Summary
Kardiyak otonom sinir sistemindeki patofizyolojik değişiklikler, özellikle sempatik branşında, ventriküler aritmilerin başlamasına ve korunmasına katkıda bulunur. Mevcut protokolde, alttaki moleküler ve hücresel süreçlerin anlaşılmasını geliştirmek için murine stellat gangliyonunun nasıl karakterize edilir olduğunu gösteriyoruz.
Abstract
Otonom sinir sistemi, kardiyak elektrofizyolojinin önemli bir sürücüsüdür. Özellikle sempatik dalının rolü, ventriküler aritmilerin (VA) patofizyolojisinde devam eden bir araştırma konusudur. Sempatik zincirin çift taraflı yıldız şeklindeki yapıları olan yıldız gangliyonlarındaki (SG) nöronlar sempatik altyapının önemli bir bileşenidir. SG, tedavi-refrakter VA'lı hastalarda kardiyak sempatik denervasyon yoluyla tedavi için tanınan bir hedeftir. VA'lı hastalarda SG'de nöronal remodeling ve glial aktivasyon tanımlanmış olmakla birlikte, aritmi başlangıcından önce potansiyel olarak altta kalan hücresel ve moleküler süreçler sadece yeterince anlaşılmamıştır ve otonom modülasyonu iyileştirmek için aydınlatılmalıdır. Fare modelleri sempatik nöronal yeniden şekillendirmeyi incelememize izin verir, ancak murine SG'nin tanımlanması deneyimsiz araştırmacı için zordur. Bu nedenle, murine SG'nin derinlemesine hücresel ve moleküler biyolojik çalışmaları birçok yaygın kardiyak hastalık için eksiktir. Burada, yetişkin farelerde SG'nin RNA düzeyinde analizler (gen ekspresyon analizleri için RNA izolasyonu, yerinde hibridizasyon), protein seviyesi (immünofluoresan bütün montaj lekelenmesi) ve hücresel düzeyde (temel morfoloji, hücre büyüklüğü ölçümü) incelenmesi ve incelenmesi için temel bir repertuar açıklıyoruz. Hazırlık tekniğindeki zorlukların üstesinden gelmek için potansiyel çözümler sunuyoruz ve otofluoresansların söndürülerek boyamanın nasıl iyileştirileceği. Bu, hücre kompozisyonunu ve yeniden şekillendirme süreçlerini belirlemek için nöronların yanı sıra glial hücrelerin yerleşik belirteçler aracılığıyla görselleştirilmesine izin verir. Burada sunulan yöntemler, SG'nin VA'ya eğilimli farelerde otonomik disfonksiyon hakkında daha fazla bilgi edinmesine izin verir ve kalpteki otonom sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerini araştıran ek tekniklerle tamamlanabilir.
Introduction
Kardiyak otonom sinir sistemi, kalbin uygun fizyolojik yanıtla çevresel değişikliklere uyum sağlamasını sağlayan sempatik, parasempatik ve duyusal bileşenlerin sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir dengesidir1,2. Bu dengedeki bozukluklar, örneğin sempatik aktivitenin artması, başlangıç için önemli bir sürücü olarak ventrikül aritmilerinin (VA) bakımı olarak belirlenmiştir3,4. Bu nedenle, beta-blokerlerle sempatik aktivitenin farmakolojik olarak azaltılması yoluyla elde edilen otonom modülasyon, on yıllardırVA'lıhastaların tedavisinde bir temel taşı olmuştur 5,6. Ancak farmakolojik ve kateter bazlı müdahalelere rağmen, ilgili sayıda hasta hala tekrarlayan VA7'denmuzdariptir.
Kalbe sempatik giriş çoğunlukla, beyin sapından kalbe çok sayıda intratorasik sinir yoluyla bilgi aktaran sempatik zincirin yıldız gangliyonlarındaki (SG) çift taraflı yıldız şeklindeki yapılarındaki nöronal hücre cisimleri aracılığıylaaracılıkeder 8 ,9,10. Yaralanmadan sonra SG'den filizlenen sinir VA ve ani kardiyak ölüm ile ilişkilidir11,12, SG'yi otonom modülasyon için bir hedef olarak vurgulayarak13,14. Kalbe sempatik girişin azaltılması geçici olarak lokal anesteziklerin perkütan enjeksiyonu ile veya video destekli torakoskopi ile SG'nin kısmen çıkarılması ile kalıcı olarak elde edilebilir15,16. Kardiyak sempatik denervasyon, umut verici sonuçlarla tedavi-refrakter VA'lı hastalar için bir seçenek sunar14,16,17. Bu hastaların eksiz SG'lerinden nöronal ve nörokimyasal remodeling, nöro-inflamasyon ve glial aktivasyonun otonomik disfonksiyona katkıda bulunabilecek veya ağırlaştırabilecek sempatik yeniden şekillendirmenin ayırt edici özellikleri olduğunu öğrendik18,19. Yine de, bu nöronlardaki altta yatan hücresel ve moleküler süreçler, örneğin, nöronal transdifferentiasyonun kolinerjik fenotip20,21'erolü gibi bugüne kadar belirsizliğini korumamaktadır. Deneysel çalışmalar VA'yı tedavi etmek için yeni yaklaşımlar sunar, örneğin, optogenetik22yoluyla sempatik sinir aktivitesinin azaltılması , ancak SG'nin derinlemesine karakterizasyonu VA ile birlikte giden birçok kardiyak patolojide hala eksiktir. Bu patolojileri taklit eden fare modelleri, aritmilerin başlangıcından önce potansiyel olarak12,23olan nöronal yeniden şekillendirmeyi incelemeye izin verir. Bunlar, kalbin ve sinir sisteminin otonom karakterizasyonu için daha fazla morfolojik ve fonksiyonel analizlerle tamamlanabilir. Mevcut protokolde, VA'nın anlaşılmasını geliştirmek için murine SG'yi parçalamaya ve karakterize etmeye izin veren temel bir yöntem repertuarı sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler Hamburg Eyaleti Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ORG870, 959) ve Kuzey Ren-Vestfalya Devlet Doğa, Çevre ve Tüketiciyi Koruma Ajansı (LANUV, 07/11) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne (2011) uygun. Çalışmalar, diyabet spontan mutasyonu (Leprdb)için erkek ve dişi (10-24 haftalık) C57BL/6 fareler (stok numarası 000664, Jackson Laboratuvarları) ve fareler homozigous (db/db) veya heterozygous (db/het; kontrol) kullanılarak gerçekleştirildi. BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, hisse senedi numarası 000642, Jackson Laboratories). Yazarlar, 60 haftaya kadar olan fareler için varyasyon olmadan eldeki protokolleri kullanmıştır.
1. Murine stellate gangliyonunun yeri ve diseksiyonu
NOT: Açıklamalar ve çizimler çoğunlukla daha büyük türlerde mevcut olsa da, bazı yayınlar daha önce sırasıyla anatomik yöntemler ve floresan muhabir çizgileri kullanarak sıçan24 ve fare25'te SG'nin yerini tanımlamaktadır.
- 50 mL buz gibi (3-4 °C) heparinize (20 birim/mL, bkz. Malzeme Tablosu) fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) SG'nin diseksiyonu gerçekleştirin.
- Kurumsal ve yerel yönergelere göre% 3-% 5 izofluran soluyarak fareyi derinden uyuşturun. Pedal çekme refleksini kaybederek yeterli anesteziyi doğrulayın. Farelerin kafasını kopar veya servikal çıkık gerçekleştirin.
NOT: Yanlış servikal çıkık omurganın kırılmasına ve sempatik zincirin hazırlanmasını veya kesilmesini engelleyen kanamaya yol açan torasik damarların hasar görmesine neden olabilir, böylece SG doğru konumda değildir. Bu nedenle, deneyimli personelin derin sedasyonda servikal çıkık veya hayvanların kafasının kesilmesini sağlamak önemlidir. - Cilde etanol püskürtün ve mayo makası ve dar desenli ön kılcal çizgiler boyunca iki kesi ile toraksı açın. Diyaframı kesin ve göğüs kafesinin önünü çıkarın.
- Londra tokmaklarını kullanarak diyaframın hemen üstündeki aort ve vena kavayı kavrayarak ve Strabismus makası ile aşağıdaki omurgaya yakın tüm damarları ve bağ dokusunu keserek kalp-akciğer paketini çıkarın.
- Tüm kan izleri giderilene kadar toraksı plastik tek kullanımlık pipet kullanarak heparinize PBS ile iyice yıkayın.
- Gövdeyi stereomikroskop hazırlama dürbünü altına yerleştirin ve dış ışık kaynaklarıyla toraksta iyi aydınlatma sağlayın.
- İlk kaburgayı ve longus colli kaslarını bulun.
NOT: SG, ilk kaburga ile omurga arasındaki daldaki omurgaya paralel olarak, longus colli kaslarına yanal bir olukta iki taraflı olarak bulunur24. SG'nin düz tarafı longus colli kaslarına bitişiktir. Preparata bağlı olarak, sempatik zincirin parçaları omurgaya paralel beyaz, eğik lifler olarak zaten görülebilir. Bunlar SG'ye kadar izlenebilir. - Bağ dokusu lateralini longus colli kasına maruz bırakmak için Dumont #5/45 tokalarının ucunu hafifçe kullanın.
- Toparlamaları 180° döndür ve SG'yi kavramak ve minimum basınçla çıkarmak için düz tarafı kullanın.
- İkinci SG ile tekrarlayın.
- Her iki SG'yi de soğuk PBS ile dolu bir tabağa (6 cm çapında) yerleştirin ve uygun büyütme ile inceleyin. Gerekirse, fazla damarları, yağ dokusunu ve daha büyük sinirleri çıkarın.
NOT: Otonom gangliyonlar kollajen lifleri ve fibroblastlardan oluşan bir bağ dokusu kapsülü ile çevrilidir26,27. Bu kapsüllerin geçirgenliği türler arasında, farklı gangliyontürü 26 ve yaş28arasında değişiyor gibi görünüyor. Dumont #5/45 #5 ve gerekirse yay makası kullanarak mümkün olduğunca çok bağ dokusunu çıkarın. - Deneyin amacına bağlı olarak, bu protokolün bölüm 2, 3 veya 5'ine geçin.
2. Tüm montaj immünhistokimya protokolü
NOT: Bu protokol kardiyak bütün montaj lekelerinden uyarlanmıştır4,29. Her bir SG için kuluçka adımlarını 96 kuyu plakasının bir kuyusunda gerçekleştirin ve tam kapsama sağlamak için çözeltinin 200 μL'sine (diğer tüm çözümler için) 100 μL (antikor içeren çözeltiler için) kullanın. SG'nin kapsamını ve doğru daldırmasını dürbünle düzenli olarak kontrol edin. Sıvıları 200 μL ucun üzerine ek 10 μL uçlu 200 μL pipetle manuel olarak çıkarın. Bu, pipet ucundaki SG'nin aspirasyonunu önleyecektir. Bakteri üremesini önlemek için yeni hazırlanmış çözeltiler ve steril sıvılar kullanın.
- Histoloji için SG'i %4 metanol içermeyen paraformaldehit (PFA)/PBS'de RT'de 2 saat boyunca düzeltin.
- SG'yi mümkün olduğunca çabuk işleyin, ancak bu noktada% 0.02 (w / v) sodyum azit ile PBS'de 4-6 ° C'de 2-4 hafta saklanabilirler.
- Sudan siyah stok çözeltisini hazırlayın (%100 etanolde%1 Sudan siyah w/v) otofluoresansın azaltılması ve sinyalin arka plan oranına iyileştirilmesi için30. RT'de manyetik karıştırıcıda 2-3 saat çözün.
NOT: Stok çözeltisini en fazla 6-8 hafta kullanın, sedimasyon göründüğünde daha erken atın. - Enkazı gidermek için stok çözeltisini tam hızda (13.000 x g)30 dakika santrifüjleyarak ve stoku% 70 etanolde% 0.25 Sudan siyahı nihai konsantrasyonuna seyrelterek Sudan siyah çalışma çözümünü hazırlayın.
- Antikor permeabilizasyonunu iyileştirmek için SG'yi Dent'in çamaşır suyu ile tedavi edin31. Metanol (MeOH), hidrojen peroksit çözeltisini H2O'da %30 (w/w) ve dimetil sülfit (DMSO) 4:1:1 oranında karıştırarak Dent'in çamaşır suyunu yeni hazırlayın. SG başına 200 μL ekleyin ve plakayı RT'de 1 saat boyunca bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin.
- Yörüngesel çalkalayıcıda her biri 10 dakika kuluçkaya yatırarak rehidrasyon için alçalan bir MeOH serisi gerçekleştirin: %100 MeOH, %75 MeOH/PBS, %50 MeOH/PBS, %25 MeOH/PBS.
- RT'de PBS/%1 Triton-X-100'de SG'yi her biri 60 dakika boyunca iki kez inkübe ederek permeabilizasyon gerçekleştirin.
- SG'den permeabilizasyon çözümünü çıkarın ve Sudan siyah çalışma çözümünü ekleyin. Yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 2 saat kuluçkaya yatır.
- Bu arada PBS 15 mL'lik bir kapta %5 reseptör sınıfı sığır serum albümini (BSA) ve %0,1 Triton-X-100 ekleyerek bir blokaj çözeltisi hazırlayın ve yaklaşık 5-10 dakika boyunca bir makara çalkalayıcı üzerinde çözünmesini sağlayın. Enkazı kaldırmak için önceden pileli bir kağıt filtreden dekant.
- Plakayı yatırarak ve dik taraftan dikkatlice pipetleyarak Sudan siyahını çok dikkatli bir şekilde çıkarın.
NOT: Sudan'da SG'yi siyah görmek mümkün değildir. Güçlü bir ışık kaynağı kullanın ve yavaşça çalışın. Bu adımdan itibaren, SG siyah lekeli ve görünürlüğü artırır. Bu noktada SG'yi çevreleyen herhangi bir ek bağ dokusu görülürse, Dumont #5/45 arsip ve yay makası kullanarak çıkarın. - 200 μL PBS/%0,1 Triton-X-100 (PBS-T) ekleyin ve yörüngesel bir çalkalayıcıda RT'de 5 dakika yıkayın.
- PBS-T'yi pipetle aspire ederek çıkarın ve 2 kez tekrarlayın.
- PBS'yi kaldırın; 200 μL blokaj çözeltisi ekleyin ve yörüngesel bir çalkalayıcıda bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün, blokaj çözeltisinin içine birincil antikorlar ekleyerek çözümler hazırlayın. Antikor konsantrasyonlarını belirlenen protokollerden uyarlar.
NOT: Birincil antikor olmadan antikor kontrolü olarak bir SG ekleyin (varsa antijen-preabsorbed antikor veya IgG ile inkübe edilmiş veya tamponu bloke edin). - Orbital çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de 36-48 saat boyunca primer antikor inkübasyonu gerçekleştirin. Hücre büyüklüğü ölçümleri ve sempatik nöronların lekelenmesi için tirozin hidroksilaz'a karşı antikor kullanın (antikor önerileri için Malzeme Tablosu'ne bakın).
NOT: Bu noktada buharlaşmayı önlemek için 96 kuyu plakasını ıslak bir odaya (örneğin, ddH2O-ıslatlanmış kağıt havlularla kaplı plastik kutu) yerleştirin. - Antikor çözeltisini dikkatlice çıkarın ve 200 μL PBS-T ekleyin. Plakayı 30 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- PBS-T'yi çıkarın ve yıkama adımını 5 kez daha tekrarlayın.
- Floresan Alexa etiketli ikincil antikorları kullanımdan önce tam hızda (13.000 x g) 1 dakika santrifüj ederek ikincil antikor çalışma solüsyonini hazırlayın. Uygun ikincil antikorları blokaj çözeltisinde 1:500 birincil antikorlara göre seyreltin ve SG'ye ekleyin. Nükleer lekelenme isteniyorsa 1 μg/mL bisbenzimide H33342 trihidrochloride (Hoechst boyama) ekleyin. Yörüngesel bir çalkalayıcıda 4 °C'de 12-24 saat kuluçkaya yatır.
- Antikor çözeltisini dikkatlice çıkarın ve 200 μL PBS-T ekleyin. Plakayı 30 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- PBS-T'yi çıkarın ve yıkama adımını 5 kez daha tekrarlayın. Son adım için, Triton olmadan PBS kullanın.
- Gömmek için, 50-100 μL floresan montaj ortamını (bkz. Malzeme Tablosu)bir cam kaydırağa yayın ve hazırlama dürbünü altına yerleştirin. 96 kuyulu plakadan SG almak ve bir ucını bir filtre kağıdına (örneğin, Whatman kurutma pedi) batırarak fazla sıvıyı çıkarmak için Dumont #5/45 toparlalarını kullanın ve damlaya yerleştirin.
- Uygun büyütme ile konumlandırmayı düzeltmek için Dumont #5/45 tozlarını kullanın.
- SG'nin yanına hafifçe bir cam kapak kılıfı (20 mm x 20 mm) yerleştirin ve yavaşça alçalın.
NOT: Çok fazla montaj ortamı kullanmak SG'nin hareketine veya sinirlerin karışmasına neden olur. Bu durumda, kapak kapağını hızla çıkarın ve 2.9-2.21 adımlarını tekrarlayın. - RT'de slaytların bir gecede karanlıkta kurumasına izin verin Lekeli numunenin depolanmasının 4 °C'de en az 4-6 hafta boyunca mümkün olması mümkündür.
3. Tüm montaj yerinde hibridizasyon
NOT: SG'nin tüm montajlı yerinde hibridizasyonu, corti32'nin organından ve ticari RNA floresan in situ protokolünden uyarlanmıştır (bkz. Malzeme Tablosu). Tedarikçiden ilgi genleri ve tamponlar ve çözümler için problar alın. Aksi belirtilmezse, tüm kuluçka adımları RT'de gerçekleştirilir. Steril PBS kullanın. Bir kuyuda birkaç SG'yi boyamak istiyorsanız, en az 150 μL tampon ve çözelti kullanın.
- 1.1-1.13 adımlarında açıklandığı gibi SG'nin diseksiyonu gerçekleştirin.
- SG'nin yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirilmiş 96 kuyulu bir plakanın bir kuyusunda %4 MeOH içermeyen PFA/PBS'nin 200 μL'sinde 1 saat sabitle.
- SG'yi yörüngesel bir çalkalayıcıda %0,1 Ara-20/PBS'de her biri 30 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- MeOH/PBS serisindeki susuz SG, yörüngesel çalkalayıcıda her biri 10 dakika boyunca %50 MeOH/PBS, %70 MeOH/PBS ve %100 MeOH inkübasyon ile.
- SG'i bir gecede %100 MeOH'da -20 °C'de saklayın.
- Ertesi gün, inkübatörden 40 ° C'ye önceden ısıtın. Sıcaklığı bir termometre ile kontrol edin.
- SG'yi ters MeOH/PBS serisinde (%100 MeOH, %70 MeOH/PBS, %50 MeOH/PBS) her biri 10 dakika boyunca yeniden su verin.
- PBS'de her biri 5 dakika boyunca SG'yi üç kez yıkayın.
- Bu arada, probları 40 °C'de 10 dakika kuluçka ile önceden ısıtmaya ve ardından 10 dakika soğutmaya başlayın.
- 15 dakika boyunca 200 μL Proteaz III'te SG'yi kuluçkaya yatırın.
- İsteğe bağlı: Sonraki immünoresans lekeleme planlanırsa, bu protokolün 2.3, 2.4 ve 2.8 bölümlerine göre otofluoresansı söndürmek için Sudan siyah tedavisi gerçekleştirin.
- SG'yi 200 μL'de % 0,1 Ara-20/PBS 3x'te yörüngesel bir çalkalayıcıda 5 dakika boyunca yıkayın.
- İsteğe bağlı: Birkaç probla birlikte boyama isteniyorsa, Kanal-1 probunda (1x) Kanal-2 (50x) ve Kanal-3 problarını (50x) seyreltin.
- İlgi genini 100 μL prob ile örtün ve hafif ajitasyonla 40 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. 96 kuyu plakasını tüm kuluçka adımları için 40 °C'de ıslak bir odaya yerleştirin.
NOT: Daha sonraki adımlarda amplifikasyon reaktiflerinin spesifik olmayan bağlanmasını kontrol etmek için bakteri geni (örneğin dihidro-dipikolinat redüktaz, Dapb)aleyhinde bir prob kullanarak negatif kontrol olarak bir SG ekleyin. - SG'yi orbital çalkalayıcıda her biri 15 dakika boyunca 3x yıkama tamponunda yıkayın.
- Önceden ısınan Amp1-3, HRP-C1 ve RT'ye HRP-Blocker. Kanal-2 ve/veya Kanal-2 probu ile birlikte boyama isteniyorsa, önceden ısınır HRP-C2 ve HRP-C3.
- Yörüngesel çalkalayıcıda %4 PFA/PBS'de SG'i RT'de 10 dakika boyunca yeniden sabitle.
- RT'de yörüngesel çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 200 μL'lik birlikte verilen yıkama tamponunda SG'yi yıkayın.
- Amplifikasyon için, yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 35 dakika boyunca 100 μL Amp1 ile SG'yi kuluçkaya yatırın.
- Herhangi bir sıvıyı dikkatlice çıkarın ve SG'yi 200 μL'de 3x birlikte verilen yıkama tamponunda 5 dakika boyunca RT'de bir yörünge çalkalayıcıda yıkayın.
- Yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 35 dakika boyunca 100 μL Amp2 ile SG'yi kuluçkaya yatırın.
- 3.18.
- Yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 20 dakika boyunca 100 μL Amp3 ile SG'yi kuluçkaya yatırın.
- 3.18.
- SG'yi 100 μL ile kuluçkaya yatırın Multiplex FL v2 HRP-C1, yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 20 dakika boyunca.
- 3.18.
- Opal konjuge ikincil antikoru 200 μL'de 1:1.000 TSA tamponu hazırlayın ve yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 35 dakika boyunca SG'yi kuluçkaya yayalım. Kuluçka sırasında ışıktan ve bu adımdan koruyun.
- 3.18.
- SG'yi 100 μL'de kuluçkaya yatırın Multiplex FL v2 HRP-bloker, yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 15 dakika boyunca.
- 3.18.
- İsteğe bağlı: Kanal-2 probu ile birlikte boyama için, birlikte verilen Multiplex FL v2 HRP-C2 ile 3.25-3.30 adımlarını yineleyin.
- İsteğe bağlı: Kanal-3 probu ile birlikte boyama için, birlikte verilen Multiplex FL v2 HRP-C3 ile 3.25-3.30 adımlarını yineleyin.
- Sonraki immünoresan lekeleme durumunda, bu protokolün 2.13-2.25 adımlarını uygulayın.
- Yörüngesel çalkalayıcıda 30 dakika boyunca %1 BSA/PBS'de kuluçkaya yatır.
- Nükleer lekelenme isteniyorsa, 1 μg/mL bisbenzimide H33342 trihidroklorür (Hoechst boyama) içinde 30 dakika boyunca SG'yi % 1 BSA/PBS'de kuluçkalayın ve/veya yörüngesel bir çalkalayıcıya Alexa-bağlantılı buğday tohumu agglutinin (WGA, 1:500) ekleyin.
- 3.18.
- 2.19-2.22 adımlarında açıklandığı gibi katıştır.
4. Murine stellat gangliyonlarının görüntülenmesi ve analizleri
- Yerel görüntüleme tesisinde gömülü SG'nin konfokal mikroskopisini gerçekleştirin.
- Hücre boyutu ölçümleri gerekiyorsa, 200x büyütmede tirozin hidroksilaz için lekeli görüntü SG (bkz. Malzeme Tablosu)ve her SG'den 4-6 rastgele görüntü alın.
- Hücre boyutunu tahmin etmek için ImageJ33 yazılımını kullanarak görüntüleri analiz edin (örneğin, kalem tablosuyla bkz. Malzeme Tablosu). Serbest El Seçimi'|kullanın, her hücreyi daire içine alıp Analiz Et'e tıklayın Hücre alanı elde etmek için ölçün. Sadece SG içinde iyi bulunan sağlam, tamamen görünür hücreleri dahil etmeye dikkat edin.
- Bu yöntemi kullanarak, SG başına yaklaşık 100 hücrenin ölçümünü gerçekleştirin.
- Farklı farelerden SG'yi karşılaştırmak istiyorsanız kör bir araştırmacının 4.2-4.3 adımlarını gerçekleştirmesini isteyin. Gruplar arasındaki boyut farklarını görselleştirmek için istatistiksel yazılımda bir frekans dağılımı kullanın34.
5. Murine stellat gangliyonlarının moleküler analizleri
NOT: Deneysel tasarımınıza bağlı olarak kontrolleri ekleyin. Bu, sempatik üst servikal ganglion (boyun bölgesinde bulunur, Ziegler ve ark.35'teayrıntılı açıklamaya bakın) veya parasempatik gangliyon (intradiyak gangliyon gibi, Jungen vd.4gibi) gibi farklı genotiplere ve hastalık geçmişine ve / veya diğer otonom gangliyonlara sahip SG olabilir.
- Hayvan başına 500 μL fenol/guanidin tiyosiyanat çözeltisi (örneğin, Qiazol) içeren 2 mL'lik bir tüp hazırlayın ve şok-buzlanmaya hazır sıvı nitrojene sahip olun veya RNA'nın korunması için ticari çözümleri düşünün (isteğe bağlı, bkz. Malzeme Tablosu)36. RNA yalıtımı için hızlı bir şekilde çalışın.
- 1.1-1.13 adımlarında açıklandığı gibi SG'nin diseksiyonu gerçekleştirin.
- Her iki SG'yi de fenol/guanidin tiyosiyanat çözeltisi ve sıvı nitrojendeki şok-don tüpü ile hemen tek bir tüpe daldırin.
- Bir sonraki işleme kadar -80 °C'de saklayın.
- Doku lizisi için, fenol/ guanidin tiyosiyanat çözeltisi sıvılaştırılına kadar SG'li tüplerin çözülmesine izin verin ve iki adet 7 mm paslanmaz çelik boncuk ekleyin. Doku homojenizatörün metal kısımlarını (top veya mikser değirmeni, örneğin Doku Lyser II) kuru buz ve santrifüj üzerinde 4 °C'de soğutun.
- SSG'nin tüpün altında olması için 4 °C'de 1 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj tüpleri.
- Doku Lyser ve lyse'nin metal kısımlarına 20 Hz'de 1 dakika tüp koyun.
- Sağlam bir doku tespit edilemeyene kadar 5.6 ve 5.7 adımlarını 5 kata kadar tekrarlayın.
- Sıvıyı taze bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- Üreticinin talimatlarına göre sütun tabanlı bir RNA yalıtım kiti (örneğin, miRNeasy mini kit) ile RNA yalıtımı gerçekleştirin.
- 20 μL RNaz içermeyen suda Elute RNA ve spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçün.
NOT: Saflaştırılmış RNA'nın genomik DNA ile kirlenmesini dışlamak için, genomik astarlarla bir polimeraz zincir reaksiyonu ve şablon olarak 1 μL RNA gerçekleştirmeyi öneriyoruz, bunun yerine eksi ters transkriptaz kontrolü. Bu, önemli miktarda RNA tasarrufu sağlayacaktır. RNA kirlenmişse, sonraki nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu için ekson-intron sınır astarları veya intron kanat astarları kullanın. - CDNA sentezi gerçekleştirmek ve belirlenmiş protokolleri kullanmak için 250 ng SG RNA kullanın. Burada üreticinin talimatlarına göre yüksek kapasiteli bir cDNA ters transkripsiyon kiti kullanılmıştır.
- 2,5 ng/μL cDNA'lık son konsantrasyona seyreltin ve belirlenen protokollere göre uygun problarla nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirin. Burada, TaqMan Assay (bkz. Malzeme Tablosu)reaksiyon başına 10 ng cDNA kullanılarak gerçekleştirildi.
NOT: Yanlış pozitif sonuçları dışlamak için her gen için şablonsuz kontrol gerçekleştirin. - Farklı SG grupları arasındaki bağıl gen ekspresyonunu karşılaştırmak için ilgi geninizin gen ekspresyonunu gen tutan bir evde (örneğin, Cdkn1b)normalleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, SG'nin nasıl tanımılacağını ve inceldiğini görselleştirir. Şekil 1A, konumun şematik bir çizimini gösterirken, Şekil 1B, kalp-akciğer paketinin çıkarılmasından sonra görünümü toraksa sunar. SG ve göğüs kafesinden gelen sol ve sağ longus colli kasları oryantasyon için önemli yerlerdir. Diseksiyon kaslar ve ilk kaburga arasındaki noktalı çizgiler boyunca gerçekleştirilir. SG ve sempatik zincir beyaz yapılar olarak görünür hale gelir (Şekil 1C). Şekil 1D sol longus colli kası ile sol SG'nin bulunduğu ilk kaburga arasındaki bölgenin büyütüldüğü göstermektedir. SG morfolojisi bireyler arasında farklılık gösterir. Genellikle alt servikal ve üçüncü torasik gangliyon24'ünbir birleşiminden oluşur. Deneycinin murine SG'de bekleyebileceği bazı çeşitlilik Şekil 1E, F,beş erkek C57Bl6 vahşi tip farenin sol ve sağ SG'sinde fotoğraflanmıştır.
Brüt anatomik genel bakışın değerlendirilmesi ve kalbi içselleştiren SG'deki hücrelerin hücresel ve hücre altı analizleri protein ve RNA düzeyinde tüm montaj teknikleri ile yapılabilir. Bir SG'ye genel bakış Şekil 2'de sunulmuştur. Miyokard sempatik lifler SG'deki hücre vücutlarından kaynaklanır. Bunlar tirozin hidroksilaz 'a (TH) karşı bir antikor ile boyanarak görselleştirilir. TH ekspresyon nöronal somata kolin asetiltransfenaz (ChAT) için pozitif lekelenen sinir lifleri ile çevrilidir. Bunlar büyük olasılıkla presynaptik liflerdir37,38. Şekil 2A'daTH ve ChAT ortak etiketlemesinden örnek bir büyütme sunulmuştur. Nöronal hücre cisimlerini çevreleyen glial hücreler S100B için boyanarak görselleştirilebilir. Bu, PGP9.5 sinir işaretçisi ile birlikte Şekil 2B'de tasvir edilir. Şekil 2C-F, SG'yi hücre altı düzeyde incelemek için örnek analizler gösterir, tüm montaj in situ hibridizasyonu ve immünofluoresan ko-boyama kullanarak. Tubb3'ün TH (Şekil 2C, kırmızı) ve mRNA molekülleri (Şekil 2D, beyaz) proteini büyük nöronal hücre gövdelerinde ifade edilirken, S100b'nin mRNA'si(Şekil 2E, yeşil) çevredeki glia hücrelerinde de tespit edilebilir. Birleştirmede (Şekil 2F), bazı nöronların TH için negatif olduğu görülebilir, ancak Tubb3'ü ifade eder, S100b mRNA'lar da şekil 2G'dekibüyütmede gösterildiği gibi çevredeki hücrelerde tespit edilebilir.
Şekil 3, murine SG'yi incelemek için potansiyel nicel analizler ve tuzaklar sunun. Kontrolden nöronal somata (db/het) SG 388.8 ± 123.8 μm2 vs. diyabetik SG (db/db) 407.33 ± 139.6 μm2 (Şekil 3B, n = 2 SG, genotip başına SG başına 100 hücre, P = 0.348, veriler Mann-Whitney testi kullanılarak karşılaştırıldı). Şekil 3C, SG'nin farklı hücre tiplerinden gelen genlerin ekspresyonını göstermektedir (n = 6-7). Her iki SG'nin bir hayvandan havuza bindirilmeleri, yaklaşık 24 tahlilin (kopyalarda 12 gen) gen ekspresyon ölçümlerine izin verir. Diğer hücre tiplerini ve diseksiyonun nöronal saflığını hesaba katmak gerekiyorsa, cdkn1b (Ct değerleri 25.4 ± 0.97)'nin yanı sıra nöronal işaretleyici Neun/Rbfox3 (32.5 ± 0.7) için örnekleri normalleştiririz. SG'deki moleküler süreçleri karakterize etmek için yararlı bulduğumuz genler arasında sempatik gen Th (22.4 ± 1.6), Chat, kolinerjik transdifferentiasyonu gösterebilir (Ct değeriyle ifade edilir). 30.8 ± 1.3) ve Gap43, nöronal filizlenme için bir belirteç (22.4 ± 1.4 Ct değerlerinde tespit edilebilir). Nöronal olmayan hücre tipinde ifade edilen genler arasında S100b (glial hücreler için 27.3 ± 1.2), Ki-67 (hücrelerin çoğalması için, 33.0 ± 1.6) ve Cd45 (bağışıklık hücreleri için 30.2 ± 1.1) sayıldı.
SG, Şekil 3D,E'dehematoksilin ve eozin boyama ile görselleştirilen26bağ dokusu kapsülü ile çevrilidir. Bazen, antikor bazlı lekelenmede tutarsızlıklar gözlemledik Şekil 3F'de gösterildiği gibi , büyük olasılıkla kapsülün eksik çıkarılması nedeniyle. ChAT ve TH lekeleme sadece SG'nin bazı bölgelerinde tespit edilebilirken, DAPI ile karşılanan çekirdekler boyunca tespit edilebilir. Birleştirilen görüntüdeki noktalı çizgi, başarılı boyamayı (çizginin sağında) başarısız boyamadan (çizginin solunda) ayırır.
Veriler standart sapmanın ortalaması ± olarak sunulur. İstatistiksel anlamlılık P değeri olarak 0,05 < olarak tanımlanmıştır; istatistiksel analiz ticari yazılım kullanılarak gerçeklenmiştır.
Şekil 1: Murine stellat gangliyonunun yeri, diseksiyonu ve morfolojisi. (A) Yıldız gangliyonunun (SG) konumunun şematik çizimi. (B) Kalp-akciğer paketinin çıkarılmasından sonra toraksa görüntüleyin. SG'nin çoğu zaman hemen görünmediğini belirtmek önemlidir. Longus colli kasları omurgadan lateral olarak bulunur. SG, ilk kaburga ile kavşaktaki kaslardan yanal olarak bulunur. Gangliyayı ortaya çıkarmak için kasları (noktalı çizgi ile işaretlenmiş alan) dikkatlice parçalara çıkarın. Diseksiyondan sonra gangliyon (sırasıyla sol ve sağ, LSG ve RSG) ve sempatik zincir beyaz, uzun yapılar olarak yapılabilir. (C) Gangliyon ve anatomik simgesel yapıları gösteren örnek bir diseksiyon. (D) LSG'nin büyüttilmesi. (E) LSG ve (F) RSG vahşi tipten, erkek C57Bl6 fareler (16 hafta) morfoloji ve boyuttaki varyasyonları göstermek için parçalandı ve fotoğraflandı. Ölçek çubuğu 1.000 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Murine stellat gangliyonlarında farklı hücre tiplerinin tüm mount immünhistokimya ve yerinde hibridizasyon yoluyla görselleştirilmesi. (A) Sempatik belirteç tirozin hidroksilaz (TH) ve kolin asetiltransfenaz (ChAT) için boyanmış bir murine yıldız ganglionuna (SG) brüt genel bakış. Büyütme, TH pozitif hücre cisimlerini ve nöronal somatayı çevreleyen ChAT pozitif, büyük olasılıkla presynaptik, sinir liflerinin varlığını gösterir. (B) Nöronal hücre cisimlerini saran glial hücreler, burada nöronal belirteç PGP9.5 ile birlikte S100B için boyanarak görselleştirilebilir. (C,D,E,F) Bir SG'den mikroskobik görüntüler, TH (kırmızı) için immünhistokimya ve Tubb3 (D, beyaz) ve S100b (E, yeşil) için yerinde hibridizasyon kombinasyonu ile tüm montajı lekeledi. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşıttır. (F) Birleşme, tüm nöronal(Tubb3-pozitif) hücrelerin TH pozitif olmadığını göstermektedir. S100b mRNA'lar nöronal somata içinde tespit edilebilir, aynı zamanda hücreleri çevreleyen, büyütmede bir okla işaretlenmiş olarak (G). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Potansiyel nicel analizler ve tuzaklar. (A) Tirozin-hidroksilaz (TH) lekeli SG'den görüntüler ImageJ kullanılarak hücre boyutu ölçümleri için kullanılabilir. (B) Bu diyabetin bir fare modelinde gerçekleştirildi (SG başına 100 hücre, genotip başına n = 2 SG, veriler Mann-Whitney testi kullanılarak karşılaştırıldı). (C) SG'de ifade edilen ve moleküler süreçleri karakterize etmek için yararlı olabilecek örnek genler. Cdkn1b ve nöronal belirteç Neun/Rbfox3 (diğer hücre tiplerinin varlığını hesaba katmak için) normalleşme için kullanılabilir. Tirozin hidroksilaz (Th) kollnerjik transdifferentiation için sempatik bir belirteç, kolin asetiltransfelaz (Sohbet), nöronal filizlenme için Gap43 olarak hizmet eder. Nöronal olmayan hücre tiplerinde ifade edilen genler arasında S100b (glial hücreler), Ki-67 (çoğalyan hücreler) ve Cd45 (bağışıklık hücreleri) sayıldı. (D) Formalin sabitI bir SG'nin hematoksilin ve eozin lekelenmesi, SG'nin üstündeki bağ dokusunu ve hücrelerini görselleştirir. (F) Bazı durumlarda, antikor bazlı lekelenmede, büyük olasılıkla kapsülün eksik çıkarılması nedeniyle başarısızlık gözlemledik. ChAT (kırmızı) ve TH (yeşil) boyama sadece SG'nin bazı bölgelerinde tespit edilebilirken, DAPI (koyu mavi) ile basamaklanmış çekirdek sayaçları boyunca tespit edilebilir. Birleştirilen görüntüdeki noktalı çizgi, başarılı boyamayı (çizginin sağında) başarısız boyamadan (çizginin solunda) ayırır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Va başlangıcından önce sempatik sinir sisteminin nöronlarında ve glial hücrelerinde hücresel ve moleküler süreçlerin anlaşılması, ani kalp durması dünya çapında en yaygın ölüm nedeni olmaya devam ettiği için yüksek ilgi çekicidir5. Bu nedenle, mevcut yazıda, bu ağdaki bir murine elemanı olan murine SG'yi tanımlamak ve RNA, protein ve hücresel düzeyde sonraki analizleri yapmak için temel bir yöntem repertuarı sunuyoruz.
Murine SG'nin bir zorluğu büyüklüğü ve sınırlı sayıda hücre39. Bu nedenle, sıçanlar40, köpekler22ve domuzlar41 gibi farklı hayvan modelleri SG ile ilgili çalışmalar için kullanılır. Yine de, farelerde bulunan kardiyak fenotipler için çeşitli köklü hastalık modelleri vardır ve bunlardan bazıları zaten diyabet23,miyokard enfarktüsü42veya miyokardit43modelleri gibi kardiyak innervasyon ve aritmi farklı yönleriyle karakterize edilmiştir. Bu nedenle, murine SG'nin daha fazla çalışması, VA ışığında otonomik disfonksiyonu daha da karakterize etmek için garanti edilir. Bunlar, SG23'ünin vivo stimülasyonu da dahil olmak üzere fonksiyonel deneyler4,23,44 gibi murine kalbinin innervasyonunu incelemek için diğer yaklaşımlarla tamamlanabilir.
Küçük boyutu ve torasik boşluk içindeki konumu nedeniyle24, murine SG in vivo manipülasyonu, başarıyla gerçekleştirilmesine rağmen23. Bu nedenle, bazı çalışmalar bu nedenle, boyunda daha erişilebilir bir şekilde bulunan üstün servikal gangliyonlara, karotis çatallanmasının arkasındaki sempatik zincirde SG'nin yukarı akışına odaklanır iç ve dış karotis arterlere24,35. Üstün servikal gangliyonun çıkarılması yoluyla kardiyak denervasyonun miyokard enfarktüsünden sonra miyokard iltihabı, hipertrofi ve kardiyak disfonksiyonu azalttığu gösterilmiştir35. Bununla birlikte, üstün servikal gangliyonun kalbin farklı bölgelerini, en belirgin olarak ön tarafı45'i içselleştirdiğini belirtmek önemlidir. Ek olarak, yakın zamanda yapılan derinlemesine bir literatür incelemesi, servikal gangliyonun kalbin sempatik innervasyonu üzerindeki rolünün insanlarda belirsizliğini koruduğu sonucuna vardı46. Bu, kardiyak sempatik innervasyon çalışmaları için SG'nin karakterizeinin önemini vurgulamaktadır.
SG'nin tek hedefinin kalp olmadığını belirtmek önemlidir. Diğerleri arasında, akciğerler47 ve forepaw48 ter bezleri de SG kökenli liflerden içselleştirilmiştir, ikincisi kolin asetiltransfenaz37ifade ettikleri için sempatik fizyolojinin bir istisnasıdır. SG'nin geçici ablukası, akut akciğer hasarı49'daki enflamatuar süreçler veya sıcak floşların ve uyku disfonksiyonunun tedavisi için incelenir50; bu nedenle, eldeki protokoller bu alanlardaki mekanistik sorular için bir repertuar sunabilir. Kardiyak hastalık modellerine odaklanırken, kardiyak nöronların morfoloji veya elektrofizyolojik özelliklerle kardiyak olmayan nöronlardan ayırt edilemeyeceği sonuçların yorumlanması için akılda tutulmalıdır51. Bu retrograd izleme ile elde edilebilir, böylece kalbe yansıtılan nöronların yerinin SG52'ninkraniyo-medial kısımlarında bulunduğu gösterilmiştir.
Ek olarak, farklı nöron türlerinin yanı sıra, sempatik gangliyonların ensheathing glia, sözde uydu glial hücreleri veya glial işaretleyici S100B53ifadesi ile işaretlenmiş uydu hücrelerinden oluşuyor olduğunu belirtmek önemlidir. Bu hücrelerin kardiyovasküler patolojilerdeki rolü hakkında çok az şey bilinmekle birlikte, glial fibril asidik proteinin (GFAP) glial aktivasyonu ve ekspresyasyonu Aritmisi olan hastalardan SG'de tanımlanmıştır18.
Sunulan yöntemlerle bazı tuzaklar akılda tutulmalıdır: bazı durumlarda antikor bazlı boyamada tutarsızlıklar gözlemledik ve farklı gangliyon türleri arasında geçirgenlik olarak tanımlandıkları için SG'yi saran bağ dokusu kapsülünün eksik çıkarılmasının hatalı olabileceğini varsaydık26. Kapsülün ince forseps kullanılarak mekanik olarak çıkarılması, sıçanların 1028. SG kapsülünün çıkarılması28 yaş ve – boyut farklılıkları nedeniyle – türler arasında değişebilir. Deneyimlerimize göre, taze diseksiyon, ince forseps kullanılarak mümkün olduğunca bağ dokusunun çıkarılması ve eldeki protokolde açıklandığı gibi iyi permeabilizasyon, başarılı boyama için önemli faktörlerdir. Nicel gerçek zamanlı PCR ile ilgili olarak, hızlı çalışma ve verimli liziz esastır. Her iki SG'nin bir hayvandan birleştirilmesi, 12 farklı genin analizi için güvenilir bir şekilde izin verilir (çoğaltmalar yapılırken).
SG'nin işlevi ve brüt anatomisi on yıllardır çalışılsa ve her kardiyomiyosit sempatik lifler tarafından içselleştirilse de46, birçok açık soru devam etmektedir. Örneğin, SG'nin sempatik nöronlarının neden iskemik21 ve iskemik olmayan kalp yetmezliğinde, hayvan modellerinde ve hastalarda20'dekolinerjik fenotipe geçici olarak transdifferentiate olduğu belirsizliğini korumaktadır. Son zamanlarda, grubumuz, murine SG'de de bulunan S100B pozitif glial hücrelerin kardiyak sinir sisteminde filizlenen sinir üzerindeki rolünü tanımladı29. Bu hücrelerin VA11 , 12ile ilişkili yaralanmadan sonra sempatik sinir filizlenmesi ile ilgiliolupolmadığı, gelecekteki çalışmalarda aydınlatılmalıdır. Daha da önemlisi, optogenetik52 ve transkriptome analizleri36 gibi yenilikçi yaklaşımlar, sempatik sinir sisteminin anlaşılmasını ve kardiyak elektrofizyoloji üzerindeki rolünü derinleştirmek için nöronal izleme gibi yerleşik yöntemleri tamamlayabilir.
Sonuç olarak, bu repertuar deneyimsiz araştırmacının kardiyak patolojilerin murine modellerinde SG'nin temel bir karakterizasyonunu gerçekleştirmesini sağlar. Bunun yeni yöntemlerin kullanımını, kombinasyonunu ve oluşturulmasını teşvik edeceğini umuyoruz. Bu, VA'nın başlangıcından ve bakımından sorumlu olabilecek sempatik nöronlarda alttaki hücresel ve moleküler süreçlerin anlaşılmasını artırmaya yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Hartwig Wieboldt'a mükemmel teknik yardımı için ve Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi UKE Mikroskopi Görüntüleme Tesisi'ne (Umif) mikroskop ve destek sağladığı için teşekkür ediyor. Bu araştırma DZHK (Alman Kardiyovasküler Araştırmalar Merkezi) [FKZ 81Z4710141] tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
References
- Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
- Jänig, W.
- Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
- Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
- Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
- Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
- Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
- Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
- Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
- Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
- Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
- Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
- Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
- Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
- Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
- Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
- Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
- Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
- Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
- Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
- Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
- Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
- Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I.
- Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
- Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
- Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
- Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
- Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
- Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
- Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
- Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
- Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
- Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
- Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
- Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
- Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
- Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
- Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
- Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
- Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).
