Summary
本手法は、ナノモル量の試薬を用いた放射性医薬品の迅速かつ経済的最適化のための液滴化学反応に基づく新規ハイスループット方法論の使用を説明する。
Abstract
現在の自動無線シンセサイザーは、放射性医薬品の大規模な臨床バッチを生成するように設計されています。各データポイントは、重要な試薬の消費を伴うため、反応最適化や新しい放射性医薬品開発に適しておらず、装置の汚染には次の使用前に放射性崩壊に時間が必要です。これらの制限に対処するために、小型液滴ベースの反応のアレイを並列に行うためのプラットフォームであり、それぞれがパターン化されたポリテトラフルオロエチレンコーティングされたシリコン「チップ」上の表面張力トラップ内に閉じ込められたものが開発された。これらのチップは、試薬濃度、反応溶媒、反応温度および時間を含む反応パラメータの迅速かつ便利な研究を可能にします。このプラットフォームは、従来の無線シンセサイザーを使用して数ヶ月を取るのではなく、最小限の試薬消費で数日で何百もの反応を完了することができます。
Introduction
陽電子放出断層撮影(PET)放射性医薬品は、生体内の特定の生化学的プロセスを監視し、疾患を研究するための研究ツールとして広く使用されており、新薬や治療法の開発に使用されています。さらに、PETは疾患を診断またはステージングし、患者の治療1、2、3に対する応答を監視するための重要なツールである。PET放射性同位元素の半減期(例えば、フッ素-18標識放射性医薬品の場合は110分)と放射線の危険のために、これらの化合物は放射線遮蔽の背後で動作する特殊な自動化システムを使用して調製され、使用直前に準備する必要があります。
放射性医薬品の合成に使用される現在のシステムは、生産コストを共有するために多くの個々の用量に分割された大きなバッチを生成するように設計されています。現在のシステムは[18F]FDGのような広く使用されている放射線トレーサーの生産に適しているが(複数の患者のスキャンおよび研究実験は1日でスケジュールすることができるので)、これらのシステムは初期段階の開発中に新しい放射線トレーサーの生産のために無駄であり、またはあまり一般的に使用される放射性トレーサーである。従来のシステムが使用する体積は、通常1〜5 mLの範囲であり、反応は1〜10mgの範囲で前駆体量を必要とする。さらに、通常の無線シンセサイザーを使用すると、装置が使用後に汚染され、ユーザは次の実験を行う前に放射能が崩壊するのを待たなければならないので、最適化研究の間に一般的に面倒です。機器コストとは別に、放射性同位元素および試薬のコストは、したがって、複数のバッチの生産を必要とする研究のために非常に実質的になる可能性があります。これは、例えば、初期in vivoイメージング研究のための十分な収率と信頼性を達成するために、新しい放射線トレーサのための合成プロトコルの最適化中に発生する可能性があります。
マイクロ流体技術は、従来のシステム4、5、6よりもいくつかの利点を活用するために、放射線化学でますます使用されています。マイクロ流体プラットフォームは、1-10 μL反応容積7,8,9に基づくものを含め、試薬量の大幅な減少と高価な前駆体の消費、ならびに短い反応時間を示しています。これらの削減は、低コスト、より速い加熱および蒸発ステップ、より短く、より簡単な下流浄化、全体的な「より緑の」化学プロセス10、および生産された放射線トレーサー11のより高いモル活性につながる。これらの改良により、各合成の試薬コストを下げることにより、より広範な最適化研究を行うことがより実用的になります。さらなる利点は、1日に放射性同位元素の単一のバッチから複数の実験を行うことによって達成することができる。例えば、「発見モード」で動作するマイクロ流体流量化学無線シンセサイザは、それぞれ10sのμL反応体積12のみを使用して、数十の反応を順次行うことができる。
これらの利点に触発され、マイクロボリューム反応がパターン化されたテフロンコーティングを使用して作成されたシリコン表面上の表面張力トラップの配列に閉じ込められる多反応液滴アレイチップが開発されました。これらのチップは、1-20 μLスケールで同時に複数の反応を行い、1日あたり10種類の異なる反応条件を探索する可能性を開き、それぞれが複数の反復を伴います。本論文では、迅速かつ低コストの放射化学最適化を行うためのこの新しいハイスループットアプローチの有用性を実証する。多反応液滴チップを使用すると、試薬濃度と反応溶媒の影響を簡単に探索することができ、複数のチップを使用すると、非常に少量の前駆体を消費しながら、反応温度と時間の研究を可能にします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意: このプロトコルは放射性物質の取り扱いを含みます。実験は、必要な訓練と個人の保護具とあなたの組織の放射線安全事務所からの承認なしに行われるべきではありません。放射線遮蔽の背後で実験を行う必要があります, 好ましくは換気ホットセルで
1. 多反応チップの製造
注:多反応マイクロドロップレットチップのバッチは、以前に10(図1) に記載されているように、標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して4インチシリコンウエハーから製造されています(図1)。この手順は、反応部位の4 x 4配列を有する7チップをそれぞれ生成する。
- シリコンウェーハをスピンコーターチャックに置き、中央に配置します。3mLのポリテトラフルオロエチレン溶液をウェーハの中心に移管ピペットを用いて、3000rpmでウエハーをコート(500rpm/sランプ)に塗布する。
- コーティングを固めるには、ウエハーを160°Cのホットプレートに10分間置き、245°Cのホットプレートに10分間移します。
- 窒素雰囲気下で340°Cの高温オーブンでコーティングをアニールし、続いて10°C/分ランプで70°Cまで冷却します。
- シリコンウェーハをスピンコーターチャックに置き、中央に配置します。転写ピペットを用いてウェハ中央に2mLの正のフォトレジストを注ぎ、3000rpmで3000rpm(1000 rpm/sランプ)でコーティングを行う。
- ウエハのソフトベークを115°Cのホットプレートで3分間行い、フォトレジストを固める。
- マスクアライナにウエハーとフォトマスクを取り付け、12 mW/cm2 ランプ強度、356 nm波長で14s露光をハードコンタクトモードで行います。このステップは、負の最終ポリテトラフルオロエチレンパターンを含む透明マスク、すなわち、16反応チップの4コピーの直径パターンを使用し、反応部位は透明であり、その他すべての領域は不透明な色で。
- 20 mLのフォトレジスト現像液を使用してウエハーを3分間のガラス容器に入れ、わずかな攪拌で露出パターンを開発する。
- 20 mLのDI水を用いたガラス容器にウエハーをわずか撹拌で3分間浸して、開発液を洗い流します。ウェハを窒素銃で乾かします。
- 30 s露光、100 mTorr圧、200Wパワー、50 sccm酸素流の下で酸素プラズマを用いて、露出したポリテトラフルオロエチレン領域を酸素プラズマで除去します。
- シリコンウェーハカッターを使用して、ウェハを個々のチップ(ウエハーあたり合計7個)にダイスします。
- 各チップをアセトンに1分間沈め、フォトレジストを取り除き、イソプロパノールを1分間浸します。最後に、各チップを窒素銃で乾燥させます。
- ガラス容器にドライチップを入れ、使用するまで保管するためにアルミホイルで覆います。
2. 最適化スタディの計画
注: このプロトコルでは、高スループット最適化を例にした例として放射性医薬品[18F] の合成が使用されます (図 2)。単一のチップを使用すると、16の同時反応を、例えば、様々な前駆体濃度(8つの異なる濃度、n=2はそれぞれ複製)で行うことができる。条件は 、図 3Aの反応部位にマッピングされます。このプロトコルを調整して、他の反応パラメータ(例えば反応溶媒、反応量、TBAHCO3の量など)または他の放射性医薬品を最適化することができます。
- 変化するリアクションパラメータ、使用する特定の値、および反復の数を選択します。
- 実験を実行するために必要なチップの数を計算します。
- 各チップについて、各反応部位でどの反応条件を使用するかを示す地図を用意し、試薬の調製や液滴反応を行う際に役立ちます。
3.[18F]ファリープリドの放射線合成を最適化するための試薬と材料の調製
注:液滴ベースの放射線合成[18F]ファリープリド(図2)は、反応部位にフッ化物と相転移触媒(TBAHCO3)を添加し、続いて加熱して水を蒸発させ、乾燥残渣を残す。次に、反応溶媒中の前駆体(トシル・フォールプリド)の液滴(セキシルアルコールおよびアセトニトリル)を加え、加熱して、蛍光化反応を行う。最後に、粗生成物を分析用チップから回収します。試薬の調製および合成手順は、別のトレーサーの最適化を行う場合に適合する必要があります。
- 反応溶媒のストック溶液を調製し、1:1の体積混合物でセキシルアルコールとアセトニトリルからなる。ボリュームが計画された希釈シリーズを作成するのに十分であることを確認します。この最適化例では、〜30 μLで十分です。
- 探索する最大濃度(77 mM)の反応溶媒に、前駆体(トシル-ファリープリド)の30μLストック溶液を調製します。計画された実験を実行するのに十分なボリュームがあることを確認します。この最適化例では、〜30 μLで十分です。
- 前駆体ストック溶液および反応溶媒から、2x連続希釈を行い、前駆体溶液の異なる濃度を調製する。各希釈のボリュームが、各条件に対して必要な反復数を実行するのに十分であることを確認します。この最適化例では、各濃度の〜15μLで十分である。
- マイクロ遠心チューブを準備し、パーマネントマーカーを使用して各粗反応生成物を回収し、各チューブに固有の番号を付けます。マイクロ遠心管の総数が、反復数(8 x 2 = 16)を掛けた条件の数と一致することを確認します。
- 9:1 メタノール:DI 水 (v/v) を含む回収液 (10 mL) のストックを準備します。アリコート50μLは、16個の追加標識マイクロ遠心チューブ(チップ上の反応部位ごとに1個)のそれぞれに。
- フッ化物ストック溶液を500 μLマイクロ遠心分離チューブに用意し、[18F]フッ化物/18O]H2O(〜260 MBq[7 mCi])を75 mM TBAHCO3溶液(56 μL)で混合し、DI水で140μLまで希釈します。 この溶液の8μLは、各反応部位にロードされる(〜15 MBq[0.40 mCi]の活性、および240 nmolのTBAHCO3を含む)。
4.[18F]の並列合成は、異なる前駆体濃度を有するファリープライド
注:チップは、フィードバックのための内部熱電対信号を使用してオンオフ温度コントローラを使用して制御される25 mm x 25 mmセラミックヒーターからなる加熱プラットフォーム(前述の13)の上で動作します。ヒーター表面温度は、熱画像を用いて較正された。このようなプラットフォームが利用できない場合は、ホットプレート(105°Cで1枚、110°C)を使用できます。
- 負荷[18F]フッ化物ストック溶液(相転移触媒付き)。
- マイクロピペットを使用して、多反応チップの第1反応スポットに[18F]フッ化物ストック溶液の8μL液滴をロードします。チップを用量校正器に入れることでチップの活性を測定し、測定が行われた時間を記録します。
- 用量校正器からチップを取り出し、2番目の反応スポットに[18F]フッ化物ストック溶液の8μL液滴をロードします。チップ上の活性を再度用量校正器に入れ、測定が行われた時間を記録して測定します。
- チップ上の他のすべての反応部位について繰り返します。
- 放射性同位元素をロードした後にアクティビティ測定を行い、そのサイトがロードされる前に以前の測定値(減衰補正)を差し引いて、反応スポットごとにロードされたアクティビティを計算します。
- ヒーターのマルチリアクションチップを位置合わせします。
- セラミックヒーターの上に熱ペーストの薄い層を追加します。
- ピンセットを使用してチップをヒーターの上に慎重に配置して、液滴のこぼれを避け、チップの基準コーナーをヒーターの基準コーナーに合わせます( 図3Bを参照)。チップはヒーターを少しだけ張り出します。
- フッ化物及び相転移触媒を乾燥する[18F]
- コントロールプログラムでヒーターを105°Cに設定して1分間チップを加熱し、水滴を蒸発させて[18F]フッ化物とTBHACO3の乾燥残渣を乾燥させた。1分後、ヒーターをオフにして、コントロールプログラムで冷却ファンをオンにしてチップを冷却します。
- 前駆体ソリューションを追加します。
- マイクロピペットを使用して、第1反応部位の乾燥残渣の上にファリプリド前駆体の6μL溶液を加える。
- チップ上の他のすべての反応部位について繰り返します。各反応部位に希釈系列のどの濃度が使用されているかを決定するには、最適化計画を使用します。
- フッ素化反応を行う。
- コントロールプログラムを使用して、各チップを110°Cに加熱し、7分間、蛍光化反応を行います。その後、ヒーターをオフにして、コントロールプログラムで冷却ファンをオンにして、チップを冷却します。
- 反応部位から粗製品を収集します。
- マイクロピペットを介して指定されたマイクロ遠心分離管から10μLの回収液を加えて、最初の反応部位で粗生成物を回収します。5 sを待った後、マイクロピペット(同じチップを取り付けた状態)を使用して希釈された粗製品を吸引し、対応するラベル付きコレクションマイクロ遠心チューブに移します。
- すべての操作に同じピペットチップを使用して、このプロセスを合計4回繰り返します。
- チップ上の他のすべての反応部位に対して収集プロセスを繰り返します。
5. 合成分析による反応性能と最適条件の決定
- チップ上の最初の反応に対する「回収効率」を決定します。
- マイクロ遠心チューブを、第1反応スポットの回収粗生成物を用量キャリブレーターに入れ、活性を測定する。測定の測定と時間を記録します。
- 収集した粗生成物の活性を同じ反応部位で測定した開始活性で割って回収効率を算出する(活性値を同じタイムポイントに減衰補正)。
- チップ上の他のすべての反応部位について繰り返します。
- 採取した各粗製品の組成(フッ素化効率)を分析します。
注:短時間ですべてのサンプルの分析を実用的にするために、フッ素化効率は、前述のハイスループット無線薄層クロマトグラフィー(radio-TLC)アプローチ14を使用して分析される。この技術は、1つのTLCプレート上で並べて(5mmピッチ、0.5μL)を同時に見つけ、次いで一緒に開発し、セレンコフイメージング14、15を用いて一緒に読み出しを行うことによって、最大8個のサンプルを並列処理することを可能にする。16の並列反応による最適化の例では、2つのTLCプレートが必要です。別のオプションは、分析にラジオ-高性能液体クロマトグラフィー(radio-HPLC)を使用することですが、分離、洗浄、および平衡化の時間は分析できるサンプルの数を制限する可能性があります。- TLCプレート(50mm x 60mm)ごとに、鉛筆で、1本の50mmの端(下)から15mm離れたところに線を引き、同じ端から50mm離れたところにもう1本の線を引きます。最初の行は原点線です。2番目は溶媒の最前線です。5 mm 間隔の原点線に沿って 8 つの小さな "X" を描き、8 つの「レーン」のそれぞれに対してサンプルスポッティング位置を定義します。
- マイクロピペットを使用して、最初の粗製品の0.5 μLを最初のレーンの「X」のTLCプレートに移します。追加の粗製品(TLCプレートあたり最大8)について繰り返します。TLCプレートで粗製品スポットが乾燥するのを待ちます。
- TLCプレートごとに、溶媒前線が溶媒の前線に到達するまで、25 mM NH4HCO2 で 60% MeCN の移動相を使用して開発します。TLCプレートの溶剤が乾燥するのを待ってから、ガラス顕微鏡スライド(76.2 mm x 50.8 mm、厚さ1mm)で覆います。
- セレンコフイメージングシステムにプレートを5分間露出させることにより、各TLCプレートの放射能画像を得る。標準の画像補正(暗電流減算、フラットフィールド補正、中央値フィルタリング、背景減算)を実行します。
- 最初の TLC プレートの最初のレーンに関心領域(ROI)解析を使用します。レーンに表示される各バンドの周りに領域を描画します。ソフトウェアは、すべての領域(バンド)の合計の統合強度と比較して、各領域(バンド)の積分強度の割合を計算します。
- この移動相では、示された保持係数で以下のバンドが期待されます: Rf = 0.0: 未反応[18F]フッ化物;Rf = 0.9: [18F] ファリープライド;Rf = 0.94: 副産物。[18F]ファリープライドバンドの活性の割合としてフッ素化効率を決定する。
- すべての TLC プレート上の他のすべてのレーンに対してこの解析を繰り返します。
注:セレンコフイメージングチャンバーが利用できない場合、小さな動物(前臨床)イン ビボ 光学イメージングシステムを使用してTLCプレートを画像化することができます。あるいは、2次元TLCスキャナを使用することもできます。また、1次元TLCスキャナしか利用できない場合は、TLCプレートを、はさみ(レーンあたり1本)でストリップに切り取り、各ストリップを個別にスキャンすることで分析できます。
- 各反応部位の粗な放射化学収率(粗RCY)を決定します。
- 集積効率とフッ素化効率を掛けることで、最初の粗製品の粗RCYを求めます。
- 他のすべての反応部位についても繰り返します。
- 結果を分析する
- 反復実験の値を平均および標準偏差に集約します。
- 採集効率、フッ素化効率、粗RCYを可変したパラメータの関数としてプロットします(この例では前駆体濃度)。
- 希望の条件に基づいて最適条件を選択します。通常、これは最大粗RCYです。さらに、グラフの傾きが比較的平坦な領域でポイントが選択されることが多く、パラメータの小さな変化に対して無神経であることを示し、より堅牢なプロトコルを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この方法を例示するために代表的な実験を行った。16の反応を用いて、放射性薬[18F]ファリプリプライドの最適化研究は、反応溶媒として、前駆体濃度(77、39、19、9.6、4.8、2.4、1.2、0.6mM)を反応溶媒として行った。反応は110°Cで7分間行った。回収効率、サンプル組成(すなわち、ファリープライド生成物の[18F]の割合、未反応[18F]フッ化物、および副産物)を 表1 に集計し、 図4に図示する。
この研究は、前駆体濃度の増加に伴ってフッ素化効率([18F]ファリプリドの割合)が増加し、残りの未反応[18F]フッ化物が反比例して変化することを示した(図4A)。低い前駆体濃度では放射性側製品が少量であったが、その割合は、より高い前駆体濃度でほぼゼロに減少した(図4A)。回収効率はほとんどの条件でほぼ定量的であったが、低い前駆体濃度でわずかに低下した。
これらの結果から、最も高いRCYは前駆体の〜230 nmol(すなわち、6 μLの液滴中の39 mM濃度)で達成することができる。この状態では、フッ素化効率は0.5%(n=2)±96.0、粗RCYは87.0±2.7(n=2)であり、放射性側の生成物は観察されなかった。77 mM前駆体の使用は同様の結果を示したが、一般的には、コストを削減し、下流の精製工程を簡素化するために、より低い量の前駆体を使用することが望ましい。
図1:フォトリソグラフィーによる多反応マイクロドロップレットチップの製造(A)反応部位4x4アレイを有する多反応マイクロドロップレットチップの写真このチップはポリテトラフルオロエチレンコーティングされたシリコンで、ポリテトラフルオロエチレンの円形領域をエッチングして親水性反応部位を作り出します。(B)製造手順の概略。シリコンウエハはテフロン溶液でスピンコートされ、コーティングを固めるために焼成されます。次に、フォトレジストは、フォトリソグラフィを介してスピンコートされ、パターン化され、エッチングマスクを生成する。フォトレジストは、フォトレジスト現像液を用いて開発される。露出したテフロンは、酸素プラズマによるドライエッチングによって除去される。ウエハは個々のチップにダイシングされ、フォトレジストは剥がされる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:並列反応の手順多反応チップ上で放射性医薬品[18F]fallyprideの16個の並列合成を行うための実験手順。この例では、反応ごとに前駆体濃度が変化する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 反応部位の条件の地図. (A) 16反応チップを用いたトシルファリプリドの放射性蛍光に対する前駆体濃度の影響を探る実験計画(上図)。8つの異なる濃度が探索され、それぞれがn=2の反復を伴う。その他の反応条件は一定に保持された(温度:110°C;時間:7分;溶媒:セキシルアルコール:MeCN;TBAHCO3:240 nmolの量)。各反応は、〜14MBqの活性で行った。(B)実験中にヒータープラットフォームに取り付けられている16反応チップの写真。赤い線は、ヒーターの基準コーナーとの位置合わせに使用されるチップの基準コーナーを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:前駆体濃度が[18F]ファリープリプリドのマイクロロプレット合成に及ぼす影響(A)回収された粗反応生成物中に存在する放射性物質の割合、すなわち[18F]ファリープライド、副産物、または未反応[18F]フッ化物。(B) 合成性能回収効率、フッ素化効率、粗RCYは、前駆体濃度の関数としてプロットされています。どちらのグラフでも、データポイントはn=2反復の平均を表し、誤差範囲は標準偏差を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 前駆体協奏曲 (mM) | 回収効率(%) | フッ素化効率(%) | 原油RCY (%) | 未反応[18F]フッ化物(%) | 副産物 (%) |
| 77 | 91.8 ± 2.1 | 96.7 ± 2.0 | 88.8 ± 3.9 | 3.3 ± 2.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 39 | 90.6 ± 2.4 | 96.0 ± 0.5 | 87.0 ± 2.7 | 4.0 ± 0.5 | 0.0 ± 0.0 |
| 19 | 91.1 ± 0.5 | 81.1 ± 0.3 | 73.9 ± 0.7 | 8.4 ± 1.2 | 10.5 ± 2.0 |
| 9.6 | 90.9 ± 0.6 | 62.7 ± 0.9 | 57.0 ± 0.5 | 23.3 ± 2.1 | 14.0 ± 0.9 |
| 4.8 | 88.4 ± 0.8 | 37.0 ± 1.5 | 32.8 ± 1.6 | 47.3 ± 0.8 | 15.7 ± 1.0 |
| 2.4 | 87.6 ± 2.0 | 21.0 ± 2.1 | 18.4 ± 2.2 | 67.4 ± 2.1 | 11.6 ± 1.0 |
| 1.2 | 82.3 ± 1.6 | 12.7 ± 0.3 | 10.4 ± 0.1 | 72.8 ± 0.7 | 14.5 ± 1.0 |
| 0.6 | 81.2 ± 3.7 | 6.3 ± 0.8 | 5.1 ± 0.5 | 84.3 ± 0.2 | 9.4 ± 1.0 |
表1:前駆体濃度の研究から得られたデータ。 すべての値は、n=2反復から計算された標準偏差±平均値です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1日あたり1回または少数の反応しか許可されず、データポイント当たりの試薬を大量に消費する従来の放射線化学システムの制限により、実際には反応パラメータ空間全体のごく一部しか探索されず、繰り返しなしの結果が何度も報告されます(n=1)。従来のシステムと比較して、この多反応液滴放射合成プラットフォームは、前駆体の時間と量を非常に少なくしながら、より包括的で厳格な放射線合成条件の研究を行うことを可能にし、製品収量および副産物形成に影響を与えるパラメータに関する新しい洞察を可能にする可能性がある。この情報は、最高の製品収量または最も堅牢な合成をもたらす条件を選択するために使用することができます。低い前駆体消費は、少量の前駆体しか利用できない場合や前駆体が高価な場合に、新規の放射線トレーサの初期の開発に特に有用である可能性がある。チップの開放性は、迅速な合成時間とピペットによるアクセスの容易さに寄与する一方で、揮発性分子の大幅な損失を招き、揮発性前駆体、中間体、または製品を有する放射性医薬品の合成を最適化する際には実用的ではない可能性があります。
放射線被ばくの危険のために、これらの実験は適切な訓練と承認を得てのみ行われるべきであり、放射線遮蔽の背後で行われるべきであり、好ましくは換気された熱い細胞で行われるべきである。放射性同位元素の半減期が短いため、迅速かつ効率的に実験を行うことが重要です。チップへの試薬のピペット化とチップからの製品の収集は、ホットセル内のアクセスと可視性の低下に慣れるため、非放射性条件下で実施する必要があります。同様に、チップを取り付けて取り外し、また、用量キャリブレータでチップの測定を行うことも実践されるべきである。さらに、詳細な実験マップ(すなわち、チップ上の各部位における特定の反応条件)を用いて、組織化することが重要である。測定時に記入する結果のテーブルを事前に準備することも役立ちます。再現性を確保するために、特に人為的ミスの可能性を伴い、各条件のセットの複数の複製を実行する必要があります。反応部位の外側に液体をこぼれさせ、隣接する反応部位との交差汚染を引き起こさないように、チップから粗サンプルを収集する工程では特に注意が必要です。エラーが検出された場合は、これらの反応部位にフラグを立て、データを最終的な分析から除外することが重要です。
この研究例では、16個のデータポイントに対して消費された前駆体の量は、従来の無線シンセサイザを用いたデータポイント当たり4mgと比較して1.1mg(それぞれ約70μg)であった。さらに、16回の反応を1回の実験で全て25分で完了した。これに対して、従来の放射線シンセサイザ上で粗[18F]の合成は反応16,17あたり〜15〜20分を要する。
この代表的な実験は、高速かつ経済的な方法で8つの異なる前駆体濃度(各条件のためのn =2反復)を探索することによって放射性医薬品の放射線合成のための条件を最適化するために16反応を有する多反応マイクロドロップレットチップの有用性を実証した[18F]ファリープライド。多反応チップを使用して便利に最適化できるその他の変数には、放射能の量、相転移触媒の種類、相転移触媒の量、蒸発/乾燥条件(例えば、共沸乾燥工程の数)、反応溶媒などが含まれます。複数の多反応チップを使用することにより、蒸発/乾燥温度や時間などの条件に加えて、反応温度や反応時間の影響を探る事も可能です。このような研究は、単一のヒーターを使用して順次行うか、同時に複数のヒーターを操作することによって並列化することができる。
基礎液滴合成法は、例えば[18F]ファリープライド10、18F]FET 18、18F]FDOPA19、18F]FBB20などの18F標識放射性医薬品の広い範囲と互換性があることを示しており、他の18F標識化合物および他のアイソトとラベル付けされた化合物の大部分の最適化に使用することができる。さらに、結果として最適化された液滴ベースの反応は、本質的に、前駆体消費の減少、プロセス時間の短縮、およびコンパクトな計測を含むマイクロボリューム放射化学の利点を活用し、大規模なバッチの日常的な生産に対して同じ利点を提供することができます。大きなバッチでは、反応の開始時に最初にロードされるアクティビティの量をスケールアップする必要があります。インビトロまたはインビボアッセイでの使用に適したトレーサーを調製するためには、粗生成物を精製し(例えば、分析スケールHPLCを使用して)、(例えば、蒸発または固相溶媒交換21を介して)配合する必要がある、あるいは、液滴スケールから従来のバイアルベースの無線合成機に最適条件を適応させることが可能である。この可能性の調査は進行中です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
カリフォルニア大学リージェンツは、ヴァンダム博士によって発明されたSofie, Inc.に技術をライセンスし、ライセンス取引の一環としてソフィー社の株式を取得しました。ドクター・ファン・ダムは、ソフィー社の創設者兼コンサルタントです。残りの著者は利益相反を宣言しません。この研究の一部は、国立がん研究所(R33 240201によってサポートされました。
Acknowledgments
我々は、UCLA生物医学サイクロトロン施設とロジャー・スラヴィック博士とジュゼッペ・カルッチ博士がこれらの研究のためにフッ化物を寛大に提供し、UCLA NanoLabにチップ製造のための機器のサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A.
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M.
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al.
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
