Summary
在这里，我们提出了一种可重复的重症监护病房导向的大鼠内毒素模型。
Abstract
脓毒症和脓毒性休克仍然是重症监护病房的主要死因。尽管脓毒症管理有了显著改善，但死亡率仍在 20% 至 30% 之间。迫切需要新的治疗方法来减少脓毒症相关的多器官衰竭和死亡。强大的动物模型允许一种或多种治疗方法，以及测试它们对生理和分子参数的影响。在本文中，介绍了一个简单的动物模型。
首先，全身麻醉是通过使用挥发性或腹膜内麻醉在动物中诱导的。放置静脉导管（尾静脉）、气管切开术和插入动脉内导管（尾动脉）后，开始机械通气。记录平均动脉血压、动脉血氧饱和度和心率的基线值。
注射溶解在磷酸盐缓冲盐水中的脂多糖（1毫克/千克体重）通过toll样受体4诱导强烈且可重复的炎症反应。液体校正以及去甲肾上腺素的应用是根据完善的协议进行的。
本文中介绍的动物模型易于学习，并且强烈面向重症监护病房的临床脓毒症治疗，包括镇静，机械通气，连续血压监测和重复血液采样。此外，该模型是可靠的，允许根据动物研究的3R（减少，替换，精炼）原则，有限数量的动物提供可重复的数据。虽然脓毒症研究中的动物实验不能轻易被取代，但重复测量可以减少动物，并且保持脓毒性动物麻醉可以减轻痛苦。
Introduction
脓毒症及其更严重的形式，脓毒性休克，是感染基础上的综合征，导致细胞因子释放的过度炎症反应，导致生理和生化变化，免疫防御受到抑制，致命结果1，2。这种不平衡的炎症反应导致器官功能障碍和各种重要器官（如肺，肾和肝）的器官衰竭。脓毒症为 37%3，是患者入住重症监护病房 （ICU） 的最常见原因之一。脓毒症的死亡率目前约为20-30%4。早期和有效的抗生素治疗至关重要5.液体和血管加压药需要及早安装复苏，除此之外，治疗是纯粹的支持性6.
脓毒症被定义为已证实或疑似细菌、真菌、病毒或寄生虫感染，伴有器官功能障碍。当进一步的心血管衰竭对单独液体治疗无反应，并且存在超过 2 毫摩尔/升的乳酸水平时，符合脓毒性休克标准2。脓毒症相关器官衰竭可能发生在任何器官中，但在心血管系统、大脑、肾脏、肝脏和肺部非常常见。大多数脓毒症患者需要气管插管，以保护患者的气道，防止误吸，并使用高比例的吸入氧气进行呼气末正向通气，以防止或克服缺氧。为了耐受气管插管和机械通气，患者通常需要镇静。
内毒素，如脂多糖（LPS）作为革兰氏阴性菌膜的组分，通过toll样受体（TLR）诱导强烈的炎症反应47。激活定义的途径可确保稳定的炎症反应。细胞因子诱导的中性粒细胞化学牵伸缩蛋白1（CINC-1），单核细胞化学吸引蛋白1（MCP-1）和白细胞介素6（IL-6）等细胞因子在该模型8中被称为严重程度和结局的预后因素。静脉注射LPS应用已成功用于研究大鼠脓毒症的各个方面8，9。
脓毒症的治疗仍然是一个挑战，特别是由于缺乏预测性动物模型。如果内毒素血症伴全身炎症的激活是开发药物治疗的充分模型是值得商榷的。然而，通过众所周知的LPS诱导TLR 4通路可以获得重要的知识。
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Protocol
该协议中提出的所有实验均已获得瑞士苏黎世州兽医局的批准（批准号134/2014和ZH088/19）。此外，本实验中执行的所有步骤均符合瑞士医学科学院（SAMS）的《动物实验指南》和欧洲实验动物科学协会联合会（FELASA）的指南。
1. 麻醉诱导和动物监测
- 在没有病原体的条件下将体重为250-300克（g）的雄性Wistar大鼠保存在通风笼中。在22±1°C的环境温度下提供12-12小时的光/暗循环，并自由获取食物和水。
- 通过在麻醉诱导盒中用异氟醚（浓度为3-5%）进行挥发性诱导来诱导全身麻醉30秒（图1A），或者通过单次注射氯胺酮/甲苯噻嗪（每100g体重10/1毫克（mg））诱导麻醉。
- 在整个实验过程中，将动物转移到工作场所，并将动物放在加热垫上。保持体温在36.5至37°C之间。
- 使用鼻锥提供氧气（600毫升/分钟）。如果选择挥发性麻醉进行麻醉维持，则添加异氟醚2-3%。确保动物自发呼吸。
- 在安装气管切开术以及动脉和静脉导管之前，通过无脚趾夹反射来确认麻醉水平。
- 通过外周血氧饱和度监测（正常血氧饱和度98 - 100%）验证足够的氧合。
- 使用软膏（维生素A软膏）来保护眼睛。
- 在边桌上准备无菌手术器械和导管，如图 1B所示。
- 此外，准备压力和血氧饱和度监测，如图 1C所示。
2. 静脉通路
- 在大鼠的近端尾巴上施加止血带以促进静脉通路（图2A）。
- 用酒精对尾巴进行3次消毒。
- 将 G26 静脉导管引导至两条侧尾静脉之一。
注意：根据我们的经验，将静脉通路放置在大鼠尾巴的远端部分更容易，因为这里的静脉位于更靠近皮肤的位置。此外，在插管失败的情况下，有足够的空间向近端移动。 - 严禁空气喷射。
- 放置静脉导管后解开止血带。
- 用胶带将静脉导管固定到位（图2B）。
- 将注射泵连接到静脉通路，以实现连续的液体和药物应用。
- 使用 3 通旋塞阀进行推注液、药物应用和静脉血取样。
3. 气管切开术
- 剃除动物的前颈部区域。
- 用提供酮碘溶液对剃须后的皮肤进行3次消毒。
- 使用手术刀（刀片编号为10）进行约2厘米的纵向切口。
- 用2-0条丝线缩回皮肤。
- 用手术剪刀钝化准备喉部和气管（图3A）。
- 确保在第3-5个 气管扣处用手术微剪刀打开气管。
- 将无菌气管插管插入气管。小心，不要将套管插入太深，以避免单侧通气。
- 使用2-0丝缝线将套管固定到位。
- 将套管连接到呼吸机以进行压力或容量控制通气（图3B）。
4. 动脉通路
- 用聚维酮 - 碘溶液对大鼠尾巴进行3次消毒。
- 使用手术刀（刀片编号为10）在腹侧纵向约1厘米处切开皮肤。
- 小心，不要切得太深，以免尾动脉受伤。
- 使用手术显微镜仔细暴露动脉。用手术微剪刀切开动脉周围的筋膜。
- 使用6-0丝缝合线连接动脉的远端部分。
- 准备近端6-0丝缝线，但不要收紧丝（图4A）。
- 将G-26导管引入远端和近端丝绸缝合线之间的动脉中。
- 一旦导管进入动脉，收紧近端丝缝合线并将导管固定到位（图4B）。
- 将导管连接到压力传感器以提供连续的动脉压测量（正常平均动脉压：60 - 100 mmHg）（图4C）。
- 此外，在连接到压力传感器的导管和G-26导管之间放置一个3通旋塞阀，用于动脉血液采样。
5. 基线测量、脓毒症诱导和随访测量
- 动物达到稳定状态后，注射LPS。
- 达到稳定状态时收集血液样本（通常在15-30分钟后）。
- 用Ringer溶液以1：4的比例替换血液样品中的液体损失。
- 要诱发脓毒症，将 LPS 作为推注或连续 LPS 应用注射。
- 对于推注应用，以1mg / mL的浓度注射1mg LPS / kg体重（kg）溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
- 对于连续应用，使用注射泵在整个实验过程中注入300μgLPS / kg /小时（LPS储备溶液：PBS中的1mg / mL）。
- 始终避免空气注射，以防止空气栓塞。
- 在设置实验之前，定义补液方案、血管收缩剂应用方案和流产标准（例如，低血压定义为尽管补液后平均动脉血压低于 50 mmHg 且持续 30 分钟以上）。
注意：我们建议以10 mL / kg /小时的速率连续输注Ringer溶液。 - 从输注量中减去任何连续施用的液体（例如，用于连续LPS应用），以使结果与对照组的结果相当。
注意：在实验结束时，在收获任何器官（如肝脏，肾脏或脾脏）以进行进一步分析（例如组织学或生化检查）之前，可以通过下腔静脉的切口对动物实施安乐死。推荐的安乐死方法是在下腔静脉切口和将冰冷的生理盐水注射到左心之前将动物带到麻醉的手术平面，特别是如果要评估器官中的炎症标志物。确保遵守法律要求和当地准则。为了验证脓毒症相关的器官衰竭，可以分析半胱天冬酶-3等促凋亡标志物以及α1-微球蛋白以验证肾脏中的肾小管损伤。CINC-1、MCP-1 和 IL-6 等标志物的器官特异性分析也可能提供有关器官特异性炎症反应的信息。
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Representative Results
所提出的系统允许血流动力学稳定动物的内毒素血症，如先前报道的9。虽然在有LPS刺激和没有LPS刺激的动物中，平均动脉压保持稳定，LPS处理的动物会出现脓毒症的特征，例如阴性碱过量和通过血浆细胞因子（应用后6小时）测量的强烈炎症反应，例如CINC-1（867 ng / mL），MCP-1（5027 ng / mL）和IL-6（867 ng / mL）8， 图 5.
图1：设备准备： 麻醉诱导箱和用于麻醉/氧气应用的鼻锥（A）。手术前要准备的无菌材料：26G静脉导管，刀片编号为10的手术刀，弯曲的镊子，直镊子，1个针座，2-0和6-0丝扎带，q-尖端，手术剪刀，手术微剪刀（B）。监测设备：使用压力传感器和外周氧饱和度（SpO2）传感器进行麻醉监测，用于连续监测（C）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：静脉通路： 将止血带施加到近端大鼠的尾巴（A）。静脉通路应引入尾部远端并固定到位（B）。应严格避免空气栓塞。 请点击此处查看此图的大图。
图3：气管切开术： 喉部和气管使用手术剪刀钝化制备，并使用2-0丝缝线（A）暴露。在第3-5个 气管扣处使用手术微剪刀打开气管后，引入气管套管，固定放置并连接到呼吸机（B） 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：动脉通路： 使用手术刀和手术微剪刀手术暴露尾动脉后，收紧远端丝6-0结扎，并制备近端结扎（A）。将G-26导管插入动脉后，将其固定到位（B）。动脉导管允许重复取血以及连续血压监测（C）。 请点击此处查看此图的大图。
图5：代表性结果： 虽然动物在LPS和假组（A）中保持血流动力学稳定，但它们发展为内毒素血症的特征，例如负碱过量（B）和增加的炎症介质，例如细胞因子诱导的中性粒细胞化学牵伸蛋白1（CINC-1）（C），单核细胞化学吸引蛋白1（MCP-1）（D）和白细胞介素6（IL-6）（E）。该图经威科Kluwer Health Inc.，Beck-Schimmer等人，Eur J Anaesthesiol 2017许可转载;34：764-7759. 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里描述的方案允许高度可重复，但简单易学的败血症模型，可以根据研究问题进行调整。可以连续收集涉及器官功能的基本体内数据，例如心率，血压和外周动脉血氧饱和度，并且可以在整个实验过程中重复进行血液采样。此外，可以安装有关液体置换方案和血管加压药支持的修改。鉴于动物的血流动力学稳定性，实验可以在几个小时内进行，如先前报道的8。
必须指出的是，必须选择适当的脓毒症模型才能回答特定的研究问题10，11。所有脓毒症模型都有其优点，但也有其缺点。在当前的文章中，提出了一种内毒素血症模型，该模型诱发了强烈但无菌的炎症。脓毒症的关键特征，如发生强烈的炎症反应12，内皮功能障碍和损伤13 以及多器官衰竭14 存在。因此，所提出的模型符合“临床前脓毒症研究国际专家共识”先前发表的动物脓毒症模型定义15。其他关键因素可能与细菌性脓毒症不同。例如，LPS推注应用诱导低动态心血管反应16，这与在人类脓毒症中观察到的高动力学反应不对应。然而，后者可能是由连续的LPS输注引起的，正如目前的第16条所建议的那样。必须考虑的是，LPS仅代表一种毒素，并且对于某些研究问题可能被过度简化 - 另一方面，简化增加了数据的可重复性。内毒素血症模型的另一个特征是与细菌模型相比具有不同的细胞因子反应 - 内毒素血症诱导更高，但持续时间更短的细胞因子升高10。虽然该模型可以在几个小时内重复测量，但气管造口术对于生存实验来说并不理想。在生存实验的情况下，气管插管或通过面罩自主呼吸可能是首选。
目前在实验室脓毒症研究中应用了三类根本不同的脓毒症模型：毒血症模型（例如LPS），细菌感染模型（例如，静脉内大肠杆菌）和宿主屏障破坏模型（例如，盲肠结扎和穿刺，CLP）17。即使LPS的毒血症模型被提议作为复制人类脓毒症15的不适当模型，也必须强调的是，这些基本类别的脓毒症模型的特征已被详细描述8，12，13，14 ，并在最近的一篇文章中进行了批判性审查17。
对于人道动物实验是什么，没有最终的答案，但最常识的是3R原理，根据他们的定义，动物实验应该减少，替换和改进18。虽然在脓毒症研究中，动物实验的替代是困难的，但重复的血液采样和重要数据的连续测量可能会减少所需的动物数量。此外，保持化粪池动物麻醉可以改善实验设置，因为动物的痛苦减少了。
总之，我们提出了一个表征良好且可重复的内毒素血症模型，该设置类似于重症监护病房，有可能产生高数据密度，同时限制动物负担。此外，该模型可以根据需要回答的研究问题轻松修改。
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Disclosures
作者对所提出的研究没有利益冲突。Martin Schläpfer提交了一项专利，以减轻手术和/或麻醉对使用医用气体的患者的负面影响，特别是氧气（O2）和二氧化碳（CO2）。他获得了瑞典Sedana Medical和瑞士罗氏的无限制研究资助，与这项工作无关。
Acknowledgments
作者要感谢Beatrice Beck-Schimmer（医学博士）和Erik Schadde（医学博士）的批判性检查和他们对本手稿的宝贵贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | K833 | Standard surgical |
| 26 intravenous catheter | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 391349 | Standard anesthesia equipment |
| 6-0 LOOK black braided silk | Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA | SP114 | Standard surgical |
| Alaris Syringe Pump | Bencton Dickinson | ||
| Betadine | Mundipharma, Basel, Switzerland | 7.68034E+12 | GTIN-number |
| Curved fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 504513 | Facilitates vascular preparation |
| Fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 501976 | Tips need to be polished regularly |
| Infinity Delta XL Anesthesia monitoring | Draeger, Lübeck, Germany | ||
| Isoflurane, 250 mL bottles | Attane, Piramal, Mumbai, India | LDNI 22098 | Standard vet. equipment |
| Ketamine (Ketalar) | Pfitzer, New York, NY | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5 | Sigma, Buchs, Switzerland | ||
| Q-tips small | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | EH11.1 | Standard surgical |
| Ringerfundin | Bbraun, Melsungen, Germany | ||
| Tec-3 Isofluorane Vaporizer | Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL | not available anymore | Standard vet. equipment |
| Xylazine (Xylazin Streuli) | Streuli AG, Uznach, Switzerland |
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