Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.

Abstract

Metabolomik ist eine Methodik zur Identifizierung und Quantifizierung vieler niedermolekularer Zwischenprodukte und Stoffwechselprodukte innerhalb einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs, einer biologischen Flüssigkeit oder eines Organismus. Die Metabolomik konzentriert sich traditionell auf wasserlösliche Metaboliten. Das wasserlösliche Metabolom ist das Endprodukt eines komplexen zellulären Netzwerks, das verschiedene genomische, epigenomische, transkriptomische, proteomische und Umweltfaktoren integriert. Daher bewertet die metabolomische Analyse direkt das Ergebnis der Wirkung für all diese Faktoren in einer Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb verschiedener Organismen. Einer dieser Organismen ist die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae, ein einzelliger Eukaryot mit dem vollständig sequenzierten Genom. Da S. cerevisiae für umfassende molekulare Analysen geeignet ist, wird es als Modell für die Sezierung von Mechanismen verwendet, die vielen biologischen Prozessen innerhalb der eukaryotischen Zelle zugrunde liegen. Eine vielseitige Analysemethode zur robusten, empfindlichen und genauen quantitativen Bewertung des wasserlöslichen Metaboloms würde die wesentliche Methodik zur Sezierung dieser Mechanismen liefern. Hier stellen wir ein Protokoll für die optimierten Bedingungen der Stoffwechselaktivitätsabschreckung und wasserlöslichen Metabolitenextraktion aus S. cerevisiae-Zellen vor. Das Protokoll beschreibt auch den Einsatz der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur quantitativen Analyse der extrahierten wasserlöslichen Metaboliten. Die hier beschriebene LC-MS/MS-Methode der nicht-zielgerichteten Metabolomik ist vielseitig und robust. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 370 wasserlöslichen Metaboliten mit verschiedenen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften, einschließlich verschiedener Strukturisomere und stereoisomerer Formen dieser Metaboliten. Zu diesen Metaboliten gehören verschiedene Energieträgermoleküle, Nukleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Zwischenprodukte der Glykolyse und Zwischenprodukte des Tricarbonzyklus. Die LC-MS/MS-Methode der nicht-zielgerichteten Metabolomik ist sensibel und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger wasserlöslicher Metaboliten in Konzentrationen von nur 0,05 pmol/μL. Die Methode wurde erfolgreich zur Beurteilung wasserlöslicher Metabolome von Wildtyp- und mutierten Hefezellen eingesetzt, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden.

Introduction

Wasserlösliche Metaboliten sind niedermolekulare Zwischenprodukte und Stoffwechselprodukte, die zu essentiellen zellulären Prozessen beitragen. Diese evolutionär konservierten Prozesse umfassen die Umwandlung von Nährstoffen in nutzbare Energie, die Synthese von Makromolekülen, Zellwachstum und -signalisierung, Zellzykluskontrolle, Regulierung der Genexpression, Stressreaktion, postkonlationale Regulierung des Stoffwechsels, Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktionalität, vesikulärer Zelltransport, Autophagie, Zellalterung und regulierter Zelltod1,2,3.

Viele dieser wesentlichen Rollen wasserlöslicher Metaboliten wurden durch Studien in der Knospenhefe S. cerevisiae1, 3,4,7,9,14,15 , 16,17,18,19,20,21,22entdeckt. Dieser einzellige Eukaryot ist ein nützlicher Modellorganismus zur Sezierung von Mechanismen, durch die wasserlösliche Metaboliten aufgrund seiner Zugänglichkeit zu fortgeschrittenen biochemischen, genetischen und molekularbiologischen Analysen zu zellulären Prozessen beitragen23,24,25,26. Obwohl die LC-MS/MS-Methoden der nicht-zielgerichteten Metabolomik zur Untersuchung der Rolle wasserlöslicher Metaboliten in knospenden Hefen3,18,22,27verwendetwurden,erfordert diese Art der Analyse die Verbesserung ihrer Vielseitigkeit, Robustheit, Empfindlichkeit und Fähigkeit, zwischen verschiedenen strukturellen Isomeren und stereoisomeren Formen dieser Metaboliten zu unterscheiden.

Die letzten Jahre sind geprägt von signifikanten Fortschritten bei der Anwendung der LC-MS/MS-Methoden der nicht-zielgerichteten Metabolomik auf die Profilierung wasserlöslicher Metaboliten in vivo. Viele Herausforderungen bei der Verwendung dieser Methodik bleiben jedoch2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Zu diesen Herausforderungen gehören die folgenden. Erstens liegen die intrazellulären Konzentrationen vieler wasserlöslicher Metaboliten unter einer Empfindlichkeitsschwelle für die derzeit verwendeten Methoden. Zweitens ist die Effizienz des Abschreckens der Stoffwechselaktivität zu gering und das Ausmaß der abschreckenden Zellleckage von intrazellulären Metaboliten ist für aktuelle Methoden zu hoch; Daher unterschätzen die derzeit verwendeten Methoden die intrazellulären Konzentrationen wasserlöslicher Metaboliten. Drittens können die bestehenden Methoden die strukturellen Isomere (d. h. Moleküle mit der gleichen chemischen Formel, aber unterschiedlicher atomarer Konnektivität) oder Stereoisomere (d. h. Moleküle mit der gleichen chemischen Formel und atomaren Konnektivität, aber mit der unterschiedlichen atomaren Anordnung im Raum) spezifischer Metaboliten nicht unterscheiden; Dies verhindert die korrekte Annotation bestimmter Metaboliten durch die derzeit verwendeten Methoden. Viertens sind die vorhandenen massenspektralen Online-Datenbanken von Elternionen (MS1) und Sekundärionen (MS2) unvollständig; dies wirkt sich auf die korrekte Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Metaboliten unter Verwendung der lc-MS/MS-Rohdaten aus, die mit Hilfe der aktuellen Methoden erzeugt wurden. Fünftens können die bestehenden Methoden keine einzige Art der Metabolitenextraktion verwenden, um alle oder die meisten Klassen von wasserlöslichen Metaboliten wiederherzustellen. Sechstens können die bestehenden Methoden nicht einen einzigen Typ der LC-Säule verwenden, um alle oder die meisten Klassen wasserlöslicher Metaboliten voneinander zu trennen.

Hier optimierten wir die Bedingungen für das Abschrecken der Stoffwechselaktivität in S. cerevisiae-Zellen, die Aufrechterhaltung der meisten wasserlöslichen Metaboliten in diesen Zellen vor der Extraktion und die Extraktion der meisten Klassen wasserlöslicher Metaboliten aus Hefezellen. Wir haben eine vielseitige, robuste und empfindliche Methode zur LC-MS/MS-basierten Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 370 wasserlöslichen Metaboliten aus S. cerevisiae-Zellen entwickelt. Diese Methode der nicht zielgerichteten Metabolomik ermöglicht es, die intrazellulären Konzentrationen verschiedener Energieträgermoleküle, Nukleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Zwischenprodukte der Glykolyse und Tricarbonsäurezyklus-Zwischenprodukte zu beurteilen. Die entwickelte LC-MS/MS-Methode ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Strukturisomere und stereoisomerer Formen wasserlöslicher Metaboliten mit vielfältigen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Herstellung und Sterilisation eines Mediums für den Hefeanbau

  1. Machen Sie 180 ml eines vollständigen Hefeextrakts mit Bactopepton (YP) Medium. Das komplette YP-Medium enthält 1% (w/v) Hefeextrakt und 2% (w/v) Bactopepton.
  2. 180 ml des YP-Mediums gleichmäßig in vier 250-ml-Erlenmeyerkolben verteilen. Jeder dieser Kolben enthält 45 ml des YP-Mediums.
  3. Sterilisieren Sie die Kolben mit YP-Medium durch Autoklavieren bei 15 psi/121 °C für 45 min.

2. Wildtyp-Hefestamm

  1. Verwenden Sie den STAMM BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Hefe im YP-Medium mit 2% Glukose züchten

  1. Sterilisieren Sie eine 20% (w/v) Stammlösung von Glukose durch Autoklavieren bei 15 psi/121 °C für 45 min.
  2. 5 ml der autoklavierten 20%igen (w/v) Stammlösung von Glukose in jeden der beiden Erlenmeyerkolben mit 45 ml des sterilisierten YP-Mediums geben. Die Endkonzentration Glukose im YP-Medium beträgt 2% (w/v).
  3. Verwenden Sie eine mikrobiologische Schleife, um Hefezellen in jeden der beiden Erlenmeyerkolben mit dem YP-Medium mit 2% Glukose zu impfen.
  4. Züchten Sie die Hefezellen über Nacht bei 30 °C in einem Rotationsschüttler, der auf 200 U / min eingestellt ist.
  5. Nehmen Sie ein Aliquot der Hefekultur. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Hefezellen pro ml Kultur. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.

4. Zelltransfer zu und Zelle wächst im YP-Medium mit 2% Glukose

  1. 5 ml der sterilisierten 20% (w/v) Stammlösung von Glukose zu jedem der verbleibenden zwei Erlenmeyerkolben mit dem autoklavierten YP-Medium geben. Die Endkonzentration von Glukose beträgt 2% (w/v).
  2. Übertragen Sie ein Volumen der Hefekultur über Nacht in YP-Medium mit 2% Glukose, das die Gesamtzahl von 5,0 x 10 7 Zellen enthält, in jeden derbeiden Erlenmeyerkolben mit dem YP-Medium, das 2% Glukose enthält. Verwenden Sie eine sterile Pipette für den Zelltransfer.
  3. Züchten Sie die Hefezellen für mindestens 24 h (oder mehr, wenn das Experiment es erfordert) bei 30 °C in einem Rotationsschüttler, der auf 200 U / min eingestellt ist.

5. Herstellung von Reagenzien, Vorbereitung von Laborgeräten und Einrichtung von Geräten zum Zellabschrecken

  1. Bereiten Sie Folgendes vor: 1) eine Abschrecklösung (60% hochwertiges (>99,9%) Methanol in 155 mM Ammoniumbicarbonat (ABC) Puffer, pH = 8,0); 2) eine eiskalte ABC-Lösung (pH = 8,0); 3) ein digitales Thermometer, das bis zu -20 °C messen kann; 4) 500 ml große Zentrifugenflaschen; 5) eine vorgekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit vorgekühltem Rotor und vorgekühlten 500 mL Zentrifugenflaschen für diesen Rotor, alle bei -5 °C; 6) Metabolitenextraktionsröhrchen (15 mL Hochgeschwindigkeits-Glaszentrifugenröhrchen mit mit Polytetrafluorethylen ausgekleideten Kappen); und 7) Trockeneis.

6. Zellabschreckung

  1. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Hefezellen pro ml YP mit 2% Glukosekultur zu bestimmen.
  2. Übertragen Sie ein Volumen der Kultur in YP-Medium mit 2% Glukose, das die Gesamtzahl von 5,0 x 108 Zellen enthält, in vorgekühlte 500 ml Zentrifugenflaschen.
  3. Füllen Sie die Zentrifugenflasche mit den Zellen bis zum Volumen von 200 ml schnell mit einer bei -20 °C gelagerten Abschrecklösung.
  4. Zentrifuge die Flaschen in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 11.325 x g für 3 min bei -5 °C.
  5. Schnelle und zarte Rückgewinnung der Flasche aus der Zentrifuge; Schrauben Sie den Deckel vorsichtig ab und entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
  6. Schnell das Zellpellet in 10 ml eiskaltem ABC-Puffer resuspendieren und die Suspension in ein 15 mL Hochgeschwindigkeits-Glaszentrifugenröhrchen mit einer mit Polytetrafluorethylen ausgekleideten Kappe zur Metabolitenextraktion überführen.
  7. Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation in einer klinischen Zentrifuge bei 3.000 x g für 3 min bei 0 °C.
  8. Entfernen Sie schnell den Überstand und legen Sie das Röhrchen auf Trockeneis, um mit der Metabolitenextraktion zu beginnen, oder lagern Sie das Röhrchen bis zur Extraktion bei -80 °C.

7. Herstellung von Reagenzien, Laborgeräten und Geräten zur Metabolitenextraktion

  1. Bereiten Sie Folgendes vor: 1) LC-MS-Chloroform; 2) LC-MS-Methanol; 3) LC-Qualität nano-reines Wasser; 4) LC-MS-Klasse (ACN); 5) Glasperlen (säuregewaschen, 425-600 μm); 6) ein Wirbel mit einem Schaumstoffrohrhalter-Kit mit Halterung; 7) 15 mL Hochgeschwindigkeits-Glaszentrifugenröhrchen mit polytetrafluorethylen-ausgekleideten Kappen; 8) MS-Durchstechflaschen; 9) Trockeneis; und 10) 1,5 ml Röhrchen einmal mit Ethanol, einmal mit ACN und einmal mit nanoreinem Wasser gewaschen.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur Mikropipettenspitzen und -röhrchen aus Polypropylen, die gegen organische Lösungsmittel beständig sind.

8. Metabolitenextraktion

  1. Zu den Metaboliten, die auf Trockeneis aufbewahrt oder bei einem Röhrchen von -80 °C ab Schritt 6.7 gelagert werden, wird Folgendes hinzugefügt: 1) 2 ml Chloroform, das bei -20 °C gelagert wird; 2) 1 ml Methanol, gelagert bei -20 °C; 3) 1 ml eiskaltes nanoreines Wasser; und 4) 200 μL 425-600 μm säuregewaschene Glasperlen.
  2. Bedecken und schließen Sie den Mund eines Rohres mit Aluminiumfolie. Legen Sie die Rohre in ein Schaumrohrhalter-Kit mit Halterung und wirbeln Sie sie für 30 minuten bei mittlerer Geschwindigkeit (d. H. Bei einer Geschwindigkeit, die auf 6 eingestellt ist, wobei 12 die maximale Geschwindigkeit eines Wirbels ist) bei 4 ° C, um die Metabolitenextraktion zu erleichtern.
  3. Inkubieren Sie das Röhrchen für 15 minuten auf Eis (NICHT Trockeneis!), um die Proteinausfällung und die Trennung der oberen wässrigen von der unteren organischen Phase zu fördern.
  4. Zentrifuge das Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C. Dieser Zentrifugationsschritt ermöglicht es, die obere wässrige Phase (die wasserlösliche Metaboliten enthält) von der mittleren Schicht (die Zelltrümmer und Proteine enthält) und von der unteren organischen Phase (die hauptsächlich Lipide enthält) zu trennen.
  5. Verwenden Sie eine Mikropipette, um die obere wässrige Phase (400 μL) in ein gewaschenes und markiertes 1,5-ml-Röhrchen mit 800 μL ACN zu übertragen, das bei -20 °C gelagert wurde.
    HINWEIS: Nach dem Hinzufügen der oberen wässrigen Phase zu ACN, die bei -20 ° C gehalten wird, kommt es zu weißen Wolkenniederschlägen.
  6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit der Probe in einer Tischzentrifuge bei 13.400 x g für 10 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Der weiße Wolkenniederschlag verschwindet nach der Zentrifugation.
  7. 800 μL aus dem oberen Teil einer Flüssigkeit in der Tube in eine markierte MS-Durchstechflasche geben. Lagern Sie die Probe bei 0 °C, bis sie mit LC-MS/MS analysiert wird.

9. Herstellung von Reagenzien, Laborgeräten und Geräten für LC

  1. Bereiten Sie Folgendes vor: 1) einen Wirbel; 2) ein Ultraschall-Ultraschallgerät; 3) MS-Glasfläschchen; 4) ein LC-System, das mit einer binären Pumpe, einem Entgaser und einem Autosampler ausgestattet ist; 5) eine zwitterionische Phasenchromatographiesäule (5 μm Polymer, 150 x 2,1 mm), die in der Materialtabellegenannt ist; 6) eine Säulenheizung; und 7) mobile Phasen, einschließlich Phase A (5:95 ACN:Wasser (v/v) mit 20 mM Ammoniumacetat, pH = 8,0) und Phase B (100% ACN).

10. Trennung der extrahierten Metaboliten durch LC

  1. Den Inhalt der MS-Durchstechflasche 15 Minuten lang einer Ultraschall beschallen.
  2. Wirbeln Sie die MS-Durchstechflasche 3x für 10 Sec bei Raumtemperatur (RT).
  3. Legen Sie die MS-Durchstechflasche in die Brunnenplatte.
  4. Halten Sie die Säule während des Chromatographen bei 45 °C und einem Durchfluss von 0,250 ml/min. Halten Sie die Probe in der Bohrplatte bei 0 °C. In Tabelle 1 finden Sie die LC-Gradienten, die während der Chromatographie verwendet werden müssen.
    HINWEIS: Ein repräsentatives Gesamtionenchromatogramm wasserlöslicher Metaboliten, die aus Zellen des Wildtypstamms BY4742 extrahiert wurden, ist in Abbildung 1 dargestellt. Die durch LC getrennten Metaboliten wurden durch eine massenspektrometrische Analyse identifiziert und quantifiziert, die im positiven Ionisationsmodus [ESI (+)] durchgeführt wurde, wie für Schritt 11 beschrieben.

11. Massenspektrometrische Analyse von Metaboliten, die durch LC getrennt sind

  1. Verwenden Sie ein Massenspektrometer mit beheizter Elektrospray-Ionisation (HESI) zur Identifizierung und Quantifizierung von wasserlöslichen Metaboliten, die durch LC getrennt wurden. Verwenden Sie den Analysator des Massenspektrometers für MS1-Ionen und den Detektor des Massenspektrometers für MS2-Ionen. Verwenden Sie die Einstellungen in Tabelle 2 und Tabelle 3 für die datenabhängige Erfassung von MS1- bzw. MS2-Ionen.
  2. Verwenden Sie ein Probenvolumen von 10 μL für die Injektion sowohl im ESI- (+) als auch im ESI-Modus (-).

12. Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Metaboliten durch Verarbeitung von Rohdaten aus LC-MS/MS

  1. Verwenden Sie die in der Materialtabelle genannte Software, um verschiedene wasserlösliche Metaboliten aus rohen LC-MS/MS-Dateien zu identifizieren und zu quantifizieren. Diese Software verwendet MS1 für die Metabolitenquantifizierung und MS2 für die Metabolitenidentifikation. Die Software nutzt die am umfangreichsten kuratierte Massenspektralfragmentierungsbibliothek, um die Metaboliten mit den LC-MS/MS-Rohdaten durch Abgleich von MS-Spektren zu kommentieren. Diese Software verwendet auch die genaue Masse von MS1 und Isotopenmusterabgleich, um Metaboliten mithilfe von Online-Datenbanken zu kommentieren. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 2.
  2. Nutzen Sie die Bibliothek der Datenbanken und Spektren, die online frei verfügbar ist (https://www.mzcloud.org), um nach MS2-Spektren der Rohdaten zu suchen.

13. Membranintegritätstest durch Propidieniodid (PI)-Färbung und Fluoreszenzmikroskopie

  1. Nachdem die Zelle wie für Schritt 6 beschrieben abgeschreckt wurde, waschen Sie die abgeschreckten Zellen gründlich mit 15 ml ABC-Puffer, um die Abschrecklösung zu entfernen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min bei 0 °C.
  2. Das Zellpellet wird in 1 ml ABC-Puffer resuspendiert und 0,5 ml pi-Lösung (0,5 mg/ml) hinzugefügt.
  3. Ein Röhrchen mit der Probe 3x für 10 s durchträuchern und 10 min im Dunkeln und auf Eis inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit der Probe in einer Tischzentrifuge bei 13.400 x g für 10 min bei 4 °C.
  5. Entfernen Sie den Überstand und brauen Sie das Pellet in 1 ml ABC-Puffer wieder auf.
  6. Zentrifuge das Röhrchen bei 13.400 x g für 10 min bei 4 °C und entferne den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male, um den an die Zelloberfläche gebundenen PI zu entfernen.
  7. Das Pellet wird in 300 μL ABC-Puffer resuspendiert. Legen Sie 10 μL der Suspension auf die Oberfläche eines Objektträgers.
  8. Erfassen Sie die Differentiellen Interferenzkontrast- (DIC) und Fluoreszenzmikroskopiebilder mit einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie einen Filter, der bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen von 593 nm bzw. 636 nm aufgestellt ist.
  9. Verwenden Sie eine Software, um die Gesamtzahl der Zellen (im DIC-Modus) und die Anzahl der fluoreszierend gefärbten Zellen zu zählen. Verwenden Sie diese Software auch, um die Intensität der Färbung für einzelne Zellen zu bestimmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Um eine quantitative Bewertung von wasserlöslichen Metaboliten innerhalb einer Hefezelle zu verbessern, haben wir die Bedingungen der Zellabschreckung für den Metabolitennachweis optimiert. Das Zellabschrecken zu diesem Zweck beinhaltet einen schnellen Abknirschen aller enzymatischen Reaktionen innerhalb einer Zelle31,33,37,38. Ein solcher Stopp der zellulären Stoffwechselaktivität ist ein wesentlicher Schritt jeder Methode zur Quantifizierung wasserlöslicher Metaboliten in vivo, da er die Unterschätzung ihrer intrazellulären Konzentrationen verhindert31,33,37,38. Zellabschreckung zur Metabolitenbewertung beeinträchtigt immer die Integrität der Plasmamembran (PM) (und der Zellwand (CW), falls vorhanden); Dies verursacht Metabolitenleckage aus der Zelle31,33,37,38. Das Verfahren verwendet Zellabschreckbedingungen, die eine solche Beeinträchtigung minimieren und dadurch die quenching-assoziierte Zellleckage intrazellulärer Metaboliten signifikant verringern. Tatsächlich beinhalten die meisten aktuellen Methoden zur Zellabschreckung die Verwendung einer bestimmten Konzentration von Methanol (d. h. 40% (v/v), 60% (v/v), 80% (v/v) oder 100% (v/v)) bei einer bestimmten Temperatur (d. h. -20 °C, -40 °C oder -60 °C), mit oder ohne Puffer31,33,37,38. Wir verglichen die Effizienz der PM- und CW-Beeinträchtigung für eine der derzeit verwendeten Zellabschreckverfahren (d.h. durch Zellbehandlung mit 80% (v/v) Methanol bei -40 °C in Abwesenheit eines Puffers38)mit der für die modifizierte Zellabschreckmethode (d.h. durch Zellbehandlung mit 60% (v/v) Methanol bei -20 °C in Gegenwart einer isotonischen gepufferten ABC-Lösung bei pH = 8,0). PI ist ein fluoreszierender Farbstoff, der für intakte Zellen undurchlässig ist; es kann nur in die Zelle gelangen, wenn die Integrität des PM (und des CW, falls vorhanden) beeinträchtigt ist39. Darüber hinaus steigt die Intensität der Fluoreszenzemission durch PI um das 30-fache, wenn sie an DNA oder RNA39gebunden ist. Somit kann ein PI-Färbeassay zur Beurteilung der Effizienz der Quenching-assoziierten Zellleckage intrazellulärer Metaboliten verwendet werden, da diese Metaboliten nur dann in den extrazellulären Raum austreten können, wenn das PM und CW einer Hefezelle beschädigt sind39. Wir fanden heraus, dass die modifizierte Zellabschreckmethode signifikant geringere Schäden an PM und CW verursacht als die Abschreckmethode durch Zellbehandlung mit nicht gepufferter 80% (v/ v) Methanol bei -40 °C (Abbildung 3). Tatsächlich wiesen fast alle Zellen, die mit dem Verfahren abgeschreckt wurden, eine rote Fluoreszenzemission auf, die für die Hefezellen charakteristisch ist, deren PM und CW nicht beschädigt sind (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu zeigten fast alle Zellen, die mit der anderen Methode abgeschreckt wurden, eine grüne Fluoreszenzemission, die für die Hefezellen charakteristisch ist, deren PM und CW signifikant geschädigt sind (Abbildung 3). Die intensivste rote Fluoreszenz wurde von einer Software in grüne Fluoreszenz umgewandelt, um zwischen der starken roten Fluoreszenz und den milden roten Fluoreszenzemissionen zu unterscheiden.

Das modifizierte Zellabschreckverfahren verursachte eine deutlich geringere Leckage von wasserlöslichen Metaboliten aus Hefezellen als das - Abschreckverfahren durch Zellbehandlung mit ungepuffertem 80%igem (v/v) Methanol bei -40 °C. Wir unterzogen eine gleiche Anzahl von Hefezellen dem Abschrecken mit beiden Methoden (d.h. durch Zellbehandlung mit 60% (v/v) Methanol bei -20 °C in Gegenwart einer isotonischen gepufferten ABC-Lösung bei pH = 8,0; Abbildung 4) oder das andere Verfahren (d. h. durch Zellbehandlung mit ungepuffertes 80%v/v)-Methanol bei -40 °C; Abbildung 5). Das Ausmaß der Quenching-assoziierten Zellleckage in die extrazelluläre Lösung wurde für spezifische wasserlösliche Metaboliten mit Hilfe von LC-MS/MS untersucht. Die Konzentrationen verschiedener Aminosäureklassen (d.h. große und kleine saure, basische, neutral-unpolare und neutrale polare Aminosäuren) in der extrazellulären Lösung wurden vor und nach dem Zellabschrecken gemessen. Wir fanden heraus, dass die Zellabschreckmethode eine signifikant geringere Leckage all dieser Aminosäureklassen in die extrazelluläre Lösung verursacht (Abbildung 4) als die andere Methode (Abbildung 5).

Die LC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bewertung wasserlöslicher Metaboliten innerhalb einer Hefezelle verwendet einen einzigen Säulentyp zur chromatographischen Trennung aller wasserlöslichen Metabolitenklassen. Diese Spalte ist die zwitterionische Phasenspalte, die in der Materialtabellegenannt ist. Wir fanden heraus, dass diese Säule eine viel effizientere Trennung verschiedener Klassen wasserlöslicher Metaboliten bietet als die in der Materialtabelle genannte Umkehrphasensäule (Ergänzende Tabelle 1). Tatsächlich waren die Verschiebungswerte der Retentionszeit (RT) der wasserlöslichen Metabolitenstandards (d. h. NAD+, AMP, GMP, Arginin und Glutaminsäure) signifikant niedriger und die Spitzenformen für die Zwitterionsphasensäule im Vergleich zur Umkehrphasensäule wesentlich schärfer (Ergänzende Tabelle 1). LC-Bedingungen, die für die chromatographische Trennung aller Metaboliten (d. h. wasserlöslich und wasserunlöslich) für die Umkehrphasensäule verwendet werden, sind in der ergänzenden Tabelle 2aufgeführt.

Ein weiterer Vorteil der LC-MS/MS-Methode besteht in der Fähigkeit der chromatographischen Trennung an der obigen zwitterionischen Phasensäule, um verschiedene wasserlösliche Metaboliten mit unterschiedlichen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften effizient voneinander zu trennen. Diese wasserlöslichen Metaboliten umfassen die folgenden Metabolitenklassen: 1) saure, basische, neutralpolare und nicht neutrale polare Aminosäuren, einschließlich ihrer verschiedenen Strukturisomere (Abbildung 6); 2) stabile und instabile Nukleotide und ihre Derivate, die lebenswichtige Funktionen innerhalb einer Zelle erfüllen (Abbildung 7); und 3) verschiedene Monosaccharide, einschließlich ihrer verschiedenen stereoisomeren Formen (Abbildung 8).

Wichtig ist, dass die LC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bewertung wasserlöslicher Metaboliten innerhalb einer Hefezelle vielseitig und robust war. Es ermöglichte uns, 374 wasserlösliche Metaboliten mit verschiedenen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften in S. cerevisiae-Zellen zu identifizieren und zu quantifizieren, die im vollständigen YP-Medium kultiviert wurden, das zunächst 2% Glukose enthielt (Ergänzende Tabelle 3). 240 Metaboliten wurden im positiven Ionisationsmodus und 134 Metaboliten im negativen Ionisationsmodus nachgewiesen. Die Identitäten all dieser wasserlöslichen Metaboliten wurden bestätigt, indem ihre ms2-Fragmente (Data-Dependent Acquisition, DDA), die sowohl im positiven als auch im negativen Ionisationsmodus erworben wurden, mit der MS2 mzCloud-Spektralbibliothek abgegleicht wurden. Diese Online-Bibliothek enthält die Spektren von Metabolitenstandards, die sich in ihren MS1- und DDA-MS2-Parametern unterscheiden. Um den Umfang der Übereinstimmung der MS2-Spektren der Probe mit der Online-Spektralbibliothek zu maximieren, haben wir verschiedene DDA MS2-Parameter verwendet. Diese Parameter sind in der ergänzenden Tabelle 4 aufgeführt. Fast 6.000 Merkmale (mutmaßliche Metaboliten) für dieselbe Probe wurden mit Hilfe der Hochenergie-induzierten-Kollisionsdissoziation (HCD) oder kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) Fragmentierungsmethode unter Verwendung der Top 5 MS2-Ereignisse, 35 Kollisionsenergiewerte und 10 ms Aktivierungszeiten erfasst. Nach Filterung der resultierenden Dateien mit > 95% MS2-Übereinstimmung und > 90% MS1-Isotopenmuster-Matching-Kriterien wurden nur 162 Metaboliten unter HCD-fragmentiertem Zustand und 142 Metaboliten unter CID-fragmentiertem Zustand identifiziert. 81 von 162 Metaboliten waren einzigartig für die HCD-Fragmentierungsmethode, während 42 von 142 für die CID-Fragmentierungsmethode eindeutig waren (siehe ein Blatt mit dem Titel "T5_35E__10 ms_HCD vs CID" in Der Ergänzenden Tabelle 4). Daher kamen wir zu dem Schluss, dass die korrekte Annotation von wasserlöslichen Metaboliten mit Hilfe der LC-MS/MS-Methode die Verwendung vieler verschiedener DDA MS2-Parameter erfordert.

Auch die LC-MS/MS-Methode ist hochempfindlich. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger wasserlöslicher Metaboliten in Konzentrationen von nur 0,05 pmol/μL (siehe Daten für Phenylalanin in Tabelle 4). Diese Quantifizierungsgrenze variiert innerhalb eines breiten Konzentrationsbereichs für verschiedene Metabolitenklassen (Tabelle 4).

Das hier verwendete MS-System verfügt über einen weiten (mindestens zwei Größenordnungen) linearen Dynamikbereich zur Messung der Konzentrationen verschiedener Metaboliten (Ergänzende Tabelle 5).

Figure 1
Abbildung 1: Das Gesamtionenchromatogramm (TIC) aus Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC-MS) Daten von wasserlöslichen Metaboliten, die aus Zellen des Wildtypstamms BY4742 extrahiert wurden. Die Metaboliten wurden durch LC auf der in der Materialtabelle genanntenzwitterionischen Phasenchromatographiesäule getrennt. Die Metaboliten wurden durch MS von Elternionen (MS1) nachgewiesen, die im positiven Elektrospray-Ionisationsmodus erzeugt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Ein Workflow zur Analyse wasserlöslicher Metaboliten mit Hilfe der in der Materialtabelle genannten Software. Alle Parameter wurden von der Software basierend auf den MS-Rohdaten automatisch korrigiert, mit Ausnahme der folgenden: 1) Registerkarte "Verbindungen erkennen": min einstellen, Spitzenintensität 10.000; und 2) Registerkarte "Search ChemSpider": 4 Online-Datenbanken wurden für die Identifizierung von Metaboliten ausgewählt, darunter die BioCyc, humane Metabolomdatenbank, KEGG und Hefemetabolomdatenbank. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Differentialinterferenzkontrast (DIC; obere Reihe) und Fluoreszenz (untere Reihe) mikroskopische Bilder von Hefezellen, die entweder mit Ammoniumbicarbonat (ABC)-Puffer (pH = 8,0; Kontrolle) oder mit einer anderen Abschrecklösung abgeschreckt wurden. Nach dem Zellabschrecken wurden gleich viele Zellen mit der PI-Lösung für 10 min im Dunkeln und auf Eis inkubiert. Die intensivste rote Fluoreszenz wurde per Software in grüne Fluoreszenz umgewandelt, um zwischen der starken roten Fluoreszenz und den milden roten Fluoreszenzemissionen zu unterscheiden. Die Effizienz der Schädigung von PM und CW wurde für die Methode der Zellabschreckung (d.h. durch Zellbehandlung mit 60% (v/v) Methanol bei -20 °C in Gegenwart einer isotonischen gepufferten ABC-Lösung bei pH = 8,0) und eine der derzeit verwendeten Methoden (d.h. durch Zellbehandlung mit 80% (v/v) Methanol bei -40 °C in Abwesenheit eines Puffers) verglichen. Eine Skalierungsleiste wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Der Leckageprozentsatz verschiedener Aminosäureklassen für das Verfahren der Zellabschreckung. 5,0 x 108 hefezellen wurden durch die Behandlung mit 60% (v/v) Methanol bei -20 °C in Gegenwart einer isotonischen gepufferten ABC-Lösung bei pH = 8,0 abgeschreckt. Der Leckageprozentsatz verschiedener Aminosäureklassen wurde mit LC-MS/MS bewertet, um ihre Konzentrationen in der extrazellulären Lösung vor und nach dem Abschrecken zu messen. Die Mittelwerte ± SD und einzelnen Datenpunkten werden angezeigt (n = 3). * p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Der Leckageprozentsatz verschiedener Aminosäureklassen für eine der derzeit verwendeten Zellabschreckmethoden. 5,0 x 108 Hefezellen wurden durch die Behandlung mit 80% (v/v) Methanol bei -40 °C in Abwesenheit eines Puffers abgeschreckt. Der Leckageprozentsatz verschiedener Aminosäureklassen wurde mit LC-MS/MS bewertet, um ihre Konzentrationen in der extrazellulären Lösung vor und nach dem Abschrecken zu messen. Die Mittelwerte ± SD und einzelnen Datenpunkten werden angezeigt (n = 3). * p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Effiziente chromatographische Trennung von sauren, basischen, neutralpolaren und nicht neutralen polaren Aminosäureklassen, einschließlich zweier Strukturisomere (d. h. Leucin und Isoleucin), auf der in der Materialtabelle genannten zwitterionischen Phasensäule. Alle diese Aminosäuren wurden durch MS/MS im positiven Ionisationsmodus [ESI (+)] nachgewiesen. Die Bedingungen für LC an der zwitterionischen Phasenchromatographiesäule sind in Tabelle 1beschrieben. Die Bedingungen für MS/MS sind in Tabelle 2 und Tabelle 3beschrieben. Alle Aminosäurestandards werden kommerziell gekauft (z. B. Sigma). Die Retentionszeitverschiebungen zwischen 3 unabhängigen Chromatographieläufen betragen weniger als ± 10 Sekunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Effiziente chromatographische Trennung verschiedener Klassen von Nukleotiden, einschließlich energetisch instabiler Nukleotide (Nukleosidmonophosphate, Nukleosiddiphosphate und Nukleosidtriphosphate) und Elektronenträgermoleküle (NADH und NAD+), auf derin derMaterialtabelle genannten Zwitterionphasensäule. Alle diese Nukleotide wurden durch MS/MS im positiven Ionisationsmodus [ESI (+)] nachgewiesen. Die Bedingungen für LC an der zwitterionischen Phasenchromatographiesäule sind in Tabelle 1beschrieben. Die Bedingungen für MS/MS sind in Tabelle 2 und Tabelle 3beschrieben. Alle Nukleotidstandards werden kommerziell gekauft (z. B. Sigma). Die Retentionszeitverschiebungen zwischen 3 unabhängigen Chromatographieläufen betragen weniger als ± 10 Sekunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Effiziente chromatographische Trennung verschiedener Klassen von Monosacchariden, einschließlich Strukturisomeren und stereoisomeren Formen von Aldo- und Ketohexosen (Fructose, Mannose und Galactose) und Aldopentosen (Ribose und Arabinose), auf derin derMaterialtabelle genannten zwitterionischen Phasensäule. Alle diese Monosaccharide wurden durch MS/MS im positiven Ionisationsmodus [ESI (+)] nachgewiesen. Die Bedingungen für LC an der zwitterionischen Phasenchromatographiesäule sind in Tabelle 1beschrieben. Die Bedingungen für MS/MS sind in Tabelle 2 und Tabelle 3beschrieben. Alle Monosaccharid-Standards werden kommerziell gekauft (z. B. Sigma). Die Retentionszeitverschiebungen zwischen 3 unabhängigen Chromatographieläufen betragen weniger als ± 10 Sekunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Spaltentyp SeQuant ZIC-pHILIC 5μm Polymer 150 x 2,1 mm
Lösungsmittel A LC-MS Klasse H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM Ammoniumacetat
Lösungsmittel B Acetonitril (ACN) in LC-MS-Qualität
Druckgrenze Maximum = 300 bar Minimum = 0
HPLC-Gradientenprogramm
Zeit (Minuten) Durchfluss (0,25 ml/min) Kompositionen
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tabelle 1: LC-Zustand zur Trennung von wasserlöslichen Metaboliten mit Hilfe derin derMaterialtabelle genannten zwitterionischen Phasensäule. Diese Bedingungen wurden in allen hier beschriebenen Experimenten verwendet.

Voller Scan-Massenbereich (Dalton) 70-900
FTMS (Orbitrap Analyzer) volle Scanauflösung 6,0 x 104
FTMS (Orbitrap Analyzer) HCD Auflösung 7500
FTMS-Vollscan-AGC-Ziel 1,0 x 106
FTMS MSn AGC-Ziel 5,0 x 104
Ionenfallen (LTQ) MSn AGC-Ziel 1,0 x 104
Ionenquellentyp Beheizte Elektrospray-Ionisation
Kapillartemperatur (°C) 275
Quellheizung Temperatur (°C) 250
Mantelgasstrom 10
Aux Gasstrom 5

Tabelle 2: Die Massenspektrometereinstellungen, die zur Analyse von Metaboliten verwendet werden, die durch LC getrennt wurden. Diese Bedingungen wurden für die Analyse von Metaboliten in allen hier beschriebenen Experimenten verwendet. Abkürzungen: FTMS = Fourier-Transformation (FTMS); HCD = hochenergetisch-induzierte Kollisionsdissoziation; LTQ = linearer Trap-Quadrupol; AGC = Automatic Gain Control, ein Ionenpopulationswert für MS und MS/MS.

Polarität des Instruments Positiv/Negativ
Aktivierungstyp CID/HCD
Min. Signal erforderlich 5000
Isolationsbreite 2
Normalisierte Kollisionsenergien für CID 35, 60
Normalisierte Kollisionsenergien für HCD 35, 45, 55
Standard-Ladezustand 1
Aktivierungszeit für CID (ms) 10, 30
Aktivierungszeit für HCD (ms) 10
Anzahl der MS/MS-Ereignisse in CID Top 3, Top 5, Top 10
Anzahl der MS/MS-Ereignisse in HCD Die Top 5
Anzahl der Mikroscans, die sowohl in HCD als auch in CID verwendet werden 1

Tabelle 3: Die Massenspektrometereinstellungen zum Nachweis sekundärer Ionen (MS2). Abkürzungen: HCD = high-energy-induced-collision-dissociation; CID = kollisionsinduzierte Dissoziation; ms = Millisekunden.

Std-Metaboliten M.W. (g/Mol) [M+H]+1 [M-H]-1 Erkennungsmodus Niedrigste nachgewiesene Konzentration (pmol/μL)
Glycin 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
Tryptophan 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
Phenylalanin 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
Arginin 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
Threonin* 119.05824 120.06552 118.05096 P
Serin 105.04259 106.04987 104.03531 P 4,66E+00
Glutamat 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
Methionin 149.05105 150.05833 148.04377 P 1,96E+00
Aspartat 133.03751 134.04479 132.03023 P 3,75E+00
Valin 117.07898 118.08626 116.0717 P 1,49E+00
Isoleucin 131.09463 132.10191 130.08735 P 1,84E+00
Leucin 131.09463 132.10191 130.08735 P 2,26E+00
Histidin 155.06948 156.07676 154.0622 P 2,53E+00
Tyrosin 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
Lysin 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
Alanin 89.04768 90.05496 88.0404 P 1,12E+00
Prolin 115.06333 116.07061 114.05605 P 1,05E+00
Cystein 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
Asparagin 132.05349 133.06077 131.04621 P 1,08E+00
Glutamin 146.06914 147.07642 145.06186 P 1,92E+00
Guanin 151.04941 152.05669 150.04213 P 5,47E+00
Guanosin 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
BIP 443.02434 444.03162 442.01706 P 2,57E+00
AGB 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
AMPERE 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1,32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1,77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1,47E+00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
Glukose** 180.06339 181.07067 179.05611
Fruktose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
Mannose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1,05E+00
Galactose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
Ribose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1,10E+00
arabinose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1,23E+00
Fructose-6-phosphat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6,60E+00
Glukose-6-phosphat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4,27E+00
Zitronensäure 192,12 g 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
Äpfelsäure 134.09 135.0288 133.014247 N 1,23E+00
Brenztraubensäure 88.06 89.02332 87.008768 N 2,77E+00

Tabelle 4:Die niedrigsten Konzentrationen verschiedener wasserlöslicher Metabolitenstandards, die die LC-MS/MS-Methode identifizieren und quantifizieren kann. Die MS1-Peakfläche jedes Metabolitenstandards wurde verwendet, um die niedrigste quantifizierbare Konzentration für diesen Metaboliten abzuschätzen. Die Mittelwerte von zwei unabhängigen Experimenten werden gezeigt. Für jedes der beiden unabhängigen Experimente wurden drei technische Replikate durchgeführt. HINWEIS: Threonin* kann nachgewiesen, aber aufgrund seiner Co-Elution mit Homoserin, einem chemischen Isomer von Threonin, nicht quantifiziert werden. Glukose** kann nicht identifiziert werden, da sie mehrere Chromatographie-Peaks erzeugt. Metabolitenstandards*** können nur in einzelnen Proben identifiziert und quantifiziert werden, nicht jedoch in einer Mischung von Metabolitenstandards oder einer biologischen Mischung von Metaboliten.

Ergänzende Tabelle 1: Retention time (RT) Shift-Werte des gleichen Satzes von Metaboliten für die zwitterionischen Phasen- und Umkehrphasenspalten (siehe Materialtabelle) nach Spaltengleichgewicht. Die Tabelle vergleicht die Retentionsreproduzierbarkeit der zwitterionischen Phasen- und Umkehrphasensäulen für einen bestimmten Satz von Metaboliten, die sich in ihrer Hydrophilie und Hydrophobie voneinander unterscheiden. Diese Metaboliten wurden mit Hilfe von LC-MS/MS identifiziert. Beachten Sie, dass die RT-Verschiebungswerte hydrophiler Metaboliten (d. H. NAD+, AMP, GMP, Arginin und Glutaminsäure) signifikant niedriger sind und die Spitzenformen für die zwitterionische Phasensäule im Vergleich zur Umkehrphasensäule wesentlich schärfer sind. Im Gegensatz dazu sind die RT-Verschiebungswerte hydrophober Metaboliten (d. h. Stearinsäure, Laurinsäure und Dekansäure) signifikant niedriger und die Spitzenformen sind für die Umkehrphasensäule im Vergleich zur Zwitterionsphasensäule wesentlich schärfer. Die Bedingungen für die chromatographische Trennung von Metaboliten mit Hilfe der zwitterionischen Phasen- und Umkehrphasensäulen sind in Tabelle 1 bzw. Ergänzende Tabelle 2aufgeführt. Die hier berichteten RT-Verschiebungswerte basieren auf der Messung von 20 verschiedenen Proben aus verschiedenen Fläschchen. Die Proben wurden nach Säulengleichgewicht analysiert. Die Metaboliten in jeder Probe wurden aus 5,0 × 108 Hefezellen extrahiert. RT-Verschiebungswerte sind das Mittel von 20 verschiedenen Proben (n = 20). Die aus dem ungepaarten t-Test abgeleiteten p-Werte wurden verwendet, um die beiden Spalten mit der gleichen Varianz zwischen beiden Stichprobentypen zu vergleichen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: LC-Bedingungen für die in der Materialtabelle genannte Spalte der Umkehrphase 8, die zur Trennung verschiedener Metaboliten in dieser Studie verwendet wird. Die Säuleneigenschaften waren wie folgt: 150 x 2,1 mm, 5 μm Polymer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Eine Liste aller 374 wasserlöslichen Metaboliten, die mit der LC-MS/MS-Methode zurückgewonnen und annotiert wurden. Alle Metaboliten wurden aus demselben LC-Gradientenlauf gewonnen, einem in Der Ergänzenden Tabelle 4beschriebenen DDA-Fragmentierungsalgorithmus (Data-Dependent Acquisition) unterzogen und mit der in der Materialtabelle genanntenSoftware kommentiert. Die MS1-Peakformen von 211 Metaboliten (deren Status in der Tabelle als Leerzeichen angegeben ist) waren für die Quantifizierung geeignet, und ihre jeweiligen MS2-Spektren stimmten vollständig mit der mzCloud-Spektralbibliothek überein. MS2-Spektren von 38 Metaboliten (deren Status in der Tabelle als d angegeben ist) hatten vollständige Übereinstimmungen mit der Online-Spektralbibliothek. Dennoch waren ihre MS1-Peakformen nicht für die Quantifizierung geeignet. MS2-Spektren von 125 Metaboliten (deren Status in der Tabelle als n angegeben ist) hatten keine vollständigen Übereinstimmungen mit der Online-Spektralbibliothek. Diese Metaboliten wurden wie folgt kommentiert: 1) unter Verwendung des "Predict composition node" (der Metaboliten basierend auf der genauen Übereinstimmung der MS1-Werte, der Anzahl der übereinstimmenden und verpassten Isotope und der Isotopen-Prozent-Intensität, die mit der der theoretischen Referenzstandards übereinstimmt, annotiert); 2) Verwendung des "ChemSpider-Knotens" (der Metaboliten basierend auf der genauen Übereinstimmung der MS1-Werte und der Ähnlichkeit der MS2-Spektren mit der Online-Spektralbibliothek annotiert); und 3) unter Verwendung der Retentionszeit (RT) Verschiebungswerte von Metaboliten (diese Werte hängen von der physikalischen Struktur und den chemischen Eigenschaften von Metaboliten ab). Die in der Tabelle aufgeführten Metaboliten wurden in allen 3 durchgeführten biologischen Replikaten gefunden, wobei die RT-Verschiebungswerte von < 0,2 min.

Ergänzende Tabelle 4: Ein Datenabhängiger Erfassungsalgorithmus (DDA), der hier zur Annotation von wasserlöslichen Metaboliten mit Hilfe der in der Materialtabelle genannten Software verwendet wurde.

Ergänzende Tabelle 5: Ein typischer linearer Dynamikbereich, den wir beobachtet haben, als wir die Konzentrationen verschiedener Aminosäuren mit Hilfe des in der Materialtabelle genannten MS-Systems gemessen haben. Das hier eingesetzte MS-System verfügt über einen weiten (mindestens zwei Größenordnungen) linearen Dynamikbereich zur Messung der Konzentrationen verschiedener Metaboliten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um das hier beschriebene Protokoll erfolgreich zu verwenden, befolgen Sie die unten beschriebenen vorbeugenden Maßnahmen. Chloroform und Methanol extrahieren verschiedene Substanzen aus Laborkunststoffen. Behandeln Sie sie daher mit Vorsicht. Vermeiden Sie die Verwendung von Kunststoffen in Schritten, die Kontakt mit einem dieser beiden organischen Lösungsmittel beinhalten. Verwenden Sie für diese Schritte Borosilikatglaspipetten. Diese Pipetten vor Gebrauch mit Chloroform und Methanol aufsteigen lassen. Verwenden Sie nur Mikropipettenspitzen und -röhrchen aus Polypropylen, das gegen organische Lösungsmittel beständig ist. Beseitigen Sie während der Probenvorbereitung für LC-MS/MS alle Luftblasen in den Glasfläschchen, bevor Sie sie in eine Vertiefungsplatte einführen.

Die hier verwendete zwitterionische Phasensäule erfordert nach jedem Durchlauf eine umfangreiche Rekonditionierung, um die RT-Verschiebung zu minimieren. Für die Säulenkonditionierung empfehlen wir, ein Volumen der Rekonditionierungslösung zu verwenden, das etwa 20 Volumen der Säule beträgt. Die Säule muss mit der mobilen Anfangsphase für 15 minuten bei einer erhöhten Durchflussrate von 0,4 ml/min neu konditioniert werden. Um Schäden an der Säule während der Rekonditionierung zu vermeiden, halten Sie den Säulendruck unter der vom Hersteller empfohlenen oberen Druckgrenze.

Bemerkenswert ist, dass einige Mischtrennchromatographiesäulen, die im Umkehrphasenmodus arbeiten, die Auflösung geladener Metaboliten40,41ermöglichen. Diese Mischtrennsäulen basieren auf der hier verwendeten Umkehrphasensäule (siehe Materialtabelle)und enthalten polare eingebettete Gruppen, die Metaboliten basierend auf Ladung40,41trennen können.

Hier beschrieben wir eine LC-MS/MS-basierte Methode der nicht-zielgerichteten Metabolomik zur quantitativen Analyse vieler wasserlöslicher Metaboliten, die aus Hefezellen extrahiert werden. Die Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber den LC-MS/MS-Methoden der nicht-zielgerichteten Metabolomik, die derzeit für diesen Zweck verwendet werden. Zu diesen Vorteilen gehören die folgenden. Erstens ist die Methode empfindlich und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger wasserlöslicher Metaboliten in Konzentrationen von nur 0,05 pmol / μL. Die berichtete Sensitivität der bestehenden LC-MS/MS-Methoden ist niedriger3,22,27,42. Zweitens verwendet das Verfahren ein Zellabschreckverfahren, das eine signifikant geringere Leckage intrazellulärer Metaboliten aus der Zelle hervorruft als bei den derzeit verwendeten Verfahren31,33,38. So senkt das von uns entwickelte Verfahren zur Zellabschreckung das Ausmaß, in dem die derzeit verwendeten Verfahren die intrazellulären Konzentrationen wasserlöslicher Metaboliten unterschätzen. Drittens unterscheidet die Methode im Gegensatz zu den bestehenden LC-MS/MS-Methoden2, 31,33zwischen verschiedenen Strukturisomeren und stereoisomeren Formen vieler Metaboliten. Zu diesen Metaboliten gehören verschiedene Energieträgermoleküle, Nukleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Zwischenprodukte der Glykolyse und Zwischenprodukte des Tricarbonzyklus. Viertens haben wir die Methode verwendet, um eine umfangreiche Massenspektraldatenbank von MS1 und MS2 für die korrekte Identifizierung und Quantifizierung einer Vielzahl spezifischer Metaboliten unter Verwendung der LC-MS/MS-Rohdaten zu erstellen. Im Gegensatz dazu sind die vorhandenen massenspektralen Online-Datenbanken von MS1 und MS2 unvollständig43,44,45. Fünftens verwendet die Methode eine einzige Art der Metabolitenextraktion, um wasserlösliche Metaboliten mit verschiedenen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften zurückzugewinnen. Die Diversität dieser Metaboliten übersteigt deutlich die alternativer Methoden zur einstufigen Extraktion wasserlöslicher Metaboliten aus Hefezellen3,22,27,46. Sechstens verwendet das Verfahren im Gegensatz zuden bestehenden LC-MS/MS-Methoden3,22,47,48einen einzigen Typ der LC-Säule, um verschiedene strukturelle und funktionelle Klassen wasserlöslicher Metaboliten voneinander zu trennen. Siebentens ermöglicht die Methode die Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 370 wasserlöslichen Metaboliten, die aus Hefezellen extrahiert werden. Diese Anzahl identifizierbarer und quantifizierbarer Metaboliten übersteigt die Anzahl derMetaboliten,die für andere Methoden der nicht zielgerichteten Metabolomik in Hefe3,22,27,49,50gemeldet wurden .

Die Methode hat mehrere Einschränkungen. Diese Einschränkungen lauten wie folgt. Die zwitterionische Phasensäule, die für die Metabolitentrennung durch LC verwendet wird, erfordert nach jedem Durchlauf eine umfangreiche Rekonditionierung. Darüber hinaus ist die Methode nur für die nicht zielgerichtete Metabolomik wasserlöslicher, hydrophiler Metaboliten wirksam. Darüber hinaus können verschiedene isomere Formen von Kohlenhydraten (einschließlich Isomeren von Fructose, Glucose und Galactose) mit Hilfe der Methode nicht quantifiziert werden. Dies liegt daran, dass die in der Methode verwendete zwitterionische Phasensäule diese Kohlenhydratisomere nicht voneinander trennen kann, wenn sie in einer Mischung mit anderen Metaboliten vorhanden ist. Außerdem kann die Methode nicht zur Identifizierung von Glukose verwendet werden, da dieses Kohlenhydrat während der Chromatographie an der in der Methode verwendeten zwitterionischen Phasensäule mehrere Peaks erzeugt. Schließlich kann Threonin mit Hilfe der Methode nicht quantifiziert werden, da diese Aminosäure mit ihrem Isomer Homoserin während der Metabolitentrennung durch Chromatographie mit elutioniert wird.

Mit dieser LC-MS/MS-Methode untersuchen wir alterungsbedingte Veränderungen im wasserlöslichen Metabolom der Knospenhefe S. cerevisiae. Wir verwenden diese Methode auch, um zu untersuchen, wie viele alterungsverzögernde genetische, diätetische und pharmakologische Eingriffe das wasserlösliche Metabolom von Hefezellen während ihrer chronologischen Alterung beeinflussen. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit, Robustheit und Empfindlichkeit kann die LC-MS/MS-Methode erfolgreich zur quantitativen Beurteilung der wasserlöslichen Metabolome in evolutionär weit entfernten eukaryotischen Organismen eingesetzt werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Wir danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Titorenko-Labors für Gespräche. Wir danken dem Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, dem Centre for Structural and Functional Genomics und dem Centre for Microscopy and Cellular Imaging (alle an der Concordia University) für herausragende Leistungen. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) von Kanada (RGPIN 2014-04482 und CRDPJ 515900 - 17) unterstützt. K.M. wurde durch das Concordia University Armand C. Archambault Fellowship und den Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

Biochemie Heft 167 wasserlösliche Metaboliten Metabolomik-Profiling Abschreckung der Stoffwechselaktivität Propidiumiodidfärbung Fluoreszenzmikroskopie Extraktion von Metaboliten Energieträgermolekülen Nukleotiden Aminosäuren Monosacchariden Flüssigkeitschromatographie Massenspektrometrie
Quantitative Metabolomik von <em>Saccharomyces Cerevisiae</em> mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter