Summary
Los cambios fisiopatológicos en el sistema nervioso autónomo cardíaco, especialmente en su rama simpática, contribuyen al inicio y mantenimiento de las arritmias ventriculares. En el actual protocolo, mostramos cómo caracterizar los ganglios estrellado murine para mejorar la comprensión de los procesos moleculares y celulares subyacentes.
Abstract
El sistema nervioso autónomo es un conductor substancial de la electrofisiología cardiaca. Especialmente el papel de su rama comprensiva es una materia en curso de la investigación en la patofisiología de las arritmias ventriculares (VA). Las neuronas en los ganglios estrellados (SG) – estructuras bilaterales en forma de estrella de la cadena simpática – son un componente importante de la infraestructura simpática. Los SG son una blanco reconocida para el tratamiento vía la desnervación comprensiva cardiaca en pacientes con el VA terapia-refractario. Mientras que el remodelado neuronal y la activación glial en el SG se han descrito en pacientes con el VA, los procesos celulares y moleculares subyacentes que potencialmente preceden el inicio de la arritmia se entienden solamente escaso y se deben aclarar para mejorar la modulación autonómica. Los modelos de ratón nos permiten estudiar la remodelación neuronal simpática, pero la identificación del SG murino es un desafío para el investigador inexperto. Así, los estudios biológicos celulares y moleculares profundizados del SG murine están careciendo para muchas enfermedades cardiacas comunes. Aquí, se describe un repertorio básico para la disección y el estudio de la SG en ratones adultos para análisis a nivel de ARN (aislamiento de ARN para análisis de expresión génica, hibridación in situ), nivel de proteína (inmunofluorescente de montaje entero de tinción), y el nivel celular (morfología básica, medición del tamaño celular). Presentamos soluciones potenciales para superar los desafíos en la técnica de preparación, y cómo mejorar la tinción a través del temple de la autofluorescencia. Esto permite la visualización de neuronas, así como células gliales a través de marcadores establecidos con el fin de determinar la composición celular y los procesos de remodelación. Los métodos aquí presentados permiten caracterizar el SG para obtener más información sobre la disfunción autonómica en ratones propensos al VA y pueden complementarse con técnicas adicionales que investigan los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso autónomo en el corazón.
Introduction
El sistema nervioso autónomo cardíaco es un equilibrio estrechamente regulado de componentes simpáticos, parasimpáticos y sensoriales que permite al corazón adaptarse a los cambios ambientales con la respuesta fisiológica adecuada1,2. Las alteraciones en este equilibrio, por ejemplo, un aumento de la actividad simpática, se han establecido como un factor clave para la aparición, así como el mantenimiento de las arritmias ventriculares (AV)3,4. Por lo tanto, la modulación autonómica, lograda a través de la reducción farmacológica de la actividad simpática con betabloqueantes, ha sido una piedra angular en el tratamiento de pacientes con AV durante décadas5,6. Pero a pesar de las intervenciones farmacológicas y basadas en catéteres, un número relevante de pacientes todavía sufre de VArecurrente 7.
La entrada simpática al corazón está mediada principalmente a través de cuerpos celulares neuronales en los ganglios estrellados (SG), estructuras bilaterales en forma de estrella de la cadena simpática, que transmiten información a través de numerosos nervios intratorácicos desde el tronco encefálico hasta elcorazón 8,9,10. La brotación nerviosa del SG después de la lesión se asocia con el AV y la muerte súbita cardíaca11,12,destacando el SG como objetivo de la modulación autonómica13,14. Una reducción de la entrada simpática al corazón se puede lograr temporalmente a través de la inyección percutánea de anestésicos locales o permanentemente mediante la extirpación parcial de la SG a través de la toracoscopia asistida por video15,16. La denervación simpática cardíaca presenta una opción para los pacientes con AV refractaria a la terapia con resultados prometedores14,16,17. Hemos aprendido de la SG explantada de estos pacientes que la remodelación neuronal y neuroquímica, la neuroinflamación y la activación glial son sellos de remodelación simpática que podrían contribuir o agravar la disfunción autonómica18,19. Aún así, los procesos celulares y moleculares subyacentes en estas neuronas siguen siendo oscuros hasta la fecha, por ejemplo, el papel de la transdiferenciación neuronal en un fenotipo colinérgico20,21. Los estudios experimentales presentan nuevos enfoques para tratar el AV, por ejemplo, la reducción de la actividad nerviosa simpática a través de la optogenética22,pero la caracterización en profundidad de la SG todavía falta en muchas patologías cardíacas que van de la mano con el AV. Los modelos de ratón que imitan estas patologías permiten estudiar la remodelación neuronal que potencialmente precede a la aparición de arritmias12,23. Éstos se pueden completar por otros análisis morfológicos y funcionales para la caracterización autonómica del corazón y del sistema nervioso. En el presente protocolo, proporcionamos un repertorio básico de métodos que permiten diseccionar y caracterizar el SG murino para mejorar la comprensión del AV.
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Protocol
Todos los procedimientos relacionados con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Estado de Hamburgo (ORG870, 959) y la Agencia Estatal de Renania del Norte-Westfalia para la Naturaleza, el Medio Ambiente y la Protección del Consumidor (LANUV, 07/11) y se ajustan a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (2011). Los estudios fueron realizados usando los ratones masculinos y femeninos (envejecidos 10-24 semanas) C57BL/6 (número común 000664, laboratorios de Jackson) y los ratones homocigóticos (db/db) o heterozigóticos (db/het; control) para la mutación espontánea de la diabetes (DbdeLepr; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, número de stock 000642, Jackson Laboratories). Los autores han utilizado los protocolos disponibles sin variaciones para ratones de hasta 60 semanas de edad.
1. Localización y disección de ganglios estrellado murinos
NOTA: A pesar de que las descripciones y dibujos están disponibles en su mayoría en especies más grandes, algunas publicaciones han descrito previamente la ubicación del SG en ratas24 y ratones25 utilizando métodos anatómicos y líneas de reportero fluorescente, respectivamente.
- Preparar 50 mL de solución salina tamponada por fosfato (PBS) helada (3-4 °C) heparinizada (20 unidades/mL, ver Tabla de Materiales)tamponada con fosfato. Realizar la disección del SG a temperatura ambiente (RT).
- Anestesiar profundamente el ratón por inhalación de isoflurano al 3%-5% de acuerdo con las directrices institucionales y locales. Verificar la anestesia adecuada por pérdida del reflejo de abstinencia del pedal. Decapitar ratones o realizar dislocación cervical.
NOTA: La dislocación cervical incorrecta puede dar lugar a la rotura de la espina dorsal y al daño de los recipientes torácicos que llevan a la sangría que dificulta la preparación o la ruptura de la cadena comprensiva, de modo que los SG no estén en su posición correcta. Por lo tanto, es fundamental que el personal experimentado realice la dislocación cervical o decapitar a los animales en la sedación profunda. - Rocíe la piel con etanol y abra el tórax con dos incisiones a lo largo de las líneas axilares anteriores usando tijeras mayo y escopas de patrón estrecho. Cortar el diafragma y retirar la parte delantera de la caja torácica.
- Retire el paquete corazón-pulmón agarrando la aorta y la vena cava justo encima del diafragma usando fórceps de Londres y cortando todos los vasos y tejido conectivo cerca de la columna vertebral de abajo con las tijeras del estrabismo.
- Enjuague el tórax a fondo con PBS heparinizado usando una pipeta desechable de plástico hasta que se eliminen todos los rastros de sangre.
- Coloque el torso bajo prismáticos de preparación de estereomicroscopio y asegure una buena iluminación en el tórax con fuentes de luz externas.
- Localice la primera costilla y los músculos longus colli.
NOTA: Los SG están situados bilateralmente, paralelos a la columna vertebral en la rama entre la primera costilla y la columna vertebral, en un surco lateral a los músculos longus colli24. El lado plano del SG se encuentra adyacente a los músculos longus colli. Dependiendo de la preparación, partes de la cadena simpática ya podrían ser visibles como fibras blancas y oblicuas paralelas a la columna vertebral. Éstos se pueden remontar a lo largo del SG. - Use suavemente la punta de las pinzas Dumont #5/45 para exponer el tejido conectivo lateral al músculo longus colli.
- Gire las pinzas alrededor de 180 ° y use el lado plano para agarrar el SG y sacarlo con una presión mínima.
- Repita con el segundo SG.
- Coloque ambos SG en un plato (6 cm de diámetro) lleno de PBS frío e inspeccione con el aumento adecuado. Si es necesario, elimine el exceso de vasos, el tejido graso y los nervios más grandes.
NOTA: Los ganglios autonómicos están rodeados por una cápsula de tejido conectivo que consiste en fibras de colágeno y fibroblastos26,27. La permeabilidad de estas cápsulas parece variar entre especies, diferentes tipos de ganglios de26 años y28años. Retire tanto tejido conectivo como sea posible usando dumont #5/45 fórceps y, si es necesario, tijeras de resorte. - Dependiendo del objetivo del experimento, continúe con la sección 2, 3 o 5 de este protocolo.
2. Protocolo de inmunohistoquímica de montaje completo
NOTA: Este protocolo está adaptado de las tinciones cardíacas de montura entera4,29. Realice los pasos de incubación para cada SG en un pozo de una placa de 96 pozos y use de 100 μL (para soluciones que contienen anticuerpos) a 200 μL (para todas las demás soluciones) de la solución para garantizar una cobertura completa. Comprobar regularmente la cobertura y correcta inmersión del SG con prismáticos. Retire los líquidos manualmente con una pipeta de 200 μL con una punta adicional de 10 μL encima de la punta de 200 μL. Esto evitará la aspiración del SG en la punta de la pipeta. Use soluciones recién preparadas y líquidos estériles para prevenir el crecimiento bacteriano.
- Fije el SG para la histología para 2 h en el RT en el paraformaaldehído metanol-libre del 4% (PFA) /PBS.
- Procese sg lo más rápido posible, pero se pueden almacenar durante 2-4 semanas a 4-6 °C en PBS con azida de sodio al 0,02% (p/v) en este punto.
- Preparar la solución de stock negro de Sudán (1% negro de Sudán w / v en etanol al 100%) para la reducción de la autofluorescencia y la mejora de la relación señal/fondo30. Disolver durante 2-3 h en un agitador magnético en RT.
NOTA: Utilice la solución común durante un máximo de 6-8 semanas, deseche antes cuando aparezca la sedimentación. - Prepare la solución de trabajo negro de Sudán centrifuminando la solución común durante 30 min a toda velocidad (13,000 x g)para eliminar los desechos y diluir el stock en etanol al 70% hasta una concentración final de 0.25% de negro de Sudán.
- Tratar la SG con lejía de Dent para mejorar la permeabilización de anticuerpos31. Prepare recientemente la lejía de Dent mezclando metanol (MeOH), solución de peróxido de hidrógeno al 30% (p/p) enH2O y dimetil sulfóxido (DMSO) en una proporción de 4:1:1. Añadir 200 μL por SG y colocar la placa en una coctelera orbital durante 1 h en RT.
- Realice una serie de MeOH descendente para la rehidratación incubando durante 10 minutos cada una en una coctelera orbital: 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
- Realizar la permeabilización incubando SG dos veces durante 60 min cada una en PBS/1% Triton-X-100 a RT.
- Elimine la solución de permeabilización del SG y agregue la solución de trabajo negro de Sudán. Incubar durante 2 h en RT en una coctelera orbital.
- Mientras tanto, prepare una solución de bloqueo agregando al 5% de albúmina sérica bovina (BSA) de grado receptor y al 0,1% de Tritón-X-100 en PBS un recipiente de 15 mL y déjelo disolver en un agitador de rodillos durante aproximadamente 5-10 min. Decantar a través de un filtro de papel pre-plisado para eliminar los escombros.
- Retire el negro sudanés con mucho cuidado inclinando la placa y pipeteando cuidadosamente desde el lado vertical.
NOTA: No es posible ver el SG en Sudán negro. Utilice una fuente de luz fuerte y trabajar lentamente. A partir de este paso, los SG se tiñen de negro, mejorando la visibilidad. Si se ve algún tejido conectivo adicional que rodea a SG en este punto, retírelo usando las fórceps de Dumont #5/45 y las tijeras de resorte. - Añadir 200 μL de PBS/0,1% Tritón-X-100 (PBS-T) y lavar durante 5 min a RT en una coctelera orbital.
- Retirar el PBS-T aspirando con una pipeta y repetir 2 veces.
- Quitar PBS; añadir 200 μL de solución de bloqueo e incubar a 4 °C durante la noche en una coctelera orbital.
- Al día siguiente, prepare las soluciones agregando anticuerpos primarios en la solución de bloqueo. Adaptar las concentraciones de anticuerpos a partir de los protocolos establecidos.
NOTA: Incluya un SG como control de anticuerpos sin anticuerpos primarios (incubado con anticuerpos preabsorbidos por antígeno o IgG, si está disponible, o tampón de bloqueo). - Realizar incubación primaria de anticuerpos durante 36-48 h a 4 °C en una coctelera orbital. Para las mediciones del tamaño celular y la tinción de neuronas simpáticas, use anticuerpos contra la tirosina hidroxilasa (consulte la Tabla de materiales para obtener recomendaciones sobre anticuerpos).
NOTA: Coloque la placa de 96 pozos en una cámara húmeda (por ejemplo, caja de plástico forrada con toallas de papel ddH2O humedecido) para evitar la evaporación en este punto. - Retire la solución de anticuerpos cuidadosamente y agregue 200 μL de PBS-T. Coloque la placa en una coctelera orbital durante 30 min.
- Retire PBS-T y repita el paso de lavado 5 veces adicionales.
- Prepare la solución de trabajo de anticuerpos secundarios centrifuminando los anticuerpos secundarios fluorescentes marcados con Alexa durante 1 minuto a toda velocidad (13,000 x g)antes de su uso. Diluir los anticuerpos secundarios apropiados de acuerdo con los anticuerpos primarios 1:500 en la solución de bloqueo y añadir a SG. Añadir 1 μg/mL de bisbenzimida H33342 tricloruro (tinción de Hoechst) si se desea tinción nuclear. Incubar durante 12-24 h a 4 °C en una coctelera orbital.
- Retire la solución de anticuerpos con cuidado y agregue 200 μL de PBS-T. Coloque la placa en una coctelera orbital durante 30 min.
- Retire PBS-T y repita el paso de lavado 5 veces adicionales. Para el último paso, utilice PBS sin Tritón.
- Para la incrustación, esparcir 50-100 μL de medio de montaje fluorescente (ver Tabla de Materiales)en un portaobjetos de vidrio y colocar en preparación prismáticos. Use las fórceps Dumont #5/45 para recoger SG de la placa de 96 pocillos y elimine el exceso de líquido sumergiendo un extremo en un papel de filtro (por ejemplo, almohadilla de secado Whatman) y colóquelo en la gota.
- Utilice las #5/45 de Dumont para corregir el posicionamiento con el aumento adecuado.
- Coloque suavemente una cubierta de vidrio (20 mm x 20 mm) junto al SG y descienda lentamente.
NOTA: El uso de demasiado medio de montaje dará lugar al movimiento del SG o al enredo de los nervios. Si eso sucede, retire rápidamente el cubrebocas y repita los pasos 2.9-2.21. - Deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad durante la noche en RT. El almacenamiento del espécimen teñido es posible durante al menos 4-6 semanas a 4 °C.
3. Hibridación in situ de montaje completo
NOTA: La hibridación in situ de montaje completo del SG está adaptada del órgano de corti32 y del protocolo comercial de fluorescencia de ARN in situ (ver Tabla de Materiales). Obtener sondas para los genes de interés y tampones y soluciones del proveedor. Todos los pasos de incubación se realizan en RT, si no se menciona lo contrario. Use PBS estéril. Si está interesado en tinción de varios SG en un pozo, utilice al menos 150 μL de tampones y soluciones.
- Realice la disección del SG según lo descrito en los pasos 1.1-1.13.
- Fije SG durante 1 h en 200 μL de PFA/PBS libre de MeOH al 4% en un pozo de una placa de 96 pozos colocada en una coctelera orbital.
- Lave el SG tres veces durante 30 minutos cada una en Tween-20/PBS del 0,1% en un agitador orbital.
- Deshidratar SG en la serie MeOH/PBS por incubación posterior en MeOH/PBS al 50%, MeOH/PBS al 70% y MeOH/PBS al 100% durante 10 min cada uno en una coctelera orbital.
- Guarde SG a -20 °C en 100% MeOH durante la noche.
- Al día siguiente, precalentar la incubadora a 40 °C. Compruebe la temperatura con un termómetro.
- Rehidrate SG en series Inversas de MeOH/PBS (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) durante 10 min cada una.
- Lave sg tres veces durante 5 minutos cada una en PBS.
- Mientras tanto, comience a precalentar las sondas por incubación a 40 °C durante 10 min, seguido de enfriamiento durante 10 min.
- Incubar SG en 200 μL de Proteasa III durante 15 min.
- Opcional: Realice el tratamiento negro de Sudán para apagar la autofluorescencia de acuerdo con las secciones 2.3, 2.4 y 2.8 de este protocolo si se planean tinciones de inmunofluorescencia posteriores.
- Lavar sg en 200 μL de Tween-20/PBS 3x al 0,1% durante 5 min cada uno en una coctelera orbital.
- Opcional: Si se desea la tinción co-tinción con varias sondas, diluya la sonda Channel-2 (50x) y la sonda Channel-3 (50x) en la sonda Channel-1 (1x).
- Cubrir sg con 100 μL de sonda para el gen de interés e incubar durante la noche a 40 °C con ligera agitación. Coloque la placa de 96 pozos en una cámara húmeda a 40 °C para todos los pasos de incubación.
NOTA: Incluya un SG como control negativo, utilizando una sonda contra un gen bacteriano (por ejemplo, dihidro-dipicolinato reductasa, Dapb)para comprobar si hay una unión no específica de los reactivos de amplificación en pasos posteriores. - Lave sg en el tampón de lavado suministrado 3x durante 15 minutos cada uno en una coctelera orbital.
- Pre-caliente Amp1-3, HRP-C1, y HRP-Blocker a RT. Si se desea la tinción co-tinción con la sonda Channel-2 y/o Channel-2, HRP-C2 y HRP-C3 precalentos.
- Re-fije el SG por el minuto 10 en el RT en el 4% PFA/PBS en una coctelera orbital.
- Lavar sg en 200 μL de tampón de lavado suministrado 3x durante 5 min cada uno en una coctelera orbital en RT.
- Para la amplificación, incubar SG con 100 μL de Amp1 durante 35 min a 40 °C en un agitador orbital.
- Retire cuidadosamente cualquier líquido y lave la SG en 200 μL de tampón de lavado suministrado 3x durante 5 min cada uno a RT en una coctelera orbital.
- Incubar SG con 100 μL de Amp2 durante 35 min a 40 °C en una coctelera orbital.
- Repita el paso 3.18.
- Incubar SG con 100 μL de Amp3 durante 20 min a 40 °C en una coctelera orbital.
- Repita el paso 3.18.
- Incubar SG con 100 μL de Multiplex FL v2 HRP-C1 suministrado durante 20 min a 40 °C en una coctelera orbital.
- Repita el paso 3.18.
- Preparar el anticuerpo secundario conjugado con ópalo 1:1.000 en 200 μL de TSA-tampón suministrado e incubar SG durante 35 min a 40 °C en una coctelera orbital. Proteger de la luz durante la incubación y de este paso en.
- Repita el paso 3.18.
- Incubar SG en 100 μL de multiplexx FL v2 HRP-blocker suministrado durante 15 min a 40 °C en una coctelera orbital.
- Repita el paso 3.18.
- Opcional: Para la tinción co-tinción con la sonda Channel-2, repita los pasos 3.25-3.30 con multiplexx FL v2 HRP-C2 suministrado.
- Opcional: Para la tinción co-tinción con la sonda Channel-3, repita los pasos 3.25-3.30 con multiplexx FL v2 HRP-C3 suministrado.
- En caso de tinción inmunofluorescente posterior, realice los pasos 2.13-2.25 de este protocolo.
- Incubar en BSA/PBS al 1% durante 30 min en una coctelera orbital.
- Incubar SG durante 30 min en 1 μg/mL de tricloruro de bisbenzimida H33342 (tinción de Hoechst) en BSA/PBS al 1% si se desea tinción nuclear y/o añadir aglutinina de germen de trigo acoplada a Alexa (WGA, 1:500) en una coctelera orbital.
- Repita el paso 3.18.
- Incrustar como se describe en los pasos 2.19-2.22.
4. Imágenes y análisis de ganglios estrellados murinos
- Realice la microscopia confocal del SG encajado en la facilidad local de la proyección de imagen.
- Si se requieren mediciones de tamaño de celda, imagen SG teñida para tirosina hidroxilasa (ver Tabla de Materiales)a un aumento de 200x y tomar 4-6 imágenes aleatorias de cada SG.
- Analice imágenes utilizando el software ImageJ33 para estimar el tamaño de la celda (por ejemplo, con una tabla de lápiz, consulte Tabla de materiales). Utilice selección de manos libres, círculo de cada celda y haga clic en Analizar | Medida para obtener el área celular. Tenga cuidado de incluir sólo las células intactas, totalmente visibles que se encuentran bien dentro de la SG.
- Usando este método, realice la medida de aproximadamente 100 células por SG.
- Haga que un investigador ciego realice los pasos 4.2-4.3 si desea comparar sg de diferentes ratones. Utilice una distribución de frecuencias en un software estadístico para visualizar las diferencias de tamaño entre los grupos34.
5. Análisis moleculares de ganglios estrellados murinos
NOTA: Incluya controles dependiendo de su diseño experimental. Podría tratarse de SG con diferentes genotipos y antecedentes de enfermedad y/u otros ganglios autonómicos, como el ganglio cervical superior simpático (situado en la zona del cuello, ver descripción detallada en Ziegler et al.35)o ganglios parasimpáticos (como los ganglios intracardiacos, ver Jungen et al.4).
- Preparar un tubo de 2 mL con 500 μL de solución de tiocianato de fenol/guanidina (por ejemplo, Qiazol) por animal y tener nitrógeno líquido listo para el glaseado por choque o considerar soluciones comerciales para la protección del ARN (opcional, ver Tabla de Materiales)36. Trabaje rápidamente para el aislamiento del ARN.
- Realice la disección del SG según lo descrito en los pasos 1.1-1.13.
- Sumerja inmediatamente ambos SG directamente en un tubo con solución de tiocianato de fenol/guanidina y tubo de escarcha en nitrógeno líquido.
- Conservar a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
- Para la lisis tisular, deje que los tubos con SG se descongele hasta que la solución de tiocianato de fenol/guanidina esté licuada y agregue dos perlas de acero inoxidable de 7 mm. Enfríe las partes metálicas del homogeneizador de tejidos (molino de bolas o mezclador, por ejemplo, Tissue Lyser II) en hielo seco y centrífuga a 4 °C.
- Tubos centrífugos a 500 x g durante 1 min a 4 °C para que los SG estén en la parte inferior del tubo.
- Coloque tubos en las partes metálicas del Tissue Lyser y lise durante 1 min a 20 Hz.
- Repita los pasos 5.6 y 5.7 hasta 5 veces hasta que no se detecte ningún tejido intacto.
- Transfiera el líquido a un tubo fresco de 1,5 mL.
- Realice el aislamiento de ARN con un kit de aislamiento de ARN basado en columnas (por ejemplo, mini kit miRNeasy) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Elute RNA en 20 μL de agua libre de ARNasa y medir la concentración utilizando un espectrofotómetro.
NOTA: Para excluir la contaminación del ARN purificado con ADN genómico, proponemos realizar una reacción en cadena de la polimerasa con cebadores genómicos y 1 μL de ARN como plantilla, en lugar de menos el control de la transcriptasa inversa. Esto ahorrará una cantidad significativa de ARN. Si el ARN está contaminado, utilice cebadores de límite exón-intrón o cebadores de flanqueo de intrón para la posterior reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real. - Utilice el ARN SG de 250 ng para realizar la síntesis del cDNA y utilice los protocolos establecidos. Aquí, se utilizó un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Diluir a una concentración final de 2,5 ng/μL de ADNc y realizar una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real con las sondas adecuadas según los protocolos establecidos. Aquí, el ensayo de TaqMan (ver Tabla de Materiales)se realizó utilizando 10 ng de ADNc por reacción.
NOTA: Realice el control sin plantilla para cada gen para excluir los resultados falsos positivos. - Normalice la expresión génica de su gen de interés en un gen de mantenimiento de la casa (por ejemplo, Cdkn1b)para comparar la expresión génica relativa entre diferentes grupos de SG.
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Representative Results
La Figura 1 visualiza cómo identificar y diseccionar el SG. La Figura 1A muestra un dibujo esquemático de la ubicación, mientras que la Figura 1B presenta la vista hacia el tórax después de la eliminación del paquete corazón-pulmón. Los músculos longus colli izquierdo y derecho medial del SG y la caja torácica son puntos de referencia importantes para la orientación. La disección se realiza a lo largo de las líneas punteadas entre los músculos y la primera costilla. El SG y la cadena simpática se hacen visibles como estructuras blancas (Figura 1C). La Figura 1D muestra un aumento de la región entre el músculo longus colli izquierdo y la primera costilla, donde se encuentra el SG izquierdo. La morfología del SG difiere entre los individuos. A menudo consiste en una fusión de los ganglios cervicales inferiores y del primero al tercer ganglio torácico24. Alguna variedad que el experimentador puede esperar en SG murino se representa en la Figura 1E,F,donde se fotografía el SG izquierdo y derecho de cinco ratones machos de tipo salvaje C57Bl6.
La evaluación de la descripción anatómica gruesa, así como los análisis celulares y subcelulares de células en el SG que inerva el corazón se puede realizar por técnicas enteras del montaje en nivel de la proteína y del ARN. Una visión general de un SG se presenta en la Figura 2. Las fibras comprensivas del miocardio originan de cuerpos de célula en el SG. Éstos son visualizados manchando con un anticuerpo contra la hidroxilasa de la tirosina (TH). Somata neuronales que expresan TH están rodeados por fibras nerviosas que tinción positiva para la acetiltransferasa de colina (ChAT). Estas son más probables fibras presinápticas37,38. En la Figura 2Ase presenta un aumento ejemplar del coetiquete TH y ChAT. Las células gliales que rodean los cuerpos celulares neuronales se pueden visualizar mediante la tinción de S100B. Esto se muestra en la Figura 2B en combinación con el marcador neural PGP9.5. La Figura 2C-F muestra análisis ejemplares para estudiar el SG a nivel subcelular, utilizando hibridación in situ de montura entera y co-tinción inmunofluorescente. La proteína TH(Figura 2C,roja) y las moléculas de ARNm de Tubb3 (Figura 2D,blanca) se expresan en grandes cuerpos celulares neuronales, mientras que el ARNm de S100b (Figura 2E,verde) también es detectable en las células de la glía circundantes. En la fusión(Figura 2F),es visible que algunas neuronas son negativas para TH pero expresan Tubb3,mientras que S100b mRNAs también se pueden detectar en las células circundantes, como se muestra en la ampliación en la Figura 2G.
La Figura 3 presenta posibles análisis cuantitativos y escollos para el estudio de la SG murina. Las imágenes de la SG teñida de TH(Figura 3A)se pueden utilizar para las mediciones del tamaño celular como se realizó ejemplarmente para un modelo murino de diabetes. Los somatas neuronales de control (db/het) SG fueron de 388,8 ± 123,8 μm2 frente a sg diabético (db/db) 407,33 ± 139,6 μm2 (Figura 3B,n = 2 SG, 100 células por SG por genotipo, P = 0,348, los datos se compararon mediante el test de Mann-Whitney). La Figura 3C muestra la expresión de genes de diferentes tipos celulares del SG (n=6-7). La agrupación de ambos SG de un solo animal permite mediciones de expresión génica de aproximadamente 24 ensayos (12 genes en duplicados). Normalmente normalizamos muestras para Cdkn1b (detectados a valores de Ct de 25,4 ± 0,97) así como el marcador neuronal Neun/Rbfox3 (32,5 ± 0,7) si es necesario tener en cuenta otros tipos celulares y la pureza neuronal de la disección. Entre los genes que nos resultaron útiles para caracterizar los procesos moleculares en el SG se encuentran el simpático gen Th (22,4 ± 1,6), Chat,que podría indicar transdiferenciación colinérgica (expresado en valores de Ct de 30,8 ± 1,3) y Gap43,un marcador de brotación neuronal (detectable a valores de Ct de 22,4 ± 1,4). Los genes expresados en tipo de células no neuronales incluyen S100b (para las células gliales, 27,3 ± 1,2), Ki-67 (para las células proliferantes, 33,0 ± 1,6) y Cd45 (para las células inmunitarias, 30,2 ± 1,1).
El SG está rodeado por una cápsula de tejido conectivo26,visualizada mediante hematoxilina y tinción de eosina en la Figura 3D,E. Ocasionalmente, observamos inconsistencias en la tinción basada en anticuerpos como se demuestra en la Figura 3F,muy probablemente debido a la eliminación incompleta de la cápsula. Mientras que la tinción de ChAT y TH solo es detectable en algunas partes del SG, los núcleos contratenidos con DAPI son detectables en todas partes. La línea de puntos de la imagen combinada separa la tinción correcta (derecha de la línea) de la tinción incorrecta (izquierda de la línea).
Los datos se presentan como desviación estándar media ±. La significación estadística fue definida como un valor de P de <0,05; el análisis estadístico se realizó utilizando software comercial.
Figura 1: Localización, disección y morfología de los ganglios estrellados murinos. (A) Dibujo esquemático de la ubicación de los ganglios estrellados (SG). (B) Vista en el tórax después de la extracción del paquete corazón-pulmón. Es importante tener en cuenta que los SG no son inmediatamente visibles la mayor parte del tiempo. Los músculos longus colli se localizan lateralmente desde la columna vertebral. Los SG se localizan lateralmente de los músculos en la unión con la primera costilla. Diseccione cuidadosamente los laterales a los músculos (área marcada por la línea punteada) para descubrir los ganglios. Después de la disección, los ganglios (izquierda y derecha, LSG y RSG, respectivamente) y la cadena simpática se pueden hacer hacia fuera como estructuras blancas, largas. (C) Una disección ejemplar que muestra los ganglios y las señales anatómicas. (D) Magnificación del LSG. (E)LSG y(F)RSG de tipo salvaje, los ratones machos C57Bl6 (16 semanas) fueron disecados y fotografiados para mostrar las variaciones en morfología y tamaño. La barra de escala representa 1.000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Visualización de diferentes tipos de células en ganglios estrellados murinos a través de inmunohistoquímica de montaje completo e hibridación in situ. (A)Visión general gruesa de un ganglio estrellado murino (SG) teñido para el marcador simpático tirosina hidroxilasa (TH) y colina acetiltransferasa (ChAT). La ampliación muestra cuerpos celulares TH positivos y la presencia de fibras nerviosas chAT-positivas, muy probablemente presinápticas, que rodean la somata neuronal. (B)Las células gliales que envuelven los cuerpos celulares neuronales se pueden visualizar mediante la tinción de S100B, aquí en combinación con el marcador neuronal PGP9.5. (C, D , E ,F) Las imágenes microscópicas de un SG tiñeron el montaje entero vía una combinación de immunohistochemistry para el TH (rojo) y del hibridación in situ para Tubb3 (d, blanco) y S100b (e, verde). Los núcleos se contratained con DAPI (azul). (F) La fusión muestra que no todas las células neuronales(Tubb3-positivo) son TH positivas. Los ARNm S100b se pueden detectar dentro de somata neuronal, pero también dentro de las células circundantes, como lo marca una flecha en la ampliación en (G). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Posibles análisis cuantitativos y escollos. (A)Las imágenes de tirosina-hidroxilasa (TH)-SG teñido se pueden utilizar para las mediciones de tamaño celular utilizando ImageJ. (B)Esto se realizó en un modelo de ratón de diabetes (100 células por SG, n = 2 SG por genotipo, los datos se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney). (C)Genes ejemplares expresados en el SG que podrían ser útiles para caracterizar procesos moleculares. Cdkn1b, así como el marcador neuronal Neun/Rbfox3 (para tener en cuenta la presencia de otros tipos de células) se pueden utilizar para la normalización. Tirosina hidroxilasa (Th) sirve como un marcador simpático, colina acetiltransferasa (Chat) para la transdiferenciación colinérgica, Gap43 para la brotación neuronal. Los genes expresados en tipos de células no neuronales incluyen S100b (células gliales), Ki-67 (células proliferantes) y Cd45 (células inmunes). (D)Hematoxilina y tinción de eosina de un SG fijo en formol visualiza el tejido conectivo y las células en la parte superior de la SG.(E)Aumento de la zona en caja. (F)En algunas ocasiones, observamos fracaso en la coloración anticuerpo-basada, muy probablemente debido al retiro incompleto de la cápsula. Mientras que las tinciones chAT (rojo) y TH (verde) solo son detectables en algunas partes del SG, los núcleos contratenidos con DAPI (azul oscuro) son detectables en todas partes. La línea de puntos de la imagen combinada separa la tinción correcta (derecha de la línea) de la tinción incorrecta (izquierda de la línea). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
La comprensión de los procesos celulares y moleculares en neuronas y células gliales del sistema nervioso simpático que preceden a la aparición del AV es de alto interés, ya que la parada cardíaca súbita sigue siendo la causa más común de muerte en todo el mundo5. Por lo tanto, en el manuscrito actual, proporcionamos un repertorio básico de métodos para identificar el SG murino , un elemento murino dentro de esta red , y realizar análisis posteriores a nivel de ARN, proteína y celular.
Un desafío de la SG murina es su tamaño y el número limitado de células39. Debido a esto, diferentes modelos animales, como ratas40,perros22,y cerdos41 se utilizan para estudios sobre el SG. Aún así, existe una variedad de modelos de enfermedad bien establecidos para fenotipos cardíacos disponibles en ratones y algunos de estos ya han sido caracterizados en diferentes aspectos de la inervación cardíaca y la arritmia, como los modelos para diabetes23,infarto de miocardio42,o miocarditis43. Por lo tanto, otros estudios del SG murine se autorizan para caracterizar más lejos la disfunción autonómica teniendo en cuenta el VA. Estos pueden ser completados por otros enfoques para estudiar la inervación del corazón murino como experimentosfuncionales 4,23,44 incluyendo la estimulación in vivo del SG23.
Debido a su pequeño tamaño y a su ubicación dentro de la cavidad torácica24,la manipulación de la SG murina in vivo es un reto, aunque se ha realizado con éxito23. Por esta razón, algunos estudios se centran por lo tanto en los ganglios cervicales superiores, que se localizan más accesiblemente en el cuello, aguas arriba del SG en la cadena simpática detrás de la bifurcación carótida en arterias carótidas internas y externas24,35. Se ha demostrado que la denervación cardíaca por extirpación de los ganglios cervicales superiores atenúa la inflamación miocárdica, la hipertrofia y la disfunción cardíaca después del infarto de miocardio35. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los ganglios cervicales superiores inervan diferentes regiones del corazón, más prominentemente el lado anterior45. Además, una reciente revisión en profundidad de la literatura llegó a la conclusión de que el papel de los ganglios cervicales en la inervación simpática del corazón sigue siendo poco claro en los seres humanos46. Esto pone de relieve la importancia de caracterizar el SG para los estudios de inervación simpática cardíaca.
Es importante tener en cuenta que el corazón no es el único objetivo del SG. Entre otros, los pulmones47 y las glándulas sudoríparas en la sierra48 también están inervadas a partir de fibras originarias del SG, estas últimas son una excepción a la fisiología simpática ya que expresan colina acetiltransferasa37. El bloqueo temporal de la SG se estudia con respecto a los procesos inflamatorios en la lesión pulmonar aguda49 o para el tratamiento de sofocos y disfunción del sueño50; por lo tanto, los protocolos en cuestión podrían ofrecer un repertorio para preguntas mecanicistas en estos campos. Al centrarse en los modelos de enfermedades cardíacas, se debe tener en cuenta para la interpretación de los resultados que las neuronas cardíacas no pueden diferenciarse por morfología o propiedades electrofisiológicas de las neuronas no cardíacas51. Esto se puede lograr mediante el trazado retrógrado, por lo que se demostró que la ubicación de las neuronas que se proyectaban hacia el corazón se encontraba en las partes craneo-mediales del SG52.
Además, es importante tener en cuenta que además de los diferentes tipos de neuronas, los ganglios simpáticos están formados por glía envainada, las llamadas células gliales satélite o células satélite marcadas por la expresión del marcador glial S100B53. Si bien se sabe poco sobre el papel de estas células en las patologías cardiovasculares, la activación glial y la expresión de la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) se ha descrito en sg de pacientes con arritmias18.
Algunas trampas deben ser tenvidas con los métodos presentados: observamos inconsistencias en la tinción basada en anticuerpos en algunas ocasiones y planteamos la hipótesis de que la eliminación incompleta de la cápsula de tejido conectivo que envavaba el SG podría ser culpable, ya que se ha descrito que varían en permeabilidad entre los diferentes tipos de ganglios26. La extirpación mecánica de la cápsula mediante estrechez fino se ha descrito en el ganglio cervical superior de ratas hasta el día postnatal 1028 y el desheathing se menciona en la literatura para ratas adultas SG54,55 y ratones56. La extracción de la cápsula SG puede variar entre los28 años y, debido a las diferencias de tamaño, las especies. En nuestra experiencia, la disección fresca, el retiro de tanto tejido conectivo como sea posible usando fórceps finos y la permeabilización cuidadosa según lo descrito en el protocolo a mano, son factores importantes para la coloración acertada. En cuanto a la PCR cuantitativa en tiempo real, el trabajo rápido y la lisis eficiente son esenciales. La agrupación de ambos SGs de un animal permitió el análisis de hasta 12 genes diferentes (al realizar duplicados).
A pesar de que la función y la anatomía gruesa de sg se ha estudiado desde hace décadas y cada cardiomiocitos es inervado por fibras simpáticas46,muchas preguntas abiertas permanecen. Por ejemplo, sigue sin estar claro, por qué las neuronas simpáticas del SG transdiferenciato transitoriamente a un fenotipo colinérgico enisquémico 21 y la insuficiencia cardíaca no isquémica, en modelos animales, así como en pacientes20. Recientemente, nuestro grupo describió un papel de las células gliales S100B positivas, que también están presentes en la SG murina, en la brotación nerviosa en el sistema nervioso cardíaco29. Si estas células son relevantes para la brotación simpática del nervio después de lesión asociada al VA11, 12,necesita ser aclarado en estudios futuros. Es importante destacar que los enfoques innovadores, como la optogenética52 y los análisis del transcriptoma36, pueden complementar métodos establecidos como el rastreo neuronal para profundizar en la comprensión del sistema nervioso simpático y su papel en la electrofisiología cardíaca.
En conclusión, este repertorio permite al investigador inexperto realizar una caracterización básica de la SG en modelos murinos de patologías cardiacas. Esperamos que esto estimule el uso, la combinación y la creación de nuevos métodos. Esto pudo ayudar a aumentar la comprensión de los procesos celulares y moleculares subyacentes en las neuronas comprensivas que pudieron ser responsables del inicio y del mantenimiento del VA.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Hartwig Wieboldt por su excelente asistencia técnica, y al Centro de Microscopía de Imágenes UKE (Umif) del Centro Médico Universitario Hamburgo-Eppendorf por proporcionar microscopios y apoyo. Esta investigación fue financiada por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
References
- Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
- Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
- Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
- Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
- Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
- Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
- Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
- Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
- Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
- Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
- Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
- Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
- Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
- Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
- Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
- Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
- Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
- Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
- Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
- Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
- Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
- Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
- Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
- Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
- Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
- Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
- Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
- Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
- Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
- Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
- Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
- Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
- Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
- Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
- Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
- Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
- Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
- Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
- Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
- Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).
