5 ml sterilt vatten genom att virvla i 5 s.
- Pelletsjästceller vid 9 000 x g i 30 s vid rumstemperatur och kassera supernaten. Återanvänd jästceller i 0,5 ml steril översättningsbuffert. Placera fjädringen i ett 15 ml-rör.
OBS: Översättningsbufferten är en lösning som innehåller 2% galaktos (w/v) och 50 mM kaliumfosfat med pH 6.0.
- Pelletsjästceller vid 9 000 x g i 30 s vid rumstemperatur och kassera supernaten. Återanvänd jästceller i 0,5 ml steril översättningsbuffert. Placera fjädringen i ett 15 ml-rör.
- Tillsätt cykloheximid till cellupphängning upp till en slutlig koncentration på 0,2 mg/ml. Inkubera i 5 min agitering vid 200 varv/min och 30 °C för att hämma cytosolisk översättning.
OBS: Cykloheximidlösning (20 mg/ml, i etanol) bör beredas färsk före försöket. Kloramfenikol kan framgångsrikt ersättas med anisomycin i samma koncentration7. - Tillsätt 25–30 μCi 35S-metionin till cellfjädringen och inkubera i 30 minuter och agitera vid 200 varv/min och 30 °C.
OBS: Blandningen av 35S-metionin och 35S-cystein kan också användas. Ren 35S-metionin resulterar i den starkaste signalen och det bästa signal-till-brusförhållandet. I allmänhet är metionin effektivare än cystein eftersom innehållet i denna aminosyra i mitokondriella proteiner är högre. EasyTag-blandningen av 35S-metionin och cystein är dock billigare och ger jämförbara resultat7.
VARNING: 35S-metionin är radioaktivt. Följ de vanliga säkerhetsrutinerna för hantering av radioaktiva material.
OBS: Det är välkänt att införlivandet av radioaktivitet når en gräns på grund av vilken de totala signalerna planar ut över tiden. När denna gräns har nåtts är det nästan omöjligt att bestämma hur mycket de olika översättningsprodukterna syntetiseras. För att analysera mitokondriell översättningshastighet är det absolut nödvändigt att vara i ett tillstånd där signalintensiteten ökar med inkubationstid med 35S-metionin på ett linjärt sätt. För vanliga stammar av vild typ av laboratorium är signalen redan mättad för inkubationstider som är mycket kortare än 30 minuter. Translationella mutanter kan bete sig mycket annorlunda. En tidskurs bör utföras för att fastställa kinetiken för radioaktivitetsinkorporering och därmed översättningshastigheten, åtminstone när man arbetar med en ny stam. För detta föreslår vi att du tar prover med ett intervall på flera minuter (t.ex. 2,5, 5,0, 7,5, 10 och 20 min). - Tillsätt omärkt "kallt" metionin (slutlig koncentration ska vara 20 mM) och puromycin (slutlig koncentration ska vara 1–10 μg/ml) för att stoppa märkningen. Inkubera i 10 minuter vid 200 varv/min och 30 °C.
OBS: Detta steg är avgörande för att ge ribosomer tid att avsluta översättningen av peptiderna. Annars kommer alla polypeptider kortare än full längd att detekteras i en annan storlek. Ett tidskursexperiment (pulsjakt) kan göras i detta steg för att bestämma stabiliteten hos mitokondriella översättningsprodukter. För detta, fortsätt inkubationen med ett intervall på 30 min (t.ex. 30, 60, 90 och 120 min).
3. Jästcellslys och extraktion av proteiner
- Samla jästceller genom centrifugering vid 9 000 x g i 30 s. Tvätta cellerna med 0,5 ml sterilt vatten genom att virvla i 5 s. Pelletsjästceller vid 9 000 x g för 30 s vid rumstemperatur. Kassera supernaten.
Observera. Protokollet kan pausas här. Förvara proverna vid -20 °C. - Tillsätt 75 μL lysbuffert till pelleten och virveln i 5–10 s.
OBS: Lysis buffert är en lösning på 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol och 1 mM PMSF i vatten. Undvik överdriven inkubation med lysbuffert som leder till alkalisk hydrolys av proteiner. Fortsätt omedelbart till steg 3.3. - Tillsätt 500 μL 0,5 M Tris-HCl-buffert med pH 6,8. Vortex kort.
4. Utfällning av proteiner
VARNING: Metanol och kloroform är organiska lösningsmedel. Följ de vanliga säkerhetsrutinerna för hantering av organiska ämnen.
- Tillsätt 600 μL metanol till provet. Virvel i 5 s.
- Tillsätt 150 μL kloroform till provet. Virvel i 5 s.
- Centrifugera proverna i 2 min vid 12 000 x g. Kassera försiktigt den övre fasen med en provtagare.
- Tillsätt 600 μL metanol till provet. Blanda försiktigt genom att vända röret flera gånger.
- Centrifugera proverna i 2 min vid 12 000 x g. Kassera supernaten.
- Lufttorka pelleten i 2 min vid 80 °C.
OBS: All vätska ska avdunsta. Det finns risk för avvikande separation av proteiner i gelén om pelleten torkades otillräckligt. Det är dock inte möjligt att övertorka pelleten, så den kan till och med lagras över natten vid 4 °C. - Lös upp fällda proteiner i 60 μL 1x Laemmli provbuffert.
- Värm i 10 min vid 40 °C.
OBS: Undvik att koka proverna vid 95 °C, eftersom detta orsakar aggregering. Om aggregaten fortfarande bildas, Snurra proverna på 12 000 x g i 2 minuter och samla in supernaten. Proverna kan förvaras vid -20 °C. Protokollet kan pausas här.
5. SDS-SIDA
- Gjut 17,5% Laemmli SDS-polyakrylamidgel.
OBS: 6 M urea kan tillsättas till gelén för att lösa bättre atp8 och atp9. Gradient 15%–20% geler kan också ge bättre upplösning. - Ladda 15 μL (40–50 μg) av varje prov i fickorna.
OBS: Det är inte nödvändigt att mäta proteinkoncentrationen om OD600-värdena var nära i steg 1,6. Om så inte är möjligt, mät proteinkoncentrationerna med hjälp av analysen med rengöringsmedelskompatibla reagenser. - Kör gelén i ett kallt rum tills det blå färgämnet når cirka 65% av gellängden.
OBS: För det system som används (t.ex. Protean II xi-cell) använder vi något av de två lägena: 16–17 h vid 5 V/cm eller 5 h vid 15 V/cm. Inga proteiner går snabbare än bromophenolblå färgämnet, men långa körningar kan resultera i suddighet av atp8- och atp9-signaler. - Färga gelén med Coomassie lysande blå och gör en skanning eller foto, vilket krävs som lastkontroll.
OBS: Ett alternativt sätt att göra en lastkontroll är immunoblotting med en antikropp mot mitokondriell "hushållning" gen, t.ex. porin 1.
6. Autoradiografi
- Torka gelén i en geltork. Förvara den i kassetten med en förvaringsfosforskärm i 3–5 dagar.
OBS: Ett alternativ till screening av den torkade gelén är överföring av proteiner till ett nitrocellulosamembran genom elektro-blotting och screening därefter. Det resulterar i starkare signaler och skarpare band. - Skanna skärmen på en fosforimager.
OBS: Som ett alternativ till fosforavbildning kan röntgenfilm också användas för att avslöja signalerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt det protokoll som beskrivs ovan tilldelade vi mitokondriella översättningsprodukter från två S. cerevisiae-stammar: den vilda typen (WT) och en mutantlagerborttagning av AIM23-genen (AIM23Δ), kodning mitokondriell översättningsinitieringsfaktor 3 (tabell 1)8. Mitokondriella översättningsprodukter var radioaktivt märkta och separerade i SDS-PAAG9. Proverna samlades in var 2,5 minut före mättnad för att bygga en tidskurs (figur 1A). Gelén färgades, torkades och screenades efter 5-dagarsutställningen (Figur 1A).
Vid ett lyckat experiment visar bilden åtta band som tilldelats enligt standardmönstret4. Intensiteten hos enskilda band kan dock vara mycket varierande beroende på belastning och experimentella tillstånd. Varje band motsvarar en översättningsprodukt. Uppgifterna (figur 1A) tyder på att AIM23Δ-stammen kan mitokondriell proteinsyntes eftersom alla produkter som förekommer i WT är synliga i denna mutant. Bandens intensitet skiljer sig dock från WT, vilket innebär att borttagningen av AIM23 påverkar mitokondriellt genuttryck8. Coomassie Brilliant Blue färgning fungerar som en laddningskontroll.
De resulterande uppgifterna kan kvantifieras (figur 1B) för att identifiera skillnader mellan stammar eller experimentella tillstånd med imagej10- eller ImageQuant-programvara. För detta beräknas förhållandet mellan signalen som motsvarar varje produkt och den totala signalen. Medelvärden och standardavvikelser beräknas i minst tre oberoende experiment.
Kinetiken i syntetiserad proteinomsättning studeras i ett pulsjaktsexperiment (Figur 1C). Proverna samlas in vid de angivna tidpunkterna efter det att märkningsreaktionen stoppats av kall metionin och puromycin i steg 2.4. Denna kontroll är nödvändig för att uppskatta produkternas stabilitet eftersom signalens intensitet är ett resultat av två motsatta processer: syntes av nya kedjor och proteinnedbrytning. Immunostaining med antiporin 1 antikroppar är en belastningskontroll.
Figur 1: Representativ radioaktiv märkning av översättningsprodukter av jäst mitokondriellt. A)Tidskurs på 35S-metionininkorporation i mitokondriellt syntetiserade proteiner i levande jästceller av WT- och AIM23Δ-stammar. Coomassie Brilliant Blue färgning är en laddningskontroll. B)Halter av mitokondriellt kodade proteiner efter 5 min märkning med 35S-metionin. Det relativa uttrycket normaliseras till det totala uttrycket av mitokondriellt kodade proteingener. Felstaplar anger standardavvikelsen för medelvärdet för minst tre oberoende experiment. C)Omsättning av mitokondriellt syntetiserade proteiner i vilda och Aim23Δ-stammar. Märkningen stoppades och proverna samlades in vid de angivna tidpunkterna. Immunostaining med anti-porin 1 antikropp är en lastningskontroll. (D) Suboptimalt experiment med gammalt 35S-metionin, radioautografi. Figur 1A,B,C är anpassad från8 med mindre modifieringar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Stam | Genotyp |
| Wt | MATα mal |
| AIM23Δ (mål Δ) | MATα mal, AIM23::KanMX4 |
Tabell 1. Genotyper av S. cerevisiae stammar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersökningar av genuttryck upptar en central del i moderna livsvetenskaper. Många metoder som ger insikter om denna komplexa process har utvecklats. Här beskrev vi metoden som gör det möjligt att få tillgång till proteinbiosyntes i bagerijäst S. cerevisiae mitokondrier. Det tillämpas vanligtvis för att jämföra översättningseffektiviteten hos mRNAs i mitokondrier av mutant jäst stam kontra vild typ för att få tillgång till konsekvenserna av den studerade mutationen. Detta är ett av de grundläggande experiment som forskarna utför när de studerar den mitokondriella funktionen hos jästceller som bär mutationen som föreslås påverka mitokondrier8,11,12,13. Det kombineras ofta med mätningar av syreförbrukningshastighet och mitokondriell membranpotential. Den information den ger är dock inte tillräcklig för att skilja vilket stadium av genuttryck som påverkas. En uppsättning ytterligare experiment krävs för att ta reda på det. För det första är norra fläck eller RT-qPCR utvärdering av mitokondriell mRNAs nödvändigt för att bedöma transkriptionssteget. För det andra bör en västerländsk fläck av totala proteinextrakt med specifika antikroppar göras för att bedöma proteinnivån. För det tredje bör pulsen av märkt 35S-metionin (varmt) fortsättas med tillsats av omärkt (kallt) metionin (jakt) och flera tidpunkter bör samlas in och analyseras på gelén för att undersöka proteinens stabilitet.
Noggrann analys av mitokondriellt genuttryck med hjälp av 35S pulsmärkning kräver kontrollreaktioner, särskilt när forskaren saknar erfarenhet av att hantera det eller arbetar med en ny jäststam eller en mutant. I dessa fall är god negativ kontroll en rho0 stam utan mitokondriellt DNA. Det visar effektiv cykloheximid hämning av cytosolic översättning och bekräftar att banding mönstret är mitokondriell översättning specifik. Om rho0-stammen inte är tillgänglig, föreslår vi att inkludera kloramfenikol tillsammans med cykloheximid för att hämma all proteinsyntes för att bekräfta cykloheximid effektivitet och specificitet av banding mönstret.
Den närmaste ändringen av protokollet är pulsjakten när kulturen inkuberas i skakapparaten (steg 2.4) längre än vad som föreslås i pulsexperimentet (Figur 1C). Det används för att studera omsättningen och stabiliteten hos mitokondriella översättningsprodukter. Det finns en annan modifiering av metoden när den radioaktiva märkningen görs i organello, inte in vivo4. Det tyder på isolering av mitokondrier från jästceller. Denna modifiering är snabbare om frysta mitokondrier tidigare lagrades i alikvoter. En annan fördel är frånvaron av cykloheximidbehandling, vilket påverkar olika aspekter av cellulär metabolism. Isolering av mitokondrier och frysupptining av dem kan dock stör översättningskomplexen i organellerna som ger en artificiell bild. En annan viktig ändring av protokollet kan göras efter separationen av mitokondriella översättningsprodukter i polyakrylamidgel (steg 5). Istället för Coomassie Brilliant Blue färgning och torkning av gelén kan proteinet överföras till nitrocellulosamembranet genom elektro-blotting. Detta resulterar i starkare och skarpare signaler. Huvudorsaken är att 35S sönderfaller genom utsläpp av betapartiklar med mycket kort penetration, så signalen screenas enkelt i detta tillvägagångssätt. Elektroforesiska förhållanden kan också modifieras för att ge bättre upplösning. En punkt är att lägga till 6M urea i gelén, vilket förbättrar separationen av atp8 och atp914. Ett annat sätt är att använda gradient 15%-20% geler.
Translationell profilering15 är den metod som används för att dyka djupare in i ändringarna av mitokondriell översättning. Jämfört med radioaktiv märkning tillåter det att etablera positioner av mitokondriella ribosomer på mRNA, vilket gör det möjligt att hitta det exakta steget (initiering, förlängning eller avslutning) påverkas. Profilering är dock mycket dyrare, kompliceradere och tidskrävande. Rationellt kan det göras efter etikettinkorporeringsexperimentet, inte vice versa. Nyligen har ett nytt tillvägagångssätt för övervakning av jäst mitokondriell översättning utvecklats16. Det undviker behandling med cykloheximid, vilket är fördelaktigt eftersom sådan behandling påverkar cellulär metabolism och signalvägar. I stället för radioaktivt märkt aminosyrainkorporering använder den införandet av en omkodad gen för supervikt GFP (sfGFP) i jäst mitokondriellt genom, vilket möjliggör direkt mätning av mitokondriell översättning med hjälp av flödescytometri. Tillämpningen av detta tillvägagångssätt kräver dock den speciella jäststammen med modifierat mitokondriellt DNA som innehåller sfGFP-kodningssekvens placerad mellan 5'- och 3'- flankerande sekvenser av en viss mitokondriell gen.
Etikettinkorporeringsexperimentet innehåller flera kritiska steg, som inte kan äventyras i ett lyckat experiment. Först bör färska jästkulturer användas (steg 1.1). Att hålla jäst på plattorna längre än 1 månad rekommenderas inte; Annars kan de bete sig oförutsägbart i denna analys. För det andra bör cykloheximidlösningen beredas färsk före försöket och förvaras fryst högst 1 vecka (steg 2.1). Den gamla lösningen förlorar sin förmåga att hämma cytoplasmisk översättning vilket resulterar i ett helt avvikande bandmönster i radioautografin. För det tredje bör 35S-metionin vara friskt och aktivt (steg 2.2), annars kommer bandens intensitet att vara svag (Figur 1D). Användning av reagenset som passerade fyra halveringsliv (4 x 87,4 dagar) rekommenderas inte. Undvik att koka proteinproverna vid 95 °C som standardprovberedningsguider antyder (steg 4.8) eftersom mitokondriella proteiner är mycket hydrofoba och benägna att aggregering.
Det finns flera vanliga frågor som man kan uppleva när man hanterar den här metoden. Den första är den svaga intensiteten hos banden på radioautografin. För att fixa det, se till att färskt 35S-metionin används, tas en tillräcklig mängd jästceller och proteinerna aggregeras inte i fickorna på gelén, som kan kontrolleras av Coomassie-färgning. Håll den torkade gelén med skärmen i inte mindre än 3 dagar. Det andra problemet är det felaktiga bandmönstret. Om det påträffas, se till att färska jästplattor och nylagad cykloheximid används. Tänk på att bandens relativa intensiteter kan variera kraftigt i olika jäststammar och elektroforesförhållanden. Det är föga meningsfullt att ladda proteinets molekylviktsstege på gelén eftersom mitokondriella översättningsprodukter aldrig separeras enligt deras molekylära massor i detta förfarande eftersom de är mycket hydrofoba. Således migrerar Cox I (58 kDa) snabbare än Var 1 (47 kDa). Beroende på buffertförhållandena kan proteinerna till och med byta position med en av grannarna. Den tredje vanliga frågan är den suddiga bilden utan skarpa band observerade efter Coomassie färgning. Det indikerar misstagen i gjutningen av gelén, felaktig buffertsammansättning eller nedbrytning av proteiner i proverna. Det rekommenderas att förbereda nya gelbuffertar och löpbuffert noggrant kontrollera kompositionen och pH-värdena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av ryska stiftelsen för grundforskning, anslag nummer 18-29-07002. P.K. stöttades av Statligt uppdrag av departement av vetenskap och högre utbildning av Ryska federationen, anslag numrerar AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. stöddes av Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning, bidragsnummer 075-15-2019-1659 (Program of Kurchatov Center of Genome Research). Arbetet gjordes delvis på den utrustning som köptes inom ramen för Moskvas statliga universitetsprogram för utveckling. I.C., S.L., och M.V.B. stöttades dessutom av Moscow state university anslag "Leading Scientific School Noah's Ark".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al.
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
