Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri
Summary
Vi præsenterer en protokol for identifikation og kvantificering af større klasser af vandopløselige metabolitter i gær saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metode er alsidig, robust og følsom. Det gør det muligt at udskille strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vandopløselige metabolitter fra hinanden.
Abstract
Metabolomics er en metode, der anvendes til identifikation og kvantificering af mange lav-molekylvægt mellemprodukter og produkter af stofskiftet i en celle, væv, organ, biologisk væske, eller organisme. Metabolomics traditionelt fokuserer på vandopløselige metabolitter. Den vandopløselige metabolom er det endelige produkt af et komplekst mobilnetværk, der integrerer forskellige genomiske, epigenomic, transskriptomiske, proteomiske og miljømæssige faktorer. Derfor vurderer den metabolomiske analyse direkte resultatet af handlingen for alle disse faktorer i en overflod af biologiske processer inden for forskellige organismer. En af disse organismer er den spirende gær Saccharomyces cerevisiae, en encellet eukaryote med det fuldt sekventeret genom. Fordi S. cerevisiae er modtagelig for omfattende molekylære analyser, bruges det som model for dissekere mekanismer, der ligger til grund for mange biologiske processer i den eukaryote celle. En alsidig analysemetode til en robust, følsom og nøjagtig kvantitativ vurdering af det vandopløselige metabolom ville være den nødvendige metode til dissekering af disse mekanismer. Her præsenterer vi en protokol for de optimerede betingelser for metabolisk aktivitet, der slukker i og vandopløselig metabolitudvinding fra S. cerevisiae celler. Protokollen beskriver også brugen af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af de ekstrahviderede vandopløselige metabolitter. Den LC-MS/MS-metode til ikke-målrettede metabolomics, der er beskrevet her, er alsidig og robust. Det muliggør identifikation og kvantificering af mere end 370 vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber, herunder forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former af disse metabolitter. Disse metabolitter omfatter forskellige energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosaccharider, mellemprodukter af glykolyse og tricarboxylsyrecyklusprodukter. LC-MS/MS-metoden for ikke-målrettede metabolomics er følsom og gør det muligt at identificere og kvantificere nogle vandopløselige metabolitter i koncentrationer helt ned til 0,05 pmol/μL. Metoden er med succes blevet anvendt til vurdering af vandopløselige metabolomer af vilde og mutante gærceller, der dyrkes under forskellige forhold.
Introduction
Vandopløselige metabolitter er lavdybtrykære mellemprodukter og metabolismeprodukter, der bidrager til væsentlige cellulære processer. Disse evolutionært bevarede processer omfatter konvertering af næringsstoffer til brugbar energi, syntese af makromolekyler, cellulær vækst og signalering, cellecykluskontrol, regulering af genekspression, stressrespons, post-translationel regulering af metabolisme, vedligeholdelse af mitokondriefunktionalitet, køretøjs cellulær handel, autofagi, cellulær aldring og reguleret celledød1,2,3.
Mange af disse væsentlige roller af vandopløselige metabolitter er blevet opdaget ved undersøgelser i den spirende gær S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Denne encellede eukaryote er en nyttig modelorganisme til dissekeringsmekanismer , hvorigennem vandopløselige metabolitter bidrager til cellulære processer på grund af dets aenabilitet til avancerede biokemiske, genetiske og molekylære biologiske analyser23,24,25,26. Selv om LC-MS/MS-metoderne for ikke-målrettede metabolomics er blevet anvendt til at studere de vandopløselige metabolitters roller i spirende gær3,18,22,27, kræver denne type analyse en forbedring af dens alsidighed, robusthed, følsomhed og evne til at skelne mellem forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former af disse metabolitter.
De seneste år er præget af betydelige fremskridt med hensyn til at anvende LC-MS/MS-metoderne for ikke-målrettede metabolomics på profilering af vandopløselige metabolitter in vivo. Mange udfordringer ved at bruge denne metode er dog fortsat2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Disse udfordringer omfatter følgende. For det første er de intracellulære koncentrationer af mange vandopløselige metabolitter under en følsomhedstærskel for de nuværende anvendte metoder. For det andet er effektiviteten af metabolisk aktivitetsslukning for lav, og omfanget af slukningsrelateret cellelækage af intracellulære metabolitter er for høj til de nuværende metoder; Derfor undervurderer de nuværende anvendte metoder de intracellulære koncentrationer af vandopløselige metabolitter. For det tredje kan de eksisterende metoder ikke differentiere de strukturelle isomerer (dvs. molekyler med den samme kemiske formel, men forskellige atomnektivitet) eller stereoisomerer (dvs. molekyler med samme kemiske formel og atomare konnektivitet, men med den forskellige atomare ordning i rummet) af specifikke metabolitter; Dette forhindrer den korrekte anmærkning af visse metabolitter ved hjælp af de nuværende anvendte metoder. For det fjerde er de eksisterende massespektrale onlinedatabaser over forældre (MS1) og sekundære ioner (MS2) ufuldstændige; dette påvirker den korrekte identifikation og kvantitet af specifikke metabolitter ved hjælp af de rå LC-MS/MS-data, der er produceret ved hjælp af de nuværende metoder. For det femte kan de eksisterende metoder ikke anvende en enkelt type metabolitudvinding til at genvinde alle eller de fleste klasser af vandopløselige metabolitter. For det sjette kan de eksisterende metoder ikke bruge en enkelt type LC-kolonnen til at adskille alle eller de fleste klasser af vandopløselige metabolitter fra hinanden.
Her optimerede vi betingelserne for dæmpning af metabolisk aktivitet i S. cerevisiae celler, opretholde de fleste af de vandopløselige metabolitter i disse celler før ekstraktion, og udvinde de fleste klasser af vandopløselige metabolitter fra gærceller. Vi udviklede en alsidig, robust og følsom metode til LC-MS/MS-baseret identifikation og kvantificering af mere end 370 vandopløselige metabolitter udvundet fra S. cerevisiae celler. Denne metode til ikke-målrettede metabolomics gør det muligt at vurdere de intracellulære koncentrationer af forskellige energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosaccharider, mellemprodukter af glykolyse og tricarboxyliske cyklus mellemprodukter. Den udviklede LC-MS/MS-metode gør det muligt at identificere og kvantificere forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hvis du vil bruge den protokol, der er beskrevet her, skal du følge de forebyggende foranstaltninger, der er beskrevet nedenfor. Kloroform og methanol ekstraherer forskellige stoffer fra laboratorieplast. Håndter dem derfor med forsigtighed. Undgå brug af plast i trin, der involverer kontakt med nogen af disse to organiske opløsningsmidler. Brug borosilicate glas pipetter til disse trin. Oplad disse pipetter med kloroform og methanol før brug. Brug kun mikropipetspidser og rør lavet af polypropylen, der er resisten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige over for nuværende og tidligere medlemmer af Titorenko-laboratoriet for drøftelser. Vi anerkender Center for Biologiske Anvendelser af Mass Spectrometry, Center for Strukturel og Funktionel Genomforskning, og Center for Mikroskopi og Cellulær Imaging (alle på Concordia University) for fremragende tjenester. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482 og CRDPJ 515900 – 17). K.M. blev støttet af Concordia University Armand C. Archambault Fellowship og Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
References
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
- Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
- López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
- Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
- Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
- Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive ‘hunger factor’ linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
- Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
- Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
- Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
- Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
- Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
- Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
- Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
- Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
- Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
- Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
- Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
- Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
- Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
- Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
- Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
- Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
- Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
- Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
- Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
- Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
- Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
- Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
- Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
- Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
- Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
- Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
