Summary
Bakers gjær mitokondrie genom koder åtte polypeptider. Målet med den nåværende protokollen er å merke dem alle og deretter visualisere dem som separate bånd.
Abstract
Mitokondrier er essensielle organeller av eukaryotiske celler som er i stand til aerob åndedrett. De inneholder sirkulært genom- og genuttrykksapparat. Et mitokondriegenom av bakerens gjær koder åtte proteiner: tre underenheter av cytokrom c oksidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheter av ATP syntase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhet av ubiquinol-cytokrom c oxidoreductase enzymet, cytokrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p. Formålet med metoden som er beskrevet her er å spesifikt merke disse proteinene med 35S metionin, skille dem ved elektroforese og visualisere signalene som diskrete bånd på skjermen. Prosedyren innebærer flere trinn. For det første dyrkes gjærceller i et galaktoseholdig medium til de når det sene logaritmiske vekststadiet. Deretter blokkerer cykloheximid behandling cytoplasmatisk oversettelse og tillater 35S metioninininkorporering bare i mitokondrieoversettelsesprodukter. Deretter ekstraheres alle proteiner fra gjærceller og separeres av polyakrylamid gelelektroforese. Til slutt tørkes gelen og inkuberes med lagringsfosforskjermen. Skjermen skannes på en fosforer som avslører båndene. Metoden kan brukes til å sammenligne biosyntesehastigheten til et enkelt polypeptid i mitokondriene til en mutert gjærstamme kontra villtypen, noe som er nyttig for å studere mitokondriegenuttrykksfeil. Denne protokollen gir verdifull informasjon om oversettelseshastigheten til alle gjær mitokondrie mRNAs. Det krever imidlertid flere kontroller og flere eksperimenter for å gjøre riktige konklusjoner.
Introduction
Mitokondrier er organeller dypt involvert i metabolismen av en eukaryotisk celle. Deres elektronoverføringskjede forsyner cellen med ATP, den viktigste energiske valutaen som brukes i flere biokjemiske veier. Dessuten er de involvert i apoptose, fettsyre og heme syntese, og andre prosesser. Dysfunksjon av mitokondrier er en velkjent kilde til menneskelig sykdom1. Det kan skyldes mutasjoner i kjernefysiske eller mitokondriegener som koder strukturelle eller regulatoriske komponenter i organeller2. Bakers gjær Saccharomyces cerevisiae er en utmerket modell organisme for å studere mitokondriegenuttrykk på grunn av flere grunner. For det første er genomet deres fullstendigsekvensert 3, godt kommentert, og en stor sum data er allerede tilgjengelig i litteraturen takket være den lange historien med undersøkelser utført med denne organismen. For det andre er manipulasjonene med deres kjernefysiske genom relativt raske og enkle på grunn av deres raske vekstrate og svært effektive homologe rekombinasjonssystem. For det tredje er bakerens gjær S. cerevisiae en av de få organismene som manipulasjonene med mitokondriegenomer utvikles for. Til slutt er bakerens gjær en aerobe-anaerobe fakultetsorganisme, som tillater isolasjon og studie av respiratoriske defekte mutanter, siden de kan vokse i medier som inneholder fermenterbare karbonkilder.
Vi beskriver metoden for å studere mitokondriegenuttrykk av bakergjær S. cerevisiae på translasjonelt nivå4. Hovedprinsippet kommer fra flere observasjoner. Først koder gjær mitokondriegenomet bare åtte proteiner: tre underenheter av cytokrom c oksidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheter av ATP syntase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhet av ubiquinol-cytokrom c oxidoreductase enzymet, cytokrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p5. Dette nummeret er lite, og alle kan skilles av elektroforese på en enkelt gel under de aktuelle forholdene. For det andre tilhører mitokondrie ribosomer den prokaryotiske klassen i stedet for eukaryotisk6, og derfor er følsomheten for antibiotika forskjellig for gjær cytoplasmatiske og mitokondrie ribosomer. Det tillater hemming av cytoplasmatisk oversettelse med cykloheximid, noe som gir forholdene når den merkede aminosyren (35S-metionin) bare innlemmes i mitokondrieoversettelsesprodukter. Som et resultat gir eksperimentet informasjon om frekvensen av aminosyreinkorporering i mitokondrieproteiner syntetisert de novo, noe som gjenspeiler den generelle effektiviteten av mitokondrieoversettelse for hvert av de åtte produktene
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gjær kultur forberedelse
- Strek gjær fra de frosne lagerkulturene på ferske plater med riktig medium. Sett platene i en kultur inkubator ved 30 °C i 24–48 timer.
MERK: La de temperaturfølsomme mutantene vokse ved den tillatte temperaturen. - Inokuler gjærkulturer i 2 ml YPGal medium (2% pepton, 1% gjærekstrakt, 2% galaktose) fra den friske streken i 15 ml rør og inkubere dem over natten agitating ved 200 rpm ved 30 ° C.
- Mål den optiske tettheten av kulturen med en bølgelengde på 600 nm (OD600).
- Ta volumet tilsvarende 0,2 absorbansenheter i sterile rør, pelletgjærceller ved 9000 x g i 30 s ved romtemperatur, og kast det overnaturlige.
- Vask celler med 0,5 ml sterilt vann ved å virvle i 5 s. Pellet gjærceller på 9000 x g for 30 s ved romtemperatur og kast supernatant. Fortynn celler i 2 ml ferskt YPGal medium.
- Inkubere agitating ved 200 o/min og 30 °C til OD600 når 1,5–1,9 verdier.
MERK: Gjærvekst varierer, så vær forberedt på å vente. Det er rimelig å gjøre trinn 1.3-1.6 tidlig om morgenen. Det tar vanligvis 4–5 timer, men kan ta lengre tid.
2. Radioaktiv isotop inkorporering
- Overfør kulturvolumet tilsvarende en optisk enhet i et mikrocentrifugerør. Spinn rørene på 3000 x g i 1 min og kast supernatanten. Vask med 0,5 ml sterilt vann ved å virvle i 5 s.
- Pellet gjærceller på 9000 x g for 30 s ved romtemperatur og kast supernatant. Resuspend gjærceller i 0,5 ml steril oversettelsesbuffer. Plasser suspensjonen i et 15 ml rør.
MERK: Oversettelsesbuffer er en løsning som inneholder 2 % galaktose (m/v) og 50 mM kaliumfosfat med pH 6.0.
- Pellet gjærceller på 9000 x g for 30 s ved romtemperatur og kast supernatant. Resuspend gjærceller i 0,5 ml steril oversettelsesbuffer. Plasser suspensjonen i et 15 ml rør.
- Tilsett cykloheximid til cellefjæring opp til en endelig konsentrasjon på 0,2 mg/ml. Inkuber i 5 min agitating ved 200 rpm og 30 °C for å hemme cytosolisk oversettelse.
MERK: Cycloheximide oppløsning (20 mg/ml, i etanol) bør tilberedes friskt før forsøket. Kloramfenikol kan med hell erstattes med anisomycin i samme konsentrasjon7. - Tilsett 25–30 μCi av 35S-metionin i cellesuspensjonen og inkuber i 30 min agitating ved 200 o/min og 30 °C.
MERK: Blandingen av 35S-metionin og 35S-cystein kan også brukes. Ren 35S-metionin resulterer i det sterkeste signalet og det beste signal-til-støy-forholdet. Generelt er metionin mer effektiv enn cystein fordi innholdet av denne aminosyren i mitokondrieproteiner er høyere. EasyTag-blandingen av 35S-metionin og cystein er imidlertid billigere og gir sammenlignbare resultater7.
FORSIKTIG: 35S-metionin er radioaktivt. Følg de vanlige sikkerhetspraksisene for håndtering av radioaktive materialer.
MERK: Det er velkjent at inkorporering av radioaktivitet når en grense som de totale signalene flater ut over tid. Når denne grensen er nådd, er det nesten umulig å bestemme prisene som de forskjellige oversettelsesproduktene syntetiseres. For å analysere frekvensen av mitokondrieoversettelse, er det viktig å være i en tilstand der signalintensiteten øker med inkubasjonstid med 35S-metionin på en lineær måte. For vanlige laboratoriet wild-type stammer er signalet allerede mettet for inkubasjonstider langt kortere enn 30 min. Translasjonelle mutanter kan oppføre seg veldig annerledes. Et tidsforsett bør utføres for å etablere kinetikken til radioaktivitetsinkorporering og dermed oversettelseshastigheten, i hvert fall når du arbeider med en ny belastning. For dette foreslår vi å ta prøver med et intervall på flere minutter (f.eks. 2,5, 5,0, 7,5, 10 og 20 min). - Tilsett umerket "kald" metionin (endelig konsentrasjon bør være 20 mM) og puromycin (endelig konsentrasjon bør være 1–10 μg/ml) for å stoppe merkingen. Inkuber i 10 min agitating ved 200 o/min og 30 °C.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å gi ribosomer tid til å fullføre oversettelsen av peptidene. Ellers vil alle polypeptider kortere enn full lengde bli oppdaget i en annen størrelse. Et tidsforløpet eksperiment (puls-chase) kan gjøres på dette trinnet for å bestemme stabiliteten av mitokondrie oversettelse produkter. For dette, fortsett inkubasjonen tar prøver med et intervall på 30 min (f.eks 30, 60, 90 og 120 min).
3. Gjær celle lysis og utvinning av proteiner
- Samle gjærceller ved sentrifugering på 9000 x g for 30 s. Vask cellene med 0,5 ml sterilt vann ved å virvle i 5 s. Pellet gjærceller ved 9000 x g for 30 s ved romtemperatur. Kast det overnaturlige.
Merk. Protokollen kan settes på pause her. Oppbevar prøvene ved -20 °C. - Tilsett 75 μL lysisbuffer til pellet og virvel i 5–10 s.
MERK: Lysis buffer er en løsning på 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoetanol og 1 mM PMSF i vann. Unngå overdreven inkubasjon med lysisbuffer som fører til alkalisk hydrolyse av proteiner. Fortsett umiddelbart til trinn 3.3. - Tilsett 500 μL på 0,5 M Tris-HCl buffer med pH 6,8. Vortex kort.
4. Utfelling av proteiner
FORSIKTIG: Metanol og kloroform er organiske løsemidler. Følg de vanlige sikkerhetspraksisene for håndtering av organiske stoffer.
- Tilsett 600 μL metanol i prøven. Vortex for 5 s.
- Tilsett 150 μL kloroform i prøven. Vortex for 5 s.
- Sentrifuge prøvene i 2 min ved 12.000 x g. Kast forsiktig den øvre fasen med en sampler.
- Tilsett 600 μL metanol i prøven. Bland forsiktig ved å snu røret flere ganger.
- Sentrifuge prøvene i 2 min ved 12.000 x g. Kast det overnaturlige.
- Lufttørk pelleten i 2 min ved 80 °C.
MERK: All væsken skal fordampe. Det er en risiko for å ha en avvikende separasjon av proteiner i gelen hvis pelleten ble tørket utilstrekkelig. Det er imidlertid ikke mulig å overtørke pelleten, så den kan til og med lagres over natten ved 4 °C. - Oppløs utfellingsproteiner i 60 μL à 1x Laemmli prøvebuffer.
- Varm i 10 min ved 40 °C.
MERK: Unngå å koke prøvene ved 95 °C, fordi dette fører til aggregering. Hvis aggregatene fortsatt dannes, spinn prøvene på 12 000 x g i 2 min og samle supernatanten. Prøver kan lagres ved -20 °C. Protokollen kan settes på pause her.
5. SDS-SIDE
- Cast 17,5% Laemmli SDS-polyakrylamidgelen.
MERK: 6 M urea kan legges til gelen for å løse bedre atp8 og atp9. Gradering 15%-20% geler kan også gi bedre oppløsning. - Legg 15 μL (40–50 μg) av hver prøve i lommene.
MERK: Det er ikke nødvendig å måle proteinkonsentrasjon hvis OD600-verdiene var nær i trinn 1.6. Hvis ikke, mål proteinkonsentrasjoner ved hjelp av analysen med vaskemiddelkompatible reagenser. - Kjør gelen i et kaldt rom til det blå fargestoffet når ca 65% av gellengden.
MERK: For systemet som brukes (f.eks. Protean II xi-celle), bruker vi en av de to modusene: 16–17 timer ved 5 V/cm eller 5 timer ved 15 V/cm. Ingen proteiner går raskere enn bromophenol blå fargestoff, men lange løp kan resultere i uskarphet av atp8 og atp9 signaler. - Beis gelen med Coomassie strålende blå og gjør en skanning eller et bilde, noe som kreves som en lastekontroll.
MERK: En alternativ måte å lage en lastekontroll på er immunoblotting med et antistoff mot mitokondriegen "hushold" , f.eks porin 1.
6. Autoradiografi
- Tørk gelen i en geltørker. Oppbevar den i kassetten med en oppbevaringsfosforskjerm i 3–5 dager.
MERK: Et alternativ til screening av den tørkede gelen er overføring av proteiner til en nitrocellulosemembran ved elektroblotting og screening deretter. Det resulterer i sterkere signaler og skarpere bånd. - Skann skjermen på en fosforer.
MERK: Som et alternativ til fosforavbildning kan røntgenfilm også brukes til å avsløre signalene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen beskrevet ovenfor, tildelte vi mitokondrieoversettelsesprodukter fra to S. cerevisiae stammer: vill type (WT) og en mutert lagersletting av AIM23 genet (AIM23Δ),koding mitokondrie oversettelse initiering faktor 3 (Tabell 1)8. Mitokondrieoversettelsesprodukter ble radioaktivt merket og separert i SDS-PAAG9. Prøvene ble samlet inn hver 2,5 min før metning for å bygge et tidskurs (figur 1A). Gelen ble farget, tørket og screenet etter 5-dagers utstilling (figur 1A).
I tilfelle av et vellykket eksperiment, viser bildet åtte bånd tildelt i henhold tilstandardmønsteret 4. Intensiteten av individuelle bånd kan imidlertid være svært variabel avhengig av belastningen og eksperimentelle forhold. Hvert bånd tilsvarer ett oversettelsesprodukt. Dataene (figur 1A) tyder på at AIM23Δ-stammen er i stand til mitokondrieproteinsyntese fordi alle produkter som vises i WT er synlige i denne mutanten. Intensitetene i bandene er imidlertid forskjellige fra WT, noe som betyr at sletting av AIM23 påvirker mitokondriegenuttrykk8. Coomassie Brilliant Blue farging fungerer som en lastekontroll.
De resulterende dataene kan kvantifiseres (figur 1B) for å identifisere forskjeller mellom stammer eller eksperimentelle forhold ved hjelp av ImageJ10- eller ImageQuant-programvaren. For dette beregnes forholdene til signalet som tilsvarer hvert produkt til det totale signalet. Gjennomsnittlige verdier og standardavvik beregnes i minst tre uavhengige eksperimenter.
Kinetikken til syntetisert proteinomsetning studeres i et pulsjakteksperiment (figur 1C). Prøver samles inn på de angitte tidspunktene etter at merkereaksjonen stoppes av kald metionin og puromycin i trinn 2.4. Denne kontrollen er nødvendig for å estimere stabiliteten til produktene fordi intensiteten av signalet er et resultat av to motsatte prosesser: syntese av nye kjeder og proteinnedbrytning. Immunstaining med anti-porin 1 antistoffer er en lastekontroll.
Figur 1: Representativ radioaktiv merking av gjær mitokondrieoversettelsesprodukter. (A)Tidsforløpet på 35S-metioninininkorporering i mitokondriesyntetiserte proteiner i levende gjærceller av WT- og AIM23Δ-stammer. Coomassie Brilliant Blue farging er en lastekontroll. (B) Nivåer av mitokondriekodede proteiner etter 5 min merking med 35S-metionin. Det relative uttrykket normaliseres til det totale uttrykket av mitokondriekodede proteingener. Feilfelt indikerer standardavviket for gjennomsnittet av minst tre uavhengige eksperimenter. (C) Omsetning av mitokondriesyntiserte proteiner i vill type og Aim23Δ stammer. Merkingen ble stoppet og prøvene ble samlet inn på de angitte tidspunktene. Immunstaining med anti-porin 1 antistoff er en lastekontroll. (D) Sub-optimal eksperiment med gamle 35S-metionin, radioautografi. Figur1A,B,C er tilpasset fra 8 med mindre modifikasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Belastning | Genotype |
| Wt | Matα mal |
| MÅL23Δ | MATα mal, AIM23::KanMX4 |
Tabell 1. Genotyper av S. cerevisiae stammer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøkelser av genuttrykk opptar en sentral rolle i moderne biovitenskap. Mange metoder som gir innsikt i denne komplekse prosessen er utviklet. Her beskrev vi metoden som tillater tilgang til proteinbiosyntese i bakerens gjær S. cerevisiae mitokondrier. Det brukes vanligvis til å sammenligne oversettelseseffektivitet av mRNAs i mitokondrier av mutert gjærstamme versus vill type for å få tilgang til konsekvensene av den studerte mutasjonen. Dette er et av de grunnleggende eksperimentene forskerne utfører når de studerer mitokondriefunksjonen til gjærceller som bærer mutasjonen foreslått å påvirke mitokondrier8,11,12,13. Det kombineres ofte med målinger av oksygenforbruk og mitokondriemembranpotensial. Informasjonen den gir er imidlertid ikke tilstrekkelig til å skille mellom hvilket stadium av genuttrykk som påvirkes. Et sett med flere eksperimenter er nødvendig for å finne det ut. Først er nordlig blot eller RT-qPCR evaluering av mitokondrie mRNAs nødvendig for å vurdere transkripsjonstrinnet. For det andre bør en vestlig flekk av totale proteinekstrakter med spesifikke antistoffer gjøres for å vurdere proteinnivået. For det tredje bør pulsen av merket 35S-metionin (varmt) fortsettes med tilsetning av umerket (kald) metionin (jage) og flere tidspunkter bør samles og analyseres på gelen for å undersøke stabiliteten til proteinene.
Nøyaktig analyse av mitokondriegenuttrykk ved hjelp av 35S pulsmerking krever kontrollreaksjoner, spesielt når forskeren mangler erfaringen med å håndtere det eller fungerer med en ny gjærstamme eller en mutant. I disse tilfellene er god negativ kontroll en rho0-stamme blottet for mitokondrie-DNA. Det viser effektiv cycloheximid hemming av cytosolisk oversettelse og bekrefter at banding mønsteret er mitokondrie oversettelse spesifikk. Hvis rho0-stammen ikke er tilgjengelig, foreslår vi at du inkluderer kloramfenikol sammen med cykloheximid for å hemme all proteinsyntese for å bekrefte cykloheximideffektivitet og spesifisitet av bandingmønsteret.
Den nærmeste endringen av protokollen er pulsjakten når kulturen inkuberes i shakeren (trinn 2.4) lenger enn foreslått i pulseksperimentet (figur 1C). Den brukes til å studere omsetning og stabilitet av mitokondrieoversettelsesprodukter. Det er en annen endring av metoden når den radioaktive merkingen er gjort i organello, ikke in vivo4. Det antyder isolering av mitokondrier fra gjærceller. Denne endringen er raskere hvis frosne mitokondrier tidligere var lager i aliquots. En annen fordel er fraværet av cycloheximide behandling, som påvirker ulike aspekter av cellulær metabolisme. Imidlertid kan isolering av mitokondrier og frysetine dem perturb oversettelseskompleksene i organeller som gir et kunstig bilde. En annen viktig endring av protokollen kan gjøres etter separasjon av mitokondrieoversettelsesprodukter i polyakrylamidgel (trinn 5). I stedet for Coomassie Brilliant Blue farging og tørking av gelen, kan proteinet overføres til nitrocellulosemembranen ved elektroblotting. Dette resulterer i sterkere og skarpere signaler. Hovedårsaken er at 35S forfaller ved utslipp av betapartikler med svært kort penetrasjon, slik at signalet lett screenes i denne tilnærmingen. Elektrofororetiske forhold kan også endres for å gi bedre oppløsning. Ett poeng er å legge til 6M urea i gelen, noe som forbedrer separasjonen av atp8 og atp914. En annen måte er å bruke gradering 15%-20% geler.
Translasjonellprofilering 15 er metoden som brukes til å dykke dypere inn i endringene i mitokondrieoversettelse. Sammenlignet med radioaktiv merking, tillater det å etablere posisjoner av mitokondrie ribosomer på mRNA, noe som gjør det mulig å finne det nøyaktige trinnet (initiering, forlengelse eller oppsigelse) som påvirkes. Profilering er imidlertid mye dyrere, komplisert og tidkrevende. Rasjonelt kan det gjøres etter etiketten inkorporering eksperiment, ikke vice versa. Nylig har en ny tilnærming til overvåking av gjær mitokondrieoversettelse blitt utviklet16. Det unngår behandling med cycloheximid, som er en fordel fordi slik behandling påvirker cellulær metabolisme og signalveier. I stedet for radioaktivt merket aminosyreinkorporering, benytter den innsetting av et omkodet gen for superfoldet GFP (sfGFP) i gjær mitokondriegenom, som tillater direkte måling av mitokondrieoversettelse ved hjelp av strømningscytometri. Imidlertid krever anvendelsen av denne tilnærmingen den spesielle gjærstammen med modifisert mitokondrie-DNA som inneholder sfGFP-kodesekvens plassert mellom 5'- og 3'- flankeringssekvenser av et bestemt mitokondriegen.
Etikettkorporeringseksperimentet inneholder flere kritiske trinn, som ikke kan kompromitteres i et vellykket eksperiment. Først bør friske gjærkulturer brukes (trinn 1.1). Å holde gjær på platene lenger enn 1 måned anbefales ikke; Ellers kan de oppføre seg uforutsigbart i denne analysen. For det andre bør cycloheximide-løsningen tilberedes frisk før forsøket og lagres frosset ikke lenger enn 1 uke (trinn 2.1). Den gamle løsningen mister sin evne til å hemme cytoplasmatisk oversettelse som resulterer i et helt avvikende båndmønster i radioautografien. For det tredje bør 35S-metionin være frisk og aktiv (trinn 2.2), ellers vil intensiteten av båndene være svake (figur 1D). Bruk av reagensen som passerte fire halveringsdager (4 x 87,4 dager) anbefales ikke. Unngå å koke proteinprøvene ved 95 °C, da standard prøveforberedelsesveiledninger foreslår (trinn 4.8) fordi mitokondrieproteiner er svært hydrofobe og utsatt for aggregering.
Det er flere vanlige problemer man kan oppleve å håndtere denne metoden. Den første er den svake intensiteten av bandene på radioautografien. For å fikse det, sørg for at fersk 35S-metionin brukes, en tilstrekkelig mengde gjærceller tas, og proteinene samler ikke i lommene på gelen, som kan kontrolleres av Coomassie farging. Hold den tørkede gelen med skjermen i ikke mindre enn 3 dager. Det andre problemet er feil båndmønster. Hvis det oppstår, sørg for at friske gjærplater og nylaget cykloheximid brukes. Husk at relative intensiteter av båndene kan variere i stor grad i forskjellige gjærstammer og elektroforeseforhold. Det er liten mening å laste proteinmolekylærvektsstigen på gelen siden mitokondrieoversettelsesprodukter aldri skilles i henhold til deres molekylære masser i denne prosedyren fordi de er svært hydrofobe. Dermed migrerer Cox I (58 kDa) raskere enn Var 1 (47 kDa). Avhengig av bufferforholdene kan proteinene til og med bytte posisjoner med en av naboene. Det tredje vanlige problemet er det uskarpe bildet uten skarpe bånd observert etter Coomassie farging. Det indikerer feilene i støping av gelen, feil buffersammensetning eller nedbrytning av proteiner i prøvene. Det anbefales å forberede nye gelbuffere og kjøre buffer nøye kontrollere sammensetningen og pH-verdiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av den russiske Stiftelsen for grunnleggende forskning, tilskudd nummer 18-29-07002. P.K. ble støttet av State Assignment of Ministry of Science and Higher Education i Russland, gi nummer AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. ble støttet av Departementet for vitenskap og høyere utdanning i Russland, tilskudd nummer 075-15-2019-1659 (Program for Kurchatov Center of Genome Research). Arbeidet ble delvis gjort på utstyret kjøpt i rammen av Moskva State University Program of Development. I.C., S.L., og M.V.B. ble i tillegg støttet av Moscow State University stipend "Leading Scientific School Noah's Ark".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al.
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
