Summary
Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.
Abstract
Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryotische cellen die in staat zijn tot aërobe ademhaling. Ze bevatten cirkelvormige genoom- en genexpressieapparatuur. Een mitochondriaal genoom van bakkersgist codeert voor acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p. Het doel van de hier beschreven methode is om deze eiwitten specifiek te labelen met 35S methionine, ze te scheiden door elektroforese en de signalen te visualiseren als discrete banden op het scherm. De procedure omvat verschillende stappen. Ten eerste worden gistcellen gekweekt in een galactosebevattend medium totdat ze de late logaritmische groeifase bereiken. Vervolgens blokkeert cycloheximidebehandeling cytoplasmatische vertaling en staat 35S methionine-integratie alleen toe in mitochondriale vertaalproducten. Vervolgens worden alle eiwitten geëxtraheerd uit gistcellen en gescheiden door polyacrylamide gelelektroforese. Ten slotte wordt de gel gedroogd en geïncubeerd met het opslagfosforscherm. Het scherm wordt gescand op een fosforimager die de banden onthult. De methode kan worden toegepast om de biosynthesesnelheid van een enkel polypeptide in de mitochondriën van een mutante giststam te vergelijken met het wilde type, wat nuttig is voor het bestuderen van mitochondriale genexpressiedefecten. Dit protocol geeft waardevolle informatie over de vertaalsnelheid van alle gist mitochondriale mRNA's. Het vereist echter verschillende controles en aanvullende experimenten om goede conclusies te trekken.
Introduction
Mitochondriën zijn de organellen die nauw betrokken zijn bij het metabolisme van een eukaryotische cel. Hun elektronenoverdrachtsketen voorziet de cel van ATP, de belangrijkste energetische valuta die wordt gebruikt in meerdere biochemische paden. Bovendien zijn ze betrokken bij apoptose, vetzuur- en heemsynthese en andere processen. Disfunctie van mitochondriën is een bekende bron van menselijke ziekte1. Het kan het gevolg zijn van mutaties in nucleaire of mitochondriale genen die coderen voor structurele of regulerende componenten van organellen2. Baker's gist Saccharomyces cerevisiae is om verschillende redenen een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van mitochondriale genexpressie. Ten eerste is hun genoom vollediggesequentieerd 3, goed geannoteerd, en een grote som gegevens is al beschikbaar in de literatuur dankzij de lange geschiedenis van onderzoeken uitgevoerd met dit organisme. Ten tweede zijn de manipulaties met hun nucleaire genoom relatief snel en gemakkelijk vanwege hun snelle groeisnelheid en zeer efficiënt homologe recombinatiesysteem. Ten derde is bakkersgist S. cerevisiae een van de weinige organismen waarvoor de manipulaties met mitochondriale genomen zijn ontwikkeld. Ten slotte is bakkersgist een aerobe-anaerobe facultatief organisme, dat isolatie en studie van respiratoire defecte mutanten mogelijk maakt, omdat ze kunnen groeien in media die fermenteerbare koolstofbronnen bevatten.
We beschrijven de methode om mitochondriale genexpressie van bakkersgist S. cerevisiae op translationeel niveau 4 tebestuderen. Het belangrijkste principe komt uit verschillende observaties. Ten eerste codeert het gist mitochondriale genoom slechts acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p5. Dit aantal is klein en ze kunnen allemaal worden gescheiden door elektroforese op een enkele gel in de juiste omstandigheden. Ten tweede behoren mitochondriale ribosomen tot de prokaryotische klasse in plaats van eukaryotisch6, en daarom is de gevoeligheid voor antibiotica anders voor gistcytoplasmatische en mitochondriale ribosomen. Het maakt de remming van cytoplasmatische vertaling met cycloheximide mogelijk, op voorwaarde dat de omstandigheden waarin het gelabelde aminozuur (35S-methionine) alleen in mitochondriale vertaalproducten is opgenomen. Als gevolg hiervan geeft het experiment informatie over de snelheid van aminozuurincorporatie in mitochondriale eiwitten gesynthetiseerd de novo, wat de algehele efficiëntie van mitochondriale vertaling voor elk van de acht producten weerspiegelt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gistkweekbereiding
- Streepgist uit de bevroren stamculturen op verse borden met het juiste medium. Doe de platen 24-48 uur in een kweekincubator bij 30 °C.
OPMERKING: Laat de temperatuurgevoelige mutanten groeien bij de toegestane temperatuur. - Ent gistculturen in 2 ml YPGal medium (2% pepton, 1% gistextract, 2% galactose) uit de verse streep in 15 ml buizen en incubeer ze 's nachts roeren bij 200 tpm bij 30 °C.
- Meet de optische dichtheid van de cultuur bij een golflengte van 600 nm (OD600).
- Neem het volume dat overeenkomt met 0,2 absorptie-eenheden in steriele buizen, pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.
- Was cellen met 0,5 ml steriel water door 5 s te vortexen. Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Verdun cellen in 2 ml vers YPGal medium.
- Incubeer roeren bij 200 tpm en 30 °C tot OD600 1,5–1,9 waarden bereikt.
OPMERKING: De groeipercentages van gist variëren, dus wees voorbereid om te wachten. Het is redelijk om vroeg in de ochtend stappen 1.3-1.6 te maken. Het duurt meestal 4-5 uur, maar kan langer duren.
2. Radioactieve isotoop-integratie
- Breng het kweekvolume gelijk aan één optische eenheid over in een microcentrifugebuis. Draai de buizen 1 minuut op 3.000 x g en gooi de supernatant weg. Was met 0,5 ml steriel water door 5 s te vortexen.
- Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspend gistcellen in 0,5 ml steriele vertaalbuffer. Plaats de suspensie in een buis van 15 ml.
OPMERKING: Vertaalbuffer is een oplossing die 2% galactose (w/v) en 50 mM kaliumfosfaat met pH 6,0 bevat.
- Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspend gistcellen in 0,5 ml steriele vertaalbuffer. Plaats de suspensie in een buis van 15 ml.
- Voeg cycloheximide toe aan celsuspensie tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mg/ml. Incubeer gedurende 5 minuten roeren bij 200 tpm en 30 °C om cytosolische vertaling te remmen.
OPMERKING: Cycloheximide-oplossing (20 mg/ml, in ethanol) moet vóór het experiment vers worden bereid. Chlooramfenicol kan met succes worden vervangen door anisomycine in dezelfde concentratie7. - Voeg 25–30 μCi 35S-methionine toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten roeren bij 200 tpm en 30 °C.
OPMERKING: Het mengsel van 35S-methionine en 35S-cysteïne kan ook worden gebruikt. Pure 35S-methionine resulteert in het sterkste signaal en de beste signaal-ruisverhouding. Over het algemeen is methionine effectiever dan cysteïne omdat het gehalte aan dit aminozuur in mitochondriale eiwitten hoger is. Het EasyTag-mengsel van 35S-methionine en cysteïne is echter goedkoper en geeft vergelijkbare resultaten7.
LET OP: 35S-methionine is radioactief. Volg de gebruikelijke veiligheidspraktijken voor het omgaan met radioactieve materialen.
OPMERKING: Het is algemeen bekend dat de integratie van radioactiviteit een limiet bereikt waardoor het totale signaal in de loop van de tijd afvlakt. Zodra deze limiet is bereikt, is het bijna onmogelijk om de snelheid te bepalen waarmee de verschillende vertaalproducten worden gesynthetiseerd. Om de snelheid van mitochondriale vertaling te analyseren, is het noodzakelijk om in een toestand te verkeren waarin de signaalintensiteit toeneemt met de tijd van incubatie met 35S-methionine op een lineaire manier. Voor gewone wildstammen in het laboratorium is het signaal al verzadigd voor incubatietijden die veel korter zijn dan de 30 minuten. Translationele mutanten kunnen zich heel anders gedragen. Er moet een tijdscursus worden gevolgd om de kinetiek van radioactiviteitsing en dus de vertaalsnelheid vast te stellen, althans bij het werken met een nieuwe stam. Hiervoor raden we aan monsters te nemen met een interval van enkele minuten (bijv. 2,5, 5,0, 7,5, 10 en 20 minuten). - Voeg ongelabelde "koude" methionine (eindconcentratie moet 20 mM zijn) en puromycine (eindconcentratie moet 1–10 μg/ml zijn) toe om de etikettering te stoppen. Incubeer gedurende 10 minuten roeren bij 200 tpm en 30 °C.
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om ribosomen de tijd te geven om de peptiden te vertalen. Anders worden alle polypeptiden korter dan de volledige lengte gedetecteerd op een andere grootte. Een tijdcursusexperiment (pulse-chase) kan in deze stap worden gedaan om de stabiliteit van mitochondriale vertaalproducten te bepalen. Ga hiervoor verder met het nemen van incubatiemonsters met een interval van 30 minuten (bijv. 30, 60, 90 en 120 min).
3. Gistcellyse en extractie van eiwitten
- Verzamel gistcellen door centrifugatie bij 9.000 x g gedurende 30 s. Was de cellen met 0,5 ml steriel water door 5 s te vortexen. Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg.
Opmerking. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Bewaar de monsters bij -20 °C. - Voeg 75 μL lysisbuffer toe aan de pellet en vortex gedurende 5-10 s.
OPMERKING: Lysis buffer is een oplossing van 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol en 1 mM PMSF in water. Vermijd overmatige incubatie met lysisbuffer die leidt tot alkalische hydrolyse van eiwitten. Ga onmiddellijk verder met stap 3.3. - Voeg 500 μL van 0,5 M Tris-HCl buffer met pH 6,8 toe. Vortex kort.
4. Neerslag van eiwitten
LET OP: Methanol en chloroform zijn organische oplosmiddelen. Volg de gebruikelijke veiligheidspraktijken voor het omgaan met organische stoffen.
- Voeg 600 μL methanol toe aan het monster. Vortex voor 5 s.
- Voeg 150 μL chloroform toe aan het monster. Vortex voor 5 s.
- Centrifugeer de monsters gedurende 2 minuten bij 12.000 x g. Gooi de bovenste fase voorzichtig weg met een sampler.
- Voeg 600 μL methanol toe aan het monster. Meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren.
- Centrifugeer de monsters gedurende 2 minuten bij 12.000 x g. Gooi de supernatant weg.
- Droog de pellet 2 minuten aan de lucht bij 80 °C.
OPMERKING: Alle vloeistof moet verdampen. Er bestaat een risico op een afwijkende scheiding van eiwitten in de gel als de pellet onvoldoende is gedroogd. Het is echter niet mogelijk om de pellet te drogen, dus het kan zelfs 's nachts bij 4 °C worden bewaard. - Los neergeslagen eiwitten op in 60 μL 1x Laemmli monsterbuffer.
- Verwarm gedurende 10 min bij 40 °C.
OPMERKING: Vermijd het koken van de monsters bij 95 °C, omdat dit aggregatie veroorzaakt. Als de aggregaten zich nog vormen, draait u de monsters gedurende 2 minuten op 12.000 x g en verzamelt u het supernatant. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
5. SDS-PAGINA
- Giet de 17,5% Laemmli SDS-polyacrylamide gel.
OPMERKING: 6 M ureum kan aan de gel worden toegevoegd om betere atp8 en atp9 op te lossen. Gradiënt 15%-20% gels kunnen ook een betere resolutie geven. - Laad 15 μL (40–50 μg) van elk monster in de zakken.
OPMERKING: Het is niet nodig om de eiwitconcentratie te meten als de OD600-waarden in stap 1.6 dicht bij elkaar lagen. Zo niet, meet dan de eiwitconcentraties met behulp van de test met wasmiddelcompatibele reagentia. - Voer de gel in een koude ruimte uit tot de blauwe kleurstof ongeveer 65% van de gellengte bereikt.
OPMERKING: Voor het gebruikte systeem (bijv. Protean II xi-cel) gebruiken we een van de twee modi: 16-17 uur bij 5 V/cm of 5 uur bij 15 V/cm. Geen eiwitten lopen sneller dan de bromophenol blauwe kleurstof, maar lange runs kunnen leiden tot vervaging van atp8- en atp9-signalen. - Beits de gel met Coomassie briljant blauw en maak een scan of foto, die nodig is als laadcontrole.
OPMERKING: Een alternatieve manier om een belastingsregeling te maken is immunoblotting met een antilichaam tegen mitochondriaal "huishouding" gen, bijvoorbeeld porine 1.
6. Autoradiografie
- Droog de gel in een geldroger. Bewaar het 3-5 dagen in de cassette met een opbergfosforscherm.
OPMERKING: Een alternatief voor het screenen van de gedroogde gel is de overdracht van eiwitten naar een nitrocellulosemembraan door het daarna te elektrovlekken en te screenen. Het resulteert in sterkere signalen en scherpere banden. - Scan het scherm op een fosforimager.
OPMERKING: Als alternatief voor fosforbeeldvorming kan röntgenfilm ook worden gebruikt om de signalen te onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het hierboven beschreven protocol hebben we mitochondriale vertaalproducten toegewezen van twee S. cerevisiae stammen: het wilde type (WT) en een mutante dragende deletie van het AIM23-gen (AIM23Δ), dat codeert voor mitochondriale vertalingsinitiatiefactor 3 (tabel 1)8. Mitochondriale vertaalproducten werden radioactief geëtiketteerd en gescheiden in SDS-PAAG9. De monsters werden elke 2,5 minuut vóór verzadiging verzameld om een tijdscursus te bouwen (figuur 1A). De gel werd gekleurd, gedroogd en gescreend na de 5-daagse expositie (figuur 1A).
In het geval van een succesvol experiment toont de afbeelding acht banden die zijn toegewezen volgens het standaardpatroon4. De intensiteiten van individuele banden kunnen echter zeer variabel zijn, afhankelijk van de spanning en experimentele omstandigheden. Elke band komt overeen met één vertaalproduct. De gegevens (figuur 1A) suggereren dat de AIM23Δ stam in staat is tot mitochondriale eiwitsynthese omdat alle producten die in de WT voorkomen zichtbaar zijn in deze mutant. De intensiteiten van de banden verschillen echter van de WT, wat betekent dat de verwijdering van AIM23 van invloed is op mitochondriale genexpressie8. Coomassie Brilliant Blue kleuring dient als laadcontrole.
De resulterende gegevens kunnen worden gekwantificeerd (figuur 1B) om verschillen tussen stammen of experimentele omstandigheden te identificeren met behulp van ImageJ10- of ImageQuant-software. Hiervoor worden de verhoudingen van het signaal die overeenkomen met elk product met het totale signaal berekend. Gemiddelde waarden en standaardafwijkingen worden berekend in ten minste drie onafhankelijke experimenten.
De kinetiek van gesynthetiseerde eiwitomzet wordt bestudeerd in een pulsachtervolgingsexperiment (figuur 1C). Monsters worden verzameld op de aangegeven tijdstipen nadat de etiketteringsreactie is gestopt door koude methionine en puromycine in stap 2.4. Deze controle is nodig om de stabiliteit van de producten te schatten, omdat de intensiteit van het signaal het resultaat is van twee tegenovergestelde processen: synthese van nieuwe ketens en eiwitafbraak. Immunostaining met anti-porine 1 antilichamen is een belastingscontrole.
Figuur 1: Representatieve radioactieve etikettering van gist mitochondriale vertaalproducten. (A) Tijdsverloop van 35S-methionine-integratie in mitochondriaal gesynthetiseerde eiwitten in levende gistcellen van WT- en AIM23Δ-stammen. Coomassie Brilliant Blue beitsen is een ladingsregeling. (B) Niveaus van mitochondriaal gecodeerde eiwitten na 5 minuten labelen met 35S-methionine. De relatieve expressie wordt genormaliseerd tot de totale expressie van mitochondriale gecodeerde eiwitgenen. Foutbalken geven de standaardafwijking van het gemiddelde van ten minste drie onafhankelijke experimenten aan. (C) Omzet van mitochondriale gesynthetiseerde eiwitten in wilde soorten en Aim23Δ stammen. De etikettering werd gestopt en de monsters werden verzameld op de aangegeven tijdstippen. Immunostaining met anti-porine 1 antilichaam is een belastingscontrole. (D) Suboptimaal experiment met oude 35S-methionine, radioautografie. Figuur 1A,B,C zijn aangepast van8 met kleine aanpassingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stam | Genotype |
| Wt | MATα mal |
| DOEL23Δ | MATα mal, DOEL23::KanMX4 |
Tabel 1. Genotypen van S. cerevisiae stammen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoeken naar genexpressie spelen een centrale rol in de moderne levenswetenschappen. Er zijn tal van methoden ontwikkeld die inzicht geven in dit complexe proces. Hier beschreven we de methode die toegang geeft tot eiwitbiosynthese in bakkersgist S. cerevisiae mitochondriën. Het wordt meestal toegepast om vertaalefficiënties van de mRNA's in mitochondriën van mutante giststam versus wild type te vergelijken om toegang te krijgen tot de gevolgen van de bestudeerde mutatie. Dit is een van de basisexperimenten die de onderzoekers uitvoeren wanneer ze de mitochondriale functie bestuderen van gistcellen met de mutatie die wordt voorgesteld om mitochondriën8,11,12,13te beïnvloeden . Het wordt vaak gecombineerd met de metingen van zuurstofverbruik en mitochondriaal membraanpotentieel. De informatie die het verstrekt, is echter niet voldoende om te onderscheiden welk stadium van genexpressie wordt beïnvloed. Een reeks aanvullende experimenten is nodig om het uit te zoeken. Ten eerste is een noordelijke vlek- of RT-qPCR-evaluatie van mitochondriale mRNA's nodig om de transcriptionele stap te beoordelen. Ten tweede moet een westerse vlek van totale eiwitextracten met specifieke antilichamen worden gedaan om het eiwitgehalte te beoordelen. Ten derde moet de puls van gelabelde 35S-methionine (heet) worden voortgezet met de toevoeging van ongelabelde (koude) methionine (chase) en moeten verschillende tijdspunten worden verzameld en geanalyseerd op de gel om de stabiliteit van de eiwitten te onderzoeken.
Nauwkeurige analyse van mitochondriale genexpressie met behulp van 35S-pulsetikettering vereist controlereacties, vooral wanneer de onderzoeker de ervaring mist om ermee om te gaan of met een nieuwe giststam of een mutant werkt. In deze gevallen is een goede negatieve controle een rho0 stam zonder mitochondriaal DNA. Het toont efficiënte cycloheximide remming van cytosolische vertaling en bevestigt dat het banderolleerpatroon mitochondriale vertalingspecifiek is. Als de rho0-stam niet beschikbaar is, raden we aan om chlooramfenicol samen met cycloheximide op te doen om alle eiwitsynthese te remmen om de efficiëntie van cycloheximide en de specificiteit van het banderolleerpatroon te bevestigen.
De dichtstbijzijnde wijziging van het protocol is de pulsachtervolging wanneer de cultuur in de shaker (stap 2.4) langer wordt geïncubeerd dan in het pulsexperiment wordt gesuggereerd (figuur 1C). Het wordt gebruikt om de omzet en stabiliteit van mitochondriale vertaalproducten te bestuderen. Er is nog een wijziging van de methode wanneer de radioactieve etikettering wordt uitgevoerd in organello, niet in vivo4. Het suggereert de isolatie van mitochondriën van gistcellen. Deze wijziging is sneller als bevroren mitochondriën eerder in aliquots werden opgeslagen. Een ander voordeel is de afwezigheid van cycloheximidebehandeling, die verschillende aspecten van het cellulaire metabolisme beïnvloedt. Isolatie van mitochondriën en vriesdooien kunnen echter de vertaalcomplexen in de organellen verstoren en een kunstmatig beeld geven. Een andere belangrijke wijziging van het protocol kan worden gedaan na de scheiding van mitochondriale vertaalproducten in polyacrylamidegel (stap 5). In plaats van Coomassie Brilliant Blue de gel te beitsen en te drogen, kan het eiwit door elektro-blotting worden overgebracht naar het nitrocellulosemembraan. Dit resulteert in sterkere en scherpere signalen. De belangrijkste reden is dat 35S vervalt door emissie van bètadeeltjes met een zeer korte penetratie, dus het signaal is gemakkelijk te screenen in deze aanpak. Elektroforetische omstandigheden kunnen ook worden aangepast om een betere resolutie te bieden. Een punt is om 6M ureum toe te voegen aan de gel, wat de scheiding van atp8 en atp914verbetert. Een andere manier is het gebruik van gradiënt 15%-20% gels.
Translationele profilering15 is de methode die wordt gebruikt om dieper in te gaan op de veranderingen van mitochondriale vertaling. In vergelijking met radioactieve etikettering maakt het het mogelijk om posities van mitochondriale ribosomen op het mRNA vast te stellen, waardoor het mogelijk is om de exacte stap (initiatie, verlenging of beëindiging) te vinden die wordt beïnvloed. Profilering is echter veel duurder, ingewikkelder en tijdrovender. Rationeel kan het worden gedaan na het experiment met labelcorporatie, niet omgekeerd. Onlangs is een nieuwe benadering van het monitoren van gist mitochondriale vertaling ontwikkeld16. Het vermijdt behandeling met cycloheximide, wat voordelig is omdat een dergelijke behandeling het cellulaire metabolisme en signaleringsroutes beïnvloedt. In plaats van radioactief gelabelde aminozuurincorporatie, maakt het gebruik van het inbrengen van een gerecodeerd gen voor supergevouwen GFP (sfGFP) in gist mitochondriaal genoom, dat directe meting van mitochondriale vertaling met behulp van flowcytometrie mogelijk maakt. De toepassing van deze aanpak vereist echter de speciale giststam met gemodificeerd mitochondriaal DNA dat sfGFP-coderingssequentie bevat, geplaatst tussen 5'- en 3'- flankerende sequenties van een bepaald mitochondriaal gen.
Het label-integratie-experiment bevat verschillende kritieke stappen, die niet kunnen worden aangetast in een succesvol experiment. Ten eerste moeten verse gistculturen worden gebruikt (stap 1.1). Het langer dan 1 maand op de borden houden van gisten wordt niet aanbevolen; anders kunnen ze zich onvoorspelbaar gedragen in deze test. Ten tweede moet de cycloheximide-oplossing vóór het experiment vers worden bereid en niet langer dan 1 week bevroren worden bewaard (stap 2.1). De oude oplossing verliest zijn vermogen om cytoplasmatische vertaling te remmen, wat resulteert in een volledig afwijkend bandpatroon in de radioautografie. Ten derde moet 35S-methionine vers en actief zijn (stap 2.2), anders zullen de intensiteiten van de banden zwak zijn (figuur 1D). Het gebruik van het reagens dat vier halve levens (4 x 87,4 dagen) heeft doorstaan, wordt niet aanbevolen. Vermijd het koken van de eiwitmonsters bij 95 °C zoals standaardmonstervoorbereidingsgidsen suggereren (stap 4.8), omdat mitochondriale eiwitten zeer hydrofoob zijn en vatbaar voor aggregatie.
Er zijn verschillende veelvoorkomende problemen die men kan ervaren bij het omgaan met deze methode. De eerste is de zwakke intensiteit van de banden op de radioautografie. Om het te repareren, zorg ervoor dat verse 35S-methionine wordt gebruikt, een voldoende hoeveelheid gistcellen wordt genomen en de eiwitten niet aggregeren in de zakken op de gel, die kunnen worden gecontroleerd door Coomassie-kleuring. Bewaar de gedroogde gel met het scherm maar liefst 3 dagen. Het tweede probleem is het onjuiste bandpatroon. Als het wordt aangetroffen, zorg er dan voor dat verse gistplaten en vers bereide cycloheximide worden gebruikt. Houd er rekening mee dat de relatieve intensiteiten van de banden sterk kunnen variëren in verschillende giststammen en elektroforeseomstandigheden. Het heeft weinig zin om de eiwitmoleculaire gewichtsladder op de gel te laden, omdat mitochondriale vertaalproducten nooit worden gescheiden op basis van hun moleculaire massa's in deze procedure omdat ze zeer hydrofoob zijn. Cox I (58 kDa) migreert dus sneller dan Var 1 (47 kDa). Afhankelijk van de bufferomstandigheden kunnen de eiwitten zelfs van positie wisselen met een van de buren. Het derde veel voorkomende probleem is het wazige beeld zonder scherpe banden waargenomen na Coomassie vlekken. Het duidt op de fouten in het gieten van de gel, onjuiste buffersamenstelling of afbraak van eiwitten in de monsters. Het wordt aanbevolen om nieuwe gelbuffers en lopende buffers voor te bereiden om de samenstelling en de pH-waarden zorgvuldig te controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Russische Stichting voor Fundamenteel Onderzoek, subsidienummer 18-29-07002. P.K. werd ondersteund door staatsopdracht van het Ministerie van Wetenschappen en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie, subsidienummer AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie, subsidienummer 075-15-2019-1659 (Programma van Kurchatov Center of Genome Research). Het werk werd gedeeltelijk gedaan aan de apparatuur die werd gekocht in het kader van het Moscow State University Program of Development. I.C., S.L., en M.V.B. werden bovendien ondersteund door moscow state university grant "Leading Scientific School Noah's Ark".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al.
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
