Vi præsenterer en protokol for identifikation og kvantificering af større klasser af vandopløselige metabolitter i gær saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metode er alsidig, robust og følsom. Det gør det muligt at udskille strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vandopløselige metabolitter fra hinanden.
Metabolomics er en metode, der anvendes til identifikation og kvantificering af mange lav-molekylvægt mellemprodukter og produkter af stofskiftet i en celle, væv, organ, biologisk væske, eller organisme. Metabolomics traditionelt fokuserer på vandopløselige metabolitter. Den vandopløselige metabolom er det endelige produkt af et komplekst mobilnetværk, der integrerer forskellige genomiske, epigenomic, transskriptomiske, proteomiske og miljømæssige faktorer. Derfor vurderer den metabolomiske analyse direkte resultatet af handlingen for alle disse faktorer i en overflod af biologiske processer inden for forskellige organismer. En af disse organismer er den spirende gær Saccharomyces cerevisiae, en encellet eukaryote med det fuldt sekventeret genom. Fordi S. cerevisiae er modtagelig for omfattende molekylære analyser, bruges det som model for dissekere mekanismer, der ligger til grund for mange biologiske processer i den eukaryote celle. En alsidig analysemetode til en robust, følsom og nøjagtig kvantitativ vurdering af det vandopløselige metabolom ville være den nødvendige metode til dissekering af disse mekanismer. Her præsenterer vi en protokol for de optimerede betingelser for metabolisk aktivitet, der slukker i og vandopløselig metabolitudvinding fra S. cerevisiae celler. Protokollen beskriver også brugen af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af de ekstrahviderede vandopløselige metabolitter. Den LC-MS/MS-metode til ikke-målrettede metabolomics, der er beskrevet her, er alsidig og robust. Det muliggør identifikation og kvantificering af mere end 370 vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber, herunder forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former af disse metabolitter. Disse metabolitter omfatter forskellige energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosaccharider, mellemprodukter af glykolyse og tricarboxylsyrecyklusprodukter. LC-MS/MS-metoden for ikke-målrettede metabolomics er følsom og gør det muligt at identificere og kvantificere nogle vandopløselige metabolitter i koncentrationer helt ned til 0,05 pmol/μL. Metoden er med succes blevet anvendt til vurdering af vandopløselige metabolomer af vilde og mutante gærceller, der dyrkes under forskellige forhold.
Vandopløselige metabolitter er lavdybtrykære mellemprodukter og metabolismeprodukter, der bidrager til væsentlige cellulære processer. Disse evolutionært bevarede processer omfatter konvertering af næringsstoffer til brugbar energi, syntese af makromolekyler, cellulær vækst og signalering, cellecykluskontrol, regulering af genekspression, stressrespons, post-translationel regulering af metabolisme, vedligeholdelse af mitokondriefunktionalitet, køretøjs cellulær handel, autofagi, cellulær aldring og reguleret celledød1,2,3.
Mange af disse væsentlige roller af vandopløselige metabolitter er blevet opdaget ved undersøgelser i den spirende gær S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Denne encellede eukaryote er en nyttig modelorganisme til dissekeringsmekanismer , hvorigennem vandopløselige metabolitter bidrager til cellulære processer på grund af dets aenabilitet til avancerede biokemiske, genetiske og molekylære biologiske analyser23,24,25,26. Selv om LC-MS/MS-metoderne for ikke-målrettede metabolomics er blevet anvendt til at studere de vandopløselige metabolitters roller i spirende gær3,18,22,27, kræver denne type analyse en forbedring af dens alsidighed, robusthed, følsomhed og evne til at skelne mellem forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former af disse metabolitter.
De seneste år er præget af betydelige fremskridt med hensyn til at anvende LC-MS/MS-metoderne for ikke-målrettede metabolomics på profilering af vandopløselige metabolitter in vivo. Mange udfordringer ved at bruge denne metode er dog fortsat2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Disse udfordringer omfatter følgende. For det første er de intracellulære koncentrationer af mange vandopløselige metabolitter under en følsomhedstærskel for de nuværende anvendte metoder. For det andet er effektiviteten af metabolisk aktivitetsslukning for lav, og omfanget af slukningsrelateret cellelækage af intracellulære metabolitter er for høj til de nuværende metoder; Derfor undervurderer de nuværende anvendte metoder de intracellulære koncentrationer af vandopløselige metabolitter. For det tredje kan de eksisterende metoder ikke differentiere de strukturelle isomerer (dvs. molekyler med den samme kemiske formel, men forskellige atomnektivitet) eller stereoisomerer (dvs. molekyler med samme kemiske formel og atomare konnektivitet, men med den forskellige atomare ordning i rummet) af specifikke metabolitter; Dette forhindrer den korrekte anmærkning af visse metabolitter ved hjælp af de nuværende anvendte metoder. For det fjerde er de eksisterende massespektrale onlinedatabaser over forældre (MS1) og sekundære ioner (MS2) ufuldstændige; dette påvirker den korrekte identifikation og kvantitet af specifikke metabolitter ved hjælp af de rå LC-MS/MS-data, der er produceret ved hjælp af de nuværende metoder. For det femte kan de eksisterende metoder ikke anvende en enkelt type metabolitudvinding til at genvinde alle eller de fleste klasser af vandopløselige metabolitter. For det sjette kan de eksisterende metoder ikke bruge en enkelt type LC-kolonnen til at adskille alle eller de fleste klasser af vandopløselige metabolitter fra hinanden.
Her optimerede vi betingelserne for dæmpning af metabolisk aktivitet i S. cerevisiae celler, opretholde de fleste af de vandopløselige metabolitter i disse celler før ekstraktion, og udvinde de fleste klasser af vandopløselige metabolitter fra gærceller. Vi udviklede en alsidig, robust og følsom metode til LC-MS/MS-baseret identifikation og kvantificering af mere end 370 vandopløselige metabolitter udvundet fra S. cerevisiae celler. Denne metode til ikke-målrettede metabolomics gør det muligt at vurdere de intracellulære koncentrationer af forskellige energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosaccharider, mellemprodukter af glykolyse og tricarboxyliske cyklus mellemprodukter. Den udviklede LC-MS/MS-metode gør det muligt at identificere og kvantificere forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber.
Hvis du vil bruge den protokol, der er beskrevet her, skal du følge de forebyggende foranstaltninger, der er beskrevet nedenfor. Kloroform og methanol ekstraherer forskellige stoffer fra laboratorieplast. Håndter dem derfor med forsigtighed. Undgå brug af plast i trin, der involverer kontakt med nogen af disse to organiske opløsningsmidler. Brug borosilicate glas pipetter til disse trin. Oplad disse pipetter med kloroform og methanol før brug. Brug kun mikropipetspidser og rør lavet af polypropylen, der er resisten…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige over for nuværende og tidligere medlemmer af Titorenko-laboratoriet for drøftelser. Vi anerkender Center for Biologiske Anvendelser af Mass Spectrometry, Center for Strukturel og Funktionel Genomforskning, og Center for Mikroskopi og Cellulær Imaging (alle på Concordia University) for fremragende tjenester. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482 og CRDPJ 515900 – 17). K.M. blev støttet af Concordia University Armand C. Archambault Fellowship og Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.
Chemicals | |||
Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
L-histidine | Sigma | H8125 | |
L-leucine | Sigma | L8912 | |
L-lysine | Sigma | L5501 | |
Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
Uracil | Sigma | U0750 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Hardware equipment | |||
500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
Digital thermometer | Omega | HH509 | |
Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
Laboratory materials | |||
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
Software | |||
Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
Yeast strain | |||
Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |