Summary
심장 자율 신경계의 병리학적 변화, 특히 교감 지점에서 심실 부정맥의 발병 및 유지 보수에 기여합니다. 본 프로토콜에서, 우리는 근본적인 분자 및 세포 프로세스의 이해를 향상시키기 위하여 murine stellate ganglia를 특성화하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
자율 신경계는 심장 전기 생리학의 실질적인 동인입니다. 특히 그 공감 분기의 역할은 심실 부정맥 (VA)의 병리 생리학에 있는 조사의 지속적인 문제입니다. 동정 사슬의 양측 별 모양 구조인 스텔레이트 신경리아(SG)의 뉴런은 공감 인프라의 중요한 구성 요소입니다. SG는 치료 내화 VA를 가진 환자에 있는 심장 교감 기질을 통해 처리를 위한 인정된 표적입니다. SG의 신경 리모델링 및 신경교 활성화는 VA 환자에서 설명되었지만, 잠재적으로 부정맥의 발병에 앞서 있는 근본적인 세포 및 분자 과정은 충분히 이해되지 않으며 자율 변조를 개선하기 위해 해명되어야 합니다. 마우스 모델은 우리가 공감 신경 리모델링을 연구 할 수 있습니다, 하지만 murine SG의 식별은 경험이 없는 조사자에게 도전이다. 따라서, 뮤린 SG의 심층 세포 및 분자 생물학적 연구는 많은 일반적인 심장 질환에 대한 부족하다. 여기서, RNA 수준(유전자 발현 분석을 위한 RNA 절연, 현장에서 혼성화), 단백질 수준(면역형성 전체 마운트 염색), 및 세포 수준(기본 형태학, 세포 크기 측정)에서 분석을 위해 성인 마우스에서 SG를 해부하고 연구하기 위한 기본 레퍼토리를 설명합니다. 우리는 준비 기술의 문제를 극복하기 위한 잠재적인 해결책과 자동 불발성 담금질을 통해 염색을 개선하는 방법을 제시합니다. 이를 통해 세포 조성 및 리모델링 과정을 결정하기 위해 확립된 마커를 통해 뉴런뿐만 아니라 신경교 세포의 시각화를 가능하게 한다. 여기에 제시된 방법은 SG가 VA에 걸리기 쉬운 마우스에 있는 자율 장애에 대한 추가 정보를 얻기 위하여 허용하고 심혼에 있는 자율 신경계의 신경 및 신경교 성분을 조사하는 추가 기술에 의해 보완될 수 있습니다.
Introduction
심장 자율 신경계는 심장이 적절한 생리적 반응1,2로환경 변화에 적응할 수 있도록 교감, 부교감 및 감각 성분의 엄격하게 조절된 평형이다. 이러한 평형의 교란은 예를 들어, 교감 활동의 증가, 발병의 핵심 동인으로서 확립된 뿐만 아니라 심실 부정맥(VA)3,4의유지보수로 확립되었다. 따라서, 베타 차단제와의 교감 활동의 약리학적 감소를 통해 달성된 자율 변조는 수십 년 동안 VA를 가진 환자의 치료에 초석이 되어왔다5,6. 그러나 약리학 및 카테터 기반 내정간섭에도 불구하고, 환자의 관련 수는 아직도 재발성 VA7때문에 손해를 입습니다.
심장에 대한 공감 입력은 주로 스텔레이트 신경리아(SG)의 신경 세포 체를 통해 중재되며, 교감 사슬의 양자 별 모양 구조는 뇌간에서 심장8,9,10까지수많은 내트라토라시크 신경을 통해 정보를 전달한다. 부상 후 SG로부터 발아하는 신경은 VA및 갑작스런심장사멸(11,12)과관련이 있으며, SG를 자율변조의 대상으로강조한다(13,14). 심장에 대한 공감 입력의 감소는 비디오 보조 흉부검사(15,16)를통해 SG를 부분적으로 제거함으로써 국소 마취제의 경피 주입또는 영구적으로 영구적으로 얻을 수 있다. 심장 동정 성 서성 검사는 유망한 결과 와 치료 불응성 VA 환자에 대한 옵션을 제공합니다14,16,17. 우리는 신경 및 신경 화학적 리모델링, 신경 염증 및 신경교 활성화가 자율 기능 장애18,19에기여하거나 악화 시킬 수있는 공감 리모델링의 특징이라는 이러한 환자의 이식 SG에서 배웠습니다. 여전히, 이러한 뉴런의 기본 세포 및 분자 과정은 현재까지 모호하게 남아, 예를 들어, 해저 현상형으로 뉴런 전이의 역할20,21. 실험 연구는 VA를 치료하는 새로운 접근 방식을 제시, 예를 들어, 광유전학을 통해 교감 신경 활동의 감소(22)하지만 SG의 심층 특성은 여전히 VA와 함께 가는 많은 심장 병리학에서 부족. 이러한 병리를 모방 마우스 모델은 잠재적으로 부정맥의 발병 앞에 신경 리모델링을 연구 할 수 있습니다12,23. 이들은 심혼과 신경계의 자율 특성화를 위한 추가 형태학 및 기능적인 분석에 의해 완료될 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 우리는 VA의 이해를 향상시키기 위해 뮤린 SG를 해부하고 특성화 할 수있는 방법의 기본 레퍼토리를 제공합니다.
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Protocol
동물과 관련된 모든 절차는 함부르크 주의 동물 관리 및 사용위원회 (ORG870, 959)와 자연, 환경 및 소비자 보호를위한 노스 라인 - 웨스트 팔리안 국가 기관 (LANUV, 07/11)에 의해 승인되었으며 국립 보건 원 (2011)에 준수합니다. 연구 결과는 당뇨병 자발적인 돌연변이를 위한 남성과 여성 (10-24주) C57BL/6 마우스(주식 번호 000664, 잭슨 연구소) 및 마우스 호모지구우스(db/db) 또는 이종화구우스(db/het; 대조군)를 사용하여수행하였다. BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, 주식 번호 000642, 잭슨 연구소). 저자는 60 주까지 나이 든 마우스를 위한 변이 없이 손에 프로토콜을 이용했습니다.
1. 뮤린 스텔레이트 간리아의 위치 및 해부
참고: 설명과 도면이 대부분 더 큰 종에서 사용할 수 있더라도, 몇몇 간행물은 이전에 해부학 적인 방법 및 형광 기자 라인을 사용하여 쥐24 및 마우스25에 있는 SG의 위치를 기술했습니다, 각각.
- 50mL의 얼음-감기(3-4°C)를 준비(20단위/mL, 재료표참조) 인산완충식식(PBS). 실온(RT)에서 SG의 해부를 수행합니다.
- 기관 및 지역 지침에 따라 3%-5%의 이소플루란을 흡입하여 마우스를 심층 마취합니다. 페달 철수 반사의 손실에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 쥐를 참수하거나 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
참고: 잘못된 자궁 경부 탈구는 척추의 파손과 흉부 혈관의 손상으로 인해 교감 사슬의 준비 또는 단절을 방해하는 출혈로 이어질 수 있으므로 SG가 올바른 위치에 있지 않습니다. 따라서, 경험이 풍부한 인력이 자궁 경부 탈구를 수행하거나 깊은 퇴적에 동물을 참수하는 것이 중요합니다. - 에탄올로 피부를 살포하고 마요 가위와 좁은 패턴 집게를 사용하여 전방 보조 선을 따라 두 개의 절개로 흉부를 엽니다. 다이어프램을 자르고 흉곽의 전면을 제거합니다.
- 런던 집게를 사용하여 대오르막과 베나 카바를 다이어프램 바로 위에 쥐고 모든 혈관과 스트라비스무스 가위와 함께 아래 척추에 가까운 결합 조직을 절단하여 심장 폐 패키지를 제거하십시오.
- 모든 혈액 흔적이 제거될 때까지 플라스틱 일회용 파이펫을 사용하여 분리된 PBS로 흉부를 철저히 세척합니다.
- 몸통을 스테레오현미경 준비 쌍안경 아래에 놓고 외부 광원으로 흉부에 좋은 조명을 유지합니다.
- 첫 번째 갈비뼈와 긴 콜리 근육을 찾습니다.
참고: SG는 첫 번째 갈비뼈와 척추 사이의 가지의 척추와 평행하게, 롱러스 콜리근육(24)에대한 홈 측면으로 위치한다. SG의 평평한 면은 긴 콜리 근육에 인접해 있습니다. 준비에 따라, 공감 체인의 일부는 이미 척추에 평행 흰색, 경사 섬유로 볼 수 있습니다. SG를 따라 추적할 수 있습니다. - Dumont #5/45 집게의 끝을 부드럽게 사용하여 결합 조직 측면을 긴 콜리 근육에 노출시십시오.
- 집게를 180° 돌면 평평한 면을 사용하여 SG를 잡고 최소한의 압력으로 꺼냅니다.
- 두 번째 SG로 반복합니다.
- 차가운 PBS로 채워진 접시 (직경 6cm)에 두 SG를 놓고 적절한 배율로 검사하십시오. 필요한 경우, 과잉 혈관을 제거, 지방 조직, 그리고 더 큰 신경.
참고: 자율 신경질은 콜라겐 섬유와 섬유아세포26,27로구성된 결합 조직 캡슐에 둘러싸여 있습니다. 이 캡슐의 투과성은 종,26 및28세의 다른 종류마다 다른 것으로 보입니다. Dumont #5/45 집게를 사용하여 가능한 한 많은 결합 조직을 제거하고 필요한 경우 스프링 가위를 제거하십시오. - 실험의 목표에 따라 이 프로토콜의 섹션 2, 3 또는 5를 진행합니다.
2. 전체 마운트 면역 작용 화학 프로토콜
참고 :이 프로토콜은 심장 전체 마운트 염색4,29에서조정됩니다. 모든 단일 SG에 대한 배큐베이션 단계를 96웰 플레이트의 한 웰에서 수행하고 100 μL(항체 함유 용용용)에서 200 μL(다른 모든 솔루션의 경우)을 사용하여 완전한 커버리지를 보장합니다. 쌍안경으로 SG의 적용 범위를 정기적으로 확인하고 정확한 침수를 확인하십시오. 200 μL 팁 위에 10 μL 팁이 추가된 200 μL 파이펫으로 액체를 수동으로 제거합니다. 이렇게 하면 파이펫 팁에서 SG의 포부를 방지할 수 있습니다. 갓 준비된 솔루션과 멸균 액체를 사용하여 세균 성장을 방지하십시오.
- 4% 메탄올 프리 파라포름데히드(PFA)/PBS에서 RT에서 2시간 동안 히스토로지에 대한 SG를 수정합니다.
- 가능한 한 빨리 SG를 처리하지만, 이 시점에서 0.02 %(w /v) 나트륨 아지드와 PBS에서 4-6 °C에서 2-4 주 동안 저장할 수 있습니다.
- 자율불광 감소 및 신호 대비 배경 비율30개선을 위한 수단 블랙 스톡 솔루션(1% 수단 블랙 w/v 100% 에탄올)을 준비한다. RT의 자기 교반기에서 2-3 시간 동안 녹입니다.
참고: 스톡 솔루션을 최대 6-8주 동안 사용하고 퇴적이 나타나면 일찍 폐기하십시오. - 수단 블랙 작업 솔루션을 최고 속도(13,000 x g)로30분 간 원심분리하여 이물질을 제거하고 70% 에탄올로 재고를 희석하여 수단 블랙의 최종 농도0.25%를 준비합니다.
- 항체투과성(31)을개선하기 위해 덴트의 표백제로 SG를 치료한다. 4:1:1의 비율로 H2O및 디메틸 설산화물(DMSO)에 메탄올(MeOH), 과산화수소 용액 30%(w/w)를 혼합하여 덴트의 표백제를 신선하게 준비합니다. SG당 200 μL을 추가하고 RT에서 1시간 동안 궤도 셰이커에 플레이트를 놓습니다.
- 궤도 셰이커에서 각각 10분 동안 배양하여 재수화를 위한 내림차순 MeOH 시리즈를 수행합니다: 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
- RT에서 PBS/1% Triton-X-100에서 각각 60분 동안 SG를 두 번 배양하여 투과성화를 수행합니다.
- SG에서 투과화 솔루션을 제거하고 수단 블랙 작업 솔루션을 추가합니다. 궤도 셰이커에 RT에서 2 시간 동안 배양.
- 한편, PBS에서 5% 수용체 급 소 세럼 알부민(BSA)과 0.1% 트리톤-X-100을 PBS에 첨가하여 블로킹 용액을 준비하고 약 5-10분 동안 롤러 셰이커에 용해하게 한다. 이물질을 제거하기 위해 미리 플리츠 된 종이 필터를 통해 decant.
- 플레이트를 기울이고 조심스럽게 수직면에서 파이프를 통해 수단 블랙을 매우 신중하게 제거하십시오.
참고 : 수단 블랙의 SG를 볼 수 없습니다. 강한 광원을 사용하고 천천히 작동합니다. 이 단계에서 SG는 검은색으로 염색되어 가시성을 향상시킵니다. 이 시점에서 SG 를 둘러싼 추가 결합 조직이 보이는 경우, Dumont #5/45 포셉및 스프링 가위를 사용하여 제거하십시오. - PBS/0.1% 트리톤-X-100(PBS-T)의 200 μL을 추가하고 궤도 셰이커에서 RT에서 5분 간 세척합니다.
- 파이펫으로 흡입하여 PBS-T를 제거하고 2 번 반복하십시오.
- PBS 제거; 블로킹 용액200μL을 추가하고 궤도 셰이커에서 하룻밤 사이에 4°C에서 배양합니다.
- 다음 날 차단 용액에 1 차 항체를 추가하여 용액을 준비하십시오. 확립된 프로토콜에서 항체 농도를 조정합니다.
참고: 1차 항체 가 없는 항체 제어로 SG 1개를 포함합니다(항원 전흡수 항체 또는 IgG로 배양, 사용 가능한 경우 또는 버퍼 차단). - 궤도 셰이커에서 4°C에서 36-48h의 1차 항체 배양을 수행한다. 세포 크기 측정 및 공감 뉴런의 염색에 대 한 티로신 하이드록실라제에 대 한 항체를 사용 하 여 (항체 권장 사항에 대 한 재료의 표 참조).
참고: 96웰 플레이트를 젖은 챔버(예: ddH2O-젖은 종이 타월로 늘어선 플라스틱 상자)에 놓아 이 시점에서 증발을 방지합니다. - 항체 용액을 신중하게 제거하고 PBS-T의 200 μL을 추가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 30분 간 놓습니다.
- PBS-T를 제거하고 세척 단계를 5회 추가로 반복합니다.
- 사용 전에 전속력(13,000 x g)에서1분 동안 형광 알렉사 표지이 부착된 이차 항체를 원심분리하여 이차 항체 작동 용액을 준비한다. 1차 항체에 따라 적절한 이차 항체를 희석하여 차단용액에 1:500을 넣고 SG에 추가합니다. 궤도 셰이커에 4 °C에서 12-24 h에 대한 배양.
- 항체 용액을 신중하게 제거하고 PBS-T의 200 μL을 추가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 30분 간 놓습니다.
- PBS-T를 제거하고 세척 단계를 5회 추가로 반복합니다. 마지막 단계는 트리톤없이 PBS를 사용합니다.
- 포함의 경우, 유리 슬라이드에 형광 장착 매체 (재료 표 참조)의50-100 μL을 확산하고 준비 쌍안경 아래에 배치합니다. Dumont #5/45 집게를 사용하여 96웰 플레이트에서 SG를 선택하고 필터 용지(예: Whatman 건조 패드)에 한쪽 끝을 찍어 여분의 액체를 제거하여 드롭에 놓습니다.
- Dumont #5/45 포셉을 사용하여 적절한 배율로 위치를 수정합니다.
- SG 옆에 유리 커버슬립(20mm x 20mm)을 부드럽게 놓고 천천히 내려갑니다.
참고: 장착 매체를 너무 많이 사용하면 SG의 움직임이 나 신경이 엉킴합니다. 이 경우 커버슬립을 신속하게 제거하고 2.9-2.21 단계를 반복합니다. - RT에서 밤새 어둠 속에서 슬라이드를 건조하게 하십시오. 스테인드 시편의 저장은 4 °C에서 적어도 4-6 주 동안 가능하다.
3. 시투 혼성화의 전체 마운트
참고: SG의 시상 혼성화에서 전산은코티(32)의 오르간과 시투 프로토콜의 상용 RNA 형광으로부터 적응된다(재료표참조). 공급업체로부터 관심 및 완충제 및 솔루션 유전자에 대한 프로브를 가져옵니다. 모든 잠복기 단계는 달리 언급되지 않은 경우 RT에서 수행됩니다. 멸균 PBS를 사용합니다. 여러 SG를 하나의 우물에 염색하는 데 관심이 있으시면 최소 150μL의 버퍼와 솔루션을 사용하십시오.
- 1.1-1.13 단계에 설명된 대로 SG의 해부를 수행한다.
- 궤도 셰이커에 놓인 96웰 플레이트의 한 웰에 4% MeOH 가 없는 PFA/PBS의 200 μL에서 1h에 SG를 고정합니다.
- 궤도 셰이커에서 0.1% Tween-20/PBS로 30분 동안 SG를 세 번 세척합니다.
- MeOH/PBS 시리즈에서 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS, 궤도 셰이커에서 각각 10분 동안 100% MeOH를 배양하여 SG를 탈수합니다.
- 하룻밤 사이에 -20 °C에 SG를 저장하십시오.
- 다음 날 인큐베이터를 40°C로 미리 데워보시고 있습니다. 온도계로 온도를 확인합니다.
- 역MeOH/PBS 시리즈(100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS)로 SG를 10분 간 재수화합니다.
- PBS에서 각각 5 분 동안 SG를 세 번 씻으시면 됩니다.
- 그 동안, 10 분 동안 40 °C에서 배양하여 프로브를 미리 따뜻하게 시작하고 10 분 동안 냉각하십시오.
- 프로테제III 200μL에서 SG를 15분 동안 배양합니다.
- 선택 사항: 후속 면역 형광 얼룩이 계획된 경우 이 프로토콜의 섹션 2.3, 2.4 및 2.8항에 따라 자가 형광을 담금질하기 위해 수단 블랙 트리트먼트를 수행합니다.
- 200 μL에서 0.1% Tween-20/PBS 3x에서 궤도 셰이커에서 각각 5분 동안 SG를 세척합니다.
- 선택 사항: 여러 프로브와 공동 염색이 필요한 경우 채널-1 프로브(1x)에서 Channel-2(50x) 및 채널-3 프로브(50x)를 희석시하십시오.
- 관심 유전자에 대한 프로브의 100 μL로 SG를 커버하고 약간의 동요와 함께 40 °C에서 하룻밤 배양. 모든 인큐베이션 단계에 대해 젖은 챔버에 96웰 플레이트를 40°C로 놓습니다.
참고: 세균 유전자에 대한 프로브(예를 들어, 디하이드로 디피콜리나테 환원효소, Dapb)에대한 프로브를 사용하여 나중에 증폭 시약의 비특이적 결합을 검사하는 부정적인 대조군으로 SG 1개를 포함시한다. - 공급된 세척 버퍼에서 SG를 궤도 셰이커에서 각각 15분 동안 3배 세척합니다.
- RT에 미리 웜 Amp1-3, HRP-C1 및 HRP 차단기. 채널-2 및/또는 채널-2 프로브와 공동 염색이 필요한 경우 사전 웜 HRP-C2 및 HRP-C3.
- 궤도 셰이커에서 4% PFA/PBS에서 RT에서 10분 동안 SG를 다시 수정합니다.
- RT의 궤도 셰이커에서 각각 5분 동안 3배씩 공급된 세척 버퍼의 200μL에서 SG를 세척합니다.
- 증폭을 위해, 궤도 셰이커에 40 °C에서 35 분 동안 Amp1의 100 μLSG를 인큐베이션.
- 액체를 조심스럽게 제거하고 200 μL의 공급 된 세척 버퍼 3x에서 궤도 셰이커에서 RT에서 각각 3 배세척합니다.
- 궤도 셰이커에서 40°C에서 35분 동안 Amp2의 100 μL을 가진 SG를 배양합니다.
- 3.18 단계를 반복합니다.
- 궤도 셰이커에서 40°C에서 20분 동안 Amp3의 100 μL을 가진 SG를 배양합니다.
- 3.18 단계를 반복합니다.
- 100 μL의 공급 멀티플렉스 FL v2 HRP-C1의 인큐베이션 SG는 궤도 셰이커에서 40°C에서 20분 동안 공급된다.
- 3.18 단계를 반복합니다.
- 오팔-컨쥬게이드 이차 항체 1:1,000을 200μL에 공급된 TSA 버퍼로 준비하고 궤도 셰이커에서 40°C에서 35분 동안 SG를 배양한다. 인큐베이션 중및 이 단계에서 빛으로부터 보호하십시오.
- 3.18 단계를 반복합니다.
- 100 μL의 인큐베이트 SG는 궤도 셰이커에서 40°C에서 15분 동안 공급된 멀티플렉스 FL v2 HRP 차단제의 100μL에 공급된다.
- 3.18 단계를 반복합니다.
- 선택 사항: 채널-2 프로브와 공동 염색하기 위해 제공된 멀티플렉스 FL v2 HRP-C2와 함께 3.25-3.30 단계를 반복합니다.
- 선택 사항: 채널-3 프로브와 공동 염색하기 위해 제공된 멀티플렉스 FL v2 HRP-C3와 함께 3.25-3.30 단계를 반복합니다.
- 후속 면역 형광 염색의 경우,이 프로토콜의 단계 2.13-2.25을 수행합니다.
- 궤도 셰이커에서 30분 동안 1% BSA/PBS에서 배양합니다.
- 인큐베이션 SG는 비스벤지미드 H33342 트리하이드로염화물1μg/mL에서 30분 동안 1% BSA/PBS에서 핵 염색이 원하고/또는 알렉사 커플밀 세균 아글루틴(WGA, 1:500)을 추가한다.
- 3.18 단계를 반복합니다.
- 2.19-2.22 단계에 설명된 대로 포함.
4. 뮤린 스텔레이트 신경리아의 이미징 및 분석
- 지역 이미징 시설에서 임베디드 SG의 공초점 현미경 검사를 수행합니다.
- 셀 크기 측정이 필요한 경우, 이미지 SG는 티로신 하이드록실라제(재료 표참조)를 200배율로 염색하고 모든 SG에서 4-6개의 무작위 이미지를 취합니다.
- ImageJ33 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하여 셀 크기를 추정합니다(예: 펜 테이블이 있는 경우 재료 표참조). 무료 손 선택을사용 하 여 각 셀을 원하 고 분석 | 세포 영역을 얻기 위해 측정합니다. SG 내에 잘 위치한 그대로 완전히 보이는 셀만 포함하십시오.
- 이 방법을 사용하여 SG당 약 100개의 셀을 측정합니다.
- 다른 마우스에서 SG를 비교하려는 경우 맹목적인 조사자가 4.2-4.3 단계를 수행하도록 하십시오. 통계 소프트웨어에서 주파수 분포를 사용하여 그룹34간의 크기 차이를 시각화합니다.
5. 뮤린 스텔레이트 간리아의 분자 분석
참고: 실험 설계에 따라 컨트롤을 포함합니다. 이것은 상이한 유전형 및 질병 배경 및/또는 교감 우수한 자궁 경부 신경절과 같은 다른 자율 적 신경교를 가진 SG일 수 있었습니다 (목 부위에 위치, Ziegler 외35에서상세한 설명을 참조) 또는 부교감 신경리아 (예: 심장 내 신경리아, Jungen etal.4참조).
- 동물당 500 μL의 페놀/구니딘 티오야네이트 용액(예를 들어, Qiazol)을 갖춘 2mL 튜브를 준비하고 충격-프로스팅을 위한 액체 질소를 준비하거나 RNA 보호를 위한 상업적 용액을 고려한다(선택 사항, 재료표참조)36. RNA 격리를 위해 신속하게 작동합니다.
- 1.1-1.13 단계에 설명된 대로 SG의 해부를 수행한다.
- 페놀/구니딘 티오시야네이트 용액과 충격-서리 튜브를 액체 질소에 즉시 한 튜브에 직접 담급다.
- 추가 처리될 때까지 -80°C에 보관하십시오.
- 조직 용해의 경우, 페놀 /구니딘 티오세네이트 용액이 액화 될 때까지 SG 해동튜브를 하고 두 개의 7mm 스테인레스 스틸 구슬을 추가하십시오. 4°C에서 드라이 아이스와 원심분리기에 조직 균질화제(예: 티슈 리서 II)의 금속 부분을 식히십시오.
- 심분리기 튜브는 500 x g에서 4 °C에서 1 분 동안 1 분 동안 SG가 튜브의 바닥에 있도록합니다.
- 튜브를 티슈 리서의 금속 부분에 넣고 20Hz에서 1분 동안 용해하십시오.
- 손상되지 않은 조직이 검출될 때까지 5.6 및 5.7 단계를 최대 5배까지 반복합니다.
- 액체를 신선한 1.5mL 튜브로 옮기십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 RNA 절연 키트(예: miRNeasy mini kit)로 RNA 절연을 수행합니다.
- RNase가 없는 물의 20 μL에서 엘ute RNA와 분광광계를 사용하여 농도를 측정합니다.
참고: 게놈 DNA를 가진 정제된 RNA의 오염을 제외하기 위하여는, 우리는 유전체 프라이머를 가진 폴리머라제 연쇄 반응 및 1μL의 RNA를 템플릿으로, 대신 역 전사 대조를 빼고 제안합니다. 이것은 상당한 양의 RNA를 절약 할 것입니다. RNA가 오염되면, 후속 정량 적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응에 대한 엑손 인트론 경계 프라이머 또는 인트론 측면 프라이머를 사용합니다. - 250 ng SG RNA를 사용하여 cDNA 합성을 수행하고 확립된 프로토콜을 사용합니다. 여기서, 대용량 cDNA 역전사 키트는 제조업체의 지시에 따라 사용되었다.
- cDNA의 2.5 ng/μL의 최종 농도로 희석하고 확립된 프로토콜에 따라 적절한 프로브를 사용하여 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 수행한다. 여기서, TaqMan 분석(재료의 표참조) 반응당 10 ng cDNA를 사용하여 수행하였다.
참고: 모든 유전자에 대해 잘못된 양성 결과를 제외하기 위한 템플릿 없음 제어를 수행합니다. - SG의 다른 그룹 간의 상대적인 유전자 발현을 비교하기 위해 집 유지 유전자(예를 들어, Cdkn1b)에대한 관심 유전자의 유전자 발현을 정규화합니다.
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Representative Results
도 1은 SG를 식별하고 해부하는 방법을 시각화합니다. 도 1A는 위치의 회로도 도면을 나타내고, 도 1B는 심장 폐 패키지를 제거한 후 흉부로 뷰를 제시한다. SG와 늑골 케이지의 왼쪽 및 오른쪽 긴 콜리 근육은 방향에 중요한 랜드마크입니다. 해부는 근육과 첫 번째 갈비뼈 사이의 점선을 따라 수행됩니다. SG와 공감 체인은 흰색구조(도 1C)로표시됩니다. 도 1D는 왼쪽 긴 콜리 근육과 왼쪽 SG가 있는 첫 번째 갈비뼈 사이의 영역의 배율을 나타낸다. SG의 형태는 개인마다 다릅니다. 그것은 종종 열등한 자궁 경부의 융합과 제 3 흉부 중질(24)에첫 번째로 구성된다. 5마리의 수컷 C57Bl6 야생형 마우스의 좌우 SG가 촬영된 도1E, F, 피규어 1E,F에서 실험자가 기대할 수 있는 다양한 품종이 촬영된다.
심혼을 내면화하는 SG내 세포의 세포 및 세포 분석뿐만 아니라 총 해부학 개요의 평가는 단백질 및 RNA 수준에 대한 전체 마운트 기술에 의해 수행될 수 있다. SG에 대한 개요는 그림 2에표시됩니다. 심근 교감 섬유는 SG의 세포 체에서 유래한다. 이들은 티로신 하이드록실라제 (TH)에 대하여 항체로 염색해서 시각화됩니다. TH-expressing 신경 소마타는 콜린 아세틸 트랜스퍼라제 (ChAT)에 대 한 긍정적인 염색 신경 섬유에 의해 둘러싸여. 이들은 가장 가능성이 사전 시냅스 섬유37,38이다. TH 및 ChAT 공동 라벨링의 예시배는 도 2A에나와 있습니다. 신경 세포 체를 둘러싼 신경 교세포는 S100B에 대 한 염색 하 여 시각화될 수 있습니다. 이는 신경마커 PGP9.5와 병합하여 도 2B로 묘사된다. 도2C-F는 세포 전성 적 수준에서 SG를 연구하는 모범적인 분석을 나타내며, 시상 혼성화 및 면역 형광 의 공동 염색에 전체 마운트를 사용한다. 단백질TH(도 2C,적색) 및 tubb3의 mRNA 분자(도2D,white)는 큰 뉴런 세포 체에서 발현되며, S100b(도 2E,녹색)의 mRNA도 주변 신경세포에서 검출가능하다. 병합(도2F)에서,일부 뉴런은 TH에 대해 부정적이지만 Tubb3를발현하는 반면, S100b mRNA는 도 2G의배율에 묘사된 바와 같이 주변 세포에서도 검출될 수 있다.
도 3은 TH 염색 SG(도3A)로부터의뮤린 SG를 연구하기 위한 잠재적정량 분석 및 함정을 제시하며, 당뇨병의 마우스 모델에 대한 예시적인 수행된 바와 같이 세포 크기 측정에 사용될 수 있다. 대조군(db/het) SG로부터의 신경소마타는 388.8± 123.8 μm2 대 당뇨병 SG(db/db) 407.33 ± 139.6 μm2 (도 3B,n = 2 SG, 유전자형 당 SG당 100세포, P=0.348)를 사용하여 휘트니 를 이용한 유전자 검사하였다. 도 3C는 SG(n=6-7)의 상이한 세포 유형으로부터 유전자의 발현을 나타낸다. 한 동물에게서 두 SG의 풀링은 대략 24개의 분석의 유전자 발현 측정을 허용합니다 (중복에 있는 12개의 유전자). 당사는 전형적으로 Cdkn1b(Ct 값 25.4± 0.97에서 검출)뿐만 아니라 다른 세포 유형 및 해부의 신경 순도를 설명할 필요가 있는 경우 뉴런 마커 Neun/Rbfox3(32.5± 0.7)에 대한 샘플을 정상화합니다. 우리가 SG에서 분자 프로세스를 특성화하는 데 유용하다는 것을 발견한 유전자는 교감 유전자 Th (22.4 ± 1.6), 채팅,이는 해막 형 전분 (30.8 ± 1.3의 Ct 값으로 표현됨) 및 Gap43,신경 발아에 대한 마커 (22.4 ± 1.4의 Ct 값에서 검출)를 포함한다. 비신경 세포 유형으로 발현된 유전자는 S100b(신경세포, 27.3 ± 1.2), Ki-67(증식 세포, 33.0 ± 1.6) 및 Cd45(면역 세포의 경우, 30.2 ± 1.1)를 포함한다.
SG는 결합조직(26)의캡슐로 둘러싸여 있으며, 헤마톡시린과 에신을 통해 도 3D,E로염색한다. 때때로, 우리는 도 3F에서입증된 바와 같이 항체 기반 염색의 불일치를 관찰했습니다, 캡슐의 불완전한 제거 로 인해 가장 가능성이 높습니다. ChAT 및 TH 염색은 SG의 일부 부분에서만 검출할 수 있지만 DAPI로 반소된 핵은 전체적으로 검출할 수 있습니다. 병합된 이미지의 점선은 성공적인 염색(선의 오른쪽)을 실패한 염색(줄의 왼쪽)과 분리합니다.
데이터는 표준 편차 ± 의미로 표시됩니다. 통계적 유의성은 <0.05의 P값으로 정의되었다. 통계 분석은 상용 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
도 1: 뮤린 의 위치, 해부 및 형태는 목자리(SG)의 위치의 회로도를 형성한다. (B)심장 폐 포장을 제거한 후 흉부로 바라본다. SG가 대부분의 경우 즉시 표시되지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 긴 콜리 근육은 척추에서 측면으로 위치하고 있습니다. SG는 첫 번째 갈비뼈와 접합의 근육에서 측면으로 위치합니다. 조심스럽게 근육에 측면을 해부 (점선으로 표시된 영역) 간통을 발견합니다. 해부 후, 간질(왼쪽과 오른쪽, LSG 및 RSG) 및 공감 사슬은 흰색, 긴 구조로 만들 수 있다. (C)신경리아와 해부학적 랜드마크를 보여주는 모범적인 해부. (D)LSG의 배율. (E)LSG 및(F)RSG는 야생형으로부터, 남성 C57Bl6 마우스(16주)는 형태와 크기의 변이를 나타내기 위해 해부및 촬영하였다. 스케일 바는 1,000 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 뮤린 스텔레이트 신경리아에서 상이한 세포 유형의 시각화는 전체 산 면역조직화학 및 시투 혼성화를 통해 서있다. (A)공감마커 티로신 하이드록실라제(TH) 및 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)를 위해 염색된 뮤린 스텔레이트 신경절(SG)의 총 개요. 배율은 TH 양성 세포 체와 ChAT 양성의 존재를 보여줍니다., 가장 가능성이 사전 시 냅 스, 신경 소마타를 둘러싼 신경 섬유. (B)신경 세포 세포를 천신신경 세포 체는 S100B에 대한 염색에 의해 시각화 될 수있다, 여기에 뉴런 마커 PGP9.5와 함께. (C,D, E,F) 1SG의 현미경 이미지는 TH(빨강)에 대한 면역 조직화학의 조합을 통해 전체 마운트를 염색하고 Tubb3(D, 흰색) 및 S100b(E, 녹색)에 대한 시투 혼성화를 결합하여 염색하였다. 핵은 DAPI(파란색)로 반성됩니다. (F)병합은 모든 뉴런(Tubb3-양성) 세포가 TH 양성이 아니라는 것을 보여준다. S100b mRNAs는 뉴런 소마타 내에서 검출될 수 있지만, 또한 주변 세포에서배율(G)에서화살에 의해 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 잠재적 정량 분석 및 함정. (A)티로신-하이드록실라제(TH)-스테인드 SG의 이미지는 ImageJ를 이용한 세포 크기 측정에 사용될 수 있다. (B)이는 당뇨병의 마우스 모델(SG당 100세포, n=2 SG)에서 수행되었으며, 데이터는 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 비교되었다. (C)분자 공정을 특성화하는 데 유용할 수 있는 SG에서 발현된 예시적인 유전자. Cdkn1b뿐만 아니라 뉴런 마커 Neun/Rbfox3(다른 세포 유형의 존재를 고려하여)는 수화를 위해 사용될 수 있다. 티로신 하이드록실라제(Th)는 콜린 아세틸트랜스퍼라제(Chat)의교감 마커로서 작용하며, 신경발아를 위한 Gap43. 비신경 세포 유형에서 발현된 유전자는 S100b(신경교세포), Ki-67(증식 세포) 및 Cd45(면역세포)를 포함한다. (D)헤마톡슬린과 포름틴 고정 SG의 에오신 염색은 SG 의 상단에 결합 조직과 세포를 시각화합니다.(E)박스 형 영역에서 배율. (F)어떤 경우에는, 우리는 캡슐의 불완전한 제거로 인해 항체 기반 염색에 실패를 관찰했다. ChAT(빨간색) 및 TH(녹색) 염색은 SG의 일부 부분에서만 검출할 수 있지만, DAPI(다크 블루)로 대응하는 핵은 전체적으로 검출될 수 있다. 병합된 이미지의 점선은 성공적인 염색(선의 오른쪽)을 실패한 염색(줄의 왼쪽)과 분리합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
VA의 개시에 선행된 교감 신경계의 신경세포 및 분자 프로세스에 있는 세포 및 분자 프로세스의 이해는, 급격한 심장 정지가 전 세계적으로 죽음의 일반적인 원인 남아 있기 때문에, 높은 관심사입니다5. 따라서, 현재 원고에서, 우리는 뮤린 SG를 식별하는 방법의 기본 레퍼토리를 제공합니다 - 이 네트워크 내의 뮤린 원소 - RNA에 후속 분석을 수행, 단백질, 및 세포 수준.
뮤린 SG의 한 가지 과제는 그 크기와 제한된 수의세포(39)이다. 이때문에 쥐40마리,개(22개,돼지(41)와 같은 다양한 동물 모델이 SG에 대한 연구에 사용된다. 여전히, 마우스에서 사용할 수 있는 심장 표현형에 대한 다양한 잘 확립된 질병 모델이 있으며 이들 중 일부는 이미당뇨병(23)심근경색42,또는 심근염(43)에 대한모델과 같은 심장 내막 및 부정맥의 상이한 양상을 특징으로 하고 있다. 따라서, 뮤린 SG의 추가 연구는 VA의 빛에 있는 자율 기능 장애를 추가로 특성화하기 위하여 보증됩니다. 이들은 SG23의생체 내 자극을 포함하는 기능적 실험4,23,44와 같은 뮤린 심혼의 내면을 연구하기 위한 다른 접근법에 의해 완료될 수 있다.
작은 크기와 흉부 구멍 내의위치(24)로인해 생체 내의 뮤린 SG를 조작하는 것은 쉽지만 성공적으로 수행되고 있다23. 이러한 이유로, 일부 연구는 따라서 목, 내부 및 외부 경동맥으로 경동맥 배분 뒤에 공감 사슬에 있는 SG의 상류에 있는 우수한 자궁 경부 신경통에집중24,35. 우수한 자궁 경부 신경의 제거를 통한 심장 기질은 심근 경색 후 심근 염증, 비대 증 및 심장 기능 장애를 감쇠하는 것으로나타났다(35) 그러나, 우수한 자궁 경부 간질이 심장의 다른 영역, 가장 눈에 띄게 전방측(45)을속이는 것을 주목하는 것이 중요하다. 또한, 최근 심층문학 검토는 심장의 공감내면에 대한 자궁경부 간리아의 역할이인간(46)에서불분명하다는 결론에 이르렀다. 이것은 심장 동정 내적 의 연구를 위한 SG를 특성화의 중요성을 강조합니다.
심장이 SG의 유일한 대상이 아니라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그 중에서도,앞포(48)의 폐(47)와 땀샘은 또한 SG에서 유래한 섬유로부터 내면화되고, 후자는 콜린 아세틸트랜스퍼라아제(37)를 발현할 때 교감생리학에 대한 예외이다. SG의 일시적인 봉쇄는 급성 폐손상(49)의 염증 과정에 관하여 또는 뜨거운 홍조 및 수면 기능 장애의치료를 위해 연구된다; 따라서 현재 프로토콜은 이러한 분야에서 기계주의 적 질문에 대한 레퍼토리를 제공할 수 있습니다. 심장 질환 모델에 초점을 맞출 때, 심장 뉴런이 비 심장뉴런(51)으로부터형태학적 또는 전기생리학적 특성으로 분화될 수 없다는 결과를 해석하기 위해 염두에 두어야 한다. 이는 역행 추적에 의해 달성될 수 있고, 그로 인해 심혼에 투사되는 뉴런의 위치는 SG52의크라니오 내측 부분에 위치한 것으로 나타났다.
또한, 다른 유형의 뉴런 외에도 교감 신경교는 신경교 마커 S100B53의발현에 의해 표시된 소위 위성 신경교 세포 또는 위성 세포인 ensheathing glia로 구성됩니다. 심혈관 병리학에서 이러한 세포의 역할에 대해서는 거의 알려져 없지만, 글리아세동 산성 단백질(GFAP)의 신경교 활성화 및 발현은 부정맥18을가진 환자로부터 SG에서 기술되었다.
일부 함정은 제시된 방법을 염두에 두어야 한다: 우리는 어떤 경우에 항체 기반 염색에 있는 불일치를 관찰하고 SG를 ensheaing 결합 조직 캡슐의 불완전한 제거가 잘못될 수 있다는 가설, 그들은 ganglia의 다른 모형 중 투과성에서 변화하기 위하여 기술되었기 때문에26. 미세포셉을 이용한 캡슐의 기계적 제거는 산후일1028일까지 쥐의 우수한 자궁경부 간절에 기재되어 있으며, 성인 쥐 SG54,55 및마우스(56)에대한 문헌에서 언급된다. SG 캡슐의 제거나이 사이 다를 수 있습니다28 그리고 – 크기 차이 때문에 – 종. 우리의 경험에서, 신선한 해부, 미세 한 집게를 사용하여 가능한 한 많은 결합 조직의 제거와 손에 프로토콜에 설명 된 바와 같이 철저한 투과성, 성공적인 염색을위한 중요한 요소입니다. 정량적 실시간 PCR에 관해서는, 빠른 작업및 효율적인 용해가 필수적입니다. 한 동물에게서 두 SG를 풀링하면 최대 12개의 다른 유전자(중복을 수행할 때)의 분석을 위해 안정적으로 허용되었습니다.
SG의 기능과 총 해부학은 수십 년 동안 연구되어 왔으며 모든 단일 심근세포는 공감 섬유46에의해 내면화되어 있지만 많은 열린 질문이 남아 있습니다. 예를 들어, SG의 교감 뉴런이 왜 허혈성21 및 비허혈성 심부전의 콜린성 표현형에 과도하게 변형되는지, 동물 모델뿐만 아니라환자(20)에서도불분명하다. 최근에, 우리 그룹은 심장신경계(29)에서발아하는 신경에 대한 뮤린 SG에도 존재하는 S100B 양성 신경교 세포의 역할을 설명했다. 이러한 세포는 VA11,12와관련 된 부상 후 교감 신경 발아에 대 한 관련 된 여부, 미래 연구에서 해명 될 필요가. 중요한 것은,광유전학(52) 및전사분석(36)과 같은 혁신적인 접근법은 교감 신경계와 심장 전기생리학에 대한 그 역할에 대한 이해를 심화시키기 위해 신경 추적과 같은 확립된 방법을 보완할 수 있다.
결론적으로, 이 레퍼토리는 미숙한 조사자가 심장 병역의 뮤린 모델에서 SG의 기본 특성화를 수행 할 수 있게합니다. 우리는 이것이 새로운 방법의 사용, 조합 및 창조를 자극할 수 있기를 바랍니다. 이 VA의 발병 및 유지 보수에 대 한 책임 있을 수 있습니다 공감 뉴런에 기본 세포와 분자 프로세스의 이해를 증가 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 그의 우수한 기술 지원에 대한 하트 위비히 Wieboldt 감사하고 싶습니다, 그리고 현미경및 지원을 제공하는 대학 의료 센터 함부르크 - Eppendorf의 UKE 현미경 이미징 시설 (Umif). 이 연구는 DZHK에 의해 투자되었다 (심장 혈관 연구를위한 독일 센터) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
References
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