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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Nous présentons un protocole pour l’identification et la quantification des principales classes de métabolites solubles dans l’eau dans la levure Saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite est polyvalente, robuste et sensible. Il permet de séparer les isomères structurels et les formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau les uns des autres.

Abstract

La métabolomique est une méthodologie utilisée pour l’identification et la quantification de nombreux intermédiaires et produits de faible poids moléculaire du métabolisme dans une cellule, un tissu, un organe, un fluide biologique ou un organisme. La métabolomique se concentre traditionnellement sur les métabolites solubles dans l’eau. Le métabolome soluble dans l’eau est le produit final d’un réseau cellulaire complexe qui intègre divers facteurs génomiques, épigénomiques, transcriptomiques, protéomiques et environnementaux. Par conséquent, l’analyse métabolomique évalue directement le résultat de l’action pour tous ces facteurs dans une pléthore de processus biologiques au sein de divers organismes. L’un de ces organismes est la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, un eucaryote unicellulaire avec le génome entièrement séquencé. Parce que S. cerevisiae se prête à des analyses moléculaires complètes, il est utilisé comme modèle pour disséquer les mécanismes sous-jacents à de nombreux processus biologiques au sein de la cellule eucaryote. Une méthode d’analyse polyvalente pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise du métabolome soluble dans l’eau fournirait la méthodologie essentielle pour disséquer ces mécanismes. Nous présentons ici un protocole pour les conditions optimisées de trempe de l’activité métabolique et d’extraction des métabolites solubles dans l’eau des cellules de S. cerevisiae. Le protocole décrit également l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des métabolites solubles dans l’eau extraits. La méthode LC-MS/MS de métabolomique non ciblée décrite ici est polyvalente et robuste. Il permet l’identification et la quantification de plus de 370 métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques, y compris différents isomères structuraux et formes stéréoisomériques de ces métabolites. Ces métabolites comprennent diverses molécules porteuses d’énergie, des nucléotides, des acides aminés, des monosaccharides, des intermédiaires de la glycolyse et des intermédiaires du cycle tricarboxylique. La méthode LC-MS/MS de métabolomique non ciblée est sensible et permet l’identification et la quantification de certains métabolites solubles dans l’eau à des concentrations aussi faibles que 0,05 pmol/μL. La méthode a été utilisée avec succès pour évaluer les métabolomes solubles dans l’eau de cellules de levure de type sauvage et mutantes cultivées dans différentes conditions.

Introduction

Les métabolites solubles dans l’eau sont des intermédiaires de faible poids moléculaire et des produits du métabolisme qui contribuent aux processus cellulaires essentiels. Ces processus conservés de manière évolutionnaire comprennent la conversion des nutriments en énergie utilisable, la synthèse de macromolécules, la croissance et la signalisation cellulaires, le contrôle du cycle cellulaire, la régulation de l’expression des gènes, la réponse au stress, la régulation post-traductionnelle du métabolisme, le maintien de la fonctionnalité mitochondriale, le trafic cellulaire vésiculaire, l’autophagie, le vieillissement cellulaire et la mort cellulaire régulée1,2,3.

Beaucoup de ces rôles essentiels des métabolites solubles dans l’eau ont été découverts par des études dans la levure bourgeonnante S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Cet eucaryote unicellulaire est un organisme modèle utile pour disséquer les mécanismes par lesquels les métabolites solubles dans l’eau contribuent aux processus cellulaires en raison de son aptitude aux analyses biochimiques, génétiques et biologiques moléculairesavancées23,24,25,26. Bien que les méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée aient été utilisées pour étudier les rôles des métabolites solubles dans l’eau dans les levures bourgeonnantes3,18,22,27, ce type d’analyse nécessite l’amélioration de sa polyvalence, de sa robustesse, de sa sensibilité et de sa capacité à distinguer les différents isomères structurels et les formes stéréoisomériques de ces métabolites.

Ces dernières années sont marquées par des progrès significatifs dans l’application des méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée au profilage des métabolites solubles dans l’eau in vivo. Cependant, de nombreux défis dans l’utilisation decetteméthodologierestent 2,28 , 29,30,31,32,33,34,35,36. Ces défis sont les suivants. Premièrement, les concentrations intracellulaires de nombreux métabolites solubles dans l’eau sont inférieures à un seuil de sensibilité pour les méthodes actuellement utilisées. Deuxièmement, l’efficacité de la trempe de l’activité métabolique est trop faible et l’étendue des fuites cellulaires associées à la trempe des métabolites intracellulaires est trop élevée pour les méthodes actuelles; par conséquent, les méthodes actuellement utilisées sous-estiment les concentrations intracellulaires de métabolites solubles dans l’eau. Troisièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas différencier les isomères structuraux (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique mais une connectivité atomique différente) ou les stéréoisomères (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique et la même connectivité atomique, mais avec un arrangement atomique différent dans l’espace) de métabolites spécifiques; cela empêche l’annotation correcte de certains métabolites par les méthodes actuellement utilisées. Quatrièmement, les bases de données en ligne sur le spectral de masse des ions parents (MS1) et des ions secondaires (MS2) sont incomplètes; cela affecte l’identification et la quantification correctes de métabolites spécifiques à l’aide des données brutes LC-MS/MS produites à l’aide des méthodes actuelles. Cinquièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type d’extraction de métabolites pour récupérer toutes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau. Sixièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type de colonne LC pour séparer les unes des autres toutes les classes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau.

Ici, nous avons optimisé les conditions pour la trempe de l’activité métabolique dans les cellules de S. cerevisiae, en maintenant la plupart des métabolites solubles dans l’eau dans ces cellules avant l’extraction et en extrayant la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau des cellules de levure. Nous avons développé une méthode polyvalente, robuste et sensible pour l’identification et la quantification basées sur LC-MS/MS de plus de 370 métabolites solubles dans l’eau extraits de cellules de S. cerevisiae. Cette méthode de métabolomique non ciblée permet d’évaluer les concentrations intracellulaires de diverses molécules porteuses d’énergie, nucléotides, acides aminés, monosaccharides, intermédiaires de glycolyse et intermédiaires du cycle tricarboxylique. La méthode LC-MS/MS développée permet l’identification et la quantification de différents isomères structuraux et formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques.

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Protocol

1. Fabrication et stérilisation d’un milieu de culture de levure

  1. Faire 180 mL d’un extrait de levure complet avec un milieu de bactopéptone (YP). Le milieu YP complet contient 1% (p / v) d’extrait de levure et 2% (w / v) de bactopéptone.
  2. Répartir 180 mL du milieu YP également dans quatre flacons d’Erlenmeyer de 250 mL. Chacune de ces fioles contient 45 mL du milieu YP.
  3. Stériliser les flacons avec un milieu YP par autoclavage à 15 psi/121 °C pendant 45 min.

2. Souche de levure de type sauvage

  1. Utilisez la souche BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Cultiver de la levure dans le milieu YP contenant 2% de glucose

  1. Stériliser une solution stock de glucose à 20 % (p/v) par autoclavage à 15 psi/121 °C pendant 45 min.
  2. Ajouter 5 mL de la solution trapue autoclavée à 20 % (p/v) de glucose dans chacune des deux fioles d’Erlenmeyer avec 45 mL du milieu YP stérilisé. La concentration finale de glucose dans le milieu YP est de 2% (p / v).
  3. Utilisez une boucle microbiologique pour inoculer des cellules de levure dans chacune des deux fioles d’Erlenmeyer avec le milieu YP contenant 2% de glucose.
  4. Cultivez les cellules de levure pendant la nuit à 30 °C dans un agitateur rotatif réglé à 200 tr/min.
  5. Prenez une aliquote de culture de levure. Déterminer le nombre total de cellules de levure par mL de culture. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

4. Transfert cellulaire et croissance cellulaire dans le milieu YP avec 2% de glucose

  1. Ajouter 5 mL de la solution stock stérilisée à 20 % (p/v) de glucose à chacune des deux fioles d’Erlenmeyer restantes avec le milieu YP autoclavé. La concentration finale de glucose est de 2% (p / v).
  2. Transférer un volume de la culture de levure pendant la nuit dans un milieu YP avec 2% de glucose contenant le nombre total de 5,0 x 107 cellules dans chacune des deux fioles d’Erlenmeyer avec le milieu YP contenant 2% de glucose. Utilisez une pipette stérile pour le transfert de cellules.
  3. Cultivez les cellules de levure pendant au moins 24 h (ou plus, si l’expérience l’exige) à 30 °C dans un agitateur rotatif réglé à 200 tr/min.

5. Fabrication de réactifs, préparation de matériel de laboratoire et mise en place d’équipements pour la trempe des cellules

  1. Préparer ce qui suit : 1) une solution de trempe (60 % de méthanol de haute qualité (>99,9 %) dans un tampon de 155 mM de bicarbonate d’ammonium (ABC), pH = 8,0); 2) une solution ABC glacée (pH = 8,0); 3) un thermomètre numérique capable de mesurer jusqu’à -20 °C; 4) grandes bouteilles de centrifugeuse de 500 mL; 5) une centrifugeuse à grande vitesse pré-refroidie avec un rotor pré-refroidi et des bouteilles de centrifugeuse pré-refroidies de 500 mL pour ce rotor, le tout à -5 °C; 6) tubes d’extraction de métabolites (tubes centrifuges en verre à grande vitesse de 15 mL avec bouchons doublés de polytétrafluoroéthylène); et 7) la glace carbonique.

6. Trempe des cellules

  1. Utilisez un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules de levure par mL de YP avec une culture de glucose à 2%.
  2. Transférer un volume de la culture dans un milieu YP avec 2% de glucose contenant le nombre total de 5,0 x 108 cellules dans des bouteilles de centrifugeuse pré-refroidies de 500 mL.
  3. Remplissez rapidement le flacon de centrifugeuse contenant les cellules jusqu’à un volume de 200 mL avec une solution de trempe stockée à -20 °C.
  4. Centrifuger les bouteilles dans une centrifugeuse à grande vitesse à 11 325 x g pendant 3 min à -5 °C.
  5. Récupérer rapidement et tendrement la bouteille de la centrifugeuse; dévissez doucement le couvercle et retirez le surnageant sans déranger la pastille.
  6. Remettez rapidement en suspension la pastille de cellule dans 10 mL de tampon ABC glacé et transférez la suspension dans un tube de centrifugeuse en verre à grande vitesse de 15 mL avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène pour l’extraction des métabolites.
  7. Prélever des cellules par centrifugation dans une centrifugeuse clinique à 3 000 x g pendant 3 min à 0 °C.
  8. Retirez rapidement le surnageant et placez le tube sur de la glace carbonique pour commencer l’extraction des métabolites ou stockez le tube à -80 °C jusqu’à l’extraction.

7. Préparation des réactifs, du matériel de laboratoire et de l’équipement pour l’extraction des métabolites

  1. Préparer ce qui suit : 1) chloroforme de qualité LC-MS; 2) méthanol de qualité LC-MS; 3) eau nano-pure de qualité LC; 4) Grade LC-MS (ACN); 5) perles de verre (lavées à l’acide, 425-600 μm); 6) un vortex avec un kit de support de tube en mousse avec dispositif de retenue; 7) tubes centrifuges en verre à grande vitesse de 15 mL avec bouchons revêtus de polytétrafluoroéthylène; 8) flacons de SEP; 9) glace carbonique; et 10) des tubes de 1,5 mL lavés une fois à l’éthanol, une fois avec de l’ACN et une fois avec de l’eau nano-pure.
    REMARQUE: Utilisez uniquement des embouts de micropipette et des tubes en polypropylène résistant aux solvants organiques.

8. Extraction des métabolites

  1. Aux métabolites conservés sur de la glace carbonique ou stockés à -80 °C à partir de l’étape 6.7, ajouter ce qui suit : 1) 2 mL de chloroforme stockés à -20 °C ; 2) 1 mL de méthanol stocké à -20 °C; 3) 1 mL d’eau nano-pure glacée; et 4) 200 μL de 425 à 600 μm de billes de verre lavées à l’acide.
  2. Couvrir et fermer la bouche d’un tube avec du papier d’aluminium. Placez les tubes dans un kit de porte-tubes en mousse avec dispositif de retenue et vortexez-les pendant 30 minutes à vitesse moyenne (c.-à-d. à une vitesse fixée à 6, 12 étant la vitesse maximale d’un vortex) à 4 °C pour faciliter l’extraction des métabolites.
  3. Incuber le tube pendant 15 min sur de la glace (PAS de la glace carbonique !) pour favoriser la précipitation des protéines et la séparation de l’aqueux supérieur de la phase organique inférieure.
  4. Centrifuger le tube dans une centrifugeuse clinique à 3 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Cette étape de centrifugation permet de séparer la phase aqueuse supérieure (qui contient des métabolites solubles dans l’eau) de la couche intermédiaire (qui contient des débris cellulaires et des protéines) et de la phase organique inférieure (qui contient principalement des lipides).
  5. Utilisez une micropipette pour transférer la phase aqueuse supérieure (400 μL) dans un tube lavé et étiqueté de 1,5 mL contenant 800 μL d’ACN qui a été stocké à -20 °C.
    REMARQUE: Il y aura des précipitations nuageuses blanches après l’ajout de la phase aqueuse supérieure à ACN maintenue à -20 ° C.
  6. Centrifuger le tube avec l’échantillon dans une centrifugeuse de table à 13 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
    REMARQUE: Les précipitations nuageuses blanches disparaîtront après centrifugation.
  7. Transférer 800 μL de la partie supérieure d’un liquide dans le tube vers un flacon MS étiqueté. Conservez l’échantillon à 0 °C jusqu’à ce qu’il soit analysé par LC-MS/MS.

9. Préparation des réactifs, des articles de laboratoire et de l’équipement pour la LC

  1. Préparez ce qui suit : 1) un vortex; 2) un sonicateur à ultrasons; 3) flacons en verre MS; 4) un système LC équipé d’une pompe binaire, d’un dégazeur et d’un échantillonneur automatique; 5) une colonne de chromatographie en phase zwitterionique (polymère de 5 μm, 150 x 2,1 mm) nommée dans la table des matériaux; 6) un chauffe-colonne; et 7) les phases mobiles, y compris la phase A (5:95 ACN:eau (v/v) avec 20 mM d’acétate d’ammonium, pH = 8,0) et la phase B (100 % ACN).

10. Séparation des métabolites extraits par LC

  1. Soumettre le contenu du flacon MS à une sonication par ultrasons pendant 15 min.
  2. Vortex le flacon MS 3x pendant 10 secondes à température ambiante (RT).
  3. Placez le flacon de SEP dans la plaque du puits.
  4. Pendant le chromatographe, maintenir la colonne à 45 °C et un débit de 0,250 mL/min. Conserver l’échantillon dans la plaque du puits à 0 °C. Reportez-vous au tableau 1 pour connaître les gradients LC qui doivent être utilisés pendant la chromatographie.
    REMARQUE : Un chromatogramme ionique total représentatif des métabolites solubles dans l’eau qui ont été extraits de cellules de la souche de type sauvage BY4742 est illustré à la figure 1. Les métabolites séparés par LC ont été identifiés et quantifiés par spectrométrie de masse qui a été réalisée en mode d’ionisation positive [ESI (+)], comme décrit pour l’étape 11.

11. Analyse par spectrométrie de masse des métabolites séparés par LC

  1. Utilisez un spectromètre de masse équipé d’une ionisation par électropulvérisation chauffée (HESI) pour l’identification et la quantification des métabolites solubles dans l’eau qui ont été séparés par LC. Utilisez l’analyseur du spectromètre de masse pour les ions MS1 et le détecteur du spectromètre de masse pour les ions MS2. Utilisez les paramètres fournis dans les tableaux 2 et 3 pour l’acquisition en fonction des données des ions MS1 et MS2, respectivement.
  2. Utilisez un volume d’échantillon de 10 μL pour l’injection dans les modes ESI (+) et ESI (-).

12. Identification et quantification des différents métabolites par le traitement des données brutes de LC-MS/MS

  1. Utilisez le logiciel nommé dans la Table des matériaux pour effectuer l’identification et la quantification de différents métabolites solubles dans l’eau à partir de fichiers LC-MS/MS bruts. Ce logiciel utilise MS1 pour la quantification des métabolites et MS2 pour l’identification des métabolites. Le logiciel exploite la bibliothèque de fragmentation spectrale de masse la plus organisée pour annoter les métabolites à l’aide des données brutes LC-MS/MS en faisant correspondre les spectres MS. Ce logiciel utilise également la masse exacte de MS1 et la correspondance des modèles isotopiques pour annoter les métabolites à l’aide de bases de données en ligne. Voir la figure 2 pour plus de détails.
  2. Utilisez la bibliothèque de bases de données et de spectres, disponible gratuitement en ligne (https://www.mzcloud.org), pour rechercher des spectres MS2 des données brutes.

13. Dosage de l’intégrité de la membrane par coloration à l’iodure de propidium (PI) et microscopie à fluorescence

  1. Après la trempe des cellules effectuée comme décrit à l’étape 6, lavez soigneusement les cellules trempées avec 15 mL de tampon ABC pour éliminer la solution de trempe. Prélever les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 5 min à 0 °C.
  2. Resuspendez la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon ABC et ajoutez 0,5 mL de la solution PI (0,5 mg/mL).
  3. Vortex un tube avec l’échantillon 3x pendant 10 s et l’incuber pendant 10 min dans l’obscurité et sur la glace.
  4. Centrifuger le tube avec l’échantillon dans une centrifugeuse de table à 13 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
  5. Retirez le surnageant et ressuspendez la pastille dans 1 mL de tampon ABC.
  6. Centrifuger le tube à 13 400 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer le surnageant. Répétez cette étape 2 fois de plus pour supprimer le PI lié à la surface de la cellule.
  7. Resuspendez la pastille dans 300 μL de tampon ABC. Placez 10 μL de la suspension sur la surface d’une lame de microscope.
  8. Capturez les images de contraste d’interférence différentielle (DIC) et de microscopie à fluorescence avec un microscope à fluorescence. Utilisez un filtre configuré aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 593 nm et 636 nm (respectivement).
  9. Utilisez un logiciel pour compter le nombre total de cellules (en mode DIC) et le nombre de cellules colorées par fluorescence. Utilisez également ce logiciel pour déterminer l’intensité de la coloration pour les cellules individuelles.

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Representative Results

Pour améliorer une évaluation quantitative des métabolites solubles dans l’eau dans une cellule de levure, nous avons optimisé les conditions de trempe cellulaire pour la détection des métabolites. La trempe cellulaire à cette fin implique un arrêt rapide de toutes les réactions enzymatiques au seind’unecellule31,33,37,38. Un tel arrêt de l’activité métabolique cellulaire est une étape essentielle de toute méthode de quantification des métabolites solubles dans l’eau in vivo car il empêche la sous-estimation de leurs concentrations intracellulaires31,33,37,38. La trempe cellulaire pour l’évaluation des métabolites nuit toujours à l’intégrité de la membrane plasmique (PM) (et de la paroi cellulaire (CW), le cas échéant); cela provoque une fuite de métabolite de la cellule31,33,37,38. La méthode utilise des conditions de trempe cellulaire qui minimisent une telle altération, diminuant ainsi considérablement la fuite cellulaire associée à la trempe des métabolites intracellulaires. En effet, la plupart des méthodes actuelles de trempe cellulaire impliquent l’utilisation d’une certaine concentration de méthanol (c’est-à-dire 40% (v/v), 60% (v/v), 80% (v/v), ou 100% (v/v)) à température spécifique (c’est-à-dire -20 °C, -40 °C ou -60 °C), avec ou sans tampon31,33,37,38. Nous avons comparé l’efficacité de la dégradation des particules et des CW pour l’une des méthodes de trempe cellulaire actuellement utilisées (c.-à-d. par traitement cellulaire avec du méthanol à 80 % (v/v) à -40 °C en l’absence d’un tampon38) à celle de la méthode de trempe cellulaire modifiée (c.-à-d. par traitement cellulaire avec du méthanol à 60 % (v/v) à -20 °C en présence d’une solution tamponnée isotonique d’ABC à pH = 8,0). PI est un colorant fluorescent imperméable aux cellules intactes; il ne peut pénétrer dans la cellule que si l’intégrité du PM (et du CW, le cas échéant) est altérée39. De plus, l’intensité de l’émission de fluorescence par PI augmente de 30 fois lorsqu’elle est liée à l’ADN ou à l’ARN39. Ainsi, un test de coloration PI peut être utilisé pour évaluer l’efficacité de la fuite cellulaire associée à la trempe des métabolites intracellulaires, car ces métabolites ne peuvent s’infiltrer dans l’espace extracellulaire que si les PARTICULE et cw d’une cellule de levure sont endommagés39. Nous avons constaté que la méthode de trempe cellulaire modifiée cause des dommages significativement plus faibles aux particules et aux CW que la méthode de trempe par traitement cellulaire avec du méthanol non tamponné à 80 % (v/v) à -40 °C(figure 3). En effet, presque toutes les cellules soumises à la trempe à l’aide de la méthode présentaient une émission de fluorescence rouge, caractéristique des cellules de levure dont les PM et CW ne sont pas endommagées(Figure 3). En revanche, presque toutes les cellules soumises à la trempe à l’aide de l’autre méthode présentaient une émission de fluorescence verte caractéristique des cellules de levure dont les particules et les CW sont considérablement endommagées (Figure 3). La fluorescence rouge la plus intense a été convertie en fluorescence verte par un logiciel pour différencier les émissions de fluorescence rouge forte et de fluorescence rouge douce.

La méthode de trempe cellulaire modifiée a entraîné des fuites significativement plus faibles de métabolites solubles dans l’eau des cellules de levure que la méthode de trempe par traitement cellulaire avec du méthanol non tamponné à 80% (v / v) à -40 ° C. Nous avons soumis un nombre égal de cellules de levure à la trempe en utilisant l’une ou l’autre méthode (c’est-à-dire par traitement cellulaire avec du méthanol à 60% (v / v) à -20 ° C en présence d’une solution tamponnée isotonique d’ABC à pH = 8,0; Graphique 4) ou l’autre méthode (c.-à-d. par traitement cellulaire avec du méthanol non tamponné à 80 % (v/v) à -40 °C; Figure 5). L’étendue des fuites cellulaires associées à la trempe dans la solution extracellulaire a été évaluée pour des métabolites spécifiques solubles dans l’eau à l’aide de LC-MS/MS. Les concentrations de différentes classes d’acides aminés (c.-à-d. grands et petits acides aminés acides, basiques, neutres-non polaires et neutres polaires) dans la solution extracellulaire ont été mesurées avant et après la trempe cellulaire. Nous avons constaté que la méthode de trempe cellulaire provoque une fuite significativement plus faible de toutes ces classes d’acides aminés dans la solution extracellulaire (Figure 4) que l’autre méthode (Figure 5).

La méthode LC-MS/MS pour une évaluation quantitative des métabolites solubles dans l’eau dans une cellule de levure utilise un seul type de colonne pour la séparation chromatographique de toutes les classes de métabolites solubles dans l’eau. Cette colonne est la colonne de phase zwitterionique nommée dans table des matériaux. Nous avons constaté que cette colonne offre une séparation beaucoup plus efficace des différentes classes de métabolites solubles dans l’eau que la colonne à phase inverse nommée dans la table des matériaux (tableau supplémentaire 1). En effet, les valeurs de décalage du temps de rétention (RT) des étalons de métabolites solubles dans l’eau (c.-à-d. NAD+, AMP, GMP, arginine et acide glutamique) étaient significativement plus faibles et les formes de pic étaient considérablement plus nettes pour la colonne de phase zwitterionique, par rapport à la colonne de phase inverse(tableau supplémentaire 1). Les conditions de LC utilisées pour la séparation chromatographique de tous les métabolites (c.-à-d. solubles dans l’eau et insolubles dans l’eau) pour la colonne en phase inverse sont fournies dans le tableau supplémentaire 2.

Un autre avantage de la méthode LC-MS/MS réside dans la capacité de séparation chromatographique sur la colonne de phase zwitterionique ci-dessus à séparer efficacement les différents métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques. Ces métabolites solubles dans l’eau comprennent les classes de métabolites suivantes : 1) acides aminés acides, basiques, polaires neutres et non neutres, y compris leurs différents isomères structuraux(figure 6); 2) les nucléotides stables et instables et leurs dérivés qui remplissent des fonctions vitales au sein d’une cellule(Figure 7); et 3) divers monosaccharides, y compris leurs différentes formes stéréoisomériques (Figure 8).

Il est important de savoir si la méthode LC-MS/MS pour une évaluation quantitative des métabolites solubles dans l’eau dans une cellule de levure était polyvalente et robuste. Il nous a permis d’identifier et de quantifier 374 métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques dans les cellules de S. cerevisiae qui ont été cultivées dans le milieu YP complet contenant initialement 2% de glucose (Tableau supplémentaire 3). 240 métabolites ont été détectés en mode d’ionisation positive et 134 métabolites en mode d’ionisation négative. L’identité de tous ces métabolites solubles dans l’eau a été confirmée en faisant correspondre leurs fragments MS2 d’acquisition dépendante des données (DDA) acquis à la fois dans les modes d’ionisation positive et négative à la bibliothèque spectrale MS2 mzCloud. Cette bibliothèque en ligne comprend les spectres des étalons de métabolites qui diffèrent par leurs paramètres MS1 et DDA MS2. Pour maximiser l’étendue de la correspondance des spectres MS2 de l’échantillon avec la bibliothèque spectrale en ligne, nous avons utilisé différents paramètres DDA MS2. Ces paramètres sont fournis dans le tableau supplémentaire 4. Près de 6 000 caractéristiques (métabolites putatifs) pour le même échantillon ont été acquises à l’aide de la méthode de fragmentation par collision induite par la haute énergie (HCD) ou la dissociation induite par collision (CID), en utilisant les 5 principaux événements MS2, 35 valeurs d’énergie de collision et des temps d’activation de 10 ms. Après avoir filtré les fichiers résultants avec > 95% de correspondance MS2 et > critères d’appariement de motif isotopique MS1 à 90%, seuls 162 métabolites sous condition fragmentée HCD et 142 métabolites sous condition fragmentée CID ont été identifiés. 81 des 162 métabolites étaient uniques à la méthode de fragmentation HCD, tandis que 42 sur 142 étaient uniques à la méthode de fragmentation CID (voir une feuille intitulée « T5_35E__10 ms_HCD vs CID » dans le tableau supplémentaire 4). Par conséquent, nous avons conclu que l’annotation correcte des métabolites solubles dans l’eau à l’aide de la méthode LC-MS/MS nécessite l’utilisation de nombreux paramètres DDA MS2 différents.

La méthode LC-MS/MS est également très sensible. Il permet d’identifier et de quantifier certains métabolites solubles dans l’eau à des concentrations aussi faibles que 0,05 pmol/μL (voir les données pour la phénylalanine dans le tableau 4). Cette limite de quantification varie dans une large gamme de concentrations pour différentes classes de métabolites (Tableau 4).

Le système MS utilisé ici a une large plage dynamique linéaire (au moins deux ordres de grandeur) pour mesurer les concentrations de divers métabolites (Tableau supplémentaire 5).

Figure 1
Figure 1: Chromatogramme ionique total (TIC) des données de chromatographie liquide/spectrométrie de masse (LC-MS) des métabolites solubles dans l’eau qui ont été extraits de cellules de la souche de type sauvage BY4742. Les métabolites ont été séparés par LC sur la colonne de chromatographie en phase zwitterionique nommée dans la table des matériaux. Les métabolites ont été détectés par MS d’ions parents (MS1) qui ont été créés en utilisant le mode d’ionisation par électropulvérisation positive. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Flux de travail utilisé pour l’analyse des métabolites solubles dans l’eau à l’aide du logiciel nommé dans table des matériaux. Tous les paramètres ont été autocorrigés par le logiciel sur la base des données brutes MS, à l’exception des éléments suivants: 1) onglet « Détecter les composés »: définir min, intensité maximale 10 000; et 2) onglet « Search ChemSpider » : 4 bases de données en ligne ont été sélectionnées pour l’identification des métabolites, dont la BioCyc, la base de données sur le métabolome humain, le KEGG et la base de données sur le métabolome de la levure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Images microscopiques de contraste d’interférence différentielle (DIC; rangée supérieure) et de fluorescence (rangée inférieure) de cellules de levure trempées soit avec un tampon de bicarbonate d’ammonium (ABC) (pH = 8,0; contrôle), soit avec une solution de trempe différente. Après la trempe cellulaire, un nombre égal de cellules ont été incubées avec la solution PI pendant 10 minutes dans l’obscurité et sur la glace. La fluorescence rouge la plus intense a été convertie en fluorescence verte par un logiciel pour différencier la forte fluorescence rouge et les émissions de fluorescence rouge douce. L’efficacité des dommages causés aux particules et aux CW a été comparée pour la méthode de trempe cellulaire (c.-à-d. par traitement cellulaire avec du méthanol à 60 % (v/v) à -20 °C en présence d’une solution tamponnée isotonique d’ABC à pH = 8,0) et l’une des méthodes actuellement utilisées (c.-à-d. par traitement cellulaire avec du méthanol à 80 % (v/v) à -40 °C en l’absence d’un tampon). Une barre d’échelle s’affiche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Pourcentage de fuite des différentes classes d’acides aminés pour la méthode de trempe cellulaire. 5,0 x 108 des cellules de levure ont été soumises à la trempe par le traitement avec 60% (v/v) de méthanol à -20 °C en présence d’une solution tamponnée isotonique d’ABC à pH = 8,0. Le pourcentage de fuite des différentes classes d’acides aminés a été évalué à l’aide de LC-MS/MS pour mesurer leurs concentrations dans la solution extracellulaire avant et après la trempe. Les valeurs moyennes ± SD et les points de données individuels sont indiquées (n = 3). * p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Pourcentage de fuite des différentes classes d’acides aminés pour l’une des méthodes de trempe cellulaire actuellement utilisées. 5,0 x 108 des cellules de levure ont été soumises à une trempe par le traitement avec 80% (v/v) de méthanol à -40 °C en l’absence de tampon. Le pourcentage de fuite des différentes classes d’acides aminés a été évalué à l’aide de LC-MS/MS pour mesurer leurs concentrations dans la solution extracellulaire avant et après la trempe. Les valeurs moyennes ± SD et les points de données individuels sont indiquées (n = 3). * p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Séparation chromatographique efficace des classes d’acides aminés acides, basiques, polaires neutres et non neutres, y compris deux isomères structuraux (c.-à-d. leucine et isoleucine), sur la colonne de phase zwitterionique nommée dans la Table des matériaux. Tous ces acides aminés ont été détectés par MS/MS en mode d’ionisation positive [ESI (+)]. Les conditions de LC sur la colonne de chromatographie en phase zwitterionique sont décrites dans le tableau 1. Les conditions applicables à la SEP/SEP sont décrites dans les tableaux 2 et 3. Toutes les normes d’acides aminés sont achetées dans le commerce (par exemple, Sigma). Les décalages de temps de rétention entre 3 séries de chromatographie indépendantes sont inférieurs à ± 10 secondes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Séparation chromatographique efficace de différentes classes de nucléotides, y compris les nucléotides énergétiquement instables (monophosphates nucléosidiques, diphosphates nucléosidiques et triphosphates nucléosidiques) et les molécules porteuses d’électrons (NADH et NAD+), sur la colonne de phase zwitterioniquenommée dans la Table desmatériaux. Tous ces nucléotides ont été détectés par MS/MS en mode d’ionisation positive [ESI (+)]. Les conditions de LC sur la colonne de chromatographie en phase zwitterionique sont décrites dans le tableau 1. Les conditions applicables à la SEP/SEP sont décrites dans les tableaux 2 et 3. Tous les étalons nucléotidiques sont achetés dans le commerce (p. ex., Sigma). Les décalages de temps de rétention entre 3 séries de chromatographie indépendantes sont inférieurs à ± 10 secondes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Séparation chromatographique efficace de différentes classes de monosaccharides, y compris les isomères structuraux et les formes stéréoisomériques des aldohexoses et des kétohexoses (fructose, mannose et galactose) et des aldopentoses (ribose et arabinose), sur la colonne de phase zwitterioniquenommée dans la Table desmatériaux. Tous ces monosaccharides ont été détectés par MS/MS en mode d’ionisation positive [ESI (+)]. Les conditions de LC sur la colonne de chromatographie en phase zwitterionique sont décrites dans le tableau 1. Les conditions applicables à la SEP/SEP sont décrites dans les tableaux 2 et 3. Toutes les normes de monosaccharides sont achetées dans le commerce (par exemple, Sigma). Les décalages de temps de rétention entre 3 séries de chromatographie indépendantes sont inférieurs à ± 10 secondes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Type de colonne SeQuant ZIC-pHILIC 5μm polymère 150 x 2,1 mm
Solvant A LC-MS grade H2O : ACN (95:5, v/v) 20 mM Acétate d’ammonium
Solvant B Acétonitrile de qualité LC-MS (ACN)
Limite de pression Maximum = 300 bar Minimum = 0
Programme de gradient HPLC
Temps (minutes) Débit (0,25 ml/min) Compositions
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tableau 1 : Condition LC utilisée pour la séparation des métabolites solubles dans l’eau à l’aide de la colonne de phase zwitterioniquenommée dans la Table des matériaux. Ces conditions ont été utilisées dans toutes les expériences décrites ici.

Plage de masse de balayage complète (Dalton) 70-900
FTMS (Orbitrap analyzer) résolution de balayage complète 6,0 x 104
Résolution HCD FTMS (Orbitrap analyzer) 7500
Cible AGC FTMS à analyse complète 1,0 x 106
Cible FTMS MSn AGC 5,0 x 104
Piège à ions (LTQ) cible MSn AGC 1,0 x 104
Type de source ionique Ionisation par électropulvérisation chauffée
Température capillaire (°C) 275
Température du chauffe-source (°C) 250
Flux de gaz de gaine 10
Flux de gaz auxiliaire 5

Tableau 2 : Paramètres du spectromètre de masse utilisés pour analyser les métabolites séparés par LC. Ces conditions ont été utilisées pour l’analyse des métabolites dans toutes les expériences décrites ici. Abréviations : FTMS = transformée de Fourier (FTMS) ; HCD = dissociation de collision induite par une énergie élevée; LTQ = quadripôle à piège linéaire; AGC = contrôle automatique du gain, une valeur de population d’ions pour MS et MS/MS.

Polarité de l’instrument Positif/Négatif
Type d’activation CID/HCD
Signal min. requis 5000
Largeur d’isolation 2
Énergies de collision normalisées pour CID 35, 60
Énergies de collision normalisées pour HCD 35, 45, 55
État de charge par défaut 1
Temps d’activation pour CID (ms) 10, 30
Temps d’activation pour HCD (ms) 10
Nombre d’événements MS/MS dans le CID Top 3, Top 5, Top 10
Nombre d’événements de SEP/SEP dans HCD Top 5
Nombre de micro-scans utilisés à la fois dans HCD et CID 1

Tableau 3 : Paramètres du spectromètre de masse utilisés pour détecter les ions secondaires (MS2). Abréviations : HCD = dissociation collision induite par une énergie élevée; CID = dissociation induite par collision; ms = millisecondes.

Métabolites de la MST M.W. (g/mole) [M+H]+1 [M-H]-1 Mode de détection Concentration la plus faible détectée (pmol/μL)
glycine 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
tryptophane 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
phénylalanine 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
arginine 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
thréonine* 119.05824 120.06552 118.05096 P
sérine 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
glutamate 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
méthionine 149.05105 150.05833 148.04377 P 1,96E+00
Aspartate 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E+00
valine 117.07898 118.08626 116.0717 P 1,49E+00
isoleucine 131.09463 132.10191 130.08735 P 1,84E+00
leucine 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E+00
histidine 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E+00
tyrosine 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
lysine 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
alanine 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
proline 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E+00
cystéine 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
asparagine 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E+00
glutamine 146.06914 147.07642 145.06186 P 1,92E+00
guanine 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E+00
guanosine 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
BPF 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
PIB 443.02434 444.03162 442.01706 P 2,57E+00
Le 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
AMPÈRE 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1,77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E+00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
glucose** 180.06339 181.07067 179.05611
fructose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
mannose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E+00
galactose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
ribose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
arabinose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E+00
fructose-6-phosphate*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
glucose-6-phosphate*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E+00
acide citrique 192,12 g 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
acide malique 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E+00
acide pyruvique 88.06 89.02332 87.008768 N 2,77E+00

Tableau 4 :Les concentrations les plus faibles de différents étalons de métabolites solubles dans l’eau que la méthode LC-MS/MS peut identifier et quantifier. La zone de crête MS1 de chaque étalon de métabolite a été utilisée pour estimer la concentration quantifiable la plus faible pour ce métabolite. Les valeurs moyennes de deux expériences indépendantes sont affichées. Trois répliques techniques ont été réalisées pour chacune des deux expériences indépendantes. REMARQUE: La thréonine * peut être détectée mais ne peut pas être quantifiée en raison de sa co-élution avec l’homosérine, un isomère chimique de la thréonine. Le glucose** ne peut pas être identifié car il crée plusieurs pics de chromatographie. Les étalons de métabolites*** ne peuvent être identifiés et quantifiés que dans des échantillons individuels, mais pas dans un mélange d’étalons de métabolites ou un mélange biologique de métabolites.

Tableau supplémentaire 1 : Valeurs de décalage du temps de rétention (RT) du même ensemble de métabolites pour les colonnes de phase zwitterionique et de phase inverse (voir Tableau des matériaux) après l’équilibrage des colonnes. Le tableau compare la reproductibilité de rétention des colonnes de phase zwitterionique et de phase inverse pour un ensemble distinct de métabolites qui diffèrent les uns des autres par leur hydrophilie et leur hydrophobicité. Ces métabolites ont été identifiés à l’aide de LC-MS/MS. Notez que les valeurs de décalage RT des métabolites hydrophiles (c.-à-d. NAD+, AMP, GMP, arginine et acide glutamique) sont significativement plus faibles et que les formes de pic sont nettement plus nettes pour la colonne en phase zwitterionique, par rapport à la colonne en phase inverse. En revanche, les valeurs de décalage RT des métabolites hydrophobes (c.-à-d. l’acide stéarique, l’acide laurique et l’acide décanoïque) sont significativement plus faibles et les formes de pic sont nettement plus nettes pour la colonne de phase inverse, par rapport à la colonne de phase zwitterionique. Les conditions de séparation chromatographique des métabolites à l’aide des colonnes de phase zwitterionique et de phase inverse sont détaillées dans le tableau 1 et le tableau supplémentaire 2,respectivement. Les valeurs de décalage RT rapportées ici sont basées sur la mesure de 20 échantillons différents prélevés dans différents flacons. Les échantillons ont été analysés après équilibrage des colonnes. Les métabolites de chaque échantillon ont été extraits de 5,0 × 108 cellules de levure. Les valeurs de décalage RT sont les moyennes de 20 échantillons différents (n = 20). Les valeurs p dérivées du test t non appaire ont été utilisées pour comparer les deux colonnes avec la variance égale entre les deux types d’échantillons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 2 : Conditions de LC pour la colonne de phase inverse 8 nommée dans la Table des matériaux et utilisée pour séparer les différents métabolites de la présente étude. Les propriétés de la colonne étaient les suivantes : 150 x 2,1 mm, polymère de 5 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 3 : Liste des 374 métabolites solubles dans l’eau récupérés et annotés à l’aide de la méthode LC-MS/MS. Tous les métabolites ont été récupérés à partir du même gradient LC, soumis à un algorithme de fragmentation d’acquisition dépendante des données (DDA) décrit dans le tableau supplémentaire 4et annoté à l’aide du logiciel nommé dans la table des matériaux. Les formes de pic MS1 de 211 métabolites (dont l’état dans le tableau est indiqué comme un blanc) étaient appropriées pour être utilisées pour la quantification, et leurs spectres MS2 respectifs avaient des correspondances complètes avec la bibliothèque spectrale mzCloud. Les spectres MS2 de 38 métabolites (dont l’état dans le tableau est indiqué par un d) avaient des correspondances complètes avec la bibliothèque spectrale en ligne. Néanmoins, leurs formes de pic MS1 n’étaient pas appropriées pour être utilisées pour la quantification. Les spectres MS2 de 125 métabolites (dont l’état dans le tableau est indiqué comme un n) n’avaient pas de correspondances complètes avec la bibliothèque spectrale en ligne. Ces métabolites ont été annotés comme suit : 1) à l’aide du « nœud Prédire la composition » (qui annote les métabolites en fonction de la correspondance exacte des valeurs MS1, du nombre d’isotopes appariés et manqués et de l’intensité en % d’isotopes correspondant à celle des étalons de référence théoriques); 2) en utilisant le « nœud ChemSpider » (qui annote les métabolites en fonction de la correspondance exacte des valeurs MS1 et du score de correspondance de similitude des spectres MS2 avec la bibliothèque spectrale en ligne); et 3) en utilisant les valeurs de décalage du temps de rétention (RT) des métabolites (ces valeurs dépendent de la structure physique et des propriétés chimiques des métabolites). Les métabolites énumérés dans le tableau ont été trouvés dans les 3 répétitions biologiques effectuées, avec les valeurs de décalage RT de < 0,2 min. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 4: Un algorithme de fragmentation par acquisition dépendante des données (DDA) qui a été utilisé ici pour l’annotation des métabolites solubles dans l’eau à l’aide du logiciel nommé dans table des matériaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 5 : Plage dynamique linéaire typique que nous avons observée lorsque nous avons mesuré les concentrations de différents acides aminés à l’aide du système MS nommé dans la Table des matériaux. Le système MS utilisé ici a une large plage dynamique linéaire (au moins deux ordres de grandeur) pour mesurer les concentrations de divers métabolites. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Pour utiliser avec succès le protocole décrit ici, suivez les mesures préventives décrites ci-dessous. Le chloroforme et le méthanol extraient diverses substances de la matière plastique de laboratoire. Par conséquent, manipulez-les avec prudence. Évitez l’utilisation de plastiques dans les étapes qui impliquent un contact avec l’un de ces deux solvants organiques. Utilisez des pipettes en verre borosilicate pour ces étapes. Augmentez ces pipettes avec du chloroforme et du méthanol avant utilisation. Utilisez uniquement des embouts de micropipette et des tubes en polypropylène résistant aux solvants organiques. Lors de la préparation de l’échantillon pour LC-MS/MS, éliminer toutes les bulles d’air dans les flacons en verre avant de les insérer dans une plaque de puits.

La colonne de phase zwitterionique utilisée ici nécessite un reconditionnement approfondi après chaque exécution pour minimiser le décalage RT. Pour le reconditionnement des colonnes, nous vous recommandons d’utiliser un volume de la solution de reconditionnement d’environ 20 volumes de la colonne. La colonne doit être reconditionné avec la phase mobile initiale pendant 15 minutes à un débit accru de 0,4 mL/ min. Pour éviter tout dommage à la colonne lors de son reconditionnement, maintenez la pression de la colonne en dessous de la limite supérieure de pression recommandée par le fabricant.

A noter, certaines colonnes de chromatographie à séparation mixte qui fonctionnent en mode phase inverse permettent la résolution des métabolites chargés40,41. Ces colonnes de séparation mixte sont basées sur la colonne de phase inverse utilisée ici (voir Tableau des matériaux)et contiennent des groupes polaires incorporés qui peuvent séparer les métabolites en fonction de la charge40,41.

Ici, nous avons décrit une méthode de métabolomique non ciblée basée sur LC-MS/MS pour l’analyse quantitative de nombreux métabolites solubles dans l’eau extraits de cellules de levure. La méthode offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée actuellement utilisées à cette fin. Ces avantages sont les suivants. Tout d’abord, la méthode est sensible et permet d’identifier et de quantifier certains métabolites solubles dans l’eau à des concentrations aussi faibles que 0,05 pmol/μL. La sensibilité rapportée des méthodes LC-MS/MS existantes est inférieure3,22,27,42. Deuxièmement, la méthode utilise une procédure de trempe cellulaire qui provoque une fuite significativement plus faible de métabolites intracellulaires de la cellule que celle rapportée pour les procédures actuellement utilisées31,33,38. Ainsi, la procédure que nous avons développée pour la trempe cellulaire réduit la mesure dans laquelle les procédures actuellement utilisées sous-estiment les concentrations intracellulaires de métabolites solubles dans l’eau. Troisièmement, contrairement aux méthodes LC-MS/MSexistantes 2,31,33, la méthode distingue différents isomères structurels et formes stéréoisomériques de nombreux métabolites. Ces métabolites comprennent diverses molécules porteuses d’énergie, des nucléotides, des acides aminés, des monosaccharides, des intermédiaires de la glycolyse et des intermédiaires du cycle tricarboxylique. Quatrièmement, nous avons utilisé la méthode pour créer une vaste base de données spectrales de masse de MS1 et MS2 pour l’identification et la quantification correctes d’un large éventail de métabolites spécifiques à l’aide des données LC-MS/MS brutes. En revanche, les bases de données spectrales de masse existantes en ligne de MS1 et MS2 sont incomplètes43,44,45. Cinquièmement, la méthode utilise un seul type d’extraction de métabolites pour récupérer des métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques. La diversité de ces métabolites dépasse de manière significative celle des méthodes alternatives pour une extraction en une seule étape des métabolites solubles dans l’eau à partir de cellules de levure3,22,27,46. Sixièmement, contrairement aux méthodes LC-MS/MSexistantes 3,22,47,48, la méthode utilise un seul type de colonne LC pour séparer les unes des autres diverses classes structurelles et fonctionnelles de métabolites solubles dans l’eau. Septièmement, la méthode permet d’identifier et de quantifier plus de 370 métabolites solubles dans l’eau extraits de cellules de levure. Ce nombre de métabolites identifiables et quantifiables dépasse le nombre de métabolites rapportés pour d’autres méthodes de métabolomique non ciblée dans les levures3,22,27,49,50.

La méthode présente plusieurs limites. Ces limitations sont les suivantes. La colonne de phase zwitterionique utilisée pour la séparation des métabolites par LC nécessite un reconditionnement approfondi après chaque exécution. De plus, la méthode n’est efficace que pour la métabolomique non ciblée des métabolites hydrophiles solubles dans l’eau. De plus, différentes formes isomériques de glucides (y compris les isomères du fructose, du glucose et du galactose) ne peuvent pas être quantifiées à l’aide de la méthode. En effet, la colonne de phase zwitterionique utilisée dans la méthode ne peut pas séparer ces isomères glucidiques les uns des autres lorsqu’ils sont présents dans un mélange avec d’autres métabolites. En outre, la méthode ne peut pas être exploitée pour identifier le glucose car ce glucide crée de multiples pics pendant la chromatographie sur la colonne de phase zwitterionique utilisée dans la méthode. Enfin, la thréonine ne peut pas être quantifiée à l’aide de la méthode en raison de la co-élution de cet acide aminé avec son homosérine isomère lors de la séparation des métabolites par chromatographie.

Nous utilisons cette méthode LC-MS/MS pour étudier les changements associés au vieillissement dans le métabolome soluble dans l’eau de la levure bourgeonnante S. cerevisiae. Nous utilisons également cette méthode pour étudier combien d’interventions génétiques, diététiques et pharmacologiques retardant le vieillissement affectent le métabolome soluble dans l’eau des cellules de levure au cours de leur vieillissement chronologique. En raison de sa polyvalence, de sa robustesse et de sa sensibilité, la méthode LC-MS/MS peut être utilisée avec succès pour l’évaluation quantitative des métabolomes solubles dans l’eau dans des organismes eucaryotes éloignés de l’évolution.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants aux membres actuels et anciens du laboratoire Titorenko pour les discussions. Nous reconnaissons le Centre pour les applications biologiques de la spectrométrie de masse, le Centre de génomique structurale et fonctionnelle et le Centre de microscopie et d’imagerie cellulaire (tous de l’Université Concordia) pour leurs services exceptionnels. Cette étude a été financée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CNSR) du Canada (RGPIN 2014-04482 et CRDPJ 515900 - 17). K.M. a été soutenu par la bourse Armand C. Archambault de l’Université Concordia et le Prix d’excellence du doyen des arts et des sciences de l’Université Concordia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochimie numéro 167 métabolites solubles dans l’eau profilage métabolomique trempe de l’activité métabolique coloration à l’iodure de propidium microscopie à fluorescence extraction de métabolites molécules porteuses d’énergie nucléotides acides aminés monosaccharides chromatographie liquide spectrométrie de masse
Métabolomique quantitative de <em>Saccharomyces Cerevisiae</em> par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem
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Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

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