Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Расположение, рассечение и анализ мышиного звездчатого ганглия

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62026
Automatic Translation
1,2,3, 2,4, 2, 2,4,5, 3, 1,2,3
1Division of Cardiology, EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

Summary

Патофизиологические изменения в вегетативной нервной системе сердца, особенно в ее симпатической ветви, способствуют возникновению и поддержанию желудочковых аритмий. В настоящем протоколе мы показываем, как охарактеризовать мышиные звездчатые ганглии, чтобы улучшить понимание лежащих в основе молекулярных и клеточных процессов.

Abstract

Вегетативная нервная система является существенным драйвером электрофизиологии сердца. Особенно роль его симпатической ветви является постоянным предметом исследований в патофизиологии желудочковых аритмий (ВА). Нейроны в звездчатых ганглиях (SG)   — двусторонних звездообразных структурах симпатической цепи —   являются важным компонентом симпатической инфраструктуры. SG являются признанной мишенью для лечения с помощью сердечной симпатической денервации у пациентов с терапевтически-рефрактерным ВА. В то время как ремоделирование нейронов и глиальная активация в SG были описаны у пациентов с ВА, основные клеточные и молекулярные процессы, которые потенциально предшествуют началу аритмии, только недостаточно изучены и должны быть выяснены для улучшения вегетативной модуляции. Мышиные модели позволяют изучать симпатическое ремоделирование нейронов, но идентификация мышиного SG является сложной задачей для неопытного исследователя. Таким образом, углубленные клеточные и молекулярно-биологические исследования мышиного SG отсутствуют для многих распространенных сердечных заболеваний. Здесь мы описываем базовый репертуар для рассечения и изучения SG у взрослых мышей для анализа на уровне РНК (выделение РНК для анализа экспрессии генов, гибридизация in situ), уровне белка (иммунофлуоресцентное окрашивание цельного крепления) и клеточном уровне (базовая морфология, измерение размера клеток). Мы представляем потенциальные решения для преодоления проблем в технике приготовления и способы улучшения окрашивания путем гашения автофлуоресценции. Это позволяет визуализировать нейроны, а также глиальные клетки с помощью установленных маркеров для определения состава клеток и процессов ремоделирования. Представленные здесь методы позволяют охарактеризовать СГ для получения дополнительной информации о вегетативной дисфункции у мышей, склонных к ВА, и могут быть дополнены дополнительными методиками, исследующими нейронные и глиальные компоненты вегетативной нервной системы в сердце.

Introduction

Сердечная вегетативная нервная система представляет собой жестко регулируемое равновесие симпатических, парасимпатических и сенсорных компонентов, которое позволяет сердцу адаптироваться к изменениям окружающей среды с соответствующей физиологической реакцией1,2. Нарушения в этом равновесии, например, повышение симпатической активности, были установлены в качестве ключевого фактора возникновения, а также поддержания желудочковых аритмий (ВА)3,4. Поэтому вегетативная модуляция, достигаемая за счет фармакологического снижения симпатической активности бета-адреноблокаторами, была краеугольным камнем в лечении пациентов с ВА на протяжении десятилетий5,6. Но, несмотря на фармакологические и катетерные вмешательства, соответствующее число пациентов все еще страдает от рецидивирующего VA7.

Симпатический вход в сердце в основном опосредован через тела нейронных клеток в звездчатых ганглиях (SG), двусторонних звездообразных структурах симпатической цепи, которые передают информацию через многочисленные внутриторакальные нервы от ствола мозга к сердцу8,9,10. Прорастание нерва из СГ после травмы связано с ВА и внезапной сердечной смертью11,12,подчеркивая СГ как мишень для вегетативной модуляции13,14. Снижение симпатического поступления в сердце может быть достигнуто временно путем чрескожной инъекции местных анестетиков или постоянно путем частичного удаления SG с помощью видеоассистированной торакоскопии15,16. Сердечная симпатическая денервация представляет собой вариант для пациентов с терапией-рефрактерной ВА с многообещающими результатами14,16,17. Мы узнали из эксплантированного SG этих пациентов, что нейронное и нейрохимическое ремоделирование, нейровоспаление и глиальная активация являются отличительными признаками симпатического ремоделирования, которые могут способствовать или усугублять вегетативную дисфункцию18,19. Тем не менее, лежащие в основе клеточные и молекулярные процессы в этих нейронах остаются неясными на сегодняшний день, например, роль трансдифференциации нейронов в холинергический фенотип20,21. Экспериментальные исследования представляют новые подходы к лечению ВА, например, снижение активности симпатического нерва с помощью оптогенетики22,но углубленная характеристика SG все еще отсутствует во многих сердечных патологиях, которые идут рука об руку с VA. Мышиные модели, имитирующие эти патологии, позволяют изучать ремоделирование нейронов, которое потенциально предшествует возникновению аритмий12,23. Они могут быть дополнены дальнейшими морфологическими и функциональными анализами для вегетативной характеристики сердца и нервной системы. В настоящем протоколе мы предоставляем базовый репертуар методов, позволяющих препарировать и характеризовать мышиную СГ для улучшения понимания ВА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, касающиеся животных, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию земли Гамбург (ORG870, 959) и Государственным агентством по охране природы, окружающей среды и защиты прав потребителей Земли Северный Рейн-Вестфалия (LANUV, 07/11) и соответствуют Руководству Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (2011). Исследования проводились с использованием самцов и самок (в возрасте 10-24 недель) мышей C57BL/6 (инвентарный номер 000664, Jackson Laboratories) и мышей гомозиготных (db/db) или гетерозиготных (db/het; контроль) для спонтанной мутации диабета (Leprdb; БКС. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, биржевой номер 000642, Jackson Laboratories). Авторы использовали имеющиеся под рукой протоколы без вариаций для мышей в возрасте до 60 недель.

1. Расположение и рассечение мышиных звездчатых ганглиев

ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что описания и рисунки в основном доступны у более крупных видов, некоторые публикации ранее описывали местоположение SG у крыс24 и мышей25 с использованием анатомических методов и флуоресцентных репортерных линий соответственно.

  1. Готовят 50 мл ледяного (3-4 °C) гепаринизированного (20 ед/мл, см. Таблицу материалов)фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Выполняют рассечение СГ при комнатной температуре (РТ).
  2. Глубоко обезболивают мышь путем вдыхания 3%-5% изофлурана в соответствии с институциональными и местными рекомендациями. Проверьте адекватную анестезию путем потери рефлекса снятия педали. Обезглавливают мышей или выполняют вывих шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильный вывих шейки матки может привести к разрыву позвоночника и повреждению грудных сосудов, что приводит к кровотечению, которое препятствует подготовке или разрыву симпатической цепи, так что SG не находятся в правильном положении. Поэтому крайне важно, чтобы опытный персонал выполнял вывих шейки матки или обезглавливал животных в глубокой селении.
  3. Опрыскайте кожу этанолом и откройте грудную клетку двумя разрезами вдоль передних подмышечных линий с помощью ножниц Майо и узких щипцов. Разрежьте диафрагму и снимите переднюю часть грудной клетки.
  4. Удалите пакет сердце-легкое, захватив полую аорту и полую вену прямо над диафрагмой с помощью лондонских щипцов и разрезав все сосуды и соединительную ткань близко к позвоночнику внизу ножницами косоглазия.
  5. Тщательно промыть грудную клетку гепаринизированным PBS с помощью пластиковой одноразовой пипетки до тех пор, пока не будут удалены все следы крови.
  6. Поместите туловища под стереомикроскопический подготовительный бинокль и обеспечьте хорошее освещение в грудной клетке внешними источниками света.
  7. Найдите первое ребро и мышцы longus colli.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SG расположены двусторонне, параллельно позвоночнику на ветке между первым ребром и позвоночником, в бороздке, боковой к длинным коллиозным мышцам24. Плоская сторона SG расположена рядом с длинными колли мышцами. В зависимости от препарата, части симпатической цепи могут быть уже видны в виде белых, косых волокон, параллельных позвоночнику. Их можно проследить вдоль SG.
  8. Осторожно используйте кончик щипцов Дюмона #5/45, чтобы обнажить соединительную ткань с боковой стороны мышцы longus colli.
  9. Поверните щипцы на 180° и используйте плоскую сторону, чтобы захватить SG и вытащить его с минимальным давлением.
  10. Повторите со вторым SG.
  11. Поместите оба SG в тарелку (диаметром 6 см), наполненную холодным PBS, и осмотрите с соответствующим увеличением. При необходимости удаляют лишние сосуды, жировую ткань, более крупные нервы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вегетативные ганглии окружены соединительнотканевой капсулой, состоящей из коллагеновых волокон и фибробластов26,27. Проницаемость этих капсул, по-видимому, варьируется между видами, различными видами ганглиев26 ивозрастом 28. Удалите как можно больше соединительной ткани с помощью щипцов Dumont #5/45 и, при необходимости, пружинных ножниц.
  12. В зависимости от цели эксперимента переходите к разделу 2, 3 или 5 этого протокола.

2. Протокол иммуногистохимии всей горы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из сердечных целых окрасок4,29. Выполните этапы инкубации для каждого отдельного SG в одной скважине 96-скважинной пластины и используйте от 100 мкл (для растворов, содержащих антитела) до 200 мкл (для всех других растворов) раствора для обеспечения полного покрытия. Регулярно проверяйте покрытие и корректное погружение СГ в бинокль. Удалите жидкости вручную с помощью пипетки объемом 200 мкл с дополнительным наконечником объемом 10 мкл поверх наконечника объемом 200 мкл. Это предотвратит аспирацию СГ в наконечнике пипетки. Используйте свежеприготовленные растворы и стерильные жидкости для предотвращения роста бактерий.

  1. Фиксируйте SG для гистологии в течение 2 ч при RT в 4% параформальдегиде (PFA)/PBS без метанола.
  2. Обрабатывайте SG как можно быстрее, но их можно хранить в течение 2-4 недель при 4-6 °C в PBS с 0,02% (мас./об.) азида натрия на этом этапе.
  3. Готовят суданский черный раствор (1% суданский черный с в/в 100% этаноле) для снижения автофлуоресценции и улучшения отношения сигнал/фон30. Растворить в течение 2-3 ч на магнитной мешалке при РТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте запасной раствор максимум 6-8 недель, выбрасывайте раньше при появлении седиментации.
  4. Готовят суданский черный рабочий раствор путем центрифугирования запасного раствора в течение 30 мин на полной скорости (13 000 х г)для удаления мусора и разбавления запаса в 70% этаноле до конечной концентрации 0,25% суданского черного.
  5. Обработайте SG отбеливателем Дента для улучшения пермеабилизации антител31. Свежеприготовьте отбеливатель Dent' путем смешивания метанола (MeOH), раствора перекиси водорода 30% (мас./мас.) вH2Oи диметилсульфоксида (DMSO) в соотношении 4:1:1. Добавьте 200 мкл на SG и поместите пластину на орбитальный шейкер на 1 ч при RT.
  6. Выполните нисходящую серию MeOH для регидратации путем инкубации в течение 10 минут каждая на орбитальном шейкере: 100% MeOH, 75% MeOH / PBS, 50% MeOH / PBS, 25% MeOH / PBS.
  7. Выполняют пермеабилизацию путем инкубации SG дважды в течение 60 мин каждый в PBS/1% Triton-X-100 на RT.
  8. Удалите раствор для пермеабилизации из SG и добавьте суданский черный рабочий раствор. Инкубировать в течение 2 ч на RT на орбитальном шейкере.
  9. Тем временем приготовьте блокирующий раствор, добавив 5% рецепторный сывороточный альбумин (BSA) и 0,1% Тритон-Х-100 в PBS в сосуд емкостью 15 мл и дайте ему раствориться на валике в течение примерно 5-10 минут. Декантировать через предварительно плиссированный бумажный фильтр для удаления мусора.
  10. Удалите суданский черный очень осторожно, наклонив пластину и тщательно пипетировку с вертикальной стороны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможно увидеть SG в Судане черным. Используйте сильный источник света и работайте медленно. С этого шага SG окрашиваются в черный цвет, улучшая видимость. Если в этот момент вокруг SG видна какая-либо дополнительная соединительная ткань, удалите ее с помощью щипцов Dumont #5/45 и пружинных ножниц.
  11. Добавьте 200 мкл PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) и промывайте в течение 5 мин при RT на орбитальном шейкере.
  12. Удалите PBS-T, аспирируя его пипеткой и повторите 2 раза.
  13. Удалить PBS; добавить 200 мкл блокирующего раствора и инкубировать при 4 °C в течение ночи на орбитальном шейкере.
  14. На следующий день готовят растворы, добавляя в блокирующий раствор первичные антитела. Адаптировать концентрации антител из установленных протоколов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включить один SG в качестве контроля антител без первичного антитела (инкубированного с антиген-преабсорбированным антителом или IgG, если доступно, или блокирующего буфера).
  15. Проводят первичную инкубацию антител в течение 36-48 ч при 4 °C на орбитальном шейкере. Для измерения размера клеток и окрашивания симпатических нейронов используйте антитела против тирозингидроксилазы (см. Таблицу материалов для рекомендаций по антителам).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите 96-скважинную пластину во влажную камеру (например, пластиковую коробку, выстленную бумажными полотенцами ddH2O), чтобы предотвратить испарение в этот момент.
  16. Осторожно удалите раствор антител и добавьте 200 мкл PBS-T. Поместите пластину на орбитальный шейкер на 30 мин.
  17. Удалите PBS-T и повторите шаг стирки еще 5 раз.
  18. Готовят раствор вторичного антитела, работающего путем центрифугирования флуоресцентных вторичных антител, меченых Alexa, в течение 1 мин на полной скорости (13 000 х г)перед использованием. Развести соответствующие вторичные антитела согласно первичным антителам 1:500 в блокирующем растворе и добавить к SG. Добавить 1 мкг/мл бисбензимида H33342 тригидрохлорида (окрашивание Hoechst), если требуется ядерное окрашивание. Инкубировать в течение 12-24 ч при 4 °C на орбитальном шейкере.
  19. Осторожно удаляют раствор антител и добавляют 200 мкл PBS-T. Поместите пластину на орбитальный шейкер на 30 мин.
  20. Удалите PBS-T и повторите шаг стирки еще 5 раз. На последнем шаге используйте PBS без Triton.
  21. Для встраивания выкладывают 50-100 мкл флуоресцентной монтажной среды (см. Таблицу материалов)на стеклянную горку и ставят под подготовку бинокль. Используйте щипцы Dumont #5/45, чтобы поднять SG из 96-скважинной пластины и удалить лишнюю жидкость, окунув один конец на фильтровальную бумагу (например, сушилочную подушку Whatman) и поместите ее на каплю.
  22. Используйте щипцы Дюмона #5/45 для коррекции позиционирования с соответствующим увеличением.
  23. Аккуратно поместите стеклянную крышку (20 мм х 20 мм) рядом с SG и медленно опуститесь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование слишком большого количества монтажной среды приведет к движению SG или запутывания нервов. Если это произойдет, быстро снимите крышку и повторите шаги 2.9-2.21.
  24. Дайте слайдам высохнуть в темноте на ночь при RT. Хранение окрашенного образца возможно в течение не менее 4-6 недель при 4 °C.

3. Гибридизация всего крепления in situ

ПРИМЕЧАНИЕ: Цельномонтная in situ-гибридизация SG адаптирована из органа корти32 и коммерческого протокола флуоресценции РНК in situ (см. Таблицу материалов). Получите зонды для интересующих генов, буферы и растворы от поставщика. Все этапы инкубации выполняются на RT, если не указано иное. Используйте стерильный PBS. Если вы заинтересованы в окрашивание нескольких SG в одной скважине, используйте не менее 150 мкл буферов и растворов.

  1. Выполните рассечение СГ, как описано в шагах 1.1-1.13.
  2. Фиксируйте SG в течение 1 ч в 200 мкл 4% MeOH-free PFA/PBS в одной лунке 96-луночной пластины, размещенной на орбитальном шейкере.
  3. Промывайте SG три раза в течение 30 мин каждый в 0,1% Tween-20/PBS на орбитальном шейкере.
  4. Обезвоживание SG в серии MeOH/PBS путем последующей инкубации в 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS и 100% MeOH в течение 10 мин каждый на орбитальном шейкере.
  5. Хранить SG при -20 °C в 100% MeOH на ночь.
  6. На следующий день предварительно прогреть инкубатор до 40 °C. Проверьте температуру с помощью термометра.
  7. Регидратировать SG в обратной серии MeOH/PBS (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) в течение 10 мин каждый.
  8. Промыть SG три раза по 5 мин каждый в PBS.
  9. Тем временем начните предварительный прогрев зондов путем инкубации при 40 °C в течение 10 мин с последующим охлаждением в течение 10 мин.
  10. Инкубировать SG в 200 мкл протеазы III в течение 15 мин.
  11. Факультативно: Проводить лечение суданским черным цветом для гашения автофлуоресценции в соответствии с разделами 2.3, 2.4 и 2.8 настоящего протокола, если планируется последующее иммунофлуоресцентное окрашивание.
  12. Промывайте SG в 200 мкл 0,1% Tween-20/PBS 3x в течение 5 мин каждый на орбитальном шейкере.
  13. Дополнительно: Если требуется совместное окрашивание с несколькими зондами, разбавьте зонд Channel-2 (50x) и Channel-3 (50x) в зонд Channel-1 (1x).
  14. Покрыть SG 100 мкл зонда для интересуемого гена и инкубировать в течение ночи при 40 °C с легким перемешиванием. Поместите 96-скважинную пластину во влажную камеру при 40 °C на всех этапах инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите один SG в качестве отрицательного контроля, используя зонд против бактериального гена (например, дигидро-дипиколинатредуктазы, Dapb)для проверки неспецифического связывания реагентов амплификации на более поздних этапах.
  15. Мойте SG в прилагаемом моющий буфер 3x в течение 15 мин каждый на орбитальном шейкере.
  16. Предварительно нагрейте Amp1-3, HRP-C1 и HRP-Blocker до RT. Если желательно совместное окрашивание с зондом Channel-2 и/или Channel-2, предварительно нагрейте HRP-C2 и HRP-C3.
  17. Повторное исправление SG в течение 10 мин на RT в 4% PFA/PBS на орбитальном шейкере.
  18. Промывайте SG в 200 мкл прилагаемого промывного буфера 3x в течение 5 мин каждый на орбитальном шейкере на RT.
  19. Для усиления инкубируют SG со 100 мкл Amp1 в течение 35 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  20. Осторожно удалите любую жидкость и промыть SG в 200 мкл прилагаемого промывного буфера 3x в течение 5 минут каждый на RT на орбитальном шейкере.
  21. Инкубировать SG со 100 мкл Amp2 в течение 35 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  22. Повторите шаг 3.18.
  23. Инкубировать SG со 100 мкл Amp3 в течение 20 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  24. Повторите шаг 3.18.
  25. Инкубировать SG со 100 мкл поставляемого мультиплекса FL v2 HRP-C1 в течение 20 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  26. Повторите шаг 3.18.
  27. Готовят опал-конъюгированное вторичное антитело 1:1000 в 200 мкл поставляемого TSA-буфера и инкубируют SG в течение 35 мин при 40 °C на орбитальном шейкере. Защищайте от света во время инкубации и от этого шага.
  28. Повторите шаг 3.18.
  29. Инкубировать SG в 100 мкл поставляемого Мультиплексного FL v2 HRP-блокатора в течение 15 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  30. Повторите шаг 3.18.
  31. Дополнительно: Для совместного окрашивания с помощью зонда Channel-2 повторите шаги 3.25-3.30 с поставляемым в комплекте Мультиплексом FL v2 HRP-C2.
  32. Дополнительно: Для совместного окрашивания с помощью зонда Channel-3 повторите шаги 3.25-3.30 с поставляемым в комплекте Мультиплексом FL v2 HRP-C3.
  33. В случае последующего иммунофлуоресцентного окрашивания выполните шаги 2.13-2.25 настоящего протокола.
  34. Инкубировать в 1% BSA/PBS в течение 30 мин на орбитальном шейкере.
  35. Инкубировать SG в течение 30 мин в 1 мкг/мл бисбензимида H33342 тригидрохлорида (окрашивание Hoechst) в 1% BSA/PBS, если желательно ядерное окрашивание, и/или добавлять Алекса-связанный агглютинин зародышей пшеницы (WGA, 1:500) на орбитальный шейкер.
  36. Повторите шаг 3.18.
  37. Внедрить, как описано в шагах 2.19-2.22.

4. Визуализация и анализ мышиных звездчатых ганглиев

  1. Выполните конфокальную микроскопию встроенного SG в локальном средстве визуализации.
  2. Если требуется измерение размера ячейки, изображение SG окрашивают на тирозингиплексилазу (см. Таблицу материалов)с 200-кратным увеличением и получают 4-6 случайных изображений из каждого SG.
  3. Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения ImageJ33 для оценки размера ячейки (например, с помощью таблицы перьев, см. Таблица материалов). Используйте свободный выбор рук,обведите каждую ячейку и нажмите «Анализировать | Измерьте, чтобы получить площадь ячейки. Будьте осторожны, чтобы включить только неповрежденные, полностью видимые клетки, которые расположены хорошо в пределах SG.
  4. Используя этот метод, выполняют измерение примерно 100 клеток на SG.
  5. Попрошайки ослепленного исследователя выполнить шаги 4.2-4.3, если вы хотите сравнить SG у разных мышей. Используйте частотное распределение в статистическом программном обеспечении для визуализации различий в размерах между группами34.

5. Молекулярный анализ мышиных звездчатых ганглиев

ПРИМЕЧАНИЕ: Включите элементы управления в зависимости от вашего экспериментального проекта. Это может быть SG с различными генотипами и фоном заболевания и / или другими вегетативными ганглиями, такими как симпатический верхний шейный ганглий (расположенный в области шеи, см. подробное описание в Ziegler et al.35)или парасимпатические ганглии (такие как внутрисердечные ганглии, см. Jungen et al.4).

  1. Приготовьте пробирку объемом 2 мл с 500 мкл раствора фенола/гуанидина тиоцианата (например, Qiazol) на каждое животное и подготовьте жидкий азот, готовый к ударной глазури, или рассмотрите коммерческие решения для защиты РНК (необязательно, см. Таблицу материалов)36. Работайте быстро для выделения РНК.
  2. Выполните рассечение СГ, как описано в шагах 1.1-1.13.
  3. Немедленно погрузить оба SG непосредственно в одну трубку с раствором фенола/гуанидина тиоцианата и ударно-морозную трубку в жидкий азот.
  4. Хранить при -80 °C до дальнейшей обработки.
  5. Для лизиса тканей дайте пробиркам с SG разморозиться до тех пор, пока раствор фенола/гуанидина тиоцианата не будет разжижен, и добавьте два шарика из нержавеющей стали диаметром 7 мм. Охладите металлические части тканевого гомогенизатора (шаровая или смесительная мельница, например, Tissue Lyser II) на сухом льду и центрифуге при 4 °C.
  6. Центрифужные трубки при 500 х г в течение 1 мин при 4 °C так, чтобы SG были в нижней части трубки.
  7. Поместите трубки в металлические части тканевого лизера и лизейте в течение 1 мин при 20 Гц.
  8. Повторяйте шаги 5.6 и 5.7 до 5 раз, пока не обнаружится неповрежденная ткань.
  9. Переложите жидкость в свежую пробирку объемом 1,5 мл.
  10. Выполните изоляцию РНК с помощью комплекта изоляции РНК на основе колонки (например, мини-комплект miRNeasy) в соответствии с инструкциями производителя.
  11. Элютивная РНК в 20 мкл воды без РНКазы и измерение концентрации с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы исключить загрязнение очищенной РНК геномной ДНК, мы предлагаем выполнить полимеразную цепную реакцию с геномными праймерами и 1 мкл РНК в качестве шаблона, вместо этого за вычетом контроля обратной транскриптазы. Это позволит сэкономить значительное количество РНК. Если РНК загрязнена, используйте граничные праймеры экзон-интрон или интронные фланк-праймеры для последующей количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени.
  12. Используйте 250 нг SG РНК для выполнения синтеза кДНК и используйте установленные протоколы. Здесь был использован высокопроизводимый комплект обратной транскрипции кДНК в соответствии с инструкциями производителя.
  13. Разбавляют до конечной концентрации 2,5 нг/мкл кДНК и проводят количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени с соответствующими зондами в соответствии с установленными протоколами. Здесь анализ TaqMan (см. Таблицу материалов)проводили с использованием 10 нг кДНК на реакцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните контроль без шаблона для каждого гена, чтобы исключить ложноположительные результаты.
  14. Нормализуйте экспрессию гена, который представляет интерес для вашего гена на гене домохозяйки (например, Cdkn1b),чтобы сравнить относительную экспрессию генов между различными группами SG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 визуализируется, как идентифицировать и препарировать SG. На рисунке 1A показан схематический рисунок местоположения, в то время как на рисунке 1B представлен вид на грудную клетку после удаления пакета сердце-легкое. Левая и правая мышцы longus colli medial от SG и грудной клетки являются важными ориентирами для ориентации. Рассечение выполняется по пунктирным линиям между мышцами и первым ребром. SG и симпатическая цепь становятся видимыми в виде белых структур(рисунок 1C). На рисунке 1D показано увеличение области между левой длинной колли-мышцей и первым ребром, где расположен левый SG. Морфология СГ различается у разных особей. Она часто состоит из слияния нижнего шейного и первого к третьему грудногоганглия 24. Некоторое разнообразие, которое экспериментатор может ожидать в мышином SG, изображено на рисунке 1E,F,где сфотографированы левый и правый SG пяти самцов мышей дикого типа C57Bl6.

Оценка валового анатомического обзора, а также клеточного и субклеточного анализа клеток в SG, иннервируемых сердцем, может быть выполнена целыми методами крепления на уровне белка и РНК. Обзор SG представлен на рисунке 2. Симпатические волокна миокарда происходят из клеточных тел в SG. Они визуализируются путем окрашивания антителом против тирозингидроксилазы (TH). TH-экспрессивные нейрональные соматы окружены нервными волокнами, окрашивающими положительное для холина ацетилтрансферазы (ChAT). Это, скорее всего, пресинаптические волокна37,38. Примерное увеличение от совместной маркировки TH и ChAT представлено на рисунке 2A. Глиальные клетки, окружающие тела нейрональных клеток, могут быть визуализированы путем окрашивания для S100B. Это показано на рисунке 2B в сочетании с нейронным маркером PGP9.5. На рисунке 2C-F показаны примерные анализы для изучения SG на субклеточном уровне с использованием гибридизации всего mount in situ и иммунофлуоресцентного совместного окрашивания. Белок TH(Рисунок 2C,красный) и молекулы мРНК Tubb3 (Рисунок 2D,белый) экспрессируются в крупных нейронных клеточных телах, в то время как мРНК S100b (Рисунок 2E,зеленый) также обнаруживается в окружающих клетках глии. На слиянии(рисунок 2F)видно, что некоторые нейроны отрицательны для TH, но экспрессируют Tubb3,в то время как мРНК S100b также могут быть обнаружены в окружающих клетках, как показано на увеличении на рисунке 2G.

На рисунке 3 представлены потенциальные количественные анализы и подводные камни для изучения мышиного SG. Изображения из SG, окрашенного TH(Рисунок 3A),могут быть использованы для измерения размера клеток, как это было выполнено для мышиной модели диабета. Нейрональные соматы из контрольной (db/het) SG составляли 388,8 ± 123,8мкм2 по сравнению с диабетическим SG (db/db) 407,33 ± 139,6мкм2 (Рисунок 3B,n = 2 SG, 100 клеток на SG на генотип, P = 0,348, данные сравнивали с помощью теста Манна-Уитни). На рисунке 3С показана экспрессия генов из разных типов клеток SG (n = 6-7). Объединение обоих SG одного животного позволяет измерять экспрессию генов примерно 24 анализов (12 генов в дубликатах). Обычно мы нормализуем образцы для Cdkn1b (обнаружен при значениях Ct 25,4 ± 0,97), а также нейронного маркера Neun/Rbfox3 (32,5 ± 0,7), если необходимо учитывать другие типы клеток и нейронную чистоту рассечения. Гены, которые мы нашли полезными для характеристики молекулярных процессов в SG, включают симпатический ген Th (22,4 ± 1,6), Chat,который может указывать на холинергическую трансдифференцировку (выраженную при значениях Ct 30,8 ± 1,3) и Gap43,маркер прорастания нейронов (обнаруживаемый при значениях Ct 22,4 ± 1,4). Гены, экспрессируемые в ненейрональном типе клеток, включают S100b (для глиальных клеток 27,3 ± 1,2), Ki-67 (для пролиферационных клеток 33,0 ± 1,6) и Cd45 (для иммунных клеток 30,2 ± 1,1).

SG окружен капсулой соединительнойткани 26,визуализированной с помощью окрашивания гематоксилином и эозином на рисунке 3D,E. Иногда мы наблюдали несоответствия в окрашивание на основе антител, как показано на рисунке 3F,скорее всего, из-за неполного удаления капсулы. В то время как окрашивание ChAT и TH обнаруживаются только в некоторых частях SG, ядра, загрязненные DAPI, обнаруживаются повсюду. Пунктирная линия на объединенном изображении отделяет успешное окрашивание (справа от линии) от неудачного окрашивания (слева от линии).

Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Статистическая значимость была определена как значение P, равное <0,05; статистический анализ проводился с использованием коммерческого программного обеспечения.

Figure 1
Рисунок 1:Расположение, рассечение и морфология ганглиев мышиной звезды. (A) Схематический рисунок расположения звездчатых ганглиев (SG). (B) Вид в грудную клетку после удаления сердечно-легочной упаковки. Важно отметить, что SG не сразу видны большую часть времени. Длинные колли мышцы расположены латерально от позвоночника. СГ расположены латерально от мышц на стыке с первым ребром. Осторожно рассекайте боковые мышцы (область, отмеченная пунктирной линией), чтобы раскрыть ганглии. После рассечения ганглии (левые и правые, LSG и RSG соответственно) и симпатическая цепь могут быть разобраны как белые, длинные структуры. (C)Образцовое вскрытие, показывающее ганглии и анатомические ориентиры. (D)Увеличение МПГ. (E)LSG и(F)RSG из дикого типа, самцы мышей C57Bl6 (16 недель) были рассечены и сфотографированы, чтобы показать различия в морфологии и размере. Шкала представляет собой 1 000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Визуализация различных типов клеток в мышиных звездчатых ганглиях с помощью иммуногистохимии цельного маунта и гибридизации in situ. (A)Общий обзор мышиного звездчатого ганглия (SG), окрашенного для симпатического маркера тирозингидроксилазы (TH) и холина ацетилтрансферазы (ChAT). Увеличение показывает TH-положительные клеточные тела и наличие ChAT-положительных, скорее всего, пресинаптических, нервных волокон, окружающих нейрональные соматы. (B) Глиальные клетки, обволакивающие тела нейрональных клеток, могут быть визуализированы путем окрашивания для S100B, здесь в сочетании с нейронным маркером PGP9.5. (C, D, E,F) Микроскопические изображения с одного SG окрашенного цельного крепления с помощью комбинации иммуногистохимии для TH (красный) и гибридизации in situ для Tubb3 (D, белый) и S100b (E, зеленый). Ядра уравнодерживаются DAPI (синий). (F) Слияние показывает, что не все нейронные(Tubb3-положительные) клетки являются TH-положительными. S100b mRNAs могут быть обнаружены в нейронных соматах, а также в окружающих клетках, что отмечено стрелкой в увеличении в (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Потенциальный количественный анализ и подводные камни. (A) Изображения из SG, окрашенного тирозин-гидроксилазой (TH), могут быть использованы для измерения размера клеток с использованием ImageJ. (B) Это было выполнено на мышиной модели диабета (100 клеток на SG, n = 2 SG на генотип, данные сравнивали с помощью теста Манна-Уитни). (C) Примерные гены, экспрессируемые в SG, которые могут быть полезны для характеристики молекулярных процессов. Cdkn1b, а также нейрональный маркер Neun/Rbfox3 (для учета присутствия других типов клеток) могут быть использованы для нормализации. Тирозингидроксилаза(Th)служит симпатическим маркером, холина ацетилтрансфераза(Chat)для холинергической трансдифференциации, Gap43 для прорастания нейронов. Гены, экспрессируемые в ненейрональных типах клеток, включают S100b (глиальные клетки), Ki-67 (пролиферирующая клетка) и Cd45 (иммунные клетки). (D)Окрашивание гематоксилином и эозином закрепленного формалином SG визуализирует соединительную ткань и клетки поверх SG.(E)Увеличение из коробочной области. (F)В некоторых случаях мы наблюдали неудачу в окрашивание на основе антител, скорее всего, из-за неполного удаления капсулы. В то время как окрашивание ChAT (красный) и TH (зеленый) обнаруживаются только в некоторых частях SG, ядра, окрашенные DAPI (темно-синий), обнаруживаются повсюду. Пунктирная линия на объединенном изображении отделяет успешное окрашивание (справа от линии) от неудачного окрашивания (слева от линии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Понимание клеточных и молекулярных процессов в нейронах и глиальных клетках симпатической нервной системы, которые предшествуют началу ВА, представляет большой интерес, так как внезапная остановка сердца остается наиболее распространенной причиной смерти во всем мире5. Поэтому в настоящей рукописи мы предоставляем базовый репертуар методов идентификации мышиного SG — мышиного элемента в этой сети — и выполняем последующие анализы на уровне РНК, белка и клеток.

Одной из проблем мышиного SG является его размер и ограниченное количество клеток39. Из-за этого для исследований SG используются различные модели животных, такие как крысы40,собаки22и свиньи41. Тем не менее, существует множество хорошо заявленные модели заболеваний для сердечных фенотипов, доступных у мышей, и некоторые из них уже были охарактеризованы в различных аспектах сердечной иннервации и аритмии, таких как модели для диабета23,инфаркта миокарда42или миокардита43. Поэтому необходимы дальнейшие исследования мышиного SG для дальнейшей характеристики вегетативной дисфункции в свете VA. Они могут быть дополнены другими подходами к изучению иннервации мышиногосердца,такими как функциональные эксперименты4,23,44, включая стимуляцию in vivo SG23.

Из-за его небольших размеров и его расположения в грудной полости24,манипуляция с мысиной SG in vivo является сложной, хотя она была успешно выполнена23. По этой причине некоторые исследования поэтому фокусируются на верхних шейных ганглиях, которые расположены более легко в шее, выше по течению от SG в симпатической цепи позади каротидного бифуркации во внутренние и наружные сонные артерии24,35. Было показано, что сердечная денервация путем удаления верхних шейных ганглиев смягчает воспаление миокарда, гипертрофию и сердечную дисфункцию после инфаркта миокарда35. Тем не менее, важно отметить, что верхние шейные ганглии иннервируют различные области сердца, наиболее заметную из них является передняя сторона45. Кроме того, недавний углубленный обзор литературы пришел к выводу, что роль шейных ганглиев в симпатической иннервации сердца остается неясной у людей46. Это подчеркивает важность характеристики SG для исследований сердечной симпатической иннервации.

Важно отметить, что сердце не является единственной мишенью СГ. Среди прочего, легкие47 и потовые железы в48 также иннервируются из волокон, происходящих из SG, последние являются исключением из симпатической физиологии, поскольку они экспрессируют холина ацетилтрансферазу37. Временная блокада СГ изучается в отношении воспалительных процессов при остром повреждении легких49 или для лечения приливов и дисфункции сна50; поэтому рассматриваемые протоколы могли бы предложить репертуар для механистических вопросов в этих областях. Сосредотачиваясь на моделях сердечных заболеваний, следует иметь в виду для интерпретации результатов, что сердечные нейроны не могут быть дифференцированы по морфологии или электрофизиологическим свойствам от несердечных нейронов51. Это может быть достигнуто путем ретроградной трассировки, благодаря этому было показано, что расположение нейронов, выступающих на сердце, расположено в черепо-медиалических частях SG52.

Кроме того, важно отметить, что помимо различных типов нейронов, симпатические ганглии состоят из обволакивающих глий, так называемых спутниковых глиальных клеток или клеток-сателлитов, отмеченных экспрессией глиального маркера S100B53. Хотя мало что известно о роли этих клеток в сердечно-сосудистых патологиях, глиальная активация и экспрессия глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) были описаны в SG у пациентов с аритмиями18.

Некоторые подводные камни следует иметь в виду с представленными методами: мы наблюдали несоответствия в окрашивание на основе антител в некоторых случаях и предположили, что неполное удаление капсулы соединительной ткани, обволакивающей SG, может быть виновато, поскольку они были описаны как различающиеся по проницаемости среди различных типов ганглиев26. Механическое удаление капсулы с помощью тонких щипцов было описано в верхней шейной ганглиях крыс до постнатального 1028 дня и дешиновка упоминается в литературе для взрослых крыс SG54,55 и мышей56. Удаление капсулы SG может варьироваться от возраста28 лет и - из-за различий в размерах - видов. По нашему опыту, свежее рассечение, удаление как можно большей соединительной ткани с помощью тонких щипцов и тщательная пермеабилизация, как описано в рассматриваемом протоколе, являются важными факторами для успешного окрашивания. Что касается количественной ПЦР в режиме реального времени, важна быстрая работа и эффективный лизис. Объединение обоих СГ одного животного позволило надежно проанализировать до 12 различных генов (при выполнении дубликатов).

Несмотря на то, что функция и грубая анатомия SG изучается уже несколько десятилетий, и каждый кардиомиоцит иннервируется симпатическими волокнами46,остается много открытых вопросов. Например, остается неясным, почему симпатические нейроны SG трансдифференцируются транзиторно к холинергическому фенотипу при ишемической21 и неишемической сердечной недостаточности, на животных моделях, а также у пациентов20. Недавно наша группа описала роль S100B-положительных глиальных клеток, которые также присутствуют в мышином SG, на прорасти нервов в сердечной нервной системе29. Имеют ли эти клетки отношение к прорастию симпатического нерва послетравмы,связанной с VA11,12,необходимо выяснить в будущих исследованиях. Важно отметить, что инновационные подходы, такие как оптогенетика52 и анализ транскриптома36, могут дополнять установленные методы, такие как отслеживание нейронов, чтобы углубить понимание симпатической нервной системы и ее роли в электрофизиологии сердца.

В заключение, этот репертуар позволяет неопытным исследователю выполнить базовую характеристику СГ в мышиных моделях сердечных патологий. Мы надеемся, что это будет стимулировать использование, сочетание и создание новых методов. Это может помочь повысить понимание основных клеточных и молекулярных процессов в симпатических нейронах, которые могут быть ответственны за возникновение и поддержание VA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Хартвига Вибольдта за его отличную техническую помощь и Центр микроскопической визуализации UKE (Umif) Университетского медицинского центра Гамбург-Эппендорф за предоставление микроскопов и поддержку. Это исследование финансировалось DZHK (Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований) [FKZ 81Z4710141].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate TPP 92097 RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm R. Langenbrinck 03-0060 Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. Serva 11924.03 Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647  Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568  Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488  Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Drying block 37-100 mm Whatman (Sigma Aldrich) WHA10310992  Whole mount staining
Eosin Y Sigma Aldrich E4009 Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) Th.Geyer 2212.5000 Whole mount staining
Eukitt mounting medium AppliChem 253681.0008 Whole mount staining
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI Southern Biotech 0100-20 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
H2O2 30% (w/w) Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml Rotexmedica PZN: 3862340 Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit Life technologies  4368813 RNA isolation
Isoflurane (Forene) Abbott Laboratories 2594.00.00 Preparation SG
Mayer's hemalum solution Merck 1.09249.0500 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller Marienfeld 0101040 Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA isolation
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000C RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack Akoya Bioscience FP1488001KT RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free  Alfa Aesar 43368 Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm Th.Geyer 7691202 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco 18912-014 Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps FineScienceTools 11203-25 Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent Qiagen  79306 RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
RNAlater Merck R0901-100ML RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 biotechne (ACD) 323100 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 biotechne (ACD) 431738-C2 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 biotechne (ACD) 423391 RNAscope
Stainless steel beads 7 mm  Qiagen  69990 RNA isolation
Sudan black B Roth 0292.2 Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan mastermix Applied biosystems 4370074 Gene Expression analysis 
Tissue Lyser II Qiagen 85300 RNA isolation
Triton X-100 10% solution Sigma-Aldrich 93443-100ml Whole mount staining
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ML RNAscope
Wacom bamboo pen Wacom CTL-460/K Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 Sigma-Aldrich WHA10311647 Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 RNAscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
  2. Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
  3. Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
  4. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  5. Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
  6. Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
  7. Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
  8. Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
  9. Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
  10. Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
  11. Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
  12. Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
  13. Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
  14. Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
  15. Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
  16. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
  17. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
  18. Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
  19. Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
  20. Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
  21. Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
  22. Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
  23. Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
  24. Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
  25. Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
  26. Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
  27. Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
  28. Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
  29. Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
  30. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  31. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  32. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
  35. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
  36. Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
  37. Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
  38. Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
  39. Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
  40. Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
  41. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  42. Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
  43. Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
  44. Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
  45. Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
  46. Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
  47. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  48. Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
  49. Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
  50. Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
  51. Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
  52. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  53. Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
  54. Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  55. Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
  56. Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).

Tags

Медицина Выпуск 166 Симпатическая нервная система звездчатые ганглии внутрисердечная вегетативная нервная система желудочковая аритмия нейроморфология электрофизиология
Расположение, рассечение и анализ мышиного звездчатого ганглия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scherschel, K., Bräuninger, H., … More

Scherschel, K., Bräuninger, H., Glufke, K., Jungen, C., Klöcker, N., Meyer, C. Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion. J. Vis. Exp. (166), e62026, doi:10.3791/62026 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter