Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Placering, dissektion og analyse af Murine Stellate Ganglion

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62026
Automatic Translation
1,2,3, 2,4, 2, 2,4,5, 3, 1,2,3
1Division of Cardiology, EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

Summary

Patofysiologiske ændringer i hjerte-autonome nervesystem, især i dets sympatiske gren, bidrager til debut og vedligeholdelse af ventrikulære arytmier. I denne protokol viser vi, hvordan man karakteriserer murine stellate ganglier for at forbedre forståelsen af de underliggende molekylære og cellulære processer.

Abstract

Det autonome nervesystem er en væsentlig drivkraft for hjerteelektrofysiologi. Især den rolle, som dens sympatiske gren er et igangværende spørgsmål om undersøgelse i patofysiologi af ventrikulær arytmier (VA). Neuroner i stjernernes ganglier (SG)   - bilaterale stjerneformede strukturer i den sympatiske kæde -   er en vigtig del af den sympatiske infrastruktur. SG er et anerkendt mål for behandling via hjerte sympatisk denervation hos patienter med terapi-ildfast VA. Mens neuronal remodeling og glial aktivering i SG er blevet beskrevet hos patienter med VA, de underliggende cellulære og molekylære processer, der potentielt går forud for starten af arytmi er kun utilstrækkeligt forstået og bør belyses for at forbedre autonom graduering. Musemodeller giver os mulighed for at studere sympatisk neuronal remodeling, men identifikation af murine SG er udfordrende for den uerfarne efterforsker. Således mangler dybdegående cellulære og molekylære biologiske undersøgelser af murine SG for mange almindelige hjertesygdomme. Her beskriver vi et grundlæggende repertoire til dissekering og undersøgelse af SG'et hos voksne mus til analyser på RNA-niveau (RNA-isolation til genekspressionsanalyser, in situ-hybridisering), proteinniveau (immunfluorescent helmonterings farvning) og cellulært niveau (grundlæggende morfologi, cellestørrelsesmåling). Vi præsenterer potentielle løsninger til at overvinde udfordringer i forberedelsesteknikken, og hvordan man kan forbedre farvningen via slukning af autofluorescens. Dette giver mulighed for visualisering af neuroner såvel som gliaceller via etablerede markører for at bestemme cellesammensætning og remodelingsprocesser. De metoder, der præsenteres her, gør det muligt at karakterisere SG for at få yderligere oplysninger om autonom dysfunktion hos mus, der er tilbøjelige til VA og kan suppleres med yderligere teknikker, der undersøger neuronale og gliakomponenter i det autonome nervesystem i hjertet.

Introduction

Det hjerte autonome nervesystem er en stramt reguleret ligevægt af sympatiske, parasympatiske og sensoriske komponenter, der gør det muligt for hjertet at tilpasse sig miljømæssige ændringer med den passende fysiologiskereaktion 1,2. Forstyrrelser i denne ligevægt, for eksempel en stigning i sympatisk aktivitet, er blevet etableret som en vigtig drivkraft for debut samt vedligeholdelse af ventrikulær arytmier (VA)3,4. Derfor har autonom graduering, opnået via farmakologisk reduktion af sympatisk aktivitet med betablokkere, været en hjørnesten i behandlingen af patienter med VA i årtier5,6. Men på trods af farmakologiske og kateterbaserede interventioner lider et relevant antal patienter stadig af tilbagevendende VA7.

Sympatisk input til hjertet er for det meste medieret via neuronale cellelegemer i stjernernes ganglier (SG), bilaterale stjerneformede strukturer i den sympatiske kæde, som videresender information via adskillige intrathoracic nerver fra hjernestammen til hjertet8,9,10. Nerve spiring fra SG efter skade er forbundet med VA og pludselig hjertedød11,12, understreger SG som et mål for autonom graduering13,14. En reduktion af sympatisk input til hjertet kan opnås midlertidigt via perkutan injektion af lokalbedøvelse eller permanent ved delvis fjernelse af SG via videoassisteret thoracoskopi15,16. Hjerte sympatisk denervation præsenterer en mulighed for patienter med terapi-ildfast VA med lovende resultater14,16,17. Vi har lært af explanted SG af disse patienter, at neuronal og neurokemisk remodeling, neuro-inflammation og glial aktivering er kendetegnende for sympatisk remodeling, der kan bidrage eller forværre autonom dysfunktion18,19. Stadig forbliver de underliggende cellulære og molekylære processer i disse neuroner uklare til dato, for eksempel rollen som neuronal transdifferentiation til en cholinrgic phenotype20,21. Eksperimentelle undersøgelser præsenterer nye tilgange til behandling af VA, for eksempel, reduktion af sympatisk nerveaktivitet via optogenetics22, men dybdegående karakterisering af SG mangler stadig i mange hjertepatologier, der går i hånd med VA. Musemodeller, der efterligner disse patologier, gør det muligt at studere neuronal remodeling, der potentielt går forud for starten af arytmier12,23. Disse kan suppleres med yderligere morfologiske og funktionelle analyser for autonom karakterisering af hjertet og nervesystemet. I denne protokol leverer vi et grundlæggende repertoire af metoder, der gør det muligt at dissekere og karakterisere murine SG for at forbedre forståelsen af VA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care and Use Committee of the State of Hamburg (ORG870, 959) og Det Nordrhein-Westfalske Statslige Agentur for Natur-, Miljø- og Forbrugerbeskyttelse (LANUV, 07/11) og er i overensstemmelse med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011). Der blev udført undersøgelser med mus af hannen og kvinden (i alderen 10-24 uger) C57BL/6 mus (bestandsnummer 000664, Jackson Laboratories) og mus homozygogous (db/db) eller heterozygogous (db/het; control) for diabetes spontan mutation (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, aktienummer 000642, Jackson Laboratories). Forfatterne har brugt protokollerne ved hånden uden variationer for mus i alderen op til 60 uger.

1. Placering og dissektion af murine stellate ganglier

BEMÆRK: Selvom beskrivelser og tegninger for det meste er tilgængelige i større arter, har nogle publikationer tidligere beskrevet placeringen af SG'et hos henholdsvis rotter24 og mus25 ved hjælp af anatomiske metoder og fluorescerende reporterlinjer.

  1. Der fremstilles 50 mL iskold (3-4 °C) hepariniseret (20 enheder/mL, se materialetabel) fosfatbufferet saltvand (PBS). Udfør dissektion af SG ved stuetemperatur (RT).
  2. Dybt bedøve musen ved indånding af 3%-5% isoflurane i henhold til de institutionelle og lokale retningslinjer. Kontroller tilstrækkelig anæstesi ved tab af pedal tilbagetrækning refleks. Halshugge mus eller udføre cervikal dislokation.
    BEMÆRK: Forkert halsforskydning kan resultere i brud på rygsøjlen og beskadigelse af brystkar, hvilket fører til blødning, som hindrer forberedelsen eller afbrydelsen af den sympatiske kæde, så SG ikke er i deres korrekte position. Derfor er det afgørende at have oplevet personale udføre cervikal dislokation eller halshugge dyr i dyb sedation.
  3. Sprøjt huden med ethanol og åbn brystkassen med to snit langs de forreste aksillær linjer ved hjælp af Mayo saks og smalle mønster pincet. Skær mellemgulvet og fjern forsiden af brystkassen.
  4. Fjern hjerte-lunge-pakken ved at gribe aorta og vena cava lige over mellemgulvet ved hjælp af London pincet og skære alle fartøjer og bindevæv tæt på rygsøjlen nedenfor med Strabismus saks.
  5. Skyl brystkassen grundigt med hepariniseret PBS ved hjælp af en plast engangspipette, indtil alle spor af blod er fjernet.
  6. Placer torsoen under stereomikroskopforberedelsesbeholderen og sørg for god belysning i brystkassen med eksterne lyskilder.
  7. Find det første ribben og longus colli musklerne.
    BEMÆRK: SG'en er placeret bilateralt parallelt med rygsøjlen ved grenen mellem det første ribben og rygsøjlen i en rille lateral til longus colli musklerne24. Den flade side af SG er placeret ved siden af longus colli muskler. Afhængigt af præparatet kan dele af den sympatiske kæde allerede være synlige som hvide, skrå fibre parallelt med rygsøjlen. Disse kan spores sammen til SG.
  8. Brug forsigtigt spidsen af Dumont #5/45 pincet til at udsætte bindevævet sideværts til longus colli muskel.
  9. Vend tangen rundt med 180°, og brug den flade side til at gribe fat i SG'en og træk den ud med minimalt tryk.
  10. Gentag med den anden SG.
  11. Placer både SG i en skål (6 cm diameter) fyldt med kold PBS og inspicere med passende forstørrelse. Hvis det er nødvendigt, skal du fjerne overskydende fartøjer, fedtvæv og større nerver.
    BEMÆRK: Autonome ganglier er omgivet af en bindevævskapsel bestående af kollagenfibre og fibroblaster26,27. Permeabiliteten af disse kapsler synes at variere mellem arter, forskellige slags ganglier26 og28år . Fjern så meget bindevæv som muligt ved hjælp af Dumont #5/45 pincet og om nødvendigt fjedersaks.
  12. Afhængigt af eksperimentets mål skal du fortsætte med afsnit 2, 3 eller 5 i denne protokol.

2. Hele mount immunohistochemistry protokol

BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra hjerte hele mount pletter4,29. Udfør inkubationstrin for hver enkelt SG i en brønd af en 96-brønds plade og brug 100 μL (for antistofholdige opløsninger) til 200 μL (for alle andre opløsninger) af opløsningen for at sikre fuldstændig dækning. Kontroller regelmæssigt dækningen og korrekt nedsænkning af SG med kikkert. Væsker fjernes manuelt med en 200 μL pipette med yderligere 10 μL spids oven på spidsen på 200 μL. Dette vil forhindre Aspiration af SG i pipettespidsen. Brug frisklavede opløsninger og sterile væsker for at forhindre bakterievækst.

  1. Fix SG for histologi for 2 timer på RT i 4% methanol-fri paraformaldehyd (PFA)/PBS.
  2. Proces SG så hurtigt som muligt, men de kan opbevares i 2-4 uger ved 4-6 °C i PBS med 0,02% (w/ v) natriumazid på dette tidspunkt.
  3. Forbered Sudan sort bestand løsning (1% Sudan sort w / v i 100% ethanol) for reduktion af autofluorescens og forbedring af signal til baggrund ratio30. Opløs i 2-3 timer på en magnetisk omrører på RT.
    BEMÆRK: Brug stamopløsningen i højst 6-8 uger, kassér tidligere, når sedimentering vises.
  4. Forbered Sudan sort arbejde løsning ved centrifuging bestanden opløsning i 30 min ved fuld hastighed (13.000 x g)for at fjerne snavs og fortynding bestanden i 70% ethanol til en endelig koncentration på 0,25% Sudan sort.
  5. Behandl SG med Dent's blegemiddel for at forbedre antistof permeabilization31. Forbered Dents blegemiddel frisk ved blanding af methanol (MeOH), hydrogenperoxidopløsning 30% (w/w) i H2O og dimethylsulfoxid (DMSO) i forholdet 4:1:1. Tilsæt 200 μL pr. SG, og placer pladen på en orbital shaker i 1 time ved RT.
  6. Udfør en faldende MeOH serie til rehydrering ved inkubation i 10 min hver på en orbital shaker: 100% MeOH, 75% MeOH / PBS, 50% MeOH / PBS, 25% MeOH / PBS.
  7. Udfør permeabilisering ved at inkubere SG to gange i 60 min hver i PBS/1% Triton-X-100 på RT.
  8. Fjern permeabiliseringsløsningen fra SG'en, og tilføj Sudans sorte arbejdsløsning. Inkuberes i 2 timer ved RT på en orbital shaker.
  9. I mellemtiden forberede en blokerende løsning ved at tilføje 5% receptor grade kvæg serum albumin (BSA) og 0,1% Triton-X-100 i PBS en 15 ml fartøj og lad det opløses på en rulle shaker i ca 5-10 min. Dekantere gennem et forklæbet papirfilter for at fjerne snavs.
  10. Fjern Sudan sort meget omhyggeligt ved at vippe pladen og forsigtigt pipetter fra oprejst side.
    BEMÆRK: Det er ikke muligt at se SG i Sudan sort. Brug en stærk lyskilde og arbejd langsomt. Fra dette trin er SG farvet sort, hvilket øger synligheden. Hvis der ses yderligere bindevæv omkring SG på dette tidspunkt, skal du fjerne det ved hjælp af Dumont #5/45 pincet og fjedersaks.
  11. Der tilsættes 200 μL PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) og vaskes i 5 min ved RT på en orbital shaker.
  12. Fjern PBS-T ved at aspirere det med en pipette og gentag 2 gange.
  13. Fjern PBS; Der tilsættes 200 μL blokeringsopløsning og inkuberes ved 4 °C natten over på en orbital shaker.
  14. Den næste dag skal du forberede løsninger ved at tilføje primære antistoffer i blokeringsopløsningen. Tilpasse antistofkoncentrationer fra etablerede protokoller.
    BEMÆRK: Medtag et SG som antistofkontrol uden primært antistof (inkuberet med antigenforabsorberet antistof eller IgG, hvis det er tilgængeligt, eller blokeringsbuffer).
  15. Der udføres primær antistofinkubation i 36-48 timer ved 4 °C på en orbital shaker. For cellestørrelsesmålinger og farvning af sympatiske neuroner skal du bruge antistoffer mod tyrosinhydrafylase (se Materialetabel for antistofanbefalinger).
    BEMÆRK: Placer 96-brøndspladen i et vådt kammer (f.eks. plastkasse foret med ddH2O-våde papirhåndklæder) for at forhindre fordampning på dette tidspunkt.
  16. Antistofopløsningen fjernes forsigtigt, og der tilsættes 200 μL PBS-T. Placer pladen på en orbital shaker i 30 min.
  17. Fjern PBS-T og gentag vasketrinnet yderligere 5 gange.
  18. Forbered den sekundære antistofarbejdsløsning ved at centrifugere fluorescerende Alexa-mærkede sekundære antistoffer i 1 min. ved fuld hastighed (13.000 x g) før brug. De relevante sekundære antistoffer fortyndes i henhold til de primære antistoffer 1:500 i blokeringsopløsningen og tilsættes til SG. Tilsættes 1 μg/mL bisbenzimid H33342 trihydrochlorid (Hoechst farvning), hvis der ønskes nuklear farvning. Inkuber i 12-24 timer ved 4 °C på en orbital shaker.
  19. Antistofopløsningen fjernes forsigtigt, og der tilsættes 200 μL PBS-T. Placer pladen på en orbital shaker i 30 min.
  20. Fjern PBS-T og gentag vasketrinnet yderligere 5 gange. For det sidste trin skal du bruge PBS uden Triton.
  21. Til indlejring spredes 50-100 μL fluorescerende monteringsmedium (se Materialetabel)på en glasrutsjebane og placeres under klargøringsbeholder. Brug Dumont #5/45 pincet til at afhente SG fra 96-brøndspladen og fjerne overskydende væske ved at dyppe den ene ende på et filterpapir (f.eks. Whatman tørrepude) og læg den på dråben.
  22. Brug Dumont #5/45 tang til at korrigere positionering med den rette forstørrelse.
  23. Placer forsigtigt en glasovertræk (20 mm x 20 mm) ved siden af SG'en og gå langsomt ned.
    BEMÆRK: Brug af for meget monteringsmedium vil resultere i bevægelse af SG eller sammenfiltring af nerver. Hvis det sker, skal du hurtigt fjerne coverlip og gentage trin 2.9-2.21.
  24. Lad lysbillederne tørre i mørke natten over ved RT. Opbevaring af den farvede prøve er mulig i mindst 4-6 uger ved 4 °C.

3. Hele mount in situ hybridisering

BEMÆRK: Helmontering in situ-hybridisering af SG tilpasses fra organet af korti32 og den kommercielle RNA-fluorescens in situ-protokol (se materialetabel). Få sonder til de gener af interesse og buffere og løsninger fra leverandøren. Alle inkubationstrin udføres på RT, hvis andet ikke er nævnt. Brug steril PBS. Hvis du er interesseret i at plette flere SG i en brønd, skal du bruge mindst 150 μL buffere og opløsninger.

  1. Udfør dissektion af SG som beskrevet i trin 1.1-1.13.
  2. Fiksere SG i 1 time i 200 μL på 4% MeOH-fri PFA/PBS i en brønd af en 96-brønds plade placeret på en orbital shaker.
  3. Vask SG tre gange i 30 min hver i 0,1% Tween-20/PBS på en orbital shaker.
  4. Dehydrerer SG i MeOH/PBS-serien ved efterfølgende inkubation i 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS og 100% MeOH i 10 minutter hver på en orbital shaker.
  5. Opbevar SG ved -20 °C i 100% MeOH natten over.
  6. Den næste dag forvarmes inkubatoren til 40 °C. Kontroller temperaturen med et termometer.
  7. Rehydrer SG i omvendt MeOH / PBS serie (100% MeOH, 70% MeOH / PBS, 50% MeOH / PBS) i 10 min hver.
  8. Vask SG tre gange i 5 min hver i PBS.
  9. I mellemtiden skal sonderne forvarmes ved inkubation ved 40 °C i 10 minutter efterfulgt af afkøling i 10 minutter.
  10. SG inkuberes i 200 μL Protease III i 15 min.
  11. Valgfrit: Udfør sudansk sort behandling for at slukke for autofluorescens i henhold til punkt 2.3, 2.4 og 2.8 i denne protokol, hvis der planlægges efterfølgende immunfluorescensbegæmpning.
  12. SG vaskes i 200 μL på 0,1% Tween-20/PBS 3x i 5 min hver på en orbital shaker.
  13. Valgfrit: Hvis co-farvning med flere sonder ønskes, fortyndes Channel-2 (50x) og Channel-3 sonde (50x) i Channel-1 sonde (1x).
  14. Dæk SG med 100 μL sonde for det interessante gen og inkuber natten over ved 40 °C med let omrøring. 96-brøndspladen anbringes i et vådt kammer ved 40 °C for alle inkubationstrin.
    BEMÆRK: Medtag en SG som negativ kontrol ved hjælp af en sonde mod et bakterielt gen (f.eks. dihydro-dipicolinat reduktase, Dapb) for at kontrollere, om der er ikke-specifik binding af forstærkningsreagenser i senere trin.
  15. Vask SG i medfølgende vaskebuffer 3x i 15 minutter hver på en orbital shaker.
  16. Forvarmet Amp1-3, HRP-C1 og HRP-Blocker til RT. Hvis co-farvning med Channel-2 og / eller Channel-2 sonde ønskes, forvarme HRP-C2 og HRP-C3.
  17. Re-fix SG i 10 min på RT i 4% PFA / PBS på en orbital shaker.
  18. Vask SG i 200 μL af den medfølgende vaskebuffer 3x i 5 min hver på en orbital shaker ved RT.
  19. Til forstærkning inkuberes SG med 100 μL Amp1 i 35 min ved 40 °C på en orbital shaker.
  20. Fjern forsigtigt væske og vask SG i 200 μL af den medfølgende vaskebuffer 3x i 5 minutter hver ved RT på en orbital shaker.
  21. SG inkuberes med 100 μL Amp2 i 35 min ved 40 °C på en orbital shaker.
  22. Gentag trin 3.18.
  23. SG inkuberes med 100 μL Amp3 i 20 min ved 40 °C på en orbital shaker.
  24. Gentag trin 3.18.
  25. SG inkuberes med 100 μL af den medfølgende Multiplex FL v2 HRP-C1 i 20 min ved 40 °C på en orbital shaker.
  26. Gentag trin 3.18.
  27. Opalkonjugeret sekundært antistof 1:1.000 i 200 μL leveret TSA-buffer og inkuber SG i 35 minutter ved 40 °C på en orbital shaker. Beskyt mod lys under inkubation og fra dette trin på.
  28. Gentag trin 3.18.
  29. SG inkuberes i 100 μL af den medfølgende Multiplex FL v2 HRP-blokker i 15 minutter ved 40 °C på en orbital shaker.
  30. Gentag trin 3.18.
  31. Valgfrit: Ved co-farvning med Channel-2-sonde skal du gentage trin 3.25-3.30 med tilfølgende Multiplex FL v2 HRP-C2.
  32. Valgfrit: Ved co-farvning med Channel-3-sonde skal du gentage trin 3.25-3.30 med tilfølgende Multiplex FL v2 HRP-C3.
  33. I tilfælde af efterfølgende immunfluorescerende farvning skal trin 2.13-2.25 i denne protokol udføres.
  34. Inkuber i 1% BSA / PBS i 30 minutter på en orbital shaker.
  35. Inkuber SG i 30 minutter i 1 μg/mL bisbenzimid H33342 trihydrochlorid (Hoechst farvning) i 1% BSA/PBS, hvis nuklear farvning ønskes, og/eller tilsæt Alexa-koblet hvedekim agglutinin (WGA, 1:500) på en orbital shaker.
  36. Gentag trin 3.18.
  37. Integrer som beskrevet i trin 2.19-2.22.

4. Billeddannelse og analyser af murine stellate ganglier

  1. Udfør konfokal mikroskopi af integreret SG i det lokale billedbehandlingsanlæg.
  2. Hvis der kræves målinger af cellestørrelse, skal du se SG farves for tyrosinhydrafrpolyse (se Materialetabel)ved 200x forstørrelse og tage 4-6 tilfældige billeder fra hver SG.
  3. Analyser billeder ved hjælp af ImageJ33-software til at estimere cellestørrelse (f.eks. med en pentabel, se Materialeoversigt). Brug Frihåndsmarkering, cirkel hver celle og klik på Analyser | Mål for at hente celleområdet. Vær omhyggelig med kun at medtage intakte, fuldt synlige celler, der er placeret godt inden for SG.
  4. Ved hjælp af denne metode skal du udføre måling af ca. 100 celler pr. SG.
  5. Få en blindet efterforsker til at udføre trin 4.2-4.3, hvis du vil sammenligne SG fra forskellige mus. Brug en frekvensfordeling i statistisk software til at visualisere størrelsesforskelle mellem gruppe34.

5. Molekylære analyser af murine stellate ganglier

BEMÆRK: Medtag kontrolelementer afhængigt af dit eksperimentelle design. Dette kunne være SG med forskellige genotyper og sygdom baggrund og / eller andre autonome ganglier, såsom sympatiske overlegne cervikal ganglion (beliggende i nakken område, se detaljeret beskrivelse i Ziegler et al.35) eller parasympatisk ganglier (såsom intracardiac ganglia, se Jungen et al.4).

  1. Der fremstilles et 2 ml rør med 500 μL phenol/guanidin thiocyanatopløsning (f.eks. Qiazol) pr. dyr, og der skal være flydende nitrogen klar til stødforuring, eller der skal overvejes kommercielle opløsninger til beskyttelse af RNA (valgfrit, se materialetabel)36. Arbejd hurtigt for RNA-isolering.
  2. Udfør dissektion af SG som beskrevet i trin 1.1-1.13.
  3. Sg umiddelbart direkte i et rør med phenol/guanidin thiocyanatopløsning og stødfrostrør i flydende nitrogen.
  4. Opbevares ved -80 °C indtil videreforarbejdning.
  5. For væv lysis, lad rør med SG optø indtil phenol / guanidin thiocyanat opløsning er liquified og tilsæt to 7 mm rustfrit stål perler. Metaldelene af vævs homogenisatoren (kugle- eller mixermøllen, f.eks. vævslysstof II) afkøles på tøris og centrifuge ved 4 °C.
  6. Centrifugerør ved 500 x g i 1 min ved 4 °C, således at SG er i bunden af røret.
  7. Sæt rør i metaldelene af Tissue Lyser og lyse i 1 min ved 20 Hz.
  8. Gentag trin 5.6 og 5.7 op til 5 gange, indtil der ikke kan påvises intakt væv.
  9. Væsken overføres til et friskt 1,5 mL rør.
  10. Udfør RNA-isolering med et kolonnebaseret RNA-isolationssæt (f.eks. miRNeasy mini kit) i overensstemmelse med producentens anvisninger.
  11. Elute RNA i 20 μL RNase-frit vand og måle koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
    BEMÆRK: For at udelukke forurening af det rensede RNA med genomisk DNA foreslår vi, at der udføres en polymerasekædereaktion med genomiske primere og 1 μL RNA som skabelon, i stedet minus omvendt transskriptasekontrol. Dette vil spare en betydelig mængde RNA. Hvis RNA er forurenet, skal du bruge exon-intron grænse primere eller intron flankerende primere for efterfølgende kvantitative real-time polymerase kædereaktion.
  12. Brug 250 ng SG RNA til at udføre cDNA-syntese og bruge etablerede protokoller. Her blev der brugt et cDNA-omvendt transskriberingssæt med høj kapacitet i henhold til producentens anvisninger.
  13. Fortyndes til en endelig koncentration på 2,5 ng/μL cDNA og udfører kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid med de relevante sonder i henhold til de etablerede protokoller. Her blev TaqMan Assay (se Materialetabel)udført ved hjælp af 10 ng cDNA pr. reaktion.
    BEMÆRK: Udfør ingen skabelonkontrol for hvert gen for at udelukke falske positive resultater.
  14. Normaliser genekspression af dit gen af interesse på et husholdningsgen (f.eks. Cdkn1b)for at sammenligne relativ genekspression mellem forskellige grupper af SG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visualiserer, hvordan man identificerer og dissekerer SG. Figur 1A viser en skematisk tegning af placeringen, mens Figur 1B præsenterer udsigten ind i brystkassen efter fjernelse af hjerte-lunge-pakken. Den venstre og højre longus colli muskler mediale fra SG og brystkassen er vigtige vartegn for orientering. Dissektion udføres langs de spredte linjer mellem musklerne og det første ribben. SG og den sympatiske kæde bliver synlige som hvide strukturer (Figur 1C). Figur 1D viser en forstørrelse af regionen mellem venstre longus colli muskel og det første ribben, hvor venstre SG er placeret. Morfologi af SG adskiller sig mellem individer. Den består ofte af en fusion af den ringere livmoderhalskræft og den første til den tredje brystbrore24. Nogle sort, at experimenter kan forvente i murine SG er afbildet i figur 1E, F, hvor venstre og højre SG af fem mandlige C57Bl6 vilde type mus er fotograferet.

Evaluering af bruttoatotomisk overblik samt cellulære og subcellulære analyser af celler i SG innervating hjertet kan udføres ved hele mount teknikker på protein og RNA-niveau. En oversigt over en SG findes i figur 2. Myokardie sympatiske fibre stammer fra celle organer i SG. Disse visualiseres ved farvning med et antistof mod tyrosinhydrafylase (TH). TH-udtrykke neuronal somata er omgivet af nervefibre farvning positiv for cholin acetylkhyletransferase (ChAT). Disse er mest sandsynligt presynaptic fibre37,38. Figur 2Ainseger en eksemplarisk forstørrelse fra TH- og ChAT-co-mærkning . Gliaceller omkring neuronale cellelegemer kan visualiseres ved farvning for S100B. Dette er afbildet i figur 2B i kombination med den neurale markør PGP9.5. Figur 2C-F viser eksemplariske analyser for at studere SG på et subcellulært niveau ved hjælp af hele mount in situ hybridisering og immunfluorescerende co-farvning. Proteinet TH(Figur 2C, rød) og mRNA molekyler af Tubb3 (Figur 2D, hvid) udtrykkes i store neuronale cellelegemer, mens mRNA af S100b (Figur 2E, grøn) også kan påvises i de omkringliggende glia celler. I fletningen (Figur 2F) er det synligt, at nogle neuroner er negative for TH, men udtrykker Tubb3, mens S100b mRNA'er også kan påvises i de omkringliggende celler, som afbildet i forstørrelsen i figur 2G.

Figur 3 præsenterer potentielle kvantitative analyser og faldgruber til at studere murine SG. Billeder fra TH-farvede SG (Figur 3A) kan bruges til cellestørrelsesmålinger, som blev udført eksemplarisk for en musemodel af diabetes. Neuronal somata fra kontrol (db / het) SG var 388,8 ± 123,8 μm2 vs. I diabetisk SG (db/db) 407,33 ± 139,6 μm2 (Figur 3B, n = 2 SG, 100 celler pr. SG pr. genotype, P = 0,348, blev data sammenlignet ved hjælp af Mann-Whitney-test). Figur 3C viser ekspressionen af gener fra forskellige celletyper i SG (n = 6-7). Samling af både SG fra et dyr giver mulighed for genekspressionsmålinger af ca. 24 assays (12 gener i dubletter). Vi normaliserer typisk prøver for Cdkn1b (detekteret ved Ct-værdier på 25,4 ± 0,97) samt neuronmarkøren Neun/ Rbfox3 (32,5 ± 0,7), hvis det er nødvendigt at tage højde for andre celletyper og neuronal renhed af dissektionen. Gener, som vi fandt nyttige til at karakterisere molekylære processer i SG omfatter sympatiske gen Th (22,4 ± 1,6), Chat, som kunne indikere cholinrgic transdifferentiation (udtrykt ved C 30,8 ± 1,3) og Gap43, en markør for neuronal spiring (påviselig ved Ct-værdier på 22,4 ± 1,4). Gener udtrykt i ikke-neuronal celletype omfatter S100b (for gliaceller, 27,3 ± 1,2), Ki-67 (for formeringsceller, 33,0 ± 1,6) og Cd45 (for immunceller, 30,2 ± 1,1).

SG er omgivet af en kapsel bindevæv26, visualiseret via hematoxylin og eosin farvning i figur 3D,E. Lejlighedsvis observerede vi uoverensstemmelser i antistofbaseret farvning som påvist i figur 3F, sandsynligvis på grund af ufuldstændig fjernelse af kapslen. Mens ChAT og TH farvning kun kan påvises i nogle dele af SG, nuclei counterstained med DAPI kan påvises hele vejen igennem. Den spletterede linje i det flettede billede adskiller vellykket farvning (højre for linjen) fra mislykket farvning (venstre for linjen).

Data præsenteres som middel ± standardafvigelse. Statistisk signifikans blev defineret som en P-værdi på <0,05; statistisk analyse blev udført ved hjælp af kommerciel software.

Figure 1
Figur 1: Placering, dissektion og morfologi af murine stellate ganglier. (A) Skematisk tegning af placeringen af stjernernes ganglier (SG). (B) Se ind i brystkassen efter fjernelse af hjerte-lunge-pakken. Det er vigtigt at bemærke, at SG ikke er umiddelbart synlige det meste af tiden. Longus colli musklerne er placeret lateral fra rygsøjlen. SG er placeret lateral fra musklerne ved krydset med det første ribben. Omhyggeligt dissekere lateral til musklerne (område præget af prikket linje) for at afdække ganglier. Efter dissektion, ganglier (venstre og højre, LSG og RSG, henholdsvis) og sympatiske kæde kan gøres ud som hvide, lange strukturer. (C) En eksemplarisk dissektion, der viser ganglier og anatomiske vartegn. (D) Forstørrelse af LSG. (E) LSG og (F) RSG fra vilde typer, mandlige C57Bl6 mus (16 uger) blev dissekeret og fotograferet for at vise variationer i morfologi og størrelse. Skalalinjen repræsenterer 1.000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Visualisering af forskellige celletyper i murine stellate ganglier via hele bjerget immunohistochemistry og in situ hybridisering. (A) Brutto overblik over en murine stellate ganglion (SG) farves for sympatisk markør tyrosin hydroxylase (TH) og cholin acetyltransferase (ChAT). Forstørrelsen viser TH-positive cellelegemer og tilstedeværelsen af ChAT-positive, sandsynligvis præsynaptiske, nervefibre omkring neuronal somata. (B) Gliaceller, der indspærrer neuronale cellelegemer, kan visualiseres ved farvning for S100B, her i kombination med den neuronale markør PGP9.5. (C,D, E,F) Mikroskopiske billeder fra en SG farves hele mount via en kombination af immunohistochemistry for TH (rød) og in situ hybridisering for Tubb3 (D, hvid) og S100b (E, grøn). Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). (F) Fletningen viser, at ikke alle neuronale (Tubb3-positive) celler er TH-positive. S100b mRNA'er kan detekteres inden for neuronal somata, men også omgivende celler, som markeret med en pil i forstørrelsen i (G). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Potentielle kvantitative analyser og faldgruber. (A) Billeder fra tyrosin-hydroxylase (TH)-farvede SG kan bruges til cellestørrelsesmålinger ved hjælp af ImageJ. (B) Dette blev udført i en musemodel af diabetes (100 celler pr. SG, n = 2 SG pr. genotype, data blev sammenlignet ved hjælp af Mann-Whitney-test). (C) Eksemplariske gener udtrykt i SG, der kan være nyttige til at karakterisere molekylære processer. Cdkn1b samt neuronal markør Neun / Rbfox3 (for at tage højde for tilstedeværelsen af andre celletyper) kan bruges til normalisering. Tyrosin hydroxylase (Th) tjener som en sympatisk markør, cholin acetylkhydrogen (Chat) for cholinrgic transdifferentiation, Gap43 for neuronal spiring. Gener udtrykt i ikke-neuronale celletyper omfatter S100b (gliaceller), Ki-67 (prolifererende celler) og Cd45 (immunceller). (D) Hematoxylin og eosin farvning af en formalin-fast SG visualiserer bindevæv og celler på toppen af SG. (E) Forstørrelse fra det indrammede område. (F)I nogle tilfælde observerede vi svigt i antistofbaseret farvning, sandsynligvis på grund af ufuldstændig fjernelse af kapslen. Mens ChAT (rød) og TH (grøn) farvning kun kan påvises i nogle dele af SG, nuclei counterstained med DAPI (mørkeblå) kan påvises hele vejen igennem. Den spletterede linje i det flettede billede adskiller vellykket farvning (højre for linjen) fra mislykket farvning (venstre for linjen). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forståelsen af cellulære og molekylære processer i neuroner og gliaceller i det sympatiske nervesystem, der går forud for starten af VA, er af stor interesse, da pludseligt hjertestop forbliver den mest almindelige dødsårsag på verdensplan5. Derfor leverer vi i det nuværende manuskript et grundlæggende repertoire af metoder til at identificere murine SG – et murinelement i dette netværk – og udføre efterfølgende analyser på RNA, protein og cellulært niveau.

En udfordring af murine SG er dens størrelse og det begrænsede antal celler39. På grund af dette anvendes forskellige dyremodeller, såsom rotter40, hunde22og grise41 til undersøgelser af SG. Alligevel er der en række veletablerede sygdomsmodeller for hjertephoenotyper tilgængelige i mus, og nogle af disse er allerede karakteriseret i forskellige aspekter af hjerte innervation og arytmi, såsom modeller til diabetes23, myokardie infarkt42, eller myocarditis43. Derfor er yderligere undersøgelser af murine SG berettiget til yderligere at karakterisere autonom dysfunktion i lyset af VA. Disse kan udfyldes ved andre metoder til undersøgelse innervation af murin hjertet såsom funktionelle eksperimenter4,23,44 herunder in-vivo stimulation af SG23.

På grund af sin lille størrelse og dens placering inden for brysthulen24er manipulation af murin SG in vivo udfordrende, selvom den er blevet udført med succes23. Af denne grund fokuserer nogle undersøgelser derfor på de overlegne cervikal ganglier, som er placeret mere tilgængeligt i nakken, opstrøms for SG i den sympatiske kæde bag carotisbifurcationen i interne og eksterne halspulsårer24,35. Hjerte denervation via fjernelse af den overlegne livmoderhalskræft ganglier har vist sig at dæmpe myokardie betændelse, hypertrofi, og hjerte dysfunktion efter myokardie infarkt35. Det er dog vigtigt at bemærke, at de overlegne cervikal ganglier innerverer forskellige regioner i hjertet, mest fremtrædende den forreste side45. Derudover kom en nylig dybdegående litteraturgennemgang til den konklusion, at cervikal gangliers rolle på sympatisk innervation af hjertet forbliver uklar hos mennesker46. Dette fremhæver vigtigheden af at karakterisere SG for undersøgelser af hjerte sympatisk innervation.

Det er vigtigt at bemærke, at hjertet ikke er det eneste mål for SG. Blandt andet er lunger47 og svedkirtler i forepaw48 også innerveret fra fibre med oprindelse i SG, sidstnævnte er en undtagelse fra sympatisk fysiologi, da de udtrykker cholin acetylkreferase37. Midlertidig blokade af SG undersøges med hensyn til inflammatoriske processer i akut lungeskade49 eller til behandling af hedeture og søvndysfunktion50; derfor kan de foreliggende protokoller udgøre et repertoire for mekanistiske spørgsmål på disse områder. Når der fokuseres på hjertesygdomsmodeller, skal man huske på fortolkning af resultater, at hjerteneuroner ikke kan differentieres ved morfologi eller elektrofysiologiske egenskaber fra ikke-hjerteneuroner51. Dette kan opnås ved retrograd sporing, og dermed viste placeringen af neuroner, der projicerede til hjertet, at være placeret i kranio-mediale dele af SG52.

Derudover er det vigtigt at bemærke, at ud over forskellige typer neuroner består sympatiske ganglier af ensheathing glia, såkaldte satellitgliaceller eller satellitceller markeret med udtryk for glialmarkøren S100B53. Mens lidt er kendt om disse cellers rolle i kardiovaskulære patologier, glial aktivering og udtryk for glial fibrillary surt protein (GFAP) er blevet beskrevet i SG fra patienter med arytmier18.

Nogle faldgruber bør holdes for øje med de præsenterede metoder: vi observerede uoverensstemmelser i antistofbaseret farvning ved nogle lejligheder og hypotese, at ufuldstændig fjernelse af bindevævskapslen, der indhyller SG, kan være skyld, da de er blevet beskrevet at variere i permeabilitet blandt forskellige typer ganglier26. Mekanisk fjernelse af kapslen ved hjælp af fine pincet er blevet beskrevet i den overlegne cervikal ganglion af rotter op til postnatal dag 1028 og desheathing er nævnt i litteraturen for voksne rotte SG54,55 og mus56. Fjernelsen af SG kapslen kan variere mellem28 år og – på grund af størrelsesforskelle – arter. Det er vores erfaring, frisk dissektion, fjernelse af så meget bindevæv som muligt ved hjælp af fine pincet og grundig gennemtrængning som beskrevet i protokollen ved hånden, er vigtige faktorer for en vellykket farvning. Med hensyn til kvantitativ pcr i realtid er hurtigt arbejde og effektiv lysis afgørende. Samling af begge verdensmålene fra et dyr, der er pålideligt tilladt til analyse af op til 12 forskellige gener (ved udførelse af dubletter).

Selv om funktion og grov anatomi af SG er blevet undersøgt i årtier nu, og hver enkelt kardiomyocyt er innerveret af sympatiske fibre46, mange åbne spørgsmål tilbage. For eksempel er det fortsat uklart, hvorfor sympatiske neuroner af SG transdifferentiate forbigående til en cholinrgic fænotype i iskæmisk21 og ikke-iskæmisk hjertesvigt, hos dyremodeller såvel som hos patienter20. For nylig beskrev vores gruppe en rolle af S100B-positive gliaceller, som også er til stede i murine SG, på nervespiring i hjertenervesystemet29. Hvorvidt disse celler er relevante for sympatisk nervespiring efter skade forbundet med VA11,12, skal belyses i fremtidige undersøgelser. Det er vigtigt, at innovative tilgange, såsom optogenetics52 og transcriptomeanalyser36, kan supplere etablerede metoder såsom neuronal sporing for at uddybe forståelsen af det sympatiske nervesystem og dets rolle i hjerteelektrofysiologi.

Afslutningsvis tillader dette repertoire den uerfarne efterforsker at udføre en grundlæggende karakterisering af SG i murinemodeller af hjertepatologier. Vi håber, at dette vil stimulere brugen, kombinationen og skabelsen af nye metoder. Dette kan bidrage til at øge forståelsen af de underliggende cellulære og molekylære processer i sympatiske neuroner, der kan være ansvarlige for starten og vedligeholdelsen af VA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Hartwig Wieboldt for hans fremragende tekniske bistand, og UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) fra University Medical Center Hamburg-Eppendorf for at levere mikroskoper og støtte. Denne forskning blev finansieret af DZHK (Det Tyske Center for Hjerte-kar-forskning) [FKZ 81Z4710141].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate TPP 92097 RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm R. Langenbrinck 03-0060 Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. Serva 11924.03 Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647  Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568  Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488  Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Drying block 37-100 mm Whatman (Sigma Aldrich) WHA10310992  Whole mount staining
Eosin Y Sigma Aldrich E4009 Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) Th.Geyer 2212.5000 Whole mount staining
Eukitt mounting medium AppliChem 253681.0008 Whole mount staining
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI Southern Biotech 0100-20 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
H2O2 30% (w/w) Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml Rotexmedica PZN: 3862340 Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit Life technologies  4368813 RNA isolation
Isoflurane (Forene) Abbott Laboratories 2594.00.00 Preparation SG
Mayer's hemalum solution Merck 1.09249.0500 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller Marienfeld 0101040 Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA isolation
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000C RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack Akoya Bioscience FP1488001KT RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free  Alfa Aesar 43368 Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm Th.Geyer 7691202 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco 18912-014 Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps FineScienceTools 11203-25 Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent Qiagen  79306 RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
RNAlater Merck R0901-100ML RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 biotechne (ACD) 323100 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 biotechne (ACD) 431738-C2 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 biotechne (ACD) 423391 RNAscope
Stainless steel beads 7 mm  Qiagen  69990 RNA isolation
Sudan black B Roth 0292.2 Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan mastermix Applied biosystems 4370074 Gene Expression analysis 
Tissue Lyser II Qiagen 85300 RNA isolation
Triton X-100 10% solution Sigma-Aldrich 93443-100ml Whole mount staining
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ML RNAscope
Wacom bamboo pen Wacom CTL-460/K Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 Sigma-Aldrich WHA10311647 Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 RNAscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
  2. Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
  3. Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
  4. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  5. Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
  6. Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
  7. Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
  8. Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
  9. Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
  10. Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
  11. Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
  12. Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
  13. Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
  14. Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
  15. Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
  16. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
  17. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
  18. Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
  19. Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
  20. Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
  21. Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
  22. Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
  23. Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
  24. Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
  25. Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
  26. Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
  27. Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
  28. Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
  29. Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
  30. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  31. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  32. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
  35. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
  36. Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
  37. Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
  38. Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
  39. Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
  40. Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
  41. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  42. Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
  43. Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
  44. Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
  45. Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
  46. Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
  47. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  48. Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
  49. Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
  50. Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
  51. Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
  52. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  53. Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
  54. Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  55. Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
  56. Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).

Tags

Medicin sympatisk nervesystem stellate ganglier intracardiac autonome nervesystem ventrikulær arytmi neuromorfologi elektrofysiologi
Placering, dissektion og analyse af Murine Stellate Ganglion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scherschel, K., Bräuninger, H., … More

Scherschel, K., Bräuninger, H., Glufke, K., Jungen, C., Klöcker, N., Meyer, C. Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion. J. Vis. Exp. (166), e62026, doi:10.3791/62026 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter