Summary
Aquí, presentamos un modelo de endotoxina reproducible orientado a la unidad de cuidados intensivos en ratas.
Abstract
La sepsis y el shock séptico siguen siendo la principal causa de muerte en las unidades de cuidados intensivos. A pesar de las mejoras significativas en el manejo de la sepsis, la mortalidad todavía oscila entre el 20 y el 30%. Se necesitan urgentemente nuevos enfoques de tratamiento para reducir la insuficiencia multiorgánica relacionada con la sepsis y la muerte. Los modelos animales robustos permiten uno o múltiples enfoques de tratamiento, así como probar su efecto sobre los parámetros fisiológicos y moleculares. En este artículo, se presenta un modelo animal simple.
En primer lugar, la anestesia general se induce en animales, ya sea con el uso de anestesia volátil o intraperitoneal. Después de la colocación de un catéter intravenoso (vena de la cola), la traqueostomía y la inserción de un catéter intraarterial (arteria de la cola), se inicia la ventilación mecánica. Se registran los valores basales de la presión arterial media, la saturación de oxígeno en sangre arterial y la frecuencia cardíaca.
La inyección de lipopolisacáridos (1 miligramo/kilogramo de peso corporal) disueltos en solución salina tamponada con fosfato induce una respuesta inflamatoria fuerte y reproducible a través del receptor tipo toll 4. Las correcciones de líquidos, así como la aplicación de norepinefrina se realizan en base a protocolos bien establecidos.
El modelo animal presentado en este artículo es fácil de aprender y está fuertemente orientado hacia el tratamiento clínico de la sepsis en una unidad de cuidados intensivos con sedación, ventilación mecánica, monitoreo continuo de la presión arterial y muestreo de sangre repetitivo. Además, el modelo es confiable, lo que permite datos reproducibles con un número limitado de animales de acuerdo con los principios 3R (reducir, reemplazar, refinar) de la investigación con animales. Si bien los experimentos con animales en la investigación de la sepsis no se pueden reemplazar fácilmente, las mediciones repetitivas permiten una reducción de los animales y mantener a los animales sépticos anestesiados disminuye el sufrimiento.
Introduction
La sepsis y su forma más grave, el shock séptico, son síndromes en el terreno de una infección, lo que resulta en una reacción inflamatoria excesiva con la liberación de citoquinas, lo que lleva a cambios fisiológicos y bioquímicos con una defensa inmune suprimida y resultados fatales 1,2. Esta reacción inflamatoria desequilibrada resulta en disfunción orgánica e insuficiencia orgánica en varios órganos vitales como el pulmón, el riñón y el hígado. Con un 37%3, la sepsis es una de las razones más comunes para que un paciente sea ingresado en una unidad de cuidados intensivos (UCI). La mortalidad por sepsis oscila actualmente en torno al 20-30%4. El tratamiento antibiótico temprano y eficaz es de suma importancia5. La reanimación con líquidos y vasopresores debe instalarse temprano, aparte de eso, el tratamiento es puramente de apoyo6.
La sepsis se define como una infección comprobada o sospechada con bacterias, hongos, virus o parásitos, que se acompaña de disfunción orgánica. Los criterios de shock séptico se cumplen cuando un colapso cardiovascular adicional no responde solo al tratamiento con líquidos, y un nivel de lactato de más de 2 milimoles / litro está presente2. La insuficiencia orgánica relacionada con la sepsis puede ocurrir en cualquier órgano, pero es muy común en el sistema cardiovascular, el cerebro, el riñón, el hígado y el pulmón. La mayoría de los pacientes que sufren de sepsis requieren intubación endotraqueal para asegurar las vías respiratorias del paciente, para protegerse de la aspiración y para aplicar ventilación espiratoria final positiva con una alta fracción de oxígeno inspirado para prevenir o superar la hipoxia. Para tolerar un tubo traqueal y ventilación mecánica, los pacientes generalmente requieren sedación.
Las endotoxinas, como los lipopolisacáridos (LPS) como componente de la membrana de las bacterias gramnegativas inducen una fuerte reacción inflamatoria a través del receptor tipo toll (TLR) 47. La activación de una vía definida asegura una reacción inflamatoria estable. Las citoquinas como la proteína quimioatrayente de neutrófilos inducida por citoquinas 1 (CINC-1), la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1) y la interleucina 6 (IL-6) se conocen como factores pronósticos de gravedad y resultado en este modelo8. La aplicación intravenosa de LPS se ha utilizado con éxito para estudiar diversos aspectos de la sepsis en ratas 8,9.
El tratamiento de la sepsis sigue siendo un desafío, particularmente debido a la falta de modelos animales predictivos. Si la endotoxemia con activación de la inflamación sistémica es un modelo adecuado para el desarrollo de terapias farmacológicas es discutible. Sin embargo, con la conocida vía TLR 4 inducida por LPS se puede obtener un conocimiento importante.
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Protocol
Todos los experimentos presentados en este protocolo fueron aprobados por las Autoridades Veterinarias del Cantón de Zúrich, Suiza (números de aprobación 134/2014 y ZH088/19). Además, todos los pasos realizados en este experimento estuvieron de acuerdo con las Directrices sobre Experimentos con Animales de la Academia Suiza de Ciencias Mediales (SAMS) y las Directrices de la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencia de Animales de Laboratorio (FELASA).
1. Inducción de anestesia y monitoreo de animales
- Mantenga a las ratas Wistar macho con un peso de 250-300 gramos (g) en jaulas ventiladas en condiciones libres de patógenos. Proporcionar un ciclo de luz/oscuridad de 12-12 horas a una temperatura ambiente de 22 ± 1 °C, y acceso gratuito a alimentos y agua.
- Inducir anestesia general ya sea por inducción volátil con isoflurano (concentración de 3-5%) en una caja de inducción de anestesia durante 30 segundos (Figura 1A) o alternativamente, inducir anestesia con una inyección de una sola inyección de ketamina/xilazina (10/1 miligramo (mg) por 100 g de peso corporal).
- Transfiera al animal a un lugar de trabajo y colóquelo en una estera calefactora durante todo el experimento. Mantenga la temperatura corporal entre 36,5 y 37 °C.
- Use una nariz para proporcionar oxígeno (600 ml/minuto). Agregue isoflurano 2-3% si se eligió anestesia volátil para el mantenimiento de la anestesia. Asegúrese de que el animal esté respirando espontáneamente.
- Confirmar el nivel de anestesia por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie antes de la instalación de la traqueostomía y los catéteres arteriales y venosos.
- Verificar una oxigenación suficiente mediante el monitoreo de saturación periférica de oxígeno (saturación normal de oxígeno 98 - 100%).
- Use un ungüento (ungüento de vitamina A) para proteger los ojos.
- Prepare instrumentos quirúrgicos estériles y catéteres en una mesa auxiliar como se muestra en la Figura 1B.
- Además, prepare el monitoreo de presión y saturación de oxígeno como se muestra en la Figura 1C.
2. Acceso intravenoso
- Aplicar un torniquete en la cola proximal de la rata para facilitar el acceso venoso (Figura 2A).
- Desinfectar la cola 3 veces con alcohol.
- Inducir un catéter intravenoso G26 en una de las dos venas laterales de la cola.
NOTA: Desde nuestra experiencia es más fácil colocar el acceso intravenoso en la parte distal de la cola de la rata, porque la vena aquí se encuentra más cerca de la piel. Además, en caso de una canulación fallida, hay suficiente espacio para moverse proximalmente. - Evite estrictamente la inyección de aire.
- Desatar el torniquete después de colocar el catéter intravenoso.
- Fije el catéter intravenoso en su lugar con cinta adhesiva (Figura 2B).
- Conecte las bombas de jeringa al acceso intravenoso para la aplicación continua de líquidos y medicamentos.
- Use llaves de paso de 3 vías para el líquido en bolo, la aplicación de medicamentos y la toma de muestras de sangre venosa.
3. Traqueostomía
- Afeitar el área anterior del cuello del animal.
- Desinfecte la piel afeitada 3 veces con solución de providone-yodo.
- Realice una incisión longitudinal de alrededor de 2 cm con un bisturí (con una cuchilla número 10).
- Retraiga la piel con 2-0 suturas de seda.
- Preparar sin rodeos la laringe y la tráquea con tijeras quirúrgicas (Figura 3A).
- Asegúrese de abrir la tráquea con micro tijeras quirúrgicas en el 3-5º cierre traqueal.
- Inserte una cánula traqueal estéril en la tráquea. Tenga cuidado, no inserte la cánula demasiado profundamente para evitar la ventilación unilateral.
- Fije la cánula en su lugar con una sutura de seda 2-0.
- Conecte la cánula a un ventilador para ventilación por presión o volumen controlado (Figura 3B).
4. Acceso arterial
- Desinfecte la cola de la rata 3 veces con solución de povidona yodada.
- Cortar la piel con un bisturí (con una cuchilla número 10) alrededor de 1 cm longitudinalmente en el lado ventral.
- Tenga cuidado, no corte demasiado profundamente para evitar una lesión de la arteria de la cola.
- Use un microscopio quirúrgico para exponer la arteria con cuidado. Corte la fascia que rodea la arteria con micro tijeras quirúrgicas.
- Ligar la parte distal de la arteria usando una sutura de seda 6-0.
- Prepare una sutura de seda proximal 6-0, pero no apriete la seda (Figura 4A).
- Introduzca un catéter G-26 en la arteria entre la sutura de seda distal y proximal.
- Una vez que el catéter esté en la arteria, apriete la sutura de seda proximal y fije el catéter en su lugar (Figura 4B).
- Conecte el catéter a un transductor de presión para proporcionar una medición continua de la presión arterial (presión arterial media normal: 60 - 100 mmHg) (Figura 4C).
- Además, coloque una llave de paso de 3 vías entre el catéter conectado al transductor de presión y el catéter G-26 para la toma de muestras de sangre arterial.
5. Medición basal, inducción de sepsis y mediciones de seguimiento
- Después de que el animal alcanzó un estado estacionario, inyecte el LPS.
- Recolectar muestras de sangre cuando se alcanza un estado estacionario (generalmente después de 15-30 minutos).
- Reemplace la pérdida de líquido de las muestras de sangre por la solución de Ringer en una proporción de 1: 4.
- Para inducir sepsis, inyecte el LPS como un bolo o como una aplicación continua de LPS.
- Para la aplicación en bolo, inyecte 1 mg de LPS/kilogramo de peso corporal (kg) disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 1 mg/ml.
- Para una aplicación continua, inyecte 300 μg de LPS/kg/hora durante todo el experimento utilizando una bomba de jeringa (solución madre de LPS: 1 mg/ml en PBS).
- Evite la inyección de aire en todo momento para evitar la embolia aérea.
- Definir protocolos de reemplazo de líquidos, protocolos de aplicación de vasoconstrictores y criterios de aborto (por ejemplo, hipotensión definida como una presión arterial media por debajo de 50 mmHg durante más de 30 minutos a pesar del reemplazo de líquidos) antes de configurar el experimento.
NOTA: Sugerimos una infusión continua de la solución de Ringer a una velocidad de 10 ml/kg/hora. - Reste cualquier administración continua de fluidos (por ejemplo, para la aplicación continua de LPS) de la cantidad infundida para que los resultados sean comparables con los de los grupos de control.
NOTA: Al final del experimento, y antes de extraer cualquier órgano como el hígado, el riñón o el bazo para análisis adicionales, como el examen histológico o bioquímico, los animales pueden ser sacrificados mediante una incisión de la vena cava inferior. El método recomendado de eutanasia es llevar a los animales a un plano quirúrgico de anestesia antes de la incisión de la vena cava inferior y la inyección de solución salina helada en el corazón izquierdo, especialmente si se van a evaluar marcadores inflamatorios en los órganos. Asegúrese de cumplir con los requisitos legales y las pautas locales. Para verificar la insuficiencia orgánica relacionada con la sepsis, se puede analizar el marcador pro-apoptosis como la caspasa-3, así como la α1-microglobulina para verificar el daño tubular en los riñones. El análisis específico de órganos de marcadores como CINC-1, MCP-1 e IL-6 también puede proporcionar información sobre la respuesta inflamatoria específica del órgano.
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Representative Results
El sistema presentado permite la endotoxemia con animales hemodinámicamente estables como se informó anteriormente9. Mientras que la presión arterial media se mantiene estable en animales con y sin estimulación lpS LPS los animales tratados desarrollan características de sepsis como un exceso de base negativa y una fuerte reacción inflamatoria medida por citoquinas plasmáticas (6 horas después de la aplicación) como CINC-1 (867 ng / mL), MCP-1 (5027 ng / mL) e IL-6 (867 ng / mL)8, Figura 5.
Figura 1: Preparación del equipo: Caja de inducción de anestesia y nosecone para aplicación de anestesia/oxígeno (A). Material estéril a preparar previa cirugía: catéteres intravenosos 26G, bisturí con hoja número 10, pinzas curvas, pinzas rectas, 1 portaagujas, corbatas de seda 2-0 y 6-0, q-tips, tijeras quirúrgicas, microscisivos quirúrgicos (B). Equipo de monitorización: Monitorización de anestesia con transductor de presión y sensor de saturación de oxigenación periférica (SpO2) para monitorización continua (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Acceso venoso: Se aplica un torniquete a la cola de la rata proximal (A). El acceso venoso debe introducirse en la parte distal de la cola y fijarse en su lugar (B). La embolia aérea debe evitarse estrictamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Traqueostomía: La laringe y la tráquea se preparan sin rodeos con tijeras quirúrgicas y se exponen con suturas de seda 2-0 (A). Después de abrir la tráquea con micro tijeras quirúrgicas en el 3-5º cierre traqueal, se introduce una cánula traqueal, se fija en su lugar y se conecta a un ventilador (B) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Acceso arterial: Después de la exposición quirúrgica de la arteria de la cola con un bisturí y micro tijeras quirúrgicas, se aprieta una ligadura distal de seda 6-0 y se prepara una ligadura proximal (A). Después de la inserción del catéter G-26 en la arteria, se fija en su lugar (B). El catéter arterial permite la toma de muestras de sangre repetitivas, así como el monitoreo continuo de la presión arterial (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos: Mientras que los animales permanecen hemodinámicamente estables en el LPS, así como en el grupo simulado (A), desarrollan características de endotoxemia como un exceso de base negativo (B) y un aumento de mediadores inflamatorios como la proteína quimioatrayente de neutrófilos inducida por citoquinas 1 (CINC-1) (C), la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1) (D) y la interleucina 6 (IL-6) (E). La figura se reproduce con permiso de Wolters Kluwer Health Inc., Beck-Schimmer et al, Eur J Anaesthesiol 2017; 34:764-7759. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito aquí permite un modelo de sepsis altamente reproducible, pero fácil de aprender, que se puede adaptar de acuerdo con la pregunta de investigación. Los datos esenciales in vivo que se refieren a la función de los órganos, como la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la saturación de oxígeno arterial periférica, se pueden recopilar continuamente, y el muestreo de sangre se puede realizar repetidamente a lo largo del experimento. Además, se pueden instalar modificaciones con respecto a los protocolos de reemplazo de fluidos y el soporte de vasopresores. Dada la estabilidad hemodinámica de los animales, los experimentos se pueden llevar a cabo durante varias horas, como se informó anteriormente8.
Hay que señalar que se debe elegir un modelo de sepsis adecuado para responder a una pregunta de investigación específica10,11. Todos los modelos de sepsis tienen sus ventajas, pero también sus inconvenientes. En el presente artículo, se presenta un modelo de endotoxemia, que induce una inflamación fuerte, pero estéril. Las características clave de la sepsis, como el desarrollo de una fuerte respuesta inflamatoria12, la disfunción endotelial y el daño13 y la insuficiencia multiorgánica14 están presentes. Por lo tanto, el modelo presentado está de acuerdo con la definición previamente publicada de modelos de sepsis en animales por el "International Expert Consensus for Pre-Clinical Sepsis Studies"15. Otros elementos clave pueden ser diferentes que en la sepsis bacteriana. La aplicación en bolo LPS, por ejemplo, induce una respuesta cardiovascular hipodinámica16, que no se corresponde con la respuesta hiperdinámica observada en la sepsis humana. Este último, sin embargo, puede ser inducido por una infusión continua de LPS, como también se sugiere en el actual artículo16. Hay que tener en cuenta que el LPS solo representa una toxina y puede simplificarse en exceso para ciertas preguntas de investigación; por otro lado, la simplificación aumenta la reproducibilidad de los datos. Otra característica de los modelos de endotoxemia es una respuesta de citoquinas diferente en comparación con los modelos bacterianos: la endotoxemia induce elevaciones de citoquinas más altas, pero de menor duración10. Aunque, el modelo permite mediciones repetitivas durante varias horas, la traqueostomía no es ideal para experimentos de supervivencia. En caso de experimentos de supervivencia, se puede preferir la intubación traqueal o la respiración espontánea a través de una máscara.
Actualmente se aplican tres clases fundamentalmente diferentes de modelos de sepsis en la investigación de sepsis de laboratorio: modelos de toxemia (por ejemplo, LPS), modelos de infección bacteriana (por ejemplo, Escherichia coli intravenosa) y modelos de interrupción de la barrera del huésped (por ejemplo, ligadura y punción cecal, CLP)17. Incluso si los modelos de toxemia con LPS se propusieran como un modelo inapropiado para una replicación de la sepsis humana15, hay que enfatizar que las características de estas clases fundamentales de modelos de sepsis se han descrito en detalle 8,12,13,14 y se han revisado críticamente en un artículo reciente 17.
No hay una respuesta final, de lo que son los experimentos con animales humanitarios, pero el sentido más común es el principio 3R, por su definición, los experimentos con animales deben reducirse, reemplazarse y refinarse18. Si bien en la investigación de la sepsis el reemplazo de los experimentos con animales es difícil, el muestreo de sangre repetitivo y las mediciones continuas de datos vitales pueden reducir el número de animales necesarios. Además, mantener a los animales sépticos anestesiados refina la configuración experimental a medida que disminuye el sufrimiento de los animales.
En resumen, presentamos un modelo de endotoxemia bien caracterizado y reproducible, un entorno similar al de una unidad de cuidados intensivos con la posibilidad de generar una alta densidad de datos, y al mismo tiempo limitar la carga animal. Además, este modelo se puede modificar fácilmente dependiendo de la pregunta de investigación que deba responderse.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses con respecto al estudio presentado. Martin Schläpfer ha presentado una patente para mitigar los efectos negativos de la cirugía y/o la anestesia en pacientes que utilizan gases medicinales, en particular oxígeno (O2) y dióxido de carbono (CO2). Ha recibido becas de investigación sin restricciones de Sedana Medical, Suecia, y de Roche, Suiza, no relacionadas con este trabajo.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Beatrice Beck-Schimmer (MD) y Erik Schadde (MD) por su examen crítico y su valiosa contribución para este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | K833 | Standard surgical |
| 26 intravenous catheter | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 391349 | Standard anesthesia equipment |
| 6-0 LOOK black braided silk | Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA | SP114 | Standard surgical |
| Alaris Syringe Pump | Bencton Dickinson | ||
| Betadine | Mundipharma, Basel, Switzerland | 7.68034E+12 | GTIN-number |
| Curved fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 504513 | Facilitates vascular preparation |
| Fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 501976 | Tips need to be polished regularly |
| Infinity Delta XL Anesthesia monitoring | Draeger, Lübeck, Germany | ||
| Isoflurane, 250 mL bottles | Attane, Piramal, Mumbai, India | LDNI 22098 | Standard vet. equipment |
| Ketamine (Ketalar) | Pfitzer, New York, NY | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5 | Sigma, Buchs, Switzerland | ||
| Q-tips small | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | EH11.1 | Standard surgical |
| Ringerfundin | Bbraun, Melsungen, Germany | ||
| Tec-3 Isofluorane Vaporizer | Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL | not available anymore | Standard vet. equipment |
| Xylazine (Xylazin Streuli) | Streuli AG, Uznach, Switzerland |
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