Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Abstract

Metabolomik, bir hücre, doku, organ, biyolojik sıvı veya organizma içindeki birçok düşük moleküler ağırlıklı ara ve metabolizma ürününün tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılan bir metodolojidir. Metabolomics geleneksel olarak suda çözünen metabolitlere odaklanır. Suda çözünen metabolom, çeşitli genomik, epigenomik, transkriptomik, proteomik ve çevresel faktörleri entegre eden karmaşık bir hücresel ağın son ürünüdür. Bu nedenle, metabolomik analiz, çeşitli organizmalar içindeki çok sayıda biyolojik işlemde tüm bu faktörler için eylemin sonucunu doğrudan değerlendirir. Bu organizmalardan biri tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, tamamen sıralanmış genoma sahip tek hücreli bir ökaryot. S. cerevisiae kapsamlı moleküler analizlere elverişli olduğundan, ökaryotik hücre içindeki birçok biyolojik işlemin altında kalan mekanizmaların parçalanması için bir model olarak kullanılır. Suda çözünen metabolomların sağlam, hassas ve doğru nicel değerlendirmesi için çok yönlü bir analitik yöntem, bu mekanizmaların parçalandırılması için gerekli metodolojiyi sağlayacaktır. Burada, S. cerevisiae hücrelerinden suda çözünen metabolit ekstraksiyonu ve söndürülen metabolik aktivitenin optimize edilmiş koşulları için bir protokol sunuyoruz. Protokol ayrıca, çıkarılan suda çözünen metabolitlerin nicel analizi için tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile birleştirilmiş sıvı kromatografisinin kullanımını açıklar. Burada açıklanan hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemi çok yönlü ve sağlamdır. Bu metabolitlerin farklı yapısal izomerleri ve stereoisomerik formları da dahil olmak üzere çeşitli yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip 370'ten fazla suda çözünür metabolitlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar. Bu metabolitler çeşitli enerji taşıyıcı molekülleri, nükleotitler, amino asitler, monoakkaritler, glikoliz araları ve trikarboksilik döngü aralarını içerir. Hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemi hassastır ve 0,05 pmol/μL'ye kadar düşük konsantrasyonlarda suda çözünen bazı metabolitlerin tanımlanmasına ve nicelleşmesine izin verir. Yöntem, farklı koşullar altında kültürlenmiş vahşi tip ve mutant maya hücrelerinin suda çözünen metabolomlarını değerlendirmek için başarıyla kullanılmıştır.

Introduction

Suda çözünen metabolitler, temel hücresel süreçlere katkıda bulunan düşük moleküler ağırlıklı ara ürünler ve metabolizma ürünleridir. Bu evrimsel olarak korunan süreçler arasında besin maddelerinin kullanılabilir enerjiye dönüştürülmesi, makromolekül sentezi, hücresel büyüme ve sinyalizasyon, hücre döngüsü kontrolü, gen ekspresyonunun düzenlenmesi, stres yanıtı, metabolizmanın çeviri sonrası düzenlenmesi, mitokondriyal işlevselliğin sürdürülmesi, veziküler hücresel kaçakçılık, otofaji, hücresel yaşlanma ve düzenlenmiş hücre ölümü1,2,3sayıldı.

Suda çözünen metabolitlerin bu temel rollerinin çoğu, tomurcuklanan maya S. cerevisiae1 , 3 , 4 , 7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22'deki çalışmalarla keşfedilmiştir. Bu tek hücreli ökaryot, suda çözünen metabolitlerin gelişmiş biyokimyasal, genetik ve moleküler biyolojik analizlere uygunluğu nedeniyle hücresel süreçlere katkıda bulunduğu mekanizmaların parçalandırılması için yararlı bir model organizmadır23,24,25,26. Hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemleri tomurcuklanan maya 3,18, 22,27'desuda çözünen metabolitlerin rollerini incelemek için kullanılmış olsa da, bu tür analizler çok yönlülüğünün, sağlamlığının, hassasiyetinin ve bu metabolitlerin farklı yapısal izomerleri ve stereoisomerik formlarını ayırt etme yeteneğinin iyileştirilmesini gerektirir.

Son yıllarda, hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemlerinin suda çözünen metabolitlerin in vivo profillemesine uygulanmasında önemli gelişmeler vardır. Bununla birlikte, bu metodolojiyi kullanmada birçok zorluk2,28,29,30,31,32,33,34,35,36olarak kalır. Bu zorluklar aşağıdakileri içerir. İlk olarak, suda çözünür birçok metabolitin hücre içi konsantrasyonları, şu anda kullanılan yöntemler için bir duyarlılık eşiğinin altındadır. İkincisi, metabolik aktivite söndürmenin verimliliği çok düşüktür ve hücre içi metabolitlerin söndürme ile ilişkili hücre sızıntısının boyutu mevcut yöntemler için çok yüksektir; bu nedenle, şu anda kullanılan yöntemler, suda çözünür metabolitlerin hücre içi konsantrasyonlarını az tahmin eder. Üçüncüsü, mevcut yöntemler belirli metabolitlerin yapısal izomerlerini (yani, aynı kimyasal formüle ancak farklı atomik bağlantıya sahip molekülleri) veya stereoisomer'ları (yani, aynı kimyasal formüle ve atomik bağlantıya sahip moleküller, ancak uzaydaki farklı atomik düzenleme ile) ayırt edemez; bu, şu anda kullanılan yöntemlerle belirli metabolitlerin doğru ek açıklamalarını önler. Dördüncüsü, üst iyonların (MS1) ve ikincil iyonların (MS2) mevcut kütle spektral çevrimiçi veritabanları eksiktir; bu, mevcut yöntemlerin yardımıyla üretilen ham LC-MS/MS verilerini kullanarak belirli metabolitlerin doğru tanımlanmasını ve nicelliğini etkiler. Beşinci olarak, mevcut yöntemler suda çözünen metabolitlerin tüm veya çoğu sınıfını kurtarmak için tek bir metabolit ekstraksiyonu kullanamaz. Altıncı olarak, mevcut yöntemler, suda çözünür metabolitlerin tüm veya çoğu sınıfından ayırmak için tek bir LC sütunu türünü kullanamaz.

Burada, S. cerevisiae hücrelerindeki metabolik aktivitenin söndürülmesi, ekstraksiyondan önce bu hücreler içindeki suda çözünen metabolitlerin çoğunun korunması ve maya hücrelerinden suda çözünen metabolitlerin çoğu sınıfının çıkarılması için koşulları optimize ettik. S. cerevisiae hücrelerinden çıkarılan 370'ten fazla suda çözünür metabolitin LC-MS/MS tabanlı tanımlanması ve nicelleştirilmesi için çok yönlü, sağlam ve hassas bir yöntem geliştirdik. Hedefsiz metabolomik bu yöntem, çeşitli enerji taşıyıcı moleküllerinin, nükleotitlerin, amino asitlerin, monoakkaritlerin, glikoliz aralarının ve trikarboksilik döngü aralarının hücre içi konsantrasyonlarını değerlendirmeyi sağlar. Geliştirilen LC-MS/MS yöntemi, farklı yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip suda çözünen metabolitlerin farklı yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının tanımlanmasına ve nicelleştirilmesine izin sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Maya yetiştirmek için bir ortam yapmak ve sterilize etmek

  1. Bactopeptone (YP) ortamı ile tam bir maya özünden 180 mL yapın. Tam YP ortamı% 1 (w / v) maya özü ve% 2 (w / v) bactopeptone içerir.
  2. YP ortamının 180 mL'lik kısmını dört 250 mL Erlenmeyer şişesine eşit olarak dağıtın. Bu şişelerin her biri YP ortamının 45 mL'sini içerir.
  3. 15 psi/121 °C'de 45 dk otomatik kapatarak şişeleri YP ortamı ile sterilize edin.

2. Yabani tip maya suşu

  1. BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) suşu kullanın.

3. % 2 glikoz içeren YP ortamında büyüyen maya

  1. 15 psi/121 °C'de 45 dakika boyunca otoklavlayarak% 20 (w/v) stok glikoz çözeltisini sterilize edin.
  2. Sterilize edilmiş YP ortamının 45 mL'lik iki Erlenmeyer şişesinin her birine otomatik olarak kapatılmış% 20 (w/v) stok glikoz çözeltisinin 5 mL'sini ekleyin. YP ortamındaki son konsantrasyon glikozu% 2'dir (w/v).
  3. Maya hücrelerini% 2 glikoz içeren YP ortamı ile iki Erlenmeyer şişesinin her birine aşılamak için mikrobiyolojik bir döngü kullanın.
  4. Maya hücrelerini 30 °C'de 200 rpm'de ayarlanmış bir rotasyonel çalkalayıcıda bir gecede büyütün.
  5. Maya kültüründen bir aliquot alın. Kültürün mL'si başına toplam maya hücresi sayısını belirleyin. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın.

4. Hücre transferi ve hücre YP ortamında% 2 glikoz ile büyür

  1. Otoklavlı YP ortamı ile kalan iki Erlenmeyer şişesinin her birine sterilize edilmiş% 20 (w/ v) stok glikoz çözeltisinin 5 mL'sini ekleyin. Son glikoz konsantrasyonu% 2'dir (w / v).
  2. Toplam 5.0 x 10 7 hücre sayısını içeren %2 glikoz ile YP ortamındaki gece maya kültürünün bir hacmini%2 glikoz içeren YP ortamı ile iki Erlenmeyer şişesinin her birine aktarın. Hücre transferi için steril bir pipet kullanın.
  3. Maya hücrelerini 200 rpm'de ayarlanmış bir dönme çalkalayıcıda 30 °C'de en az 24 saat (veya daha fazla) büyütün.

5. Reaktifler yapmak, labware hazırlamak ve hücre söndürme için ekipman kurmak

  1. Aşağıdakileri hazırlayın: 1) 155 mM amonyum bikarbonat (ABC) tamponunda söndürme çözeltisi (%60 yüksek dereceli (%>99,9) metanol, pH = 8,0); 2) buz gibi bir ABC çözeltisi (pH = 8.0); 3) -20 °C'ye kadar ölçüm yapabilen dijital bir termometre; 4) 500 mL büyük santrifüj şişeleri; 5) önceden soğutulmuş rotorlu önceden soğutulmuş yüksek hızlı santrifüj ve bu rotor için önceden soğutulmuş 500 mL santrifüj şişeleri, hepsi -5 °C'de; 6) metabolit ekstraksiyon tüpleri (15 mL yüksek hızlı cam santrifüj tüpleri ile politetrafloroetilen astarlı kapaklar); ve 7) kuru buz.

6. Hücre söndürme

  1. % 2 glikoz kültürüne sahip YP'nin mL'si başına maya hücrelerinin sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanın.
  2. Toplam 5.0 x 108 hücre sayısını içeren% 2 glikoz ile YP ortamında kültürün bir hacmini önceden soğutulmuş 500 mL santrifüj şişelerine aktarın.
  3. 200 mL hacme kadar olan hücreleri içeren santrifüj şişesini -20 °C'de depolanan bir söndürme çözeltisi ile hızlıca doldurun.
  4. Şişeleri -5 °C'de 3 dakika boyunca 11.325 x g'da yüksek hızlı bir santrifüjde santrifüj edin.
  5. Şişeyi santrifüjden hızlı ve yumuşak bir şekilde geri çıkarın; kapağı yavaşça sökün ve peleti bozmadan üst kapağı çıkarın.
  6. Hücre peletini 10 mL buz gibi ABC tamponunda hızla yeniden depolayın ve süspansiyonu metabolit ekstraksiyonu için politetrafloroetilen kaplı bir kapakla 15 mL yüksek hızlı cam santrifüj tüpüne aktarın.
  7. Hücreleri 0 °C'de 3 dakika boyunca 3.000 x g'da klinik santrifüjde santrifüjleme ile toplayın.
  8. Hızlı bir şekilde süpernatant çıkarın ve metabolit ekstraksiyona başlamak için tüpü kuru buza yerleştirin veya ekstraksiyona kadar tüpü -80 ° C'de saklayın.

7. Metabolit ekstraksiyonu için reaktiflerin, labware'lerin ve ekipmanların hazırlanması

  1. Aşağıdakileri hazırlayın: 1) LC-MS sınıfı kloroform; 2) LC-MS sınıfı metanol; 3) LC sınıfı nano-saf su; 4) LC-MS notu (ACN); 5) cam boncuklar (asitle yıkanmış, 425-600 μm); 6) tutuculu köpük tüp tutucu kitli bir girdap; 7) Politetrafloroetilen astarlı kapaklara sahip 15 mL yüksek hızlı cam santrifüj tüpleri; 8) MS şişeleri; 9) kuru buz; ve 10) 1,5 mL tüpler bir kez etanol, bir kez ACN ve bir kez nano saf su ile yıkanır.
    NOT: Sadece organik çözücülere dayanıklı polipropilenden yapılmış mikropipette uçları ve tüpler kullanın.

8. Metabolit ekstraksiyonu

  1. Kuru buzda tutulan veya 6.7 adımından itibaren -80 °C tüpte depolanan metabolitlere aşağıdakileri ekleyin: 1) -20 °C'de depolanan 2 mL kloroform; 2) -20 °C'de depolanan 1 mL metanol; 3) 1 mL buz gibi nano-saf su; ve 4) 425-600 μm asitle yıkanmış cam boncukların 200 μL'si.
  2. Bir tüpün ağzını alüminyum folyo ile örtün ve kapatın. Metabolit ekstraksiyonu kolaylaştırmak için tüpleri tutucu ve girdaplı bir köpük tüp tutucu kitine orta hızda (yani 6'ya ayarlanmış bir hızda, 12 bir girdabın maksimum hızı olacak şekilde) 4 °C'ye yerleştirin.
  3. Protein yağışını ve üst sulunun alt organik fazdan ayrılmasını teşvik etmek için tüpü buzda 15 dakika (KURU BUZ Değİl!) kuluçkaya yatırın.
  4. Tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 3.000 x g'da klinik santrifüjde santrifüj edin. Bu santrifüjleme adımı, üst sulu fazın (suda çözünür metabolitler içeren) orta katmandan (hücre kalıntıları ve proteinler içeren) ve alt organik fazdan (çoğunlukla lipitler içeren) ayrılmasına izin verir.
  5. Üst sulu fazı (400 μL) -20 °C'de depolanan 800 μL ACN içeren yıkanmış ve etiketli 1,5 mL tüpe aktarmak için bir mikropipette kullanın.
    NOT: -20 °C'de tutulan ACN'ye üst sulu fazı ekledikten sonra beyaz bulut yağışı olacaktır.
  6. 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.400 x g'da bir masa üstü santrifüjde numune ile tüpü santrifüj edin.
    NOT: Beyaz bulut yağışı santrifüjlemeden sonra kaybolacaktır.
  7. Tüpteki bir sıvının üst kısmından etiketli bir MS şişesine 800 μL aktarın. Numuneyi LC-MS/MS tarafından analiz edilene kadar 0 °C'de saklayın.

9. LC için reaktiflerin, labwarelerin ve ekipmanların hazırlanması

  1. Aşağıdakileri hazırlayın: 1) bir girdap; 2) ultrasonik sonicator; 3) MS cam şişeler; 4) bir ikili pompa, gaz giderici ve otosampler ile donatılmış bir LC sistemi; 5) Malzeme Tablosundaadı geçen bir zwitteriyonik faz kromatografi sütunu (5 μm polimer, 150 x 2,1 mm); 6) bir sütun ısıtıcı; ve 7) A fazı (5:95 ACN:su (v/v) 20 mM amonyum asetat, pH = 8.0) ve faz B (%100 ACN) dahil olmak üzere mobil aşamalar.

10. Çıkarılan metabolitlerin LC ile ayrılması

  1. MS şişesinin içeriğini 15 dakika boyunca ultrasonik sonication'a tabi edin.
  2. Oda sıcaklığında (RT) 10 saniye boyunca MS şişesi 3x girdap.
  3. MS şişesini kuyu plakasına yerleştirin.
  4. Kromatograf sırasında sütunu 45 °C'de ve 0,250 mL/dk akış hızında saklayın. Numuneyi kuyu plakasında 0 °C'de tutun. Kromatografi sırasında kullanılması gereken LC degradeleri için Tablo 1'e bakın.
    NOT: Wild-type strain BY4742 hücrelerinden çıkarılan suda çözünen metabolitlerin temsili toplam iyon kromatogramı Şekil 1'degösterilmiştir. LC ile ayrılan metabolitler, 11.

11. LC ile ayrılmış metabolitlerin kütle spektrometrik analizi

  1. LC ile ayrılan suda çözünen metabolitlerin tanımlanması ve niceliği için ısıtılmış elektrospray iyonizasyon (HESI) ile donatılmış bir kütle spektrometresi kullanın. MS1 iyonları için kütle spektrometresinin analizörünü ve MS2 iyonları için kütle spektrometresinin dedektörünü kullanın. Sırasıyla MS1 ve MS2 iyonlarının veriye bağımlı olarak alınması için Tablo 2 ve Tablo 3'te sağlanan ayarları kullanın.
  2. Hem ESI (+) hem de ESI (-) modlarında enjeksiyon için 10 μL'lik bir örnek hacim kullanın.

12. LC-MS/MS'ten ham verilerin işlenmesiyle farklı metabolitlerin tanımlanması ve nicelliği

  1. Ham LC-MS/MS dosyalarından farklı suda çözünen metabolitlerin tanımlanmasını ve nicelliğini yürütmek için Malzeme Tablosu'nda adı geçen yazılımı kullanın. Bu yazılım metabolit nicelliği için MS1 ve metabolit tanımlama için MS2 kullanır. Yazılım, MS spektrasını eşleştirerek LC-MS/MS ham verilerini kullanarak metabolitlere açıklama eklemek için en kapsamlı şekilde seçilmiş kütle spektral parçalanma kitaplığından yararlanır. Bu yazılım ayrıca ms1 ve izotop desen eşleşmesinin tam kütlesini kullanarak çevrimiçi veritabanlarını kullanarak metabolitlere açıklama eklemek için kullanır. Ayrıntılar için Şekil 2'ye bakın.
  2. Ham verilerin MS2 spektrumunu aramak için çevrimiçi olarak serbestçe kullanılabilen veritabanları ve spektrumlar kitaplığını (https://www.mzcloud.org) kullanın.

13. Propidium İyodür (PI) boyama ve floresan mikroskopisi ile membran bütünlüğü tahlilleri

  1. 6. adım için açıklandığı gibi hücre söndürme işleminden sonra, söndürme çözeltisini çıkarmak için söndürülen hücreleri 15 mL ABC arabelleği ile iyice yıkayın. Hücreleri 0 °C'de 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
  2. Hücre peletini 1 mL ABC arabelleğine yeniden kullanın ve PI çözeltisinin 0,5 mL'si (0,5 mg/mL) ekleyin.
  3. Vortex, 10 s için 3x örnekli bir tüp ve karanlıkta ve buzda 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.400 x g'da bir masa üstü santrifüjde numune ile tüpü santrifüj edin.
  5. Üstnatant çıkarın ve peletin 1 mL ABC arabelleğine yeniden asın.
  6. Tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüj edin ve üst düğmeyi çıkarın. Hücre yüzeyine bağlı PI'yi çıkarmak için bu adımı 2 kez daha yineleyin.
  7. Peletin 300 μL ABC tamponunda yeniden süzülür. Süspansiyonun 10 μL'sini mikroskop kaydırağı yüzeyine yerleştirin.
  8. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve floresan mikroskopi görüntülerini floresan mikroskopla yakalayın. 593 nm ve 636 nm (sırasıyla) ekscitasyon ve emisyon dalga boylarında ayarlanmış bir filtre kullanın.
  9. Toplam hücre sayısını (DIC modunda) ve floresan lekeli hücrelerin sayısını saymak için bir yazılım kullanın. Ayrıca, tek tek hücreler için boyama yoğunluğunu belirlemek için bu yazılımı kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir maya hücresi içindeki suda çözünen metabolitlerin nicel değerlendirmesini iyileştirmek için, metabolit tespiti için hücre söndürme koşullarını optimize ettik. Bu amaçla hücre söndürme, bir hücre 31,33 ,37,38içindeki tüm enzymatic reaksiyonların hızlı bir şekilde tutuklanmasını içerir. Hücresel metabolik aktivitenin böyle bir şekilde tutuklanması, suda çözünen metabolitlerin in vivo miktarı için herhangi bir yöntemin önemli bir adımıdır, çünkü hücre içi konsantrasyonlarının 31 ,33,37,38'inaz tahminini önler. Metabolit değerlendirmesi için hücre söndürme her zaman plazma zarının (PM) (ve varsa hücre duvarının (CW) bütünlüğünü bozar; Bu,hücre 31 , 33 , 37,38hücreden metabolitsızıntısınaneden olur. Yöntem, bu tür bozulmayı en aza indiren hücre söndürme koşullarını kullanarak hücre içi metabolitlerin söndürme ile ilişkili hücre sızıntısını önemli ölçüde azaltır. Gerçekten de, hücre söndürme için en güncel yöntemler belirli bir metanol konsantrasyonunun kullanımını içerir (yani, %40 (v/v), %60 (v/v), %80 (v/v) veya %100 (v/v)) belirli bir sıcaklıkta (örneğin, -20 °C, -40 °C veya -60 °C), tamponsuz veya tamponsuz31,33,37,38. Şu anda kullanılan hücre söndürme yönteminden biri için PM ve CW bozukluğunun verimliliğini karşılaştırdık (yani, %80 (v/v) metanol ile hücre tedavisi ile -40 °C'de tamponyokluğunda 38)değiştirilmiş hücre söndürme yöntemi için (yani, pH = 8.0'da izotonik tamponlu abc çözeltisi varlığında -20 °C'de %60 (v/v) metanol ile hücre tedavisi ile). PI, sağlam hücrelere geçirimsiz bir floresan boyadır; hücreye ancak PM'nin (ve varsa CW'nin) bütünlüğü bozulursagirebilir 39. Ayrıca, PI tarafından floresan emisyonunun yoğunluğu, DNA veya RNA 39 'a bağlandığında30kat artar. Bu nedenle, hücre içi metabolitlerin söndürme ile ilişkili hücre sızıntısının verimliliğini değerlendirmek için bir PI boyama tahlili kullanılabilir, çünkü bu metabolitler hücre dışı alana ancak bir maya hücresinin PM ve CW'si hasar görürse39. Modifiye hücre söndürme yönteminin -40 °C'de tamponlanmamış %80 (v/v) metanol ile hücre tedavisi ile PM ve CW'ye söndürme yönteminden önemli ölçüde daha düşük hasara neden olduğunu tespit ettik (Şekil 3). Nitekim, yöntemi kullanılarak söndürmeye tabi tutulan hemen hemen tüm hücreler, PM ve CW'si zarar görmemiş maya hücrelerinin karakteristiği olan kırmızı floresan emisyonu sergilemektedir (Şekil 3). Buna karşılık, diğer yöntem kullanılarak söndürmeye tabi tutulan hemen hemen tüm hücreler, PM ve CW'si önemli ölçüde hasar görmüş maya hücrelerinin yeşil floresan emisyon özelliğini görüntüledi (Şekil 3). En yoğun kırmızı floresan, güçlü kırmızı floresan ve hafif kırmızı floresan emisyonlarını ayırt etmek için bir yazılım tarafından yeşil floresan'a dönüştürüldü.

Modifiye hücre söndürme yöntemi, maya hücrelerinden suda çözünen metabolitlerin sızmasına, -40 °C'de tamponlanmamış% 80 (v/v) metanol ile hücre işlemi ile söndürme yönteminden önemli ölçüde daha düşük neden oldu. PH = 8.0'da izotonik tamponlu bir ABC çözeltisi varlığında -20 °C'de %60 (v/v) metanol ile hücre tedavisi ile) yöntemi kullanarak eşit sayıda maya hücresini söndürmeye tabi tuttuk; Şekil 4) veya diğer yöntem (yani, tamponlanmamış% 80 (v / v) metanol ile hücre tedavisi ile -40 °C; Şekil 5). Hücre dışı çözeltiye sönme ile ilişkili hücre kaçağının kapsamı, LC-MS/MS yardımıyla suda çözünen spesifik metabolitler için değerlendirildi. Hücre dışı çözeltideki farklı amino asit sınıflarının (yani irili ufaklı asidik, temel, nötr-kutupsal olmayan ve nötr polar amino asitler) konsantrasyonları hücre söndürmeden önce ve sonra ölçüldü. Hücre söndürme yönteminin, tüm bu amino asit sınıflarının hücre dışı çözeltiye (Şekil 4) diğer yönteme göre önemli ölçüde daha düşük sızmasına neden olduğunu bulduk (Şekil 5).

Bir maya hücresi içindeki suda çözünen metabolitlerin nicel bir değerlendirmesi için LC-MS/MS yöntemi, suda çözünen tüm metabolit sınıflarının kromatografik ayrımı için sütunun tek bir türünü kullanır. Bu sütun, Malzeme Tablosu 'nda adlandırılan zwitterionic faz sütunudur. Bu sütunun, suda çözünen metabolitlerin farklı sınıflarının, Malzeme Tablosu 'nda(Ek Tablo 1)adlandırılan ters faz sütunundan çok daha verimli bir şekilde ayrılmasını sağladığını bulduk. Gerçekten de, suda çözünen metabolit standartlarının (nad+, AMP, GMP, arginin ve glutamik asit) tutma süresi (RT) kayma değerleri önemli ölçüde daha düşüktü ve tepe şekilleri ters faz sütununa kıyasla zwitterionic faz sütunu için önemli ölçüde daha keskindi(Ek Tablo 1). Ters faz sütunu için tüm metabolitlerin kromatografik ayrımı için kullanılan LC koşulları (yani suda çözünür ve suda çözünmez) Ek Tablo 2'deverilmiştir.

LC-MS/MS yönteminin bir diğer avantajı, yukarıdaki zwitteriyonik faz kolonundaki kromatografik ayrımın, çeşitli yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip farklı suda çözünen metabolitleri birbirinden verimli bir şekilde ayırabilmesinden oluşur. Suda çözünen bu metabolitler aşağıdaki metabolit sınıflarını içerir: 1) asidik, temel, nötr polar ve nötr olmayan polar amino asitler, farklı yapısal izomerleri de dahil olmak üzere (Şekil 6); 2) kararlı ve dengesiz nükleotitler ve bir hücre içinde hayati işlevleri yerine getiren derivatesleri (Şekil 7); ve 3) farklı stereoisomerik formları da dahil olmak üzere çeşitli monoakkaritler (Şekil 8).

Daha da önemlisi, bir maya hücresi içindeki suda çözünen metabolitlerin nicel olarak değerlendirilmesi için LC-MS/MS yöntemi çok yönlü ve sağlamdı. Başlangıçta% 2 glikoz içeren tam YP ortamında kültüre edilen S. cerevisiae hücrelerinde çeşitli yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip 374 suda çözünür metabolit tanımlamamıza ve ölçmemize izin verildi (Ek Tablo 3). Pozitif iyonlaşma modunda 240, negatif iyonlaşma modunda ise 134 metabolit tespit edildi. Tüm bu suda çözünen metabolitlerin kimlikleri, hem pozitif hem de negatif iyonlaşma modlarında elde edilen veriye bağımlı edinme (DDA) MS2 parçalarını MS2 mzCloud spektral kütüphanesiyle eşleştirerek doğrulandı. Bu çevrimiçi kitaplık, MS1 ve DDA MS2 parametrelerinde farklılık gösteren metabolit standartlarının spektrumunu içerir. Örneğin MS2 spektrumunu çevrimiçi spektral kitaplıkla eşleştirme kapsamını en üst düzeye çıkarmak için farklı DDA MS2 parametreleri kullandık. Bu parametreler Ek Tablo 4 'te verilmiştir. Aynı örnek için yaklaşık 6.000 özellik (putatif metabolitler), en iyi 5 MS2 olayı, 35 çarpışma enerji değeri ve 10 ms aktivasyon süresi kullanılarak yüksek enerji kaynaklı çarpışma-ayrışma (HCD) veya çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) parçalanma yöntemi yardımıyla elde edilmiştir. Elde edilen dosyaların %95'> i MS2 eşleştirme ve %90'ı MS1 izotopik desen eşleştirme kriterleri > filtrelendikten sonra, HCD parçalı durumu altında sadece 162 metabolit ve CID parçalı durum altında 142 metabolit tanımlanmıştır. 162 metabolitten 81'i HCD parçalanma yöntemine özgüken, 142 metabolitten 42'si CID parçalanma yöntemine özgütü (Ek Tablo 4'te"T5_35E__10 ms_HCD vs CID" adlı bir sayfaya bakın). Bu nedenle, suda çözünen metabolitlerin LC-MS/MS yöntemi yardımıyla doğru ek açıklamalarının birçok farklı DDA MS2 parametresinin kullanılmasını gerektirdiği sonucuna vardık.

LC-MS/MS yöntemi de oldukça hassastır. 0,05 pmol/μL gibi düşük konsantrasyonlarda suda çözünen bazı metabolitlerin tanımlanmasına ve nicelleşmesine izin verir (Tablo 4'tekifenilalanin verilerine bakın). Bu nicellik sınırı, farklı metabolit sınıfları için çok çeşitli konsantrasyonlar içinde değişir (Tablo 4).

Burada kullanılan MS sistemi, çeşitli metabolitlerin konsantrasyonlarını ölçmek için geniş (en az iki büyüklük sırası) doğrusal dinamik aralığa sahiptir(Ek Tablo 5).

Figure 1
Şekil 1: Vahşi tip suş BY4742 hücrelerinden çıkarılan suda çözünen metabolitlerin sıvı kromatografi/kütle spektrometresi (LC-MS) verilerinden elde edilen toplam iyon kromatogramı (TIC). Metabolitler, Malzeme Tablosu'nda adlandırılan zwitteriyonik faz kromatografi sütununda LC ile ayrılmıştır. Metabolitler, pozitif elektrospray iyonizasyon modu kullanılarak oluşturulan üst iyonların (MS1) MS'i tarafından tespit edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Malzeme Tablosu'nda adı geçen yazılım yardımıyla suda çözünen metabolitlerin analizi için kullanılan bir iş akışı. Aşağıdakiler hariç, tüm parametreler yazılım tarafından MS ham verilerine göre otomatik olarak düzeltildi: 1) "Bileşikleri Algıla" sekmesi: en az ayarla, en yüksek yoğunluk 10.000; ve 2) "ChemSpider'ı Ara" sekmesi: BioCyc, Human Metabolome Database, KEGG ve Yeast Metabolome Database dahil olmak üzere metabolitlerin tanımlanması için 4 çevrimiçi veritabanı seçildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Amonyum bikarbonat (ABC) tamponu (pH = 8.0; kontrol) veya farklı bir söndürme çözeltisi ile söndürülen maya hücrelerinin diferansiyel girişim kontrastı (DIC; üst sıra) ve floresan (alt sıra) mikroskobik görüntüleri. Hücre söndürülmeden sonra, karanlıkta ve buzda 10 dakika boyunca PI çözeltisi ile eşit sayıda hücre inkübe edildi. En yoğun kırmızı floresan, güçlü kırmızı floresan ve hafif kırmızı floresan emisyonlarını ayırt etmek için yazılım tarafından yeşil floresan'a dönüştürüldü. PM ve CW'ye verilen hasarın verimliliği hücre söndürme yöntemi için karşılaştırıldı (yani, pH = 8.0'da ABC'nin izotonik tamponlu çözeltisi varlığında -20 °C'de %60 (v/v) metanol ile hücre tedavisi ve şu anda kullanılan yöntemlerden biri (yani, tampon yokluğunda %80 (v/v) metanol ile hücre tedavisi ile). Ölçek çubuğu gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Hücre söndürme yöntemi için farklı amino asit sınıflarının kaçak yüzdesi. 5.0 x 10 8 maya hücresi pH = 8.0'da izotonik tamponlu abc çözeltisi varlığında -20 °C'de %60 (v/v) metanol ile tedavi ile söndürmeye tabi tutuldu. Farklı amino asit sınıflarının kaçak yüzdesi, söndürmeden önce ve sonra hücre dışı çözeltideki konsantrasyonlarını ölçmek için LC-MS/MS kullanılarak değerlendirildi. SD ve tek tek veri noktaları ± ortalama değerler gösterilir (n = 3). * s < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Şu anda kullanılan hücre söndürme yöntemlerinden biri için farklı amino asit sınıflarının kaçak yüzdesi. 5.0 x 108 maya hücresi tampon yokluğunda -40 °C'de %80 (v/v) metanol ile tedavi ile söndürmeye tabi tutuldu. Farklı amino asit sınıflarının kaçak yüzdesi, söndürmeden önce ve sonra hücre dışı çözeltideki konsantrasyonlarını ölçmek için LC-MS/MS kullanılarak değerlendirildi. SD ve tek tek veri noktaları ± ortalama değerler gösterilir (n = 3). * s < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Malzeme Tablosu'nda adı geçen zwitteriyonik faz sütununda iki yapısal izomer (yani lösin ve izoloksin) dahil olmak üzere asidik, temel, nötr polar ve nötr olmayan polar amino asit sınıflarının verimli kromatografik ayrımı. Tüm bu amino asitler MS/MS tarafından pozitif iyonlaşma [ESI (+)] modunda tespit edildi. Zwitteriyonik faz kromatografi sütunundaki LC koşulları Tablo 1'deaçıklanmıştır. MS/MS koşulları Tablo 2 ve Tablo 3'teaçıklanmıştır. Tüm amino asit standartları ticari olarak satın alınır (örneğin, Sigma). 3 bağımsız kromatografi çalışması arasındaki tutma süresi 10 saniyeden ± azdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: MalzemeMasası'nda adlandırılan zwitteriyonik faz sütununda enerjik olarak dengesiz nükleotitler (nükleozid monofosfatlar, nükleozid difosfatlar ve nükleozid trifosfatlar) ve elektron taşıyıcı molekülleri (NADH ve NAD+) dahil olmak üzere farklı nükleotit sınıflarının verimli kromatografik ayrımı. Tüm bu nükleotitler MS/MS tarafından pozitif iyonlaşma [ESI (+)] modunda tespit edildi. Zwitteriyonik faz kromatografi sütunundaki LC koşulları Tablo 1'deaçıklanmıştır. MS/MS koşulları Tablo 2 ve Tablo 3'teaçıklanmıştır. Tüm nükleotid standartları ticari olarak satın alınır (örneğin, Sigma). 3 bağımsız kromatografi çalışması arasındaki tutma süresi 10 saniyeden ± azdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Malzeme Masası'nda adı geçenzwitteriyonik faz sütununda yapısal izomerler ve stereoisomerik aldo ve ketohexoz formları (fruktoz, mannoz ve galaktoz) ve aldopentozlar (riboz ve arabinoz) dahil olmak üzere farklı monoakkarit sınıflarının verimli kromatografikayrımı. Tüm bu monoakkaritler MS/MS tarafından pozitif iyonlaşma [ESI (+)] modunda tespit edildi. Zwitteriyonik faz kromatografi sütunundaki LC koşulları Tablo 1'deaçıklanmıştır. MS/MS koşulları Tablo 2 ve Tablo 3'teaçıklanmıştır. Tüm monosaccharide standartları ticari olarak satın alınır (örneğin, Sigma). 3 bağımsız kromatografi çalışması arasındaki tutma süresi 10 saniyeden ± azdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sütun türü SeQuant ZIC-pHILIC 5μm polimer 150 x 2,1 mm
Çözücü A LC-MS sınıfı H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM Amonyum asetat
Çözücü B LC-MS sınıfı Asetonitril (ACN)
Basınç sınırı Maksimum = 300 bar Minimum = 0
HPLC degrade programı
Süre (dakika) Akış hızı (0,25 ml/dak) Kompozisyon
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tablo 1: Suda çözünen metabolitlerin,Malzeme Tablosu'nda adı geçen zwitteriyonik faz sütunu yardımıyla ayrılması için kullanılan LC durumu. Bu koşullar burada açıklanan tüm deneylerde kullanılmıştır.

Tam tarama kütle aralığı (Dalton) 70-900
FTMS (Orbitrap analizörü) tam tarama çözünürlüğü 6,0 x 104
FTMS (Orbitrap analizörü) HCD çözünürlüğü 7500
FTMS tam tarama AGC hedefi 1,0 x 106
FTMS MSn AGC hedefi 5,0 x 104
İyon tuzağı (LTQ) MSn AGC hedefi 1,0 x 104
İyon Kaynağı türü Isıtılmış Elektrospray İyonizasyon
Kılcal Damar Sıcaklığı (°C) 275
Kaynak ısıtıcı sıcaklığı (°C) 250
Kılım Gazı Akışı 10
Aux Gaz akışı 5

Tablo 2: LC ile ayrılan metabolitleri analiz etmek için kullanılan kütle spektrometresi ayarları. Bu koşullar burada açıklanan tüm deneylerde metabolitlerin analizi için kullanılmıştır. Kısaltmalar: FTMS = Fourier dönüşümü (FTMS); HCD = yüksek enerji kaynaklı çarpışma-ayrışma; LTQ = doğrusal bindirme dörtgeni; AGC = otomatik kazanç kontrolü, MS ve MS/MS için bir iyon popülasyon değeri.

Enstrüman polaritesi Pozitif/Negatif
Etkinleştirme türü CID/HCD
Min. sinyali gerekli 5000
Yalıtım Genişliği 2
CID için normalleştirilmiş Çarpışma enerjileri 35, 60
HCD için Normalleştirilmiş Çarpışma Enerjileri 35, 45, 55
Varsayılan ücret durumu 1
CID (ms) için etkinleştirme süresi 10, 30
HCD (ms) için etkinleştirme süresi 10
CID'deki MS/MS olaylarının sayısı Top 3, Top 5, Top 10
HCD'deki MS/MS olaylarının sayısı En İyi 5
Hem HCD hem de CID'de kullanılan mikro tarama sayısı 1

Tablo 3: İkincil iyonları (MS2) tespit etmek için kullanılan kütle spektrometresi ayarları. Kısaltmalar: HCD = yüksek enerji kaynaklı-çarpışma-ayrışma; CID = çarpışmaya bağlı ayrışma; ms = milisaniye.

Std Metabolitleri M.W. (g/köstebek) [M+H]+1 [M-H]-1 Algılama modu Tespit edilen en düşük konsantrasyon (pmol/μL)
glisin 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
Triptofan 204.08988 205.09716 203.0826 P 5,56E-02
Fenilalanin 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
arginin 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
threonine* 119.05824 120.06552 118.05096 P
Serin 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
Glutamat 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
methionine 149.05105 150.05833 148.04377 P 1,96E+00
Aspartat 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E+00
Valin 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
izolösin 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E+00
Lösin 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E+00
histidin 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E+00
Tirozin 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
lizin 146.10553 147.11281 145.09825 P 1,43E-01
Alanin 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
Prolin 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E+00
Sistein 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
kuşkonmaz 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E+00
Glutamine 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
guanine 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E+00
guanosine 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
GSYİH 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57E+00
GTP 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
AMP 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E+00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
glikoz** 180.06339 181.07067 179.05611
fruktoz*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
mannoz*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E+00
galaktoz*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
ribose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
arabinoz*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E+00
fruktoz-6-fosfat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
glikoz-6-fosfat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E+00
sitrik asit 192,12 g 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
malik asit 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E+00
pirokin asit 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77E+00

Tablo 4:LC-MS/MS yönteminin tanımlayabildiği ve nicelleştirebileceği farklı suda çözünür metabolit standartlarının en düşük konsantrasyonları. Her metabolit standardının MS1 tepe alanı, bu metabolit için ölçülebilir en düşük konsantrasyonu tahmin etmek için kullanılmıştır. İki bağımsız deneyin ortalama değerleri gösterilir. İki bağımsız deneyin her biri için üç teknik çoğaltma yapıldı. NOT: Threonine* tespit edilebilir, ancak threonine kimyasal bir izomer olan homoserin ile birlikte verilmesi nedeniyle ölçülemez. Glikoz** birden fazla kromatografi zirvesi oluşturduğu için tanımlanamaz. Metabolit standartları*** sadece bireysel örneklerde tanımlanabilir ve nicel hale getirebilir, ancak metabolit standartlarının bir karışımında veya metabolitlerin biyolojik bir karışımında tanımlanamaz.

Ek Tablo 1: Sütun dengeden sonra zwitteriyonik faz ve ters faz sütunları için aynı metabolit kümesinin tutma süresi (RT) kaydırma değerleri (bkz. Malzeme Tablosu). Tablo, hidrofililik ve hidrofobikliklerinde birbirinden farklı olan farklı metabolitler kümesi için zwitterionic faz ve ters faz sütunlarının tutma tekrarlanabilirliğini karşılaştırır. Bu metabolitler LC-MS/MS yardımıyla tanımlanmıştır. Hidrofilik metabolitlerin RT kayma değerlerinin (yani NAD+, AMP, GMP, arginin ve glutamik asit) önemli ölçüde daha düşük olduğunu ve tepe şekillerinin ters faz sütununa kıyasla zwitteriyonik faz sütunu için önemli ölçüde daha keskin olduğunu unutmayın. Buna karşılık, hidrofobik metabolitlerin RT kayma değerleri (yani, stearik asit, laurik asit ve decanoik asit) önemli ölçüde daha düşüktür ve tepe şekilleri, zwitteriyonik faz sütununa kıyasla ters faz sütunu için önemli ölçüde daha keskindir. Metabolitlerin zwitteriyonik faz ve ters faz sütunları yardımıyla kromatografik ayrımı için koşullar sırasıyla Tablo 1 ve Ek Tablo 2'deayrıntılı olarak yer uzamaktadır. Burada bildirilen RT kaydırma değerleri, farklı şişelerden alınan 20 farklı numunenin ölçümüne dayanmaktadır. Örnekler sütun dengelendikten sonra analiz edildi. Her numunedeki metabolitler 5.0 × 108 maya hücresinden çıkarıldı. RT kaydırma değerleri 20 farklı örneğin aracıdır (n = 20). Eşleşmeyen t testinden türetilen p değerleri, iki sütunu her iki örnek türü arasındaki eşit varyansla karşılaştırmak için kullanıldı. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 2: Malzeme Tablosu'nda adı geçen ve bu çalışmada farklı metabolitleri ayırmak için kullanılan ters faz 8 sütunu için LC koşulları. Kolon özellikleri aşağıdaki gibidir: 150 x 2.1 mm, 5 μm polimer. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 3: LC-MS/MS yöntemi kullanılarak kurtarılan ve açıklama yapılan 374 suda çözünen metabolitin tüm listesinin listesi. Tüm metabolitler aynı LC degrade çalıştırmasından kurtarıldı, Ek Tablo 4'teaçıklanan veriye bağımlı bir edinme (DDA) parçalanma algoritmasına tabi tutuldu ve Malzeme Tablosu'nda adlandırılan yazılım kullanılarak açıklama eklenmiştir. 211 metabolitlerin MS1 tepe şekilleri (tablodaki durumu boş olarak belirtilmiştir) niceleme için kullanılmak üzere uygundu ve ilgili MS2 spektrumları mzCloud spektral kütüphanesiyle tam eşleşmelere sahipti. 38 metabolit ms2 spektra (tablodaki durumu d olarak belirtilmiştir) çevrimiçi spektral kütüphane ile tam eşleşmeleri vardı. Yine de, MS1 tepe şekilleri nicelik için kullanılmak üzere uygun değildi. 125 metabolit ms2 spektrum (tablodaki durumu n olarak belirtilir) çevrimiçi spektral kütüphane ile tam eşleşmeleri yoktu. Bu metabolitler aşağıdaki gibi açıklamalandırılmıştır: 1) "Kompozisyon düğümünü tahmin et" (MS1 değerlerinin tam eşleşmesi, eşleşen ve kaçırılan izotopların sayısı ve teorik referans standartlarınınkiyle eşleşen izotop % yoğunluğuna göre metabolitlere açıklama ekleniyor); 2) "ChemSpider düğümünü" kullanarak (MS1 değerlerinin tam eşleşmesi ve MS2 spektrasının çevrimiçi spektral kütüphane ile benzerlik eşleşme puanına göre metabolitlere açıklama ekleyin); ve 3) metabolitlerin tutma süresini (RT) kaydırma değerlerini kullanarak (bu değerler metabolitlerin fiziksel yapısına ve kimyasal özelliklerine bağlıdır). Tabloda listelenen metabolitler, gerçekleştirilen 3 biyolojik kopyanın hepsinde bulundu, RT kaydırma değerleri 0.2 dakika <. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: Burada, Malzeme Tablosu'nda adı geçen yazılımın yardımıyla suda çözünen metabolitlerin ek açıklaması için kullanılan veriye bağımlı bir edinme (DDA) parçalanma algoritması.

Ek Tablo 5: Malzeme Tablası'nda adı geçen MS sistemi yardımıyla farklı amino asitlerin konsantrasyonlarını ölçtükken gözlemlediğimiz tipik bir doğrusal dinamik aralık. Burada kullanılan MS sistemi, çeşitli metabolitlerin konsantrasyonlarını ölçmek için geniş (en az iki büyüklük sırası) doğrusal dinamik aralığa sahiptir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan protokolü başarıyla kullanmak için aşağıda açıklanan önleyici tedbirleri izleyin. Kloroform ve metanol, laboratuvar plastik eşyalarından çeşitli maddeler çıkarır. Bu nedenle, bunları dikkatli bir şekilde ele alın. Bu iki organik çözücüden herhangi biriyle temas içeren adımlarda plastik kullanımından kaçının. Bu adımlar için borosilikat cam pipetler kullanın. Bu pipetleri kullanmadan önce kloroform ve metanol ile yükseltin. Sadece organik çözücülere dayanıklı polipropilenden yapılmış mikropipette uçları ve tüpler kullanın. LC-MS/MS için numune hazırlığı sırasında, cam şişelerdeki tüm hava kabarcıklarını bir kuyu plakasına yerleştirmeden önce ortadan kaldırın.

Burada kullanılan zwitterionic faz sütunu, RT değişimini en aza indirmek için her çalıştırmadan sonra kapsamlı yeniden şartlandırma gerektirir. Sütun yeniden koşullandırma için, sütunun yaklaşık 20 birimi olan yeniden koşullandırma çözümünün bir birimini kullanmanızı öneririz. Sütunun 0,4 mL/dk'luk artırılmış akış hızında 15 dakika boyunca ilk mobil fazla yeniden koşullanması gerekir. Yeniden koşullandırılması sırasında kolonun zarar görmesini önlemek için, kolon basıncını üretici tarafından önerilen üst basınç sınırının altında tutun.

Not olarak, ters faz modunda çalışan bazı karışık ayırma kromatografi sütunları, yüklü metabolitlerin40,41. Bu karışık ayırma sütunları burada kullanılan ters faz sütununu temel alır (bkz. Malzeme Tablosu)ve metabolitleri ücrete göre ayırabilen polar gömülü gruplar içerir40,41.

Burada, maya hücrelerinden çıkarılan birçok suda çözünen metabolitlerin nicel analizi için hedefsiz metabolomik LC-MS/MS tabanlı bir yöntem tanımladık. Bu yöntem, şu anda bu amaç için kullanılan hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemlerine göre çeşitli avantajlar sağlar. Bu avantajlar şunlardır. İlk olarak, yöntem hassastır ve 0,05 pmol/ μL'ye kadar düşük konsantrasyonlarda bazı suda çözünür metabolitlerin tanımlanmasına ve nicelleşmesine izin verir. Mevcut LC-MS/MS yöntemlerinin bildirilen duyarlılığı daha düşük3, 22,27,42 'dir. İkinci olarak, yöntem, hücre içi metabolitlerin hücreden, şu anda kullanılan prosedürler31 , 33,38için bildirilenden önemli ölçüde daha düşük bir sızıntısını ortaya çıkarır. Bu nedenle, hücre söndürme için geliştirdiğimiz prosedür, şu anda kullanılan prosedürlerin suda çözünür metabolitlerin hücre içi konsantrasyonlarını ne ölçüde az tahmin ettiğini düşürür. Üçüncüsü, mevcut LC-MS /MS yöntemleri2,31,33'ün aksine, yöntem farklı yapısal izomerler ve birçok metabolitin stereoisomerik formları arasında ayrımlar. Bu metabolitler çeşitli enerji taşıyıcı molekülleri, nükleotitler, amino asitler, monoakkaritler, glikoliz araları ve trikarboksilik döngü aralarını içerir. Dördüncü olarak, ham LC-MS/MS verilerini kullanarak çok çeşitli spesifik metabolitlerin doğru tanımlanması ve nicelliği için MS1 ve MS2'nin geniş bir kütle spektral veritabanını oluşturmak için yöntemi kullandık. Buna karşılık, MS1 ve MS2'nin mevcut kütle spektral çevrimiçi veritabanları eksik43,44,45. Beşinci olarak, yöntem, çeşitli yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip suda çözünen metabolitleri geri kazanmak için tek bir metabolit ekstraksiyonu kullanır. Bu metabolitlerin çeşitliliği, maya hücrelerinden suda çözünen metabolitlerin tek adımlı ekstraksiyonu için alternatif yöntemlerin3, 22,27,46 'ınıönemli ölçüde aşmaktadır. Altı, mevcut LC-MS / MS yöntemleri3,22,47,48'inaksine, yöntem, suda çözünür metabolitlerin çeşitli yapısal ve işlevsel sınıflarını birbirinden ayırmak için tek bir LC sütunu türü kullanır. Yedi, yöntem maya hücrelerinden çıkarılan 370'ten fazla suda çözünür metabolitlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar. Bu tanımlanabilir ve ölçülebilir metabolit sayısı, maya 3 , 22,27,49,50'deki hedefsiz metabolomik diğer yöntemler için bildirilen metabolit sayısını aşıyor.

Yöntemin birkaç sınırlaması vardır. Bu sınırlamalar aşağıdaki gibidir. LC ile metabolit ayrımı için kullanılan zwitterionic faz sütunu, her çalıştırmadan sonra kapsamlı yeniden şartlandırma gerektirir. Ayrıca, yöntem sadece suda çözünür, hidrofilik metabolitlerin hedeflenmemiş metabolomikleri için etkilidir. Ayrıca, farklı izomerik karbonhidrat formları (fruktoz, glikoz ve galaktoz izomerleri dahil) yöntemin yardımıyla ölçülemez. Bunun nedeni, yöntemde kullanılan zwitteriyonik faz sütununun, diğer metabolitlerle bir karışımda mevcut olduğunda bu karbonhidrat izomerlerini birbirinden ayıramamasıdır. Ayrıca, bu karbonhidrat yöntemde kullanılan zwitteriyonik faz sütununda kromatografi sırasında birden fazla pik oluşturduğundan, glikozu tanımlamak için yöntemden yararlanılamaz. Son olarak, bu amino asidin kromatografi ile metabolit ayırma sırasında izomer homoserin ile birlikte verilmesi nedeniyle yöntem yardımıyla threonine ölçülemez.

Tomurcuklanan maya S. cerevisiae'ninsuda çözünen metabolomunda yaşlanmaya bağlı değişiklikleri incelemek için bu LC-MS / MS yöntemini kullanıyoruz. Ayrıca, kronolojik yaşlanmaları sırasında maya hücrelerinin suda çözünen metabolomlarını kaç tane yaşlanma geciktirici genetik, diyet ve farmakolojik müdahalenin etkilediğini araştırmak için bu yöntemi kullanıyoruz. Çok yönlülüğü, sağlamlığı ve hassasiyeti nedeniyle, LC-MS/MS yöntemi evrimsel olarak uzak ökaryotik organizmalarda suda çözünen metabolomların nicel değerlendirmesi için başarıyla kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Titorenko laboratuvarının mevcut ve eski üyelerine tartışmalar için minnettarız. Olağanüstü hizmetler için Kütle Spektrometresi Biyolojik Uygulamalar Merkezi, Yapısal ve Fonksiyonel Genomik Merkezi ve Mikroskopi ve Hücresel Görüntüleme Merkezi'ni (hepsi Concordia Üniversitesi'nde) kabul ediyoruz. Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC) (RGPIN 2014-04482 ve CRDPJ 515900 - 17) tarafından desteklenmiştir. K.M. Concordia Üniversitesi Armand C. Archambault Bursu ve Concordia Üniversitesi Sanat ve Bilim Dekanı Mükemmellik Ödülü tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

Biyokimya Sayı 167 suda çözünen metabolitler metabolomik profilleme metabolik aktivitenin söndürülmesi propidium iyodür boyama floresan mikroskopi metabolitlerin ekstraksiyonu enerji taşıyıcı moleküller nükleotitler amino asitler monosankaritler sıvı kromatografisi kütle spektrometresi
Sıvı KromatografiSi Kullanan <em>Saccharomyces Cerevisiae'nin</em> Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter