Summary
Alterações fisiopatológicas no sistema nervoso autônomo cardíaco, especialmente em seu ramo simpático, contribuem para o surgimento e manutenção de arritmias ventriculares. No presente protocolo, mostramos como caracterizar gânglios estelares murinos para melhorar a compreensão dos processos moleculares e celulares subjacentes.
Abstract
O sistema nervoso autônomo é um driver substancial de eletrofisiologia cardíaca. Especialmente o papel de seu ramo simpático é uma questão de investigação em curso na fisiopatologia das arritmias ventriculares (VA). Os neurônios da gânglios estelares (SG) – estruturas bilaterais em forma de estrela da cadeia simpática – são um componente importante da infraestrutura simpática. O SG é um alvo reconhecido para o tratamento via denervação cardíaca em pacientes com terapia-refratário va. Embora a remodelagem neuronal e a ativação gliana no SG tenham sido descritas em pacientes com VA, os processos celulares e moleculares subjacentes que potencialmente precedem o início da arritmia são apenas insuficientemente compreendidos e devem ser elucidados para melhorar a modulação autônoma. Modelos de mouse nos permitem estudar remodelagem neuronal simpática, mas a identificação do Murine SG é um desafio para o investigador inexperiente. Assim, faltam estudos biológicos celulares e moleculares aprofundados da SG murina para muitas doenças cardíacas comuns. Aqui, descrevemos um repertório básico para dissecar e estudar o SG em camundongos adultos para análises no nível de RNA (isolamento de RNA para análises de expressão genética, hibridização in situ), nível de proteína (coloração de montagem total imunofluorescente) e nível celular (morfologia básica, medição do tamanho da célula). Apresentamos soluções potenciais para superar desafios na técnica de preparação e como melhorar a coloração através da sacieciação da autofluorescência. Isso permite a visualização de neurônios, bem como células gliais através de marcadores estabelecidos, a fim de determinar processos de composição celular e remodelação. Os métodos aqui apresentados permitem caracterizar o SG para obter mais informações sobre disfunção autônoma em camundongos propensos ao VA e podem ser complementados por técnicas adicionais que investigam componentes neuronais e gliais do sistema nervoso autônomo no coração.
Introduction
O sistema nervoso autônomo cardíaco é um equilíbrio fortemente regulado de componentes simpáticos, parassimpáticos e sensoriais que permite ao coração se adaptar às mudanças ambientais com a resposta fisiológica adequada1,2. Distúrbios nesse equilíbrio, por exemplo, um aumento da atividade solidária, foram estabelecidos como um driver-chave para o início, bem como a manutenção de arritmias ventriculares (VA)3,4. Portanto, a modulação autônoma, alcançada através da redução farmacológica da atividade simpática com beta-bloqueadores, tem sido uma pedra angular no tratamento de pacientes com VA por décadas5,6. Mas, apesar das intervenções farmacológicas e baseadas em cateter, um número relevante de pacientes ainda sofre de VA7recorrente .
A entrada simpática ao coração é mediada principalmente através de corpos de células neuronais na gânglio estelar (SG), estruturas bilaterais em forma de estrela da cadeia simpática, que retransmitem informações através de numerosos nervos intratorácicos do tronco cerebral ao coração8,9,10. O nervo que brota do SG após a lesão está associado à VA e morte cardíaca súbita11,12, enfatizando o SG como alvo de modulação autônoma13,14. Uma redução da entrada simpática no coração pode ser alcançada temporariamente através de injeção percutânea de anestésicos locais ou permanentemente por remoção parcial do SG via toracoscopia assistida por vídeo15,16. A denervação cardíaca simpática apresenta uma opção para pacientes com terapia-refratário VA com resultados promissores14,16,17. Aprendemos com a SG explantada desses pacientes que a remodelagem neuronal e neuroquímica, a neuro-inflamação e a ativação gliais são marcas de remodelação simpática que podem contribuir ou agravar a disfunção autônoma18,19. Ainda assim, os processos celulares e moleculares subjacentes nesses neurônios permanecem obscuros até o momento, por exemplo, o papel da transdiferente neuronal em um fenótipo colinérgico20,21. Estudos experimentais apresentam novas abordagens para tratar va, por exemplo, a redução da atividade nervosa simpática via optogenética22, mas a caracterização aprofundada do SG ainda está faltando em muitas patologias cardíacas que andam na mão com a VA. Modelos de camundongos que imitam essas patologias permitem estudar a remodelagem neuronal que potencialmente precede o aparecimento de arritmias12,23. Estes podem ser completados por análises morfológicas e funcionais para caracterização autônoma do coração e do sistema nervoso. No presente protocolo, fornecemos um repertório básico de métodos que permitem dissecar e caracterizar o SG murino para melhorar a compreensão do VA.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais do Estado de Hamburgo (ORG870, 959) e pela Agência Estadual de Proteção à Natureza, Meio Ambiente e Defesa do Consumidor (LANUV, 07/11) e conforme o Guia nacional de Atenção e Uso de Animais de Laboratório (2011). Foram realizados estudos utilizando camundongos do sexo masculino e feminino (10-24 semanas) C57BL/6 (número de estoque 000664, Jackson Laboratories) e camundongos homozigos (db/db) ou heterozigous (db/het; controle) para a mutação espontânea do diabetes (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, número de ações 000642, Jackson Laboratories). Os autores têm usado os protocolos em mãos sem variações para camundongos com idade até 60 semanas.
1. Localização e dissecção de gânglios estelares murinos
NOTA: Embora as descrições e desenhos estejam disponíveis principalmente em espécies maiores, algumas publicações descreveram anteriormente a localização do SG em ratos24 e camundongos25 usando métodos anatômicos e linhas de repórter fluorescentes, respectivamente.
- Prepare 50 mL de heparinizado com gelo (3-4 °C) (20 unidades/mL, ver Tabela de Materiais) salina tamponada com fosfato (PBS). Realizar dissecção do SG à temperatura ambiente (RT).
- Anestesia profundamente o rato por inalação de 3%-5% de isoflurane de acordo com as diretrizes institucionais e locais. Verifique a anestesia adequada por perda do reflexo de retirada do pedal. Decapitar camundongos ou realizar luxação cervical.
NOTA: A luxação cervical incorreta pode resultar em quebra da coluna vertebral e danos dos vasos torácicos que levam a sangramento que dificulta a preparação ou corte da cadeia simpática, de modo que a SG não esteja em sua posição correta. Por isso, é fundamental que pessoas experientes realizem deslocamento cervical ou decapitem animais em sedação profunda. - Pulverize a pele com etanol e abra o tórax com duas incisões ao longo das linhas axilares anteriores usando tesouras Mayo e fórceps de padrão estreito. Corte o diafragma e remova a frente da caixa torácica.
- Remova o pacote coração-pulmão segurando a aorta e vena cava bem acima do diafragma usando fórceps de Londres e cortando todos os vasos e tecido conjuntivo perto da coluna abaixo com a tesoura strabismus.
- Lave o tórax completamente com PBS heparinizado usando uma pipeta descartável de plástico até que todos os vestígios de sangue sejam removidos.
- Coloque o tronco sob binóculos de preparação do estereomicroscope e garanta uma boa iluminação no tórax com fontes de luz externas.
- Localize a primeira costela e os músculos longus colli.
NOTA: Os SG estão localizados bilateralmente, paralelos à coluna vertebral do ramo entre a primeira costela e a coluna vertebral, em uma ranhura lateral aos músculos longus colli24. O lado plano do SG está localizado ao lado dos músculos longus colli. Dependendo da preparação, partes da cadeia simpática já podem ser visíveis como fibras brancas e oblíquas paralelas à coluna vertebral. Estes podem ser rastreados até o SG. - Use delicadamente a ponta dos fórceps Dumont #5/45 para expor o tecido conjuntivo lateral ao músculo longus colli.
- Gire os fórceps em torno de 180° e use o lado plano para segurar o SG e puxá-lo para fora com pressão mínima.
- Repita com o segundo SG.
- Coloque ambos os SG em um prato (6 cm de diâmetro) recheado com PBS frio e inspecione com a ampliação apropriada. Se necessário, remova vasos em excesso, tecido adiposo e nervos maiores.
NOTA: Os gânglios autônomos são cercados por uma cápsula de tecido conjuntivo composta por fibras de colágeno e fibroblastos26,27. A permeabilidade dessas cápsulas parece variar entre espécies, diferentes tipos de gânglios26 e28anos . Remova o máximo possível de tecido conjuntivo usando o #5/45 de Dumont e, se necessário, a tesoura de mola. - Dependendo do objetivo do experimento, proceda com a seção 2, 3 ou 5 deste protocolo.
2. Protocolo de imunohistoquímica de montagem inteira
NOTA: Este protocolo é adaptado de manchas de montagem cardíaca inteira4,29. Realize etapas de incubação para cada SG em um poço de uma placa de 96 poços e use 100 μL (para soluções contendo anticorpos) a 200 μL (para todas as outras soluções) da solução para garantir uma cobertura completa. Verifique regularmente a cobertura e a imersão correta do SG com binóculos. Remova os líquidos manualmente com uma pipeta de 200 μL com uma ponta adicional de 10 μL em cima da ponta de 200 μL. Isso evitará a aspiração do SG na ponta da pipeta. Use soluções recém-preparadas e líquidos estéreis para evitar o crescimento bacteriano.
- FixE SG para histologia por 2 h em RT em paraformaldeído sem metanol (PFA)/PBS.
- Processe SG o mais rápido possível, mas eles podem ser armazenados por 2-4 semanas a 4-6 °C em PBS com azida de sódio de 0,02% (w/v) neste ponto.
- Prepare a solução de estoque negro do Sudão (1% sudão preto w/v em 100% etanol) para redução da autofluorescência e melhoria do sinal para a razão de fundo30. Dissolva-se por 2-3 h em um agitador magnético em RT.
NOTA: Use a solução de estoque por um máximo de 6-8 semanas, descarte mais cedo quando a sedimentação aparecer. - Prepare a solução de trabalho negra do Sudão, centrifugando a solução de estoque por 30 minutos a toda velocidade (13.000 x g) para remover detritos e diluir o estoque em 70% de etanol para uma concentração final de 0,25% de preto do Sudão.
- Trate o SG com o alvejante de Dent para melhorar a permeabilização de anticorpos31. Prepare recentemente o alvejante de Dent misturando metanol (MeOH), solução de peróxido de hidrogênio 30% (w/w) em H2O e sulfóxido de dimetil (DMSO) em uma razão de 4:1:1. Adicione 200 μL por SG e coloque a placa em um agitador orbital por 1 h no RT.
- Realize uma série meOH descendente para reidratação incubando por 10 minutos cada em um agitador orbital: 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
- Realize a permeabilização incubando SG duas vezes por 60 min cada em PBS/1% Triton-X-100 na RT.
- Remova a solução de permeabilização do SG e adicione a solução de trabalho preto do Sudão. Incubar por 2 h em RT em um agitador orbital.
- Enquanto isso, prepare uma solução de bloqueio adicionando 5% de gérso bovino de grau receptor albumina (BSA) e 0,1% Triton-X-100 em PBS um vaso de 15 mL e deixe dissolver-se em um agitador de rolo por aproximadamente 5-10 min. Decante através de um filtro de papel pré-plissado para remover detritos.
- Remova o Sudão preto com muito cuidado inclinando a placa e cuidadosamente tubos do lado vertical.
NOTA: Não é possível ver o SG no Sudão preto. Use uma fonte de luz forte e trabalhe lentamente. A partir deste passo, os SG são manchados de preto, aumentando a visibilidade. Se algum tecido conjuntivo adicional for visto ao redor da SG neste momento, remova-o usando fórceps Dumont #5/45 e tesouras de mola. - Adicione 200 μL de PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) e lave por 5 min em RT em um shaker orbital.
- Remova o PBS-T aspirando-o com uma pipeta e repita 2 vezes.
- Remover PBS; adicionar 200 μL de solução de bloqueio e incubar a 4 °C durante a noite em um agitador orbital.
- No dia seguinte, prepare soluções adicionando anticorpos primários na solução de bloqueio. Adapte as concentrações de anticorpos a partir de protocolos estabelecidos.
NOTA: Inclua um SG como controle de anticorpos sem anticorpo primário (incubado com anticorpo pré-teor de antígeno ou IgG, se disponível ou tampão de bloqueio). - Realize a incubação de anticorpos primários por 36-48 h a 4 °C em um agitador orbital. Para medições de tamanho celular e coloração de neurônios simpáticos, use anticorpos contra hidroxilase de tyrosina (ver Tabela de Materiais para recomendações de anticorpos).
NOTA: Coloque a placa de 96 poços em uma câmara molhada (por exemplo, caixa de plástico forrada com toalhas de papel ddH2O-molhado) para evitar a evaporação neste momento. - Remova cuidadosamente a solução de anticorpos e adicione 200 μL de PBS-T. Coloque a placa em um agitador orbital por 30 minutos.
- Remova o PBS-T e repita a etapa de lavagem 5 vezes adicionais.
- Prepare a solução secundária de trabalho de anticorpos centrifugando anticorpos secundários com etiqueta Alexa fluorescentes por 1 min a velocidade máxima (13.000 x g) antes do uso. Diluir os anticorpos secundários apropriados de acordo com os anticorpos primários 1:500 na solução de bloqueio e adicionar ao SG. Adicione 1 μg/mL de bisbenzimide H33342 trihidrocloide (coloração de Hoechst) se a coloração nuclear for desejada. Incubar por 12-24 h a 4 °C em um agitador orbital.
- Remova cuidadosamente a solução de anticorpos e adicione 200 μL de PBS-T. Coloque a placa em um agitador orbital por 30 minutos.
- Remova o PBS-T e repita a etapa de lavagem 5 vezes adicionais. Para a última etapa, use PBS sem Triton.
- Para incorporar, espalhe 50-100 μL de meio de montagem fluorescente (ver Tabela de Materiais) em um escorregador de vidro e coloque sob binóculos de preparação. Use o Dumont #5/45 fórceps para pegar SG da placa de 96 poços e remover o excesso de líquido mergulhando uma extremidade em um papel filtro (por exemplo, almofada de secagem Whatman) e colocá-lo na gota.
- Use os fórceps Dumont #5/45 para corrigir o posicionamento com a ampliação apropriada.
- Coloque delicadamente uma mancha de vidro (20 mm x 20 mm) ao lado do SG e desça lentamente.
NOTA: O uso de muito meio de montagem resultará em movimento do SG ou emaranhado de nervos. Se isso acontecer, remova rapidamente o deslizamento de tampas e repita as etapas 2.9-2.21. - Deixe os slides secarem no escuro durante a noite em RT. O armazenamento do espécime manchado é possível por pelo menos 4-6 semanas a 4 °C.
3. Montagem inteira na hibridização situ
NOTA: A montagem total no situ-hibridização do SG é adaptada do órgão do Corti32 e da fluorescência comercial de RNA no protocolo situ (ver Tabela de Materiais). Obtenha sondas para os genes de interesse e buffers e soluções do fornecedor. Todas as etapas de incubação são realizadas na RT, se não for mencionada de outra forma. Use PBS estéril. Se estiver interessado em colorar vários SG em um poço, use pelo menos 150 μL de buffers e soluções.
- Realizar dissecção do SG conforme descrito nas etapas 1.1-1.13.
- Fixar SG por 1 h em 200 μL de PFA/PBS 4% livre de MeOH em um poço de uma placa de 96 poços colocado em um agitador orbital.
- Lave OG três vezes por 30 min cada em 0,1% Tween-20/PBS em um agitador orbital.
- Desidratar SG nas séries MeOH/PBS por incubação subsequente em 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS e 100% MeOH por 10 minutos cada em um shaker orbital.
- Armazene SG a -20 °C em 100% MeOH durante a noite.
- No dia seguinte, pré-aqueça a incubadora a 40 °C. Verifique a temperatura com um termômetro.
- Reidratar SG nas séries MeOH/PBS reversas (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) por 10 min cada.
- Lave SG três vezes por 5 min cada na PBS.
- Enquanto isso, comece a pré-aquecer as sondas por incubação a 40 °C por 10 minutos, seguido de resfriamento por 10 minutos.
- Incubar SG em 200 μL de Protease III por 15 min.
- Opcional: Realize o tratamento negro do Sudão para saciar a autofluorescência de acordo com as seções 2.3, 2.4 e 2.8 deste protocolo se for planejada a coloração subsequente de imunofluorescência.
- Lave SG em 200 μL de 0,1% Tween-20/PBS 3x por 5 min cada em um shaker orbital.
- Opcional: Se for desejado a co-coloração com várias sondas, diluir o Canal-2 (50x) e a sonda Channel-3 (50x) na sonda Channel-1 (1x).
- Cubra o SG com 100 μL de sonda para o gene de interesse e incubar durante a noite a 40 °C com leve agitação. Coloque a placa de 96 poços em uma câmara molhada a 40 °C para todas as etapas de incubação.
NOTA: Inclua um SG como controle negativo, usando uma sonda contra um gene bacteriano (por exemplo, dihidro-dipicolinate reductase, Dapb) para verificar se há ligação não específica de reagentes de amplificação em etapas posteriores. - Lave SG em tampão de lavagem fornecido 3x por 15 min cada em um shaker orbital.
- Pré-quente Amp1-3, HRP-C1 e HRP-Blocker para RT. Se for desejado a co-coloração com a sonda Channel-2 e/ou Channel-2, o HRP-C2 e o HRP-C3 pré-aquecidos são.
- Corrija o SG por 10 min na RT em 4% PFA/PBS em um agitador orbital.
- Lave SG em 200 μL de tampão de lavagem fornecido 3x por 5 min cada em um shaker orbital em RT.
- Para amplificação, incubar SG com 100 μL de Amp1 por 35 min a 40 °C em um agitador orbital.
- Remova cuidadosamente qualquer líquido e lave SG em 200 μL de tampão de lavagem fornecido 3x por 5 min cada em RT em um shaker orbital.
- Incubar SG com 100 μL de Amp2 por 35 min a 40 °C em um agitador orbital.
- Repita o passo 3.18.
- Incubar SG com 100 μL de Amp3 por 20 min a 40 °C em um agitador orbital.
- Repita o passo 3.18.
- Incubar SG com 100 μL de Multiplex FL v2 HRP-C1 fornecido por 20 min a 40 °C em um agitador orbital.
- Repita o passo 3.18.
- Prepare o anticorpo secundário conjugado opala 1:1.000 em 200 μL de tsa-tampão fornecido e incubar SG por 35 min a 40 °C em um agitador orbital. Proteja-se contra a luz durante a incubação e a partir deste passo em diante.
- Repita o passo 3.18.
- Incubar SG em 100 μL de multiplex fl v2 HRP-blocker fornecido por 15 min a 40 °C em um agitador orbital.
- Repita o passo 3.18.
- Opcional: Para co-coloração com a sonda Channel-2, repita as etapas 3.25-3.30 com multiplex FL v2 HRP-C2 fornecido.
- Opcional: Para co-coloração com a sonda Channel-3, repita as etapas 3.25-3.30 com multiplex FL v2 HRP-C3 fornecido.
- No caso de posterior coloração imunofluorescente, realize as etapas 2.13-2.25 deste protocolo.
- Incubar em 1% BSA/PBS por 30 min em um agitador orbital.
- Incubar SG por 30 min em 1 μg/mL de bisbenzimide H33342 trihidrocloide (mancha de Hoechst) em 1% BSA/PBS se a coloração nuclear for desejada e/ou adicionar agglutinina de germe de trigo acoplado alexa (WGA, 1:500) em um orbital de shake.
- Repita o passo 3.18.
- Incorporado conforme descrito nas etapas 2.19-2.22.
4. Imagens e análises de gânglios estelares murinos
- Realize microscopia confocal de SG embarcada na instalação local de imagem.
- Se forem necessárias medidas de tamanho de célula, a imagem SG está manchada para hidroxilase de tyrosina (ver Tabela de Materiais) a 200x de ampliação e pegue 4-6 imagens aleatórias de cada SG.
- Analise imagens usando o software ImageJ33 para estimar o tamanho da célula (por exemplo, com uma tabela de caneta, consulte Tabela de Materiais). Use seleção de mão livre,circule cada célula e clique em Analisar | Medida para obter área celular. Tenha cuidado para incluir apenas células intactas e totalmente visíveis que estão localizadas bem dentro do SG.
- Usando este método, realize a medição de aproximadamente 100 células por SG.
- Faça com que um investigador cego realize as etapas 4.2-4.3 se você quiser comparar SG de diferentes ratos. Use uma distribuição de frequência em software estatístico para visualizar diferenças de tamanho entre os grupos34.
5. Análises moleculares de gânglios estelares murinos
NOTA: Inclua controles dependendo do seu design experimental. Este pode ser SG com diferentes genótipos e fundo da doença e/ou outros gânglios autônomos, como o gânglio cervical superior simpático (localizado na área do pescoço, ver descrição detalhada em Ziegler et al.35) ou gânglios parassimpáticos (como gânglio intracardiac, ver Jungen et al.4).
- Prepare um tubo de 2 mL com 500 μL de solução de tiocianato fenol/guanidina (por exemplo, Qiazol) por animal e tenha nitrogênio líquido pronto para cobertura de choque ou considere soluções comerciais para proteção de RNA (opcional, ver Tabela de Materiais)36. Trabalhe rapidamente para o isolamento do RNA.
- Realizar dissecção do SG conforme descrito nas etapas 1.1-1.13.
- Imerque imediatamente tanto sg diretamente em um tubo com solução de fenol/guanidina tiocianato e tubo de choque-geada em nitrogênio líquido.
- Armazene a -80 °C até que seja mais processamento.
- Para a lise tecidual, deixe os tubos com degelo SG até que a solução de tiocianato fenol/guanidina seja liqueificada e adicione duas contas de aço inoxidável de 7 mm. Esfrie as partes metálicas do homogeneizador de tecido (moinho de esferas ou misturadores, por exemplo, Tissue Lyser II) em gelo seco e centrífuga a 4 °C.
- Tubos centrífugas a 500 x g por 1 min a 4 °C de modo que sg estão na parte inferior do tubo.
- Coloque tubos nas partes metálicas do Tissue Lyser e lise por 1 min a 20 Hz.
- Repita as etapas 5.6 e 5.7 até 5 vezes até que nenhum tecido intacto seja detectável.
- Transfira o líquido para um tubo fresco de 1,5 mL.
- Realize o isolamento do RNA com um kit de isolamento de RNA baseado em coluna (por exemplo, mini kit miRNeasy) de acordo com as instruções do fabricante.
- Elute RNA em 20 μL de água sem RNase e mede a concentração usando um espectrômetro.
NOTA: Para excluir a contaminação do RNA purificado com DNA genômico, propomos realizar uma reação em cadeia de polimerase com primers genômicos e 1 μL de RNA como modelo, em vez de menos controle de transcriptase reversa. Isso economizará uma quantidade significativa de RNA. Se o RNA estiver contaminado, use primers de limite exon-intron ou primers de flanco intron para subsequente reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real. - Use 250 ng SG RNA para realizar a síntese cDNA e usar protocolos estabelecidos. Aqui, um kit de transcrição reversa cDNA de alta capacidade foi usado de acordo com as instruções do fabricante.
- Diluir a uma concentração final de 2,5 ng/μL de cDNA e realizar reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real com as sondas apropriadas de acordo com os protocolos estabelecidos. Aqui, o Ensaio TaqMan (ver Tabela de Materiais) foi realizado utilizando 10 ng cDNA por reação.
NOTA: Realize o controle sem modelo para cada gene para excluir resultados falsos positivos. - Normalize a expressão genética do seu gene de interesse em um gene de manutenção de casa (por exemplo, Cdkn1b) para comparar a expressão genética relativa entre diferentes grupos de SG.
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Representative Results
A Figura 1 visualiza como identificar e dissecar o SG. A Figura 1A mostra um desenho esquemático do local, enquanto a Figura 1B apresenta a visão no tórax após a remoção do pacote coração-pulmão. Os músculos longus colli esquerdo e direito medial do SG e da caixa torácica são marcos importantes para a orientação. A dissecação é realizada ao longo das linhas pontilhadas entre os músculos e a primeira costela. O SG e a cadeia simpática tornam-se visíveis como estruturas brancas(Figura 1C). A Figura 1D mostra uma ampliação da região entre o músculo longus colli esquerdo e a primeira costela, onde está localizada a SG esquerda. A morfologia do SG difere entre os indivíduos. Muitas vezes consiste em uma fusão do cervical inferior e do primeiro ao terceiro gânglio torácico24. Alguma variedade que o experimentador pode esperar em Murine SG é retratada na Figura 1E,F, onde sg esquerda e direita de cinco ratos machos C57Bl6 tipo selvagem são fotografados.
A avaliação da visão geral anatômica bruta, bem como análises celulares e subcelulares de células no SG inervando o coração podem ser realizadas por técnicas de montagem inteiras no nível de proteína e RNA. Uma visão geral de um SG é apresentada na Figura 2. Fibras simpáticas do miocárdio são originárias de corpos celulares no SG. Estes são visualizados pela coloração com um anticorpo contra a hidroxilase de tyrosina (TH). A somata neuronal expressa em TH é cercada por fibras nervosas que colorem positivamente para acetiltransferase de colina (ChAT). Estas são provavelmente fibras pré-sinápticas37,38. Uma ampliação exemplar da co-rotulagem TH e ChAT é apresentada na Figura 2A. Células gliais ao redor de corpos de células neuronais podem ser visualizadas pela coloração para S100B. Isto é retratado na Figura 2B em combinação com o marcador neural PGP9.5. A Figura 2C-F mostra análises exemplares para estudar o SG em nível subcelular, utilizando montagem inteira em situ hibridização e co-coloração imunofluorescente. As moléculas de proteína TH(Figura 2C, vermelho) e mRNA de Tubb3 (Figura 2D, branca) são expressas em grandes corpos de células neuronais, enquanto mRNA de S100b (Figura 2E, verde) também é detectável em células glia circundantes. Na fusão (Figura 2F), é visível que alguns neurônios são negativos para TH, mas expressam Tubb3,enquanto os MRNAs S100b também podem ser detectados em células circundantes, como descrito na ampliação na Figura 2G.
A Figura 3 apresenta potenciais análises quantitativas e armadilhas para o estudo do Murine SG. Imagens de SG manchados de TH (Figura 3A) podem ser utilizadas para medições de tamanho celular, como foi realizado exemplarmente para um modelo de camundongo de diabetes. Somata neuronal do controle (db/het) SG foram 388,8 ± 123,8 μm2 vs. em SG diabético (db/db) 407,33 ± 139,6 μm2 (Figura 3B, n = 2 SG, 100 células por SG por genótipo, P = 0,348, os dados foram comparados utilizando-se o teste de Mann-Whitney). A Figura 3C mostra a expressão de genes de diferentes tipos celulares do SG (n = 6-7). A agrupação de ambos os SG de um animal permite medições de expressão genética de aproximadamente 24 ensaios (12 genes em duplicatas). Normalmente normalizamos amostras para Cdkn1b (detectadas em valores ct de 25,4 ± 0,97) bem como o marcador neuronal Neun/Rbfox3 (32,5 ± 0,7) se for necessário responder por outros tipos de células e pureza neuronal da dissecção. Genes que achamos úteis para caracterizar processos moleculares no SG incluem o gene simpático Th (22,4 ± 1,6), Chat, que poderia indicar transdiferenciação colinérgica (expressa a valores ct de 30,8 ± 1,3) e Gap43, um marcador para broto neuronal (detectável em valores ct de 22,4 ± 1,4). Os genes expressos no tipo de células não neuronais incluem S100b (para células gliais, 27,3 ± 1,2), Ki-67 (para células proliferadoras, 33,0 ± 1,6) e Cd45 (para células imunes, 30,2 ± 1,1).
O SG é cercado por uma cápsula de tecido conjuntivo26,visualizado via hematoxilina e eosina na Figura 3D,E. Ocasionalmente, observamos inconsistências na coloração à base de anticorpos, como demonstrado na Figura 3F,provavelmente devido à remoção incompleta da cápsula. Enquanto as manchas de ChAT e TH só são detectáveis em algumas partes do SG, núcleos contra-identificados com DAPI são detectáveis em toda parte. A linha pontilhada na imagem mesclada separa a coloração bem sucedida (à direita da linha) da coloração mal sucedida (esquerda da linha).
Os dados são apresentados como ± desvio padrão. A significância estatística foi definida como valor P de <0,05; a análise estatística foi realizada por meio de software comercial.
Figura 1: Localização, dissecção e morfologia da gânglio estelar murina. (A) Desenho esquemático da localização do gânglio estelar (SG). (B) Ver no tórax após a remoção do pacote coração-pulmão. É importante notar que o SG não é imediatamente visível na maioria das vezes. Os músculos longus colli estão localizados laterais da coluna vertebral. Os SG estão localizados laterais dos músculos na junção com a primeira costela. Dissecar cuidadosamente lateral aos músculos (área marcada por linha pontilhada) para descobrir os gânglios. Após a dissecção, os gânglios (esquerda e direita, LSG e RSG, respectivamente) e a cadeia simpática podem ser feitos como estruturas brancas e longas. (C) Uma dissecação exemplar mostrando os marcos gânglios e anatômicos. (D) Ampliação do LSG. (E) LSG e (F) RSG do tipo selvagem, ratos C57Bl6 machos (16 semanas) foram dissecados e fotografados para mostrar as variações em morfologia e tamanho. A barra de escala representa 1.000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visualização de diferentes tipos de células em gânglios estelares murinos através de toda a imunohistoquímica do monte e hibridização in situ. (A) Visão geral bruta de um gânglio estelar murino (SG) manchado para o marcador simpático tyrosine hidroxilase (TH) e acetiltransferase de colina (ChAT). A ampliação mostra corpos celulares TH positivos e a presença de ChAT positivo, provavelmente presináptica, fibras nervosas ao redor da somata neuronal. (B) As células gliais ensheathing corpos de células neuronais podem ser visualizadas pela coloração para S100B, aqui em combinação com o marcador neuronal PGP9.5. (C,D,E,F) Imagens microscópicas de um SG mancharam toda a montagem através de uma combinação de imunohistoquímica para TH (vermelho) e hibridização in situ para Tubb3 (D, branco) e S100b (E, verde). Os núcleos são contra-identificados com DAPI (azul). (F) A fusão mostra que nem todas as células neuronais(Tubb3-positive) são TH positivas. S100b mRNAs podem ser detectados dentro de somata neuronal, mas também células circundantes, como marcado por uma seta na ampliação em(G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Potenciais análises quantitativas e armadilhas. (A) Imagens de SG manchado de tyrosina-hidroxilase (TH) podem ser usadas para medições de tamanho de células usando ImageJ. (B) Este foi realizado em um modelo de camundongo de diabetes (100 células por SG, n = 2 SG por genótipo, os dados foram comparados por meio do teste Mann-Whitney). (C) Genes exemplares expressos no SG que podem ser úteis para caracterizar processos moleculares. Cdkn1b, bem como o marcador neuronal Neun/Rbfox3 (para explicar a presença de outros tipos de células) podem ser usados para a normalização. A hidroxilase de tyrosinaservecomo um marcador simpático, acetiltransferase de colina(Chat) para transdiferenciação colinérgica, Gap43 para broto neuronal. Os genes expressos em tipos de células não neuronais incluem S100b (células gliais), Ki-67 (células proliferadoras) e Cd45 (células imunes). (D) A coloração da hematoxilina e da eosina de um SG fixo de formalina visualiza tecido conjuntivo e células em cima do SG. (E) Ampliação da área encaixotada. (F) Em algumas ocasiões, observamos falha na coloração à base de anticorpos, provavelmente devido à remoção incompleta da cápsula. Enquanto as manchas de ChAT (vermelho) e TH (verde) só são detectáveis em algumas partes do SG, núcleos contra-identificados com DAPI (azul escuro) são detectáveis em todas as partes. A linha pontilhada na imagem mesclada separa a coloração bem sucedida (à direita da linha) da coloração mal sucedida (esquerda da linha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A compreensão dos processos celulares e moleculares em neurônios e células gliais do sistema nervoso simpático que precedem o início do VA é de alto interesse, pois a parada cardíaca súbita continua sendo a causa de morte mais comum em todo o mundo5. Portanto, no manuscrito atual, fornecemos um repertório básico de métodos para identificar o Murine SG – elemento murino dentro dessa rede – e realizar análises subsequentes sobre RNA, proteína e nível celular.
Um desafio do murine SG é o seu tamanho e o número limitado de células39. Devido a isso, diferentes modelos animais, como ratos40, cães22e suínos41 são utilizados para estudos sobre o SG. Ainda assim, há uma variedade de modelos de doenças bem estabelecidas para fenótipos cardíacos disponíveis em camundongos e alguns deles já foram caracterizados em diferentes aspectos de inervação cardíaca e arritmia, como modelos para diabetes23,infarto do miocárdio42, ou miocardite43. Portanto, estudos adicionais da SG murina são garantidos para caracterizar ainda mais disfunção autônoma à luz da VA. Estas podem ser completadas por outras abordagens para estudar a inervação do coração murino, como os experimentos funcionais4,23,44, incluindo a estimulação in vivo do SG23.
Devido ao seu pequeno tamanho e sua localização dentro da cavidade torácica24, a manipulação do murine SG in vivo é desafiadora, embora tenha sido realizada com sucesso23. Por essa razão, alguns estudos se concentram, portanto, nos gânglios cervicais superiores, localizados de forma mais acessível no pescoço, a montante do SG na cadeia simpática por trás da bifurcação carótida em artérias carótidas internas e externas24,35. A denervação cardíaca através da remoção da gânglio cervical superior tem sido demonstrada para atenuar inflamação do miocárdio, hipertrofia e disfunção cardíaca após o infarto do miocárdio35. No entanto, é importante notar que os gânglios cervicais superiores inervam diferentes regiões do coração, principalmente o lado anterior45. Além disso, uma revisão recente da literatura concluiu que o papel dos gânglios cervicais na inervação simpática do coração permanece incerto em humanos46. Isso destaca a importância de caracterizar o SG para estudos de inervação cardíaca.
É importante notar que o coração não é o único alvo do SG. Entre outros, pulmões47 e glândulas sudoríparas na forepaw48 também são inervados das fibras originárias do SG, estes últimos são uma exceção à fisiologia simpática, pois expressam acetiltransferase37. O bloqueio temporário do SG é estudado no que diz respeito aos processos inflamatórios na lesão pulmonar aguda49 ou para tratamento de ondas de calor e disfunção do sono50; portanto, os protocolos em mãos podem oferecer um repertório para questões mecanicistas nestes campos. Ao focar em modelos de doenças cardíacas, deve-se ter em mente a interpretação dos resultados de que os neurônios cardíacos não podem ser diferenciados por morfologia ou propriedades eletrofisiológicas de neurônios não cardíacos51. Isso pode ser alcançado através do rastreamento retrógrado, assim, a localização dos neurônios projetando-se para o coração foi mostrada localizada nas partes cranio-medial do SG52.
Além disso, é importante notar que, além de diferentes tipos de neurônios, as gânglios simpáticos são compostas de glia ensheathing, as chamadas células gliais satélites ou células satélites marcadas pela expressão do marcador glia S100B53. Embora pouco se saiba sobre o papel dessas células em patologias cardiovasculares, a ativação gliana e a expressão da proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) tem sido descrita em SG a partir de pacientes com arritmias18.
Algumas armadilhas devem ser consideradas com os métodos apresentados: observamos inconsistências na coloração à base de anticorpos em algumas ocasiões e hipóteses de que a remoção incompleta da cápsula de tecido conjuntivo que envolve o SG pode estar em falta, pois foram descritas como variam em permeabilidade entre diferentes tipos de gânglios26. A remoção mecânica da cápsula utilizando fórceps finos foi descrita no gânglio cervical superior de ratos até o pós-natal dia 1028 e a desheathing é mencionada na literatura para ratos adultos SG54,55 e camundongos56. A remoção da cápsula SG pode variar entreos 28 anos e – devido a diferenças de tamanho – espécies. Em nossa experiência, dissecção fresca, remoção do máximo de tecido conjuntivo possível usando fórceps finos e permeabilização completa como descrito no protocolo em questão, são fatores importantes para o sucesso da coloração. Em relação ao PCR quantitativo em tempo real, o trabalho rápido e a lisis eficiente são essenciais. A junção de ambos os OGs de um animal permitiu a análise de até 12 genes diferentes (ao realizar duplicatas).
Embora a função e a anatomia bruta da SG tenham sido estudadas há décadas e cada cardiomiócito seja inervatado por fibras simpáticas46,muitas questões abertas permanecem. Por exemplo, ainda não está claro, por que os neurônios simpáticos do SG transdiferenciam transitoriamente a um fenótipo colinérgico em insuficiência isquêmica21 e insuficiência cardíaca não isquêmica, em modelos animais, bem como em pacientes20. Recentemente, nosso grupo descreveu um papel das células gliais S100B positivas, que também estão presentes no murine SG, no nervo brotando no sistema nervoso cardíaco29. Se essas células são relevantes para o nervo simpático que brota após lesão associada ao VA11,12, precisa ser elucidada em estudos futuros. É importante ressaltar que abordagens inovadoras, como optogenética52 e análises de transcriptome36 podem complementar métodos estabelecidos, como o rastreamento neuronal, a fim de aprofundar a compreensão do sistema nervoso simpático e seu papel na eletrofisiologia cardíaca.
Em conclusão, esse repertório permite ao investigador inexperiente realizar uma caracterização básica do SG em modelos murinos de patologias cardíacas. Esperamos que isso estimule o uso, a combinação e a criação de novos métodos. Isso pode ajudar a aumentar a compreensão dos processos celulares e moleculares subjacentes em neurônios simpáticos que podem ser responsáveis pelo início e manutenção do VA.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Hartwig Wieboldt por sua excelente assistência técnica, e o UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) do University Medical Center Hamburg-Eppendorf por fornecer microscópios e suporte. Esta pesquisa foi financiada pelo DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
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