Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

Abstract

מטבולומיקה היא מתודולוגיה המשמשת לזיהוי וכימות של מתווכים ותוצרים רבים במשקל מולקולרי נמוך ומוצרים של חילוף חומרים בתוך תא, רקמה, איבר, נוזל ביולוגי או אורגניזם. מטבולומיה מתמקדת באופן מסורתי במטבוליטים מסיסים במים. המטבולום המסיס במים הוא התוצר הסופי של רשת סלולרית מורכבת המשלבת גורמים גנומיים, אפיגנומיים, שעתוקיים, פרוטאומיים וסביבתיים שונים. לפיכך, הניתוח המטבולומי מעריך ישירות את התוצאה של הפעולה עבור כל הגורמים האלה בשפע של תהליכים ביולוגיים בתוך אורגניזמים שונים. אחד האורגניזמים האלה הוא שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae, אאוקריוטה חד-תאית עם הגנום הרצף המלא. מכיוון ש- S. cerevisiae מקובל על ניתוחים מולקולריים מקיפים, הוא משמש כמודל לניתוח מנגנונים שבבית תהליכים ביולוגיים רבים בתוך התא האוקריוטי. שיטה אנליטית רב-תכליתית להערכה כמותית חזקה, רגישה ומדויקת של מטבולום מסיס במים תספק את המתודולוגיה החיונית לניתוח מנגנונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור התנאים הממוטבים של פעילות מטבולית מרווה פנימה ומיצוי מטבוליט מסיס במים מתאי S. cerevisiae. הפרוטוקול מתאר גם את השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית (LC-MS/MS) לניתוח כמותי של מטבוליטים מסיסים במים שחולצו. שיטת LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת המתוארת כאן היא רב-תכליתית וחזקה. היא מאפשרת זיהוי וכימות של יותר מ-370 מטבוליטים מסיסים במים בעלי תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות, כולל איסומרים מבניים שונים וצורות סטריאואימוזוריות של מטבוליטים אלה. מטבוליטים אלה כוללים מולקולות נושאות אנרגיה שונות, נוקלאוטידים, חומצות אמינו, מונוסכרידים, מתווכים של גליקוליזה, ומתווכים מחזור tricarboxylic. שיטת LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת רגישה ומאפשרת זיהוי וכמות של כמה מטבוליטים מסיסים במים בריכוזים נמוכים ככל 0.05 pmol / μL. השיטה שימשה בהצלחה להערכת מטבולומים מסיסים במים של תאי שמרים מסוג בר ומוטנטים בתרבית בתנאים שונים.

Introduction

מטבוליטים מסיסים במים הם מתווכים במשקל מולקולרי נמוך ומוצרים של חילוף החומרים התורמים לתהליכים תאיים חיוניים. תהליכים אלה השמורים אבולוציונית כוללים המרה של חומרים מזינים לאנרגיה שמישה, סינתזה של macromolecules, צמיחה תאית איתות, בקרת מחזור התא, רגולציה של ביטוי גנים, תגובת מתח, ויסות לאחר תרגום של חילוף החומרים, שמירה על פונקציונליות מיטוכונדריאלית, סחר תאי אופניים, autophagy, הזדקנות תאית, ומוות תאים מוסדר1,2,3.

רבים מהתפקידים החיוניים האלה של מטבוליטים מסיסים במים התגלו על ידי מחקרים בשמרים ניצנים S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. אאוקריוטה חד-תאית זו היא אורגניזם מודל שימושי לניתוח מנגנונים שבאמצעותם מטבוליטים מסיסים במים תורמים לתהליכים תאיים בשל נוחותו לנתחים ביולוגיים ביוכימיים, גנטיים ומולקולריים מתקדמים23,24,25,26. למרות שיטות LC-MS/ MS של מטבולומיקה לא ממוקדת שימשו לחקר התפקידים של מטבוליטים מסיסים במים בשמרים ניצנים3,18,22,27, סוג זה של ניתוח דורש שיפור הרבגוניות שלה, חוסן, רגישות, ואת היכולת להבחין בין איזומרים מבניים שונים וצורות סטריאויזומריות של מטבוליטים אלה.

השנים האחרונות מאופיינות בהתקדמות משמעותית ביישום שיטות LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת ליצירת פרופיל של מטבוליטים מסיסים במים ב- vivo. עם זאת, אתגרים רבים בשימוש במתודולוגיה זו נשארים2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. אתגרים אלה כוללים את הדברים הבאים. ראשית, הריכוזים התאיים של מטבוליטים מסיסים במים רבים נמצאים מתחת לסף הרגישות לשיטות הנמצאות בשימוש כיום. שנית, היעילות של מרווה פעילות מטבולית נמוכה מדי, והיקף דליפת התאים הקשורים להרוותה של מטבוליטים תאיים גבוה מדי עבור השיטות הנוכחיות; לפיכך, השיטות הנמצאות בשימוש כיום בהערכת הריכוזים התאיים של מטבוליטים מסיסים במים. שלישית, השיטות הקיימות אינן יכולות להבדיל בין האיסומרים המבניים (כלומר, מולקולות עם אותה נוסחה כימית אך קישוריות אטומית שונה) או סטריאוטיומרים (כלומר, מולקולות עם אותה נוסחה כימית וקישוריות אטומית, אך עם הסידור האטומי השונה בחלל) של מטבוליטים ספציפיים; פעולה זו מונעת ביאור נכון של מטבוליטים מסוימים על ידי השיטות הנמצאות בשימוש כיום. רביעית, מסדי הנתונים המקוונים הספקטרליים ההמוניים הקיימים של יונים הורים (MS1) ויונים משניים (MS2) אינם שלמים; זה משפיע על הזיהוי הנכון וכמות של מטבוליטים ספציפיים באמצעות נתוני LC-MS/ MS גולמיים המיוצרים בעזרת השיטות הנוכחיות. חמישית, השיטות הקיימות אינן יכולות להשתמש בסוג יחיד של מיצוי מטבוליט כדי לשחזר את כל או רוב המעמדות של מטבוליטים מסיסים במים. שישית, השיטות הקיימות אינן יכולות להשתמש בסוג יחיד של עמודת LC כדי להיפרד זו מזו כולה או רוב הקטגוריות של מטבוליטים מסיסים במים.

כאן, אנו ממוטבים תנאים להרוות פעילות מטבולית בתוך תאי S. cerevisiae, שמירה על רוב מטבוליטים מסיסים במים בתוך תאים אלה לפני החילוץ, וחילוצת רוב המעמדות של מטבוליטים מסיסים במים מתאי שמרים. פיתחנו שיטה רב-תכליתית, חזקה ורגישה לזיהוי וכימות מבוססי LC-MS/MS של יותר מ-370 מטבוליטים מסיסים במים שחולצו מתאי S. cerevisiae. שיטה זו של מטבולומיה לא ממוקדת מאפשרת להעריך את הריכוזים התאיים של מולקולות נושאות אנרגיה שונות, נוקלאוטידים, חומצות אמינו, מונוסכרידים, מתווכים של גליקוליזה, ומתווכים מחזור tricarboxylic. שיטת LC-MS/MS המפותחת מאפשרת זיהוי וכימות של איסומרים מבניים שונים וצורות סטריאואימוזוריות של מטבוליטים מסיסים במים בעלי תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ביצוע וחיטוי מדיום לגידול שמרים

  1. הפוך 180 מ"ל של תמצית שמרים מלאה עם bactopeptone (YP) בינוני. מדיום YP המלא מכיל 1% (w/v) תמצית שמרים ו 2% (w/v) bactopeptone.
  2. יש לפזר 180 מ"ל של מדיום YP באופן שווה לארבעה בקבוקוני ארלנמאייר 250 מ"ל. כל אחד מהבקבוקונים האלה מכיל 45 מ"ל של מדיום YP.
  3. לחטא את הבקבוקונים עם YP בינוני על ידי autoclaving ב 15 psi / 121 °C (45 דקות).

2. זן שמרים מסוג בר

  1. השתמש בזן BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. גידול שמרים במדיום YP המכיל 2% גלוקוז

  1. לחטא 20% (w/v) פתרון מלאי של גלוקוז על ידי autoclaving ב 15 psi /121 °C (45 דקות).
  2. הוסף 5 מ"ל של תמיסת מלאי autoclaved 20% (w / v) של גלוקוז לכל אחד משני צלוחיות Erlenmeyer עם 45 מ"ל של מדיום YP מעוקר. הריכוז הסופי גלוקוז במדיום YP הוא 2% (w/v).
  3. השתמש בלולאה מיקרוביולוגית כדי לחסן תאי שמרים לתוך כל אחד משני צלוחיות Erlenmeyer עם מדיום YP המכיל 2% גלוקוז.
  4. לגדל את תאי שמרים לילה ב 30 °C (50 °F) בשייקר סיבוב להגדיר ב 200 סל"ד.
  5. קח aliquot של תרבות שמרים. לקבוע את המספר הכולל של תאי שמרים לכל mL של תרבית. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.

4. העברת תאים לתאים ולגידול במדיום YP עם 2% גלוקוז

  1. הוסף 5 מ"ל של פתרון מלאי מעוקר 20% (w / v) של גלוקוז לכל אחד משני צלוחיות Erlenmeyer הנותרות עם מדיום YP autoclaved. הריכוז הסופי של גלוקוז הוא 2% (w/v).
  2. העבר נפח של תרבית שמרים לילה במדיום YP עם 2% גלוקוז המכיל את המספר הכולל של 5.0 x 107 תאים לתוך כל אחד משני צלוחיות Erlenmeyer עם מדיום YP המכיל 2% גלוקוז. השתמש פיפטה סטרילית להעברת התא.
  3. לגדל את תאי שמרים לפחות 24 שעות (או יותר, אם הניסוי דורש) ב 30 °C בשייקר סיבוב להגדיר ב 200 סל"ד.

5. הכנת ריאגנטים, הכנת כלי מעבדה והגדרת ציוד להרוות תאים

  1. הכן את הדברים הבאים: 1) פתרון מרווה (60% ברמה גבוהה (>99.9%) מתנול ב 155 מ"מ אמוניום ביקרבונט (ABC) חוצץ, pH = 8.0); 2) פתרון ABC קר כקרח (pH = 8.0); 3) מדחום דיגיטלי המסוגל למדוד עד -20 °C (70 °F); 4) 500 מ"ל בקבוקי צנטריפוגה גדולים; 5) צנטריפוגה מקוררת מראש במהירות גבוהה עם רוטור מקורר מראש ובקבוקי צנטריפוגות מקוררים מראש של 500 מ"ל עבור רוטור זה, כולם ב -5 מעלות צלזיוס; 6) צינורות מיצוי מטבוליט (15 מ"ל צינורות צנטריפוגות זכוכית במהירות גבוהה עם כובעים מרופדים בפוליטרפלואורואתילן); ו -7) קרח יבש.

6. מרווה תאים

  1. השתמש hemocytometer כדי לקבוע את מספר תאי שמרים לכל mL של YP עם 2% תרבית גלוקוז.
  2. העבר נפח של התרבות במדיום YP עם 2% גלוקוז המכיל את המספר הכולל של 5.0 x 108 תאים לתוך בקבוקי צנטריפוגות 500 מ"ל מקוררים מראש.
  3. מלא במהירות את בקבוק הצנטריפוגה המכיל את התאים עד לנפח של 200 מ"ל עם פתרון מרווה המאוחסן ב -20 °C (50 °F).
  4. צנטריפוגות הבקבוקים בצנטריפוגה במהירות גבוהה ב 11,325 x גרם במשך 3 דקות ב -5 °C (5 °F).
  5. במהירות ובקינות לשחזר את הבקבוק מן הצנטריפוגה; פתחו בעדינות את המכסה והסירו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור.
  6. במהירות resuspend את גלולה התא ב 10 מ"ל של חוצץ ABC קר כקרח ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור צנטריפוגה זכוכית במהירות גבוהה 15 מ"ל עם כובע מצופה polytetrafluoroethylene להפקת מטבוליט.
  7. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה קלינית ב 3,000 x גרם במשך 3 דקות ב 0 °C (50 °F).
  8. במהירות להסיר את supernatant ומניחים את הצינור על קרח יבש כדי להתחיל חילוץ מטבוליט או לאחסן את הצינור ב -80 °C (70 °F) עד החילוץ.

7. הכנת ריאגנטים, כלי מעבדה וציוד להפקת מטבוליט

  1. הכן את הדברים הבאים: 1) כלורופורם כיתה LC-MS; 2) מתנול כיתה LC-MS; 3) מים ננו-טהורים בדרגת LC; 4) ציון LC-MS (ACN); 5) חרוזי זכוכית (שטף חומצה, 425-600 מיקרומטר); 6) מערבולת עם ערכת מחזיק צינור קצף עם שכר טרחה; 7) צינורות צנטריפוגות זכוכית במהירות גבוהה 15 מ"ל עם כובעים מצופים פוליטרפלואורואתילן; 8) בקבוקוני MS; 9) קרח יבש; ו 10) 1.5 mL צינורות שטף פעם אחת עם אתנול, פעם עם ACN ופעם אחת עם מים ננו טהורים.
    הערה: השתמש רק טיפים מיקרופיפט וצינורות עשוי פוליפרופילן כי הוא עמיד ממסים אורגניים.

8. מיצוי מטבוליט

  1. כדי מטבוליטים המשיך על קרח יבש או מאוחסן ב -80 °C צינור מ שלב 6.7, להוסיף את הדברים הבאים: 1) 2 מ"ל של כלורופורם מאוחסן ב -20 °C (7 °F); 2) 1 מ"ל של מתנול מאוחסן ב -20 °C (50 °F); 3) 1 מ"ל של מים ננו-טהורים קרים כקרח; ו-4) 200 μL של חרוזי זכוכית שטופי חומצה 425-600 מיקרומטר.
  2. לכסות ולסגור את הפה של צינור עם רדיד אלומיניום. מניחים צינורות בערכת מחזיק צינור קצף עם שכר טרחה ומערבולת אותם במשך 30 דקות במהירות בינונית (כלומר, במהירות שנקבעה על 6, עם 12 להיות המהירות המרבית של מערבולת) ב 4 °C כדי להקל על מיצוי מטבוליט.
  3. לדגור על הצינור במשך 15 דקות על קרח (לא קרח יבש!) כדי לקדם משקעים חלבון והפרדה של מימית העליונה מן השלב האורגני התחתון.
  4. צנטריפוגה הצינור בצנטריפוגה קלינית ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). שלב צנטריפוגה זה מאפשר הפרדת השלב המימי העליון (המכיל מטבוליטים מסיסים במים) מהשכבה האמצעית (המכילה פסולת תאים וחלבונים) ומהפאזה האורגנית התחתונה (המכילה בעיקר שומנים).
  5. השתמש micropipette כדי להעביר את השלב מימי העליון (400 μL) לשטוף ומסומן 1.5 מ"ל צינור המכיל 800 μL של ACN שאוחסן ב -20 °C (5 °F).
    הערה: יהיו משקעים בענן לבן לאחר הוספת השלב מימי העליון ACN נשמר ב -20 °C (50 °F).
  6. צנטריפוגות הצינור עם המדגם בצנטריפוגה שולחן ב 13,400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (50 °F).
    הערה: משקעי הענן הלבן ייעלמו לאחר צנטריפוגה.
  7. מעבירים 800 μL מהחלק העליון של נוזל בצינור למנתול MS שכותרתו. לאחסן את המדגם ב 0 °C (50 °F) עד שהוא מנותח על ידי LC-MS/MS.

9. הכנת ריאגנטים, כלי מעבדה וציוד ל-LC

  1. הכן את הדברים הבאים: 1) מערבולת; 2) סוניקטור קולי; 3) בקבוקוני זכוכית MS; 4) מערכת LC המצוידת במשאבה בינארית, בדגל ודגימה אוטומטית; 5) עמודת כרומטוגרפיה של שלב זויטרוני (פולימר 5 מיקרומטר, 150 x 2.1 מ"מ) הנקראת בטבלת החומרים; 6) תנור טורים; ו-7) שלבים ניידים, כולל שלב A (5:95 ACN:מים (v/v) עם אצטט אמוניום 20 מ"מ, pH = 8.0) ושלב B (100% ACN).

10. הפרדת מטבוליטים שחולצו על ידי LC

  1. נושא את התוכן של ביון MS sonication קולי במשך 15 דקות.
  2. מערבולת את מקטורן MS 3x למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. מניחים את מקטורן ה- MS לתוך צלחת הבאר.
  4. במהלך הכרומטוגרפיה, לשמור על העמודה ב 45 °C (5 °F) וקצב זרימה של 0.250 מ"ל / דקה. שמור את המדגם בצלחת הבאר ב 0 °C (50 °F). עיין בטבלה 1 עבור מעברי הצבע LC שיש להשתמש בהם במהלך הכרומטוגרפיה.
    הערה: כרומטוגרמה כוללת מייצגת של מטבוליטים מסיסים במים שחולצו מתאי זן מסוג בר BY4742 מוצגת באיור 1. המטבוליטים המופרדים על-ידי LC זוהו וכימתו על-ידי ניתוח ספקטרומטרי מסה שבוצע במצב יינון חיובי [ESI (+)], כמתואר לשלב 11.

11. ניתוח ספקטרומטרי מסה של מטבוליטים המופרדים על ידי LC

  1. השתמש בספקטרומטר מסה המצויד ביינון אלקטרוספרי מחומם (HESI) לזיהוי וכמות של מטבוליטים מסיסים במים שהופרדו על ידי LC. השתמש מנתח ספקטרומטר המסה עבור יונים MS1 וגלאי ספקטרומטר המסה ליוני MS2. השתמש בהגדרות שסופקו בטבלה 2 ובטבלה 3 עבור הרכישה תלוית הנתונים של יונים תלויי נתונים של MS1 ו- MS2, בהתאמה.
  2. השתמש באמצעי אחסון לדוגמה של 10 μL עבור ההזרקה הן במצב ESI (+) והן במצב ESI (-).

12. זיהוי וכמות של מטבוליטים שונים על ידי עיבוד נתונים גולמיים מ- LC-MS / MS

  1. השתמש בתוכנה בשם בטבלת החומרים כדי לבצע זיהוי וכמות של מטבוליטים שונים מסיסים במים מקבצי LC-MS/MS גולמיים. תוכנה זו משתמשת MS1 עבור כמות מטבוליט ו- MS2 לזיהוי מטבוליט. התוכנה מנצלת את ספריית הפיצול הספקטרלית ההמונית הנרחבת ביותר כדי לבאר את המטבוליטים באמצעות הנתונים הגולמיים של LC-MS/MS על-ידי התאמת ספקטרום MS. תוכנה זו משתמשת גם במסה המדויקת של MS1 ולהתאים דפוס איזוטופ כדי ביאור מטבוליטים באמצעות מסדי נתונים מקוונים. ראו איור 2 לקבלת פרטים.
  2. השתמש בספרייה של מסדי נתונים וספקטרום, אשר זמין באופן חופשי באינטרנט (https://www.mzcloud.org), כדי לחפש ספקטרום MS2 של הנתונים הגולמיים.

13. בדיקת תקינות הממברנה על ידי פרופיליום יודיד (PI) כתמים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית

  1. לאחר מרווה תא המבוצע כמתואר לשלב 6, לשטוף את התאים מרווים ביסודיות עם 15 מ"ל של מאגר ABC כדי להסיר את הפתרון מרווה. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות ב 0 °C (5 °F).
  2. resuspend הכדור התא ב 1 מ"ל של חוצץ ABC ולהוסיף 0.5 מ"ל של פתרון PI (0.5 מ"ג / מ"ל).
  3. מערבולת צינור עם המדגם 3x עבור 10 s ודגרה אותו במשך 10 דקות בחושך על קרח.
  4. צנטריפוגות הצינור עם המדגם בצנטריפוגה שולחן ב 13,400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (50 °F).
  5. הסר את supernatant ו resuspend הכדור ב 1 מ"ל של חוצץ ABC.
  6. צנטריפוגות הצינור ב 13,400 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F) ולהסיר את supernatant. חזור על שלב זה 2 פעמים נוספות כדי להסיר את ה- PI המאוגד למשטח התא.
  7. resuspend הכדור ב 300 μL של חוצץ ABC. מקם 10 μL של ההשעיה על פני השטח של שקופית מיקרוסקופ.
  8. לכוד את ניגודיות ההפרעה הדיפרנציאלית (DIC) ותמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש במסנן שהוגדר לאורכי גל עירור ופליטה של 593 ננומטר ו- 636 ננומטר (בהתאמה).
  9. השתמש בתוכנה כדי לספור את מספר התא הכולל (במצב DIC) ואת מספר התאים המוכתמים בפלואורסצנטיות. כמו כן, השתמש בתוכנה זו כדי לקבוע את עוצמת הכתמים עבור תאים בודדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לשפר את ההערכה הכמותית של מטבוליטים מסיסים במים בתוך תא שמרים, מיטבנו את התנאים של מרווה תאים לגילוי מטבוליטים. מרווה תאים למטרה זו כרוך במעצר מהיר של כל התגובות אנזימטיות בתוך תא31,33,37,38. מעצר כזה של פעילות מטבולית תאית הוא צעד חיוני של כל שיטה לכמות של מטבוליטים מסיסים במים ב vivo כי זה מונע את ההערכה התת-הערכתית של הריכוזים התאיים שלהם31,33,37,38. מרווה תאים להערכת מטבוליט תמיד פוגע בשלמות קרום הפלזמה (PM) (ושל דופן התא (CW), אם קיים); זה גורם לדליפת מטבוליט מהתא31,33,37,38. השיטה משתמשת בתנאי מרווה תאים הממזערים ליקוי כזה, ובכך מפחיתה באופן משמעותי את דליפת התא הקשורים מרווה של מטבוליטים תאיים. ואכן, רוב השיטות הנוכחיות להרוות תאים כרוכות בשימוש בריכוז מסוים של מתנול (כלומר, 40% (v/v), 60% (v/v), 80% (v/v), או 100% (v/v)) בטמפרטורה ספציפית (כלומר, -20 °C,40 °C (60 °F), עם או בלי חיץ31,33,37,38. השווינו את היעילות של ליקוי PM ו- CW עבור אחת משיטת מרווה התאים הנמצאת בשימוש הנוכחי (כלומר, על ידי טיפול בתא עם 80% (v/ v) מתנול ב -40 °C בהיעדר מאגר38) לזה עבור שיטת מרווה התאים שהשתנתה (כלומר, על ידי טיפול בתא עם 60% (v/ v) מתנול ב -20 °C בנוכחות פתרון איזוטוני חוצץ של ABC ב- pH = 8.0). PI הוא צבע פלואורסצנטי שאינו חדיר לתאים שלמים; זה יכול להיכנס לתא רק אם השלמות של ראש הממשלה (ושל CW, אם קיים) פגום39. יתר על כן, עוצמת פליטת הפלואורסצנטיות על ידי PI עולה פי 30 כאשר היא קשורה ל- DNA או RNA39. לכן, PI כתמים assay יכול לשמש להערכת היעילות של דליפת תאים הקשורים מרווה של מטבוליטים תאיים כי מטבוליטים אלה יכולים לדלוף לתוך החלל החוץ תאי רק אם ראש הממשלה ו CW של תא שמריםניזוקו 39. מצאנו כי שיטת מרווה התאים שהשתנתה גורמת לנזק נמוך משמעותית לראש הממשלה ול- CW מאשר שיטת ההרוואות על ידי טיפול בתא עם מתנול שאינו חוצץ 80% (v / v) ב - 40 °C(איור 3). ואכן, כמעט כל התאים שהיו נתונים להרוות בשיטה הציגו פליטת פלואורסצנטיות אדומה, המאפיינת את תאי השמרים שראש הממשלה ו-CW שלהם אינם ניזוקו(איור 3). לעומת זאת, כמעט כל התאים שנחשפו להרוות בשיטה האחרת, הציגו פליטת פלואורסצנטיות ירוקה האופיינית לתאי השמרים שראש הממשלה ו-CW שלהם נפגעים באופן משמעותי(איור 3). הפלואורסצנטיות האדומה האינטנסיבית ביותר הומרה לפלורסצנטיות ירוקה על ידי תוכנה כדי להבדיל בין הפלואורסצנטיות האדומה החזקה לבין פליטות פלואורסצנטיות אדומות קלות.

שיטת מרווה התאים שהשתנתה גרמה לדליפת מטבוליטים מסיסים במים מתאי שמרים מאשר שיטת מרווה על ידי טיפול בתא עם מתנול שאינו חוצץ של 80% (v/v) ב - 40 מעלות צלזיוס. אנו נתונים מספרים שווים של תאי שמרים להרוות באמצעות או השיטה (כלומר, על ידי טיפול בתא עם 60% (v / v) מתנול ב -20 °C בנוכחות פתרון איזוטוני חוצץ של ABC ב- pH = 8.0; איור 4) או השיטה האחרת (כלומר, על ידי טיפול בתא עם מתנול שאינו חוצץ 80% (v/v) ב -40 °C;; איור 5). היקף דליפת התא הקשורים מרווה לתוך הפתרון החוץ תאי הוערך עבור מטבוליטים ספציפיים מסיסים במים בעזרת LC-MS/ MS. הריכוזים של חומצות אמינו שונות (כלומר, חומציות גדולות וקטנות, בסיסיות, נייטרליות-קוטביות וחומצות אמינו קוטביות נייטרליות) בתמיסה החוץ-תאית נמדדו לפני ואחרי מרווה תאים. גילינו ששיטת מרווה התאים גורמת לדליפת חומצות אמינו נמוכה משמעותית מכל מחלקות חומצות האמינו הללו לתמיסה החוץ-תאית (איור 4) מאשר השיטה האחרת (איור 5).

שיטת LC-MS/MS להערכה כמותית של מטבוליטים מסיסים במים בתוך תא שמרים משתמשת בסוג יחיד של העמודה להפרדה כרומטוגרפית של כל מחלקות המטבוליט המסיסות במים. עמודה זו היא העמודה zwitterionic-phase בשם בטבלה של חומרים. מצאנו כי עמודה זו מספקת הפרדה יעילה בהרבה בין סוגים שונים של מטבוליטים מסיסים במים מאשר העמודה ההפוכה הנקראת בטבלה של חומרים ( טבלהמשלימה 1). ואכן, זמן השמירה (RT) הסטת ערכים של תקני מטבוליט מסיסים במים (כלומר, NAD +, AMP, GMP, ארגינין וחומצה גלוטמית) היו נמוכים משמעותית וצורות השיא היו חדות משמעותית עבור עמודת השלב הזויטרוני, בהשוואה לעמודה ההפוכה(טבלה משלימה 1). תנאי LC המשמשים להפרדה כרומטוגרפית של כל המטבוליטים (כלומר, מסיסים במים וניתנים מסיסים למים) עבור העמודה בשלב ההפוך מסופקים בטבלה משלימה 2.

יתרון נוסף של שיטת LC-MS/MS מורכב ביכולת ההפרדה הכרומטוגרפית בעמודה של השלב הזויטרוני לעיל להפריד ביעילות זה מזה מטבוליטים שונים מסיסים במים עם תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות. מטבוליטים מסיסים במים אלה כוללים את שיעורי המטבוליט הבאים: 1) חומציות, בסיסיות, נייטרליות של חומצות אמינו קוטביות ולא נייטרליות, כולל האיסומרים המבניים השונים שלהם (איור 6); 2) נוקלאוטידים יציבים ולא יציבים והנגזרים שלהם המבצעים תפקידים חיוניים בתוך התא (איור 7); ו-3) מונו-סכרידים שונים, כולל הצורות הסטריאוטיומיות השונות שלהם(איור 8).

חשוב לציין, שיטת LC-MS/MS להערכה כמותית של מטבוליטים מסיסים במים בתוך תא שמרים הייתה רב-תכליתית וחזקה. זה איפשר לנו לזהות ולכומת 374 מטבוליטים מסיסים במים עם תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות בתאי S. cerevisiae שתרבו במדיום YP השלם שהכיל בתחילה 2% גלוקוז (טבלה משלימה 3). 240 מטבוליטים זוהו במצב יינון חיובי ו 134 מטבוליטים זוהו במצב יינון שלילי. הזהויות של כל המטבוליטים המסיסים במים האלה אושרו על ידי התאמת שברי MS2 הרכישה תלויי הנתונים שלהם (DDA) שנרכשו הן במצבי היוניזציה החיוביים והן במצבי היונים השליליים לספרייה הספקטרלית MS2 mzCloud. ספריה מקוונת זו כוללת את הספקטרום של תקני מטבוליטים השונים בפרמטרים MS1 ו- DDA MS2 שלהם. כדי למקסם את מידת התאמת ספקטרום MS2 של המדגם לספרייה הספקטרלית המקוונת, השתמשנו בפרמטרים שונים של DDA MS2. פרמטרים אלה מסופקים בטבלה משלימה 4. כמעט 6,000 תכונות (מטבוליטים putative) עבור אותה מדגם נרכשו בעזרת שיתוף התנגשות-אנרגיה גבוהה (HCD) או דיסקט פיצול המושרה התנגשות (CID), באמצעות 5 אירועי MS2 העליון, ערכי אנרגיית התנגשות 35 וזמני הפעלה של 10 אלפיות שניים. לאחר סינון הקבצים המתקבלים עם התאמת MS2 > 95% ו- > 90% MS1 תבנית איזוטופית תואמת קריטריונים, רק 162 מטבוליטים במצב מקוטע HCD ו 142 מטבוליטים במצב מקוטע CID זוהו. 81 מתוך 162 מטבוליטים היו ייחודיים לשיטת הפיצול של HCD, בעוד ש-42 מתוך 142 היו ייחודיים לשיטת הפיצול של CID (ראו גיליון בשם "T5_35E__10 ms_HCD לעומת CID" בטבלה משלימה 4). לכן, הגענו למסקנה כי הביאורים הנכונים של מטבוליטים מסיסים במים בעזרת שיטת LC-MS / MS דורש שימוש בפרמטרים רבים ושונים DDA MS2.

שיטת LC-MS/MS היא גם רגישה מאוד. זה מאפשר לזהות וכמות כמה מטבוליטים מסיסים במים בריכוזים נמוכים ככל 0.05 pmol / μL (ראה נתונים עבור פנילאלנין בטבלה 4). מגבלה זו של כמות משתנה בתוך מגוון רחב של ריכוזים עבור מחלקות מטבוליט שונות (טבלה 4).

מערכת הטרשת הנפוצה המשמשת כאן כוללת טווח דינמי ליניארי רחב (לפחות שני סדרי גודל) למדידת הריכוזים של מטבוליטים שונים (טבלה משלימה 5).

Figure 1
איור 1: סך כל כרומטוגרמת היונים (TIC) מנתוני כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה (LC-MS) של מטבוליטים מסיסים במים שחולצו מתאי זן מסוג בר BY4742. המטבוליטים הופרדו על ידי LC בעמודת הכרומטוגרפיה של השלב הזוויטרוני בשם בטבלת החומרים. המטבוליטים זוהו על ידי טר-בינו של יונים אב (MS1) שנוצרו באמצעות מצב יינון אלקטרוספריי חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זרימת עבודה המשמשת לניתוח מטבוליטים מסיסים במים בעזרת התוכנה הנקראת בטבלת החומרים. כל הפרמטרים וטוחו אוטומטית על ידי התוכנה בהתבסס על הנתונים הגולמיים של MS, למעט הדברים הבאים: 1) הכרטיסיה "זיהוי תרכובות": מוגדר דקות, עוצמת שיא 10,000; ו-2) לשונית "חיפוש ChemSpider": 4 מסדי נתונים מקוונים נבחרו לזיהוי מטבוליטים, כולל מסד הנתונים של הביו-מחזור, מטבולום אנושי, KEGG ומסד נתונים של מטבולום שמרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC; שורה עליונה) ופלואורסצנטיות (שורה תחתונה) תמונות מיקרוסקופיות של תאי שמרים מרווים עם חיץ אמוניום ביקרבונט (ABC) (pH = 8.0; בקרה) או עם פתרון מרווה שונה. לאחר מרווה תאים, מספר שווה של תאים היו דגירה עם פתרון PI במשך 10 דקות בחושך ועל קרח. הפלואורסצנטיות האדומה האינטנסיבית ביותר הומרה לפלואורסצנטיות ירוקה על ידי תוכנה כדי להבדיל בין הפלואורסצנטיות האדומה החזקה לבין פליטות פלואורסצנטיות אדומות קלות. היעילות של נזק לראש הממשלה ו CW הושוותה עבור השיטה של מרווה תאים (כלומר, על ידי טיפול בתא עם 60% (v / v) מתנול ב -20 °C בנוכחות פתרון איזוטוני חוצץ של ABC ב- pH = 8.0) ואחת השיטות הנפוצות כיום (כלומר, על ידי טיפול בתא עם 80% (v / v) מתנול ב -40 °C בהיעדר חיץ). מוצג סרגל קנה מידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אחוז הדליפה של מחלקות חומצות אמינו שונות לשיטת מרווה תאים. 5.0 x 108 של תאי שמרים היו נתונים להרוות על ידי הטיפול עם 60% (v/ v) מתנול ב -20 °C בנוכחות פתרון איזוטוני חוצץ של ABC ב pH = 8.0. אחוז הדליפה של מחלקות חומצות אמינו שונות הוערך באמצעות LC-MS/MS כדי למדוד את הריכוזים שלהם בתמיסה חוץ תאית לפני ואחרי מרווה. הערכים הממוצעים ± SD ונקודות נתונים בודדות מוצגים (n = 3). * p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: אחוז הדליפה של מחלקות חומצות אמינו שונות עבור אחת משיטות מרווה התאים הנמצאות בשימוש כיום. 5.0 x 108 של תאי שמרים היו נתונים להרוות על ידי הטיפול עם 80% (v / v) מתנול ב -40 °C בהיעדר חיץ. אחוז הדליפה של מחלקות חומצות אמינו שונות הוערך באמצעות LC-MS/MS כדי למדוד את הריכוזים שלהם בתמיסה חוץ תאית לפני ואחרי מרווה. הערכים הממוצעים ± SD ונקודות נתונים בודדות מוצגים (n = 3). * p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הפרדה כרומטוגרפית יעילה של חומציות, בסיסיות, נייטרליות בקטבים ובשיעורי חומצות אמינו קוטביות לא נייטרליות, כולל שני איזומרים מבניים (כלומר, לאוצין ואיסולוצין), בעמודת השלב הזוויטרוני הנקראת בטבלת החומרים. כל חומצות האמינו האלה זוהו על ידי MS/MS במצב יינון חיובי [ESI (+)]. התנאים עבור LC בעמודה כרומטוגרפיה של השלב zwitterionic מתוארים בטבלה 1. התנאים עבור MS/MS מתוארים בטבלה 2 ובטבלה 3. כל תקני חומצות האמינו נקנים מסחרית (למשל, סיגמא). זמן השמירה משתנה בין 3 ריצות כרומטוגרפיה עצמאיות הן פחות מ-± 10 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: הפרדה כרומטוגרפית יעילה של סוגים שונים של נוקלאוטידים, כולל נוקלאוטידים לא יציבים אנרגטית (מונופוספטים נוקלאוזידים, דיפוספטים נוקלאוזידים וטריפוספטים נוקלאוזידים) ומולקולות נושאות אלקטרונים (NADH ו-NAD+), בעמודת הפאזה הזוויטרוניתהנקראת בטבלת החומרים. כל הנוקלאוטידים האלה זוהו על-ידי MS/MS במצב יינון חיובי [ESI (+)]. התנאים עבור LC בעמודה כרומטוגרפיה של השלב zwitterionic מתוארים בטבלה 1. התנאים עבור MS/MS מתוארים בטבלה 2 ובטבלה 3. כל תקני הנוקלאוטידים נקנים מסחרית (למשל, סיגמא). זמן השמירה משתנה בין 3 ריצות כרומטוגרפיה עצמאיות הן פחות מ-± 10 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: הפרדה כרומטוגרפית יעילה של סוגים שונים של מונו-סוכרידים, כולל איזומרים מבניים וצורות סטריאואיזומטריות של אלדו וקטוהקסוז (פרוקטוז, מנוז וגלקטוז), ואלדופנטוזים (ריבוז וערבינוס), על עמודת השלבים הזויטרונייםהנקראת בטבלת החומרים. כל המונו-סכרידים האלה זוהו על-ידי MS/MS במצב יינון חיובי [ESI (+)]. התנאים עבור LC בעמודה כרומטוגרפיה של השלב zwitterionic מתוארים בטבלה 1. התנאים עבור MS/MS מתוארים בטבלה 2 ובטבלה 3. כל הסטנדרטים המונו-סכרידים נקנים מסחרית (למשל, סיגמא). זמן השמירה משתנה בין 3 ריצות כרומטוגרפיה עצמאיות הן פחות מ-± 10 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סוג עמודה סקוואנט ZIC-pHILIC פולימר 5μm 150 x 2.1 מ"מ
ממס A LC-MS כיתה H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM אמוניום אצטט
ממס B LC-MS כיתה Acetonitrile (ACN)
מגבלת לחץ מקסימום = 300 בר מינימום = 0
תוכנית מעבר צבע של HPLC
שעה (דקות) קצב זרימה (0.25 מיליליטר/דקה) יצירות
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

טבלה 1: מצב LC המשמש להפרדה של מטבוליטים מסיסים במים בעזרת עמודת השלב zwitterionicבשם בטבלת החומרים. תנאים אלה שימשו בכל הניסויים המתוארים כאן.

טווח מסת סריקה מלא (דלטון) 70-900
רזולוציית סריקה מלאה של FTMS (Orbitrap) 6.0 x 104
רזולוציית HCD של FTMS (מנתח Orbitrap) 7500
יעד AGC סריקה מלאה של FTMS 1.0 x 106
יעד MSn AGC של FTMS 5.0 x 104
מלכודת יון (LTQ) MSn AGC target 1.0 x 104
סוג מקור יון יינון אלקטרוספרי מחומם
טמפרטורת נימי (°C) 275
טמפרטורת תנור מקור (°C) 250
זרימת גז נדן 10
זרימת גז Aux 5

טבלה 2: הגדרות ספקטרומטר המסה המשמשות לניתוח מטבוליטים שהופרדו באמצעות LC. תנאים אלה שימשו לניתוח מטבוליטים בכל הניסויים המתוארים כאן. קיצורים: FTMS = המרת פורייה (FTMS); HCD = התנגשות-דיסוציאציה-התנגשות-אנרגיה גבוהה; LTQ = טרקטורופ מלכודת ליניארי; AGC = בקרת רווח אוטומטית, ערך אוכלוסיה יונים עבור MS ו- MS/MS.

קוטביות מכשירים חיובי/שלילי
סוג הפעלה CID/HCD
נדרש אות מיני 5000
רוחב בידוד 2
אנרגיות התנגשות מנורמלות עבור CID 35, 60
אנרגיות התנגשות מנורמלות עבור HCD 35, 45, 55
מצב חיוב המהווה ברירת מחדל 1
זמן הפעלה עבור CID (ms) 10, 30
זמן הפעלה עבור HCD (ms) 10
מספר אירועי MS/MS ב-CID למעלה 3, למעלה 5, העליון 10
מספר אירועי MS/MS ב- HCD 5 המובילים
מספר סריקות מיקרו המשמשות הן ב- HCD והן ב- CID 1

טבלה 3: הגדרות ספקטרומטר המסה המשמשות לזיהוי יונים משניים (MS2). קיצורים: HCD = התנגשות-התנגשות-ניתוק-אנרגיה גבוהה; CID = התנגשות המושרה דיסוציאציה; ms = אלפיות שניה.

מטבוליטים מסוג Std M.W. (g/mole) [M+H]+1 [מ-ה]-1 מצב זיהוי הריכוז הנמוך ביותר שזוהה (pmol/μL)
גליצין 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
טריפטופן 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
פנילאלנין 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
ארגינין 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
ת'רון* 119.05824 120.06552 118.05096 P
סרין 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
גלוטמט 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
מתיונין 149.05105 150.05833 148.04377 P 1.96E+00
אספרטיאט 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E+00
valine 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
איזולאוצין 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E+00
לאוצין 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E+00
היסטידין 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E+00
טירוזין 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
ליזין 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
אלנין 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
פרולין 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E+00
ציסטאין 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
אספרגין 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E+00
גלוטמין 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
גואנין 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E+00
גואנוסין 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
תמ"ג 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57E+00
GTP 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
המגבר 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E+00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
גלוקוז** 180.06339 181.07067 179.05611
פרוקטוז*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
מנוז*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E+00
גלקטוז*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
ריבוז*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
arabinose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E+00
פרוקטוז-6-פוספט*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
גלוקוז-6-פוספט*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E+00
חומצת לימון 192.12 גרם 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
חומצה מאלית 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E+00
חומצה פירווית 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77E+00

טבלה 4:הריכוזים הנמוכים ביותר של תקני מטבוליט שונים מסיסים במים ששיטת LC-MS/MS יכולה לזהות וכמות. אזור השיא MS1 של כל תקן מטבוליט שימש להערכת הריכוז הנמוך ביותר לכימות עבור מטבוליט זה. מוצגים ערכים ממוצעים של שני ניסויים עצמאיים. שלושה שכפולים טכניים בוצעו עבור כל אחד משני הניסויים העצמאיים. הערה: Threonine * ניתן לזהות אבל לא ניתן לכמת בשל שיתוף שלו elution עם homoserine, איזומר כימי של threonine. לא ניתן לזהות גלוקוז** מכיוון שהוא יוצר פסגות כרומטוגרפיות מרובות. תקני מטבוליט*** ניתן לזהות וכמות רק בדגימות בודדות, אבל לא בתערובת של תקני מטבוליט או תערובת ביולוגית של מטבוליטים.

טבלה משלימה 1: זמן שמירה (RT) הסטת ערכים של אותה קבוצה של מטבוליטים עבור עמודות זויטריונית-פאזה והפיז'ן (ראה טבלת חומרים) לאחר שיווי משקל עמודות. הטבלה משווה את יכולת הרבייה של העמודות שלב zwitterionic-פאזה הפוכה עבור קבוצה ברורה של מטבוליטים שונים זה מזה ההידרופיליות וההידרופוביה שלהם. מטבוליטים אלה זוהו בעזרת LC-MS/MS. שים לב כי ערכי הסטת RT של מטבוליטים הידרופיליים (כלומר, NAD+, AMP, GMP, ארגינין וחומצה גלוטמית) נמוכים משמעותית וצורות השיא חדות משמעותית עבור עמודת השלב הזוויטרוני, בהשוואה לעמודה בשלב ההפוך. לעומת זאת, ערכי הסטת RT של מטבוליטים הידרופוביים (כלומר, חומצה סטארית, חומצה לאורית וחומצה דקאנואית) נמוכים משמעותית וצורות השיא חדות משמעותית עבור עמודת השלב ההפוך, בהשוואה לעמודת הפאזה הזויטרונית. התנאים להפרדה כרומטוגרפית של מטבוליטים בעזרת העמודות שלב zwitterionic-פאזה הפוכה מפורטים בטבלה 1 בטבלה משלימה 2, בהתאמה. הערכים המדווחים כאן RT shift מבוססים על מדידה של 20 דגימות שונות שנלקחו מבקבוקונים שונים. הדגימות נותחו לאחר שאיון העמודות. המטבוליטים בכל דגימה חולצו מ 5.0 × 108 תאי שמרים. ערכי הזזת RT הם האמצעים של 20 דוגמאות שונות (n = 20). ערכי ה- p הנגזרים מבדיקת t שלא נוספה שימשו כדי להשוות את שתי העמודות לשונות השווה בין שני סוגי המדגם. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 2: תנאי LC עבור עמודה 8 שלב הפוך בשם בטבלת החומרים ומשמש להפרדת מטבוליטים שונים במחקר זה. מאפייני העמודה היו כדלקמן: 150 x 2.1 מ"מ, 5 מיקרומטר פולימר. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 3: רשימה של כל 374 המטבוליטים המסיסים במים התאוששו וביאורים באמצעות שיטת LC-MS/MS. כל המטבוליטים נמצאו מאותה הפעלת מעבר צבע של LC, נתונים לאלגוריתם פיצול רכישה תלוי נתונים (DDA) המתואר בטבלה משלימה 4, ונוארו באמצעות התוכנה הנקראת בטבלה של חומרים. צורות השיא של MS1 של 211 מטבוליטים (שמצבם בטבלה מצוין כרקה) היו מתאימות לכימות, ולספקטרום MS2 בהתאמה היו התאמות מלאות עם הספריה הספקטרלית של mzCloud. ספקטרום MS2 של 38 מטבוליטים (שמצבם בטבלה מצוין כ- d) היה התאמות מלאות עם הספרייה הספקטרלית המקוונת. ובכל זאת, צורות השיא של MS1 שלהם לא היו מתאימות לשימוש לכימות. ספקטרום MS2 של 125 מטבוליטים (שמצבם בטבלה מצוין כ- n) לא היה התאמות מלאות עם הספריה הספקטרלית המקוונת. מטבוליטים אלה היו ביאורים כדלקמן: 1) באמצעות "צומת הרכב חיזוי" (אשר ביאורים מטבוליטים בהתבסס על ההתאמה המדויקת של ערכי MS1, מספר איזוטופים תואמים והוחמצו, ואיזוטופ % אינטנסיביות תואמת לזה של תקני הייחוס התיאורטיים); 2) באמצעות "צומת ChemSpider" (אשר ביאורים מטבוליטים בהתבסס על ההתאמה המדויקת של ערכי MS1 וציון התאמת דמיון של ספקטרום MS2 עם הספרייה הספקטרלית המקוונת); ו 3) באמצעות זמן השמירה (RT) לשנות ערכים של מטבוליטים (ערכים אלה תלויים במבנה הפיזי ואת המאפיינים הכימיים של מטבוליטים). המטבוליטים המפורטים בטבלה נמצאו בכל 3 המשכפלים הביולוגיים שבוצעו, עם ערכי משמרת RT של < 0.2 דקות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 4: אלגוריתם פיצול רכישה תלוי נתונים (DDA) ששימש כאן לבאור של מטבוליטים מסיסים במים בעזרת התוכנה הנקראת בטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 5: טווח דינמי ליניארי טיפוסי שראינו כאשר מדדנו את הריכוזים של חומצות אמינו שונות בעזרת מערכת MS בשם בטבלת החומרים. מערכת הטרשת הנפוצה המשמשת כאן כוללת טווח דינמי ליניארי רחב (לפחות שני סדרי גודל) למדידת ריכוזי מטבוליטים שונים. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להשתמש בהצלחה בפרוטוקול המתואר כאן, בצע את אמצעי המניעה המתוארים להלן. כלורופורם ומתנול לחלץ חומרים שונים מכלי פלסטיק במעבדה. לכן, לטפל בהם בזהירות. הימנע משימוש בפלסטיק בשלבים הכרוכים במגע עם כל אחד משני הממיסים האורגניים האלה. השתמש פיפטות זכוכית borosilicate עבור שלבים אלה. העלו את הפיפטות האלה עם כלורופורם ומתנול לפני השימוש. השתמש רק טיפים מיקרופיפט וצינורות עשוי פוליפרופילן כי הוא עמיד ממסים אורגניים. במהלך הכנה מדגם עבור LC-MS / MS, לחסל את כל בועות האוויר בבקבוקונים זכוכית לפני החדרת אותם לתוך אטב.

עמודת השלב zwitterionic המשמשת כאן דורשת מיזוג מחדש נרחב לאחר כל ריצה כדי למזער את משמרת RT. עבור מיזוג מחדש של עמודות, אנו ממליצים להשתמש באמצעי אחסון של פתרון המיזוג מחדש שהוא כ- 20 אמצעי אחסון של העמודה. העמודה צריכה להיות מותנית מחדש עם השלב הנייד הראשוני במשך 15 דקות בקצב זרימה מוגבר של 0.4 מ"ל / דקה. כדי למנוע נזק לעמודה במהלך ההתניה מחדש שלה, שמור את לחץ העמודה מתחת לגבול העליון של הלחץ המומלץ על ידי היצרן.

שימו לב, כמה עמודות כרומטוגרפיה בהפרדה מעורבת הפועלות במצב פאזה הפוכה מאפשרות רזולוציה של מטבוליטיםטעונים 40,41. עמודות הפרדה מעורבים אלה מבוססות על העמודה ההפוכה המשמשת כאן (ראה טבלת חומרים) ומכילים קבוצות מוטבעות קוטביות שיכולות להפריד מטבוליטים בהתבסס על מטען40,41.

כאן, תיארנו שיטה מבוססת LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת לניתוח כמותי של מטבוליטים מסיסים במים רבים המופקים מתאי שמרים. השיטה מספקת מספר יתרונות על פני שיטות LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת המשמשת כיום למטרה זו. יתרונות אלה כוללים את היתרונות הבאים. ראשית, השיטה רגישה ומאפשרת זיהוי וכמות של כמה מטבוליטים מסיסים במים בריכוזים נמוכים ככל 0.05 pmol / μL. הרגישות המדווחת של שיטות LC-MS/MS הקיימות נמוכה יותר3,22,27,42. שנית, השיטה משתמשת בהליך מרווה תא המעורר דליפה נמוכה משמעותית של מטבוליטים תאיים מהתא מאשר זה שדווח עבור ההליכים הנמצאים בשימוש הנוכחי31,33,38. לכן, ההליך שפיתחנו עבור מרווה תאים מוריד את המידה שבה ההליכים המשמשים כיום מתחת להעריך את הריכוזים התאיים של מטבוליטים מסיסים במים. שלישית, שלא כמו שיטות LC-MS/MS הקיימות2,31,33, השיטה מבחינה בין isomers מבניים שונים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים רבים. מטבוליטים אלה כוללים מולקולות נושאות אנרגיה שונות, נוקלאוטידים, חומצות אמינו, מונוסכרידים, מתווכים של גליקוליזה, ומתווכים מחזור tricarboxylic. רביעית, השתמשנו בשיטה כדי ליצור מסד נתונים ספקטרלי המוני נרחב של MS1 ו- MS2 לזיהוי נכון וכמות של מגוון רחב של מטבוליטים ספציפיים באמצעות נתוני LC-MS / MS גולמיים. לעומת זאת, מסדי הנתונים המקוונים הספקטרליים ההמוניים הקיימים של MS1 ו- MS2 אינם שלמים43,44,45. החמישית, השיטה משתמשת בסוג יחיד של מיצוי מטבוליט כדי לשחזר מטבוליטים מסיסים במים עם תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות. המגוון של מטבוליטים אלה עולה באופן משמעותי על זה של שיטות חלופיות להפקה חד-שלבית של מטבוליטים מסיסים במים מתאי שמרים3,22,27,46. שש, בניגוד לשיטות הקיימות של LC-MS/MS3,22,47,48, השיטה משתמשת בסוג יחיד של עמודת LC כדי להפריד זה מזה סוגים מבניים ותפקודיים שונים של מטבוליטים מסיסים במים. שבע, השיטה מאפשרת זיהוי וכימות של יותר מ -370 מטבוליטים מסיסים במים המופקים מתאי שמרים. מספר זה של מטבוליטים הניתנים לזיהוי וכמת עולה על מספר המטבוליטים המדווחים עבור שיטות אחרות של מטבולומיה לא ממוקדת בשמרים3,22,27,49,50.

לשיטה יש מספר מגבלות. מגבלות אלה הן כדלקמן. עמודת השלב zwitterionic המשמשת להפרדת מטבוליט על ידי LC דורשת מיזוג מחדש נרחב לאחר כל ריצה. יתר על כן, השיטה יעילה רק עבור מטבולומיה לא ממוקדת של מטבוליטים מסיסים במים, הידרופילי. יתר על כן, צורות isomeric שונים של פחמימות (כולל isomers של פרוקטוז, גלוקוז, גלקטוז) לא ניתן לכמת בעזרת השיטה. הסיבה לכך היא כי הטור zwitterionic-שלב המשמש בשיטה לא יכול להפריד את זה פחמימות isomers אחד מהשני כאשר נוכח בתערובת עם מטבוליטים אחרים. חוץ מזה, לא ניתן לנצל את השיטה לזיהוי גלוקוז מכיוון שפחמימות אלה יוצרות פסגות מרובות במהלך הכרומטוגרפיה בעמודת השלב הזוויטרוני המשמש בשיטה. לבסוף, threonine לא ניתן לכמת בעזרת השיטה בשל שיתוף elution של חומצת אמינו זו עם איזומר הומוסרין שלה במהלך הפרדת מטבוליט על ידי כרומטוגרפיה.

אנו משתמשים בשיטת LC-MS/MS זו כדי לחקור שינויים הקשורים להזדקנות במטבולום מסיס במים של שמרים ניצנים S. cerevisiae. אנו משתמשים בשיטה זו גם כדי לחקור כמה התערבויות גנטיות, תזונתיות ופרמקולוגיות מעכבות הזדקנות משפיעות על חילוף החומרים המסיס במים של תאי שמרים במהלך ההזדקנות הכרונולוגית שלהם. בשל הרבגוניות, החוסן והרגישות שלה, ניתן להשתמש בהצלחה בשיטת LC-MS/MS להערכה כמותית של מטבולום מסיס במים באורגניזמים אאוקריוטים מרוחקים מבחינה אבולוציונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדת טיטורנקו בהווה ובעבר על הדיונים. אנו מכירים את המרכז ליישומים ביולוגיים של ספקטרומטריית מסה, את המרכז לגנומיקה מבנית ותפקודית, ואת המרכז למיקרוסקופיה והדמיה תאית (כולם באוניברסיטת קונקורדיה) עבור שירותים מצטיינים. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה (NSERC) של קנדה (RGPIN 2014-04482 ו- CRDPJ 515900 - 17). K.M. נתמך על ידי אוניברסיטת קונקורדיה ארמנד C. ארצ'מבולט מלגת אוניברסיטת קונקורדיה דיקן האמנויות והמדעים של מצוינות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

ביוכימיה גיליון 167 מטבוליטים מסיסים במים פרופיל מטבולומי מרווה של פעילות מטבולית כתמי פרופידיום יודיד מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מיצוי מטבוליטים מולקולות נושאות אנרגיה נוקלאוטידים חומצות אמינו מונו-סכרידים כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה
מטבולומיה כמותית של <em>Saccharomyces Cerevisiae</em> באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter