Summary
Hier beschrijven we een eenvoudige methode die RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-FISH) combineert met immunofluorescentie om ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA te visualiseren. Dit protocol kan het begrip van de moleculaire kenmerken van SARS-CoV-2 RNA-host interacties op eencellig niveau vergroten.
Abstract
Dit manuscript biedt een protocol voor in situ hybridisatiekettingreactie (HCR) in combinatie met immunofluorescentie om ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in cellijn en driedimensionale (3D) culturen van menselijk luchtwegepitheel te visualiseren. De methode maakt zeer specifieke en gevoelige visualisatie van viraal RNA mogelijk door te vertrouwen op HCR geïnitieerd door sondelokalisatie. Split-initiator sondes helpen het signaal te versterken door fluorescentie gelabelde versterkers, wat resulteert in verwaarloosbare achtergrondfluorescentie in confocale microscopie. Het labelen van versterkers met verschillende fluorescerende kleurstoffen vergemakkelijkt de gelijktijdige herkenning van verschillende doelen. Dit maakt het op zijn beurt mogelijk om de infectie in weefsels in kaart te brengen om virale pathogenese en replicatie op het niveau van één cel beter te begrijpen. Het koppelen van deze methode aan immunofluorescentie kan een beter begrip van gastheer-virusinteracties vergemakkelijken, inclusief afwisseling van het gastheerepidogeen en immuunresponsroutes. Dankzij gevoelige en specifieke HCR-technologie kan dit protocol ook als diagnostisch hulpmiddel worden gebruikt. Het is ook belangrijk om te onthouden dat de techniek gemakkelijk kan worden gewijzigd om detectie van RNA mogelijk te maken, inclusief niet-coderende RNA's en RNA-virussen die in de toekomst kunnen ontstaan.
Introduction
SARS-CoV-2 is een nieuw humaan betacoronavirus dat eind 2019 opkwam en een paar maanden later een ongekende pandemie veroorzaakte. Omdat het virus nieuw is voor de wetenschap, blijven veel van de biologie en de impact ervan op gastheercellen onbekend. Daarom is het in kaart brengen van het viruscel- en -weefseltropisme tijdens infectie belangrijk om de biologische basiskenmerken en de effecten ervan op de gastheer te begrijpen. Verschillende technieken worden gebruikt om virus-gastheer samenspel te onderzoeken, waaronder biochemische, biologische en fysieke assays. In situ hybridisatie is een veelgebruikte methode die gebruik maakt van gelabeld complementair DNA, RNA of gemodificeerde nucleïnezuursondes, die lokaliseren naar specifieke DNA- of RNA-sequenties in een cel of weefsel.
Er is een nieuwe RNA fluorescente in situ hybridisatiemethode (RNA-FISH) ontwikkeld die wijzigingen bevat om de gevoeligheid te verhogen door de signaal-ruisverhouding te versterken via een HCR1. HCR maakt de studie van RNA-lokalisatie op een eencellig niveau mogelijk. Vanwege de hoge specificiteit, gevoeligheid en resolutie is deze methode niet alleen nuttig voor basiswetenschappelijke studies, maar ook voor toepassingsprojecten, bijvoorbeeld diagnostiek. Onlangs werd de haalbaarheid van deze methode aangetoond voor het detecteren van SARS-CoV-2 RNA gelokaliseerd in ciliated cellen binnen volledig gedifferentieerde 3D menselijke luchtwegepitheel (HAE) culturen2. HAE-culturen vormen een van de meest geavanceerde instrumenten die worden gebruikt om virale infectie te bestuderen in de context van het micromilieu "natuurlijke infectie"3,4.
Verschillende rapporten over menselijke coronavirussen (HCoV), waaronder SARS-CoV-2, benadrukken het belang van epigenetische modificaties met betrekking tot HCoV-infectie en pathofysiologie [herzien in 5], bijvoorbeeld het methylatiepatroon van het gen dat codeert voor de angiotensine-converterende enzym 2 (ACE-2) receptor6,7. Interessant is dat massaspectrometrische screening verschillende epigenetische factoren identificeerde die interageren met het SARS-CoV-2 proteoom8. Meer specifiek bindt niet-structureel eiwit 5 (NSP5) zich aan de epigenetische regulator, histondeacetylase 2 en de katalytisch inactieve NSP5 (C145A) interageert met tRNA methyltransferase 1 (24). Bovendien wordt de NSP16-methyltransferaseactiviteit geblokkeerd door de methyltransferaseremmer, sinefungin9. De exacte rol van deze epigenetische factoren bij COVID-19 blijft echter onduidelijk. Replicatie van HCoV vindt plaats in het cytoplasma van de geïnfecteerde cel en veroorzaakt ontstekingsreacties die worden gereguleerd door epigenetische modificaties10.
Bijvoorbeeld, HCoV-229E fine-tunes nucleaire factor-kappa B signalering en herprogrammeert diep het gastheer cellulaire chromatine landschap door het verhogen van acetylatie van H3K36 en H4K5 in bepaalde regio's11. De infectie met het midden-oosten respiratoire syndroom verhoogt de niveaus van H3K27me3 en put H3K4me3 uit in de promotorregio's van subsets van specifieke interferongevoelige genen12. Bovendien activeert viraal RNA celimmuunreacties, zoals aangetoond voor flavivirussen13, retrovirussen14,15en coronavirussen16. De epigenetische markers op viraal RNA kunnen een rol spelen bij de herkenning door cellulaire sensoren, zoals aangetoond voor m7A methylatie van humaan immunodeficiëntievirus-1 RNA17. Er blijven echter vragen over: Wat is de impact van SARS-CoV-2 RNA op de immuunrespons en zijn epigenetische tekens betrokken?
Hier is een geoptimaliseerde RNA-FISH-methode beschreven in combinatie met immunofluorescentieanalyse van cellijnen en 3D-weefsels (volledig gedifferentieerde HAE). Hoewel cytologische methoden, zoals FISH en immunofluorescentie, op grote schaal worden gebruikt, is deze nieuwe generatie in situ hybridisatiemethode op basis van HCR nooit gebruikt voor virusdetectie (behalve in een recente publicatie)2. Over het algemeen vereisen immunostaining en FISH de volgende stappen: permeabilisatie om penetratie van sondes of antilichamen mogelijk te maken; fixatie waarbij cellulair materiaal wordt gefixeerd en bewaard; detectie waarbij antilichamen of nucleïnezuursondes worden toegepast; en ten slotte, montage van de monsters voor visualisatie.
Hoewel bestaande protocollen deze algemene kenmerken delen, variëren ze aanzienlijk met betrekking tot de betrokken parameters. Hier is een geoptimaliseerd, eenvoudig, immuno-RNA-FISH protocol beschreven om SARS-CoV-2 RNA te detecteren in HAE-culturen en Vero-cellen. De techniek bestaat uit de volgende stappen: (1) fixatie van cellen met paraformaldehyde; (2) permeabilisatie met detergent of methanol (MeOH); (3) rehydratatie door middel van een reeks MeOH-oplossingen (alleen HAE-culturen); 4. detectie; (5) versterking met behulp van HCR-technologie om SARS-CoV-2 RNA te detecteren; 6. immunostaining; en (7) beeldvorming onder een confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffervoorbereiding
- Combineer voor 500 ml 2x PHEM-buffer 18,14 g piperazine-N,N′-bis(2-ethaansulfaatzuur) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethaanesulfonzuur (HEPES), 3,8 g ethyleenglycoltetraazijnzuur (EGTA) en0,99g magnesiumsulfaat (EGTA). Maak het volume tot ~400 ml met gedestilleerd water (dH2O), roer en stel de pH in op 7,0 met 10 M kaliumhydroxide (KOH) of natriumhydroxide (NaOH). Maak het uiteindelijke volume tot 500 ml en splits het vervolgens op in 50 ml aliquots. Bewaren bij -20 °C tot nodig.
OPMERKING: De buffer is pas vrij als de pH 7,0 bereikt. - Bereid een stamoplossing van 37% w/v paraformaldehyde (PFA). Meng voor 50 ml 18,5 g PFA en 35 ml dH2O in een glazen fles. Plaats de fles op een magneetroerder met verwarming. Voeg 900 μL 1 M KOH of NaOH toe en roer tot de oplossing helder wordt. Laat afkoelen en breng over op een conische centrifugebuis van 50 ml; top tot 50 ml met dH2O. De oplossing kan tot en met de gewenste tijd bij -20 °C worden bewaard.
OPMERKING: Formaldehyde moet worden behandeld in een zuurkast terwijl u beschermende handschoenen en een laboratoriumjas draagt. - Fixatiebuffer voorbereiden (3,7% PFA gebufferd met PHEM). Combineer voor 50 ml 5 ml 37% PFA-oplossing, 25 ml 2x PHEM-buffer en 20 ml dH2O in een conische centrifugebuis van 50 ml. Bewaren bij -20 °C tot nodig.
OPMERKING: Na het ontdooien kan de buffer maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard. - Bereid PBST (0,1% Tween-20 in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]). Voeg voor 50 ml 50 μL van 100% Tween-20 tot 50 ml 1x PBS toe en meng goed.
OPMERKING: De oplossing kan bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard. - Bereid rehydratatiebuffers voor door MeOH/PBST te combineren in verhoudingen van 3:1, 1:1 en 1:3 (eindvolume van elk 100 ml; zie tabel 1).
OPMERKING: MeOH is zeer giftig en ontvlambaar. Omdat het de oogzenuw kan beschadigen, moet het in een zuurkast worden behandeld om open vlammen te vermijden. Omdat het mengen van MeOH en PBST een exotherme reactie genereert, combineert u de oplossingen op ijs. - Combineer voor 1000 ml 20x SSC 175,3 g natriumchloride (NaCl) en 88,2 g natriumcitraat in een bekerglas en vul met 800 ml dH2O. Roer tot het is opgelost en stel de pH in met NaOH tot 7,2. Voeg dH2O toe aan een totaal volume van 1000 ml en autoclaaf of filter door een filter van 0,22 μm in een autoclaaffles.
- Combineer voor 50 ml 5x SSCT 12,5 ml 20x SSC-buffer met 37,5 ml dH2O en voeg 50 μL van 100% Tween-20 toe. Meng goed.
- Combineer voor 50 ml 50% 5x SSCT/50% PBST 25 ml 5x SSCT met 25 ml PBST.
- Combineer voor 50 ml 2x SSC 5 ml 10x SSC buffer met 45 ml dH2O. Meng goed.
OPMERKING: Alle SSC-buffers moeten in het donker bij RT worden opgeslagen.
2. Doeldefinitie, sondes en versterkers
- Gebruik de tools die beschikbaar zijn op de website van de fabrikant om versterkers en sondes te ontwerpen. Zorg ervoor dat de sondes complementair zijn aan de omgekeerde DNA-streng van het SARS-CoV-2 N-gen (Aanvullende figuur 1).
- Bepaal de beste grootte van de sondeset (een set van 20 sondes is voldoende voor visualisatie).
- Stel de versterkers in die worden gebruikt voor doel-RNA-detectie.
- Gebruik HCR versterker B1 gelabeld met Alexa Fluor 647.
OPMERKING: Een HCR versterker bestaat uit meetbare HCR haarspelden h1 en h2. Multiplexed experimenten kunnen worden ontworpen met behulp van dit protocol. Als dit gepland is, kies dan een andere HCR-versterker (B1, B2, ...) voor elk doel-RNA dat binnen hetzelfde monster moet worden afgebeeld (bijv. versterker B1 voor doel 1, versterker B2 voor doel 2, ...).
- Gebruik HCR versterker B1 gelabeld met Alexa Fluor 647.
3. Celkweek en infectie met SARS-CoV-2
- Kweek Vero (apennierepitheelcellen) cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium met 5% foetale runderserum.
- Zaai 50.000 cellen op afdekplaten (nr. 1, 15 × 15 mm) in een plaat met 12 putjes.
- Bereid volledig gedifferentieerde HAE-culturen voor zoals beschreven18 op doorlatende Transwell insert-steunen met een membraan (diameter = 6,5 mm) en cultuur in bronchiale epitheliale groeimedium tot volledig samenvloeiend.
- Virusinfectie
- Inentcellen met SARS-CoV-2 bij 1000x mediane infectieuze dosis weefselkweek (TCID50) per ml
- Incubeer cellen gedurende 2 uur bij 37 °C.
- Was cellen twee keer met PBS om het ongebonden virus te verwijderen.
- Kweekcellen gedurende 48 uur.
4. SARS-CoV-2 RNA-FISH in Vero cellen gekweekt op coverslips
DAG 1
- Cellen repareren en permeabiliseren
- Fix geïnfecteerde cellen met 3,7% w/v PFA-oplossing gedurende 1 uur bij RT.
- Aspireer de 3,7% PFA-oplossing en was de cellen tweemaal met 1x PBS.
- Permeabiliseer de cellen met PBST-oplossing gedurende 10 minuten bij RT met agitatie.
- Aspireer de PBST en was de cellen tweemaal met 1x PBS.
- opsporing
- Aspireer de 1x PBS-oplossing en was de cellen tweemaal met 2x SSC bij RT.
- Aspireer de 2x SSC-oplossing en prehybridiseer de monsters door ten minste 300 μL probe hybridisatiebuffer toe te voegen. Bedek de putten die de cellen bevatten en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Bereid de sondeoplossing voor door 1,2 pmol sondemengsel toe te voegen aan de hybridisatiebuffer van de sonde.
- Gebruik 1,2 μL van de 1 μM sondevoorraad om 300 μL werkvoorraad voor te bereiden.
- Verwijder de prehybridisatieoplossing en breng de afdeklips over naar een bevochtigde kamer.
- Pipet 30-50 μL sondeoplossing op parafilm om individuele druppels te vormen.
- Incubeer de monsters 's nachts (12-18 uur) bij 37 °C.
DAG 2 - Breng de afdeklips terug in een 12-put plaat en verwijder overtollige sondeoplossing door 4 x 5 min te wassen met 400 μL sondewasbuffer bij 37 °C.
OPMERKING: Als alternatief voor het plaatsen van 30-50 μl aliquots op parafilm en onder deklips voor incubatie, voeg 300 μL sondeoplossing rechtstreeks toe aan deklips in een 12-put plaat. Deze procedure is eenvoudiger, maar vereist aanzienlijke hoeveelheden reagentia. Verwarm de sondewasbuffer voor gebruik tot 37 °C. Bereken de benodigde hoeveelheid buffer en breng deze over naar een conische centrifugebuis van 15 ml. - Was monsters gedurende 2 x 5 min met 5x SSCT bij RT.
- Vervang de 5x SSCT-oplossing door 1x PBS en bewaar de monsters bij 4 °C tot versterking.
- amplificatie
- Verwijder de 1x PBS-oplossing uit de putten en voeg ten minste 300 μL versterkingsbuffer toe aan elke put. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij RT.
- Bereid elke HCR-haarspeld (h1 en h2) voor door het gewenste volume in afzonderlijke buizen te koelen.
- Gebruik 18 pmol van elke haarspeld (bijv. voor 300 μL 6 μL van een 3 μM stock haarspeldoplossing) om 300 μL versterkingsoplossing te bereiden.
- Breng de haarspeldoplossing over in tubes.
- Incubeer bij 95 °C gedurende 90 s.
- Koel af naar RT gedurende 30 minuten in het donker.
- Bereid een haarspeldmengsel door de snapgekoelde "h1" en "h2" haarspelden toe te voegen aan de versterkingsbuffer.
- Plaats druppels van 30-50 μL haarspeldmengsel op parafilm.
- Incubeer de monsters 's nachts (12-18 uur) in het donker bij RT.
DAG 3 - Breng de afdeklips terug in de 12 putplaat en verwijder overtollige haarspelden door 5 x 5 min te wassen met 5x SSCT bij RT met agitatie.
- Aspireer de 5x SSCT buffer en vervang deze door 1x PBS.
OPMERKING: Gebruik indien nodig de RNA-FISH-monsters in een standaard immunofluorescentietest, gevolgd door kleuring van kernen (zie rubriek 5).
- Nucleaire kleuring en schuifmontage
- Aspireer de 1x PBS-oplossing en vervang deze door 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 0,2 μg/ml) in 1x PBS-oplossing.
- Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij RT in het donker.
- Aspireer de DAPI-oplossing en was de cellen twee keer met 1x PBS.
- Plaats twee druppels van elk 10 μL montagemedium; zorg ervoor dat de druppels voldoende van elkaar zijn gescheiden, zodat twee afdeklipjes op één dia kunnen worden geplaatst.
- Verwijder overtollige vloeistof door op de afdeklipjes op een schone handdoek te tikken en plaats ze vervolgens in een antivetmontagemedium met de cellen naar beneden gericht.
- Plaats de gemonteerde monsters op een droge, vlakke ondergrond in het donker en laat ze uitharden.
- Sluit na het uitharden de randen van de afdeklips af met VALAP-kit of nagellak om uitdroging van de monsters te voorkomen.
5. SARS-CoV-2 RNA-FISH in HAE culturen
DAG 1
- Vaststelling en permeabilisatie van de HAE-cultuur
- Aspireer het medium en repareer de geïnfecteerde cellen met behulp van 3,7% PFA-oplossing gedurende 1 uur bij RT.
- Aspireer de 3,7% PFA-oplossing en was de cellen tweemaal met 1x PBS.
- Vervang de 3,7% PFA-oplossing door 1x PBS onder een Transwell-inzetstuk.
- Gooi de PBS weg en droog de monsters uit met 2 x 5 minuten wasbeurten met 100% MeOH voorgekauwd tot -20 °C.
- Vervang na de tweede wasbeurt de buffer door verse, gekoelde MeOH voor permeabilisatie onder de Transwell insert. 's Nachts bewaren bij -20 °C.
DAG 2
- Rehydratatie
Rehydrateer de monsters door middel van een reeks MeOH/PBST-oplossingen (elk gedurende 5 minuten) op ijs: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS en 100% PBST (tweemaal).- Was de cellen 5 min op ijs met 50% 5x SSCT/50% PBST.
- Was cellen 5 min op ijs met 5x SSCT.
- Vervang de 5x SSCT buffer door 1x PBS.
- opsporing
- Incubeer de cellen (in de Transwell insert) gedurende 5 minuten op ijs met 100 μL probe hybridisatie buffer. Breng vervolgens de plaat gedurende 30 minuten over naar de incubator bij 37 °C (prehybridisatie).
OPMERKING: De hybridisatiebuffer van de sonde moet voor gebruik worden voorverwarmd tot 37 °C. Bereken het gewenste volume: 100 μL is nodig voor een enkele Transwell insert. - Bereid de sondeoplossing voor. Aangezien 1 ml sondeoplossing 4 pmol sonde vereist, voegt u 4 μL van 1 μM sondevoorraadoplossing toe aan 1 ml probehybrideisatiebuffer en mengt u goed.
OPMERKING: Gebruik voor RNA-detectie 100 μL sondeoplossing per Transwell-inzetstuk. Laat de sondeoplossing op ijs staan tot het einde van de prehybridisatiestap. - Verwijder de prehybridisatieoplossing en voeg de sondeoplossing toe.
- Incubeer de cellen 's nachts (12-18 uur) bij 37 °C.
DAG 3 - Verwijder overtollige sonde door 4 x 15 min te wassen met 100 μL sondewasbuffer bij 37 °C.
- Was de monsters 2 x 5 min met 5x SSCT bij RT.
- Vervang de 5x SSCT door 1x PBS en bewaar de monsters bij 4 °C tot versterking.
- Incubeer de cellen (in de Transwell insert) gedurende 5 minuten op ijs met 100 μL probe hybridisatie buffer. Breng vervolgens de plaat gedurende 30 minuten over naar de incubator bij 37 °C (prehybridisatie).
- amplificatie
- Voorversterkereer de monsters door ze gedurende 30 minuten bij RT te incuberen met versterkingsbuffer.
- Bereid elke haarspeld door de gewenste volumes in afzonderlijke buizen te koelen.
- Gebruik 30 pmol van elke haarspeld (bijv. voor 500 μL 10 μL van 3 μM stock haarspeldoplossing) om 500 μL versterkingsoplossing te bereiden.
- Breng de haarspeldoplossing over op de buizen.
- Incubeer bij 95 °C gedurende 90 s.
- Koel af naar RT gedurende 30 minuten in het donker.
- Bereid de haarspeldoplossing voor door alle snapgekoelde haarspelden toe te voegen aan 500 μL versterkingsbuffer bij RT.
- Verwijder de voorversterkeroplossing en voeg de volledige haarspeldoplossing toe.
- Incubeer de monsters 's nachts (12-18 uur) bij RT in het donker.
- Verwijder overtollige haarspelden door te wassen met 5x SSCT bij RT als volgt: 2 x 5 min, 2 x 15 min en 1 x 5 min.
- Vervang de 5x SSCT-oplossing door 1x PBS en bewaar deze bij 4 °C gedurende niet meer dan 2-3 dagen of ga direct over tot nucleaire kleuring.
OPMERKING: Gebruik indien nodig de RNA-FISH-monsters in een standaard immunofluorescentietest, gevolgd door nucleaire kleuring (zie rubriek 6).
- Nucleaire kleuring en schuifmontage
- Aspireer de 1x PBS-oplossing en vervang deze door DAPI-oplossing (0,2 μg/ml) in 1x PBS.
- Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij RT in het donker.
- Aspireer de DAPI-oplossing en was de cellen twee keer met 1x PBS.
- Plaats het uitgesneden membraan van de Transwell-inzetstukken op 10 μL antivetmontagemedium met de cellen naar boven gericht en voeg extra montagemedium (5 μL) toe aan het membraan.
- Bedek de membranen met coverslips.
- Hard de gemonteerde monsters uit op een droog, vlak oppervlak in het donker.
- Sluit na het uitharden de randen van de afdeklips af met VALAP-kit of nagellak om uitdroging van de monsters te voorkomen.
6. Immunofluorescentieanalyse van Vero-cellen en HAE-culturen
OPMERKING: Voer de immunofluorescentietest uit op dag 3 voor cellijnen of dag 4 voor HAE-culturen. Gebruik voor elk model een andere aanpak. Alle verschillen zijn duidelijk aangegeven.
- Aspireer de 1x PBS oplossing uit de putten.
- Blokkeer de monsters door incubatie met 1% w/v runderserumalbumine in PBST-oplossing gedurende 30 min bij 37 °C.
- Bereid primaire antilichamen voor door geschikte verdunningen in blokkeeroplossing voor te bereiden en incubeer.
- Voor Vero cellen op coverslips:
- Plaats druppels (30-50 μL) antilichaamoplossing op parafilm in een vochtigheidskamer.
- Plaats de afdeklips op de antilichaamdruppels met de cellen naar beneden gericht.
- Vervang voor HAE het blokkeermiddel in de inserts door antilichaamoplossing (100 μL) en incubeer de monsters in een bevochtigde kamer.
OPMERKING: Pas de tijd en temperatuur voor elke incubatie aan met primair antilichaam. Typische parameters zijn 2 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C.
- Voor Vero cellen op coverslips:
- Was de monsters 3 x 5 min met PBST.
- Voor cellen op afdeklips, breng over naar een 12-put plaat en voeg PBST-oplossing toe.
- Vervang voor HAE-culturen de antilichaamoplossing door PBST-oplossing.
- Controleer de beschikbare lichtbronnen en filters voor de confocale microscoop.
- Kies secundaire antilichamen op basis van de gastheersoort. Kies de fluorofoorparameters (excitatie- en emissiegolflengten, spectrumbreedte en excitatie-efficiëntie volgens de beschikbare lichtbron).
OPMERKING: Spectrale parameters kunnen worden gemodelleerd met behulp van online tools (zie tabel met materialen). - Bereid geschikte secundaire antilichaamoplossingen voor door ze te verdunnen met een blokkerende oplossing.
- Incubeer met secundaire antilichamen (zoals in 6.3), maar incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Was de monsters zoals in stap 6.4.
- Nucleaire kleuring en schuifmontage
- Voor cellen op coverslips
- Aspireer de PBST en vervang deze door DAPI (0,2 μg/ml) in 1x PBS-oplossing.
- Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij RT in het donker.
- Aspireer de DAPI-oplossing en was de cellen twee keer met 1x PBS.
- Plaats de afdeklips op druppels van 10 μL montagemedium met de cellen naar beneden gericht.
- Sluit de hoezen af met nagellak.
- Voor HAE-culturen
- Aspireer de 1x PBST en vervang deze door DAPI (0,2 μg/ml) in 1x PBS-oplossing.
- Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij RT in het donker.
- Aspireer de DAPI-oplossing en was de cellen twee keer met 1x PBS.
- Plaats de uitgesneden membranen op druppels van 10 μL montagemedium met de cellen naar boven gericht en voeg extra (5 μL) montagemedium toe aan het membraan.
- Bedek de membranen met coverslips.
- Sluit de hoezen af met nagellak.
- Voor cellen op coverslips
7. Confocale microscopie
- Definieer de sporen door de gebruikte fluoroforen op te geven.
- Kies de scanmodus en snelheid.
- Pas de laservermogens-, gain- en offsetwaarden voor elke fluorofoor aan door ze te vergelijken met de respectieve negatieve controles: voor virussen, met nep geïnfecteerde cellen; voor cellulaire eiwitten, monsters bevlekt met isotypecontroleantistoffen van een geschikte gastheer.
- Als u een 3D-afbeelding wilt verkrijgen, activeert u de z-stackmodus en stelt u de boven- en ondergrenzen in. Stel de stapgrootte/het aantal in.
OPMERKING: Zie19voor meer informatie over beeldvorming van het coronavirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het immuno-RNA-FISH protocol beschreven in dit manuscript werd uitgevoerd met behulp van twee cellulaire systemen: een Vero-cellijn en een 3D HAE-cultuur. De belangrijkste stappen voor beide cellulaire modellen worden weergegeven in tabel 2. Het RNA-FISH-protocol voor visualisatie van SARS-CoV-2 in HAE-culturen bevat stappen die typisch zijn voor weefselmonsters, d.w.z. permeabilisatie met 100% MeOH en rehydratatie door middel van een beoordeelde reeks MeOH-PBS- en 0,1% Tween-oplossingen. Immunofluorescentie werd uitgevoerd nadat RNA-FISH was voltooid. Zstack beelden werden verworven en verwerkt.
Figuur 1 toont immuno RNA FISH in mock-geïnenoculeerde controle Vero cellen of cellen geïnfecteerd met SARS-CoV-2. Figuur 2 toont immuno RNA FISH in mock-geïnenoculeerde controle HAE culturen of culturen besmet met SARS-CoV-2. Figuur 3 toont optimalisatie van het permeabilisatieprotocol in Vero-cellen: 70% ethanol 's nachts bij -20 °C of 0,1% Tween-20 in PBS gedurende 5 minuten bij RT. Permeabilisatie met detergent resulteert in een duidelijk, specifiek signaal voor SARS-CoV-2 subgenomic RNA, terwijl het gebruik van ethanol resulteert in een wazig ongericht beeld.
Figuur 1: Immuno-RNA-FISH om SARS-CoV-2 RNA en β-tubuline in Vero cellen te detecteren. Lokalisatie van SARS-CoV-2 subgenomic RNA in (A) geïnfecteerde en (B) mock-geïnenuleerde Vero cellen. Virale RNA werd gevisualiseerd door FISH (rood). β-tubuline is gekleurd met antilichamen tegen muis β5tubulin (1:100, nachtelijke incubatie bij 4 °C) en met Alexa fluorofoor 488-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:400, 1 uur incubatie bij RT). Kernen waren bevlekt met DAPI (blauw). Elke afbeelding is een enkel confocaal vlak. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: SARS-CoV-2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; FISH = fluorescentie in situ hybridisatie; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Menselijke luchtwegepitheelcellen geïnfecteerd met SARS-CoV-2. Lokalisatie van SARS-CoV-2 subgenomic RNA in (A) geïnfecteerde en (B) mock-ingeënte HAE culturen. Virale RNA werd gevisualiseerd door FISH (rood). Ciliated cellen worden gevisualiseerd met behulp van antilichamen tegen muis β5-tubuline (1:100, nachtelijke incubatie bij 4 °C) en met Alexa fluorofoor 488-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:400, 1 uur incubatie bij RT). Kernen waren bevlekt met DAPI (blauw). Elke afbeelding vertegenwoordigt een maximale projectie gereconstrueerd uit confocale beeldstapels (dikte = 3 μm). Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: SARS-CoV-2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; FISH = fluorescentie in situ hybridisatie; HAE = menselijk luchtwegepitheel; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Optimalisatie van permeabilisatieomstandigheden voor Vero cellen. Permeabilisatie van Vero cellen met (A) 70% ethanol en (B) met 0,1% Tween-20 in PBS. Permeabilisatie met detergent resulteert in een duidelijk specifiek signaal voor SARS-CoV-2 subgenomic RNA, terwijl ethanol resulteert in een wazig beeld. Virale RNA wordt in het rood weergegeven. Kernen waren bevlekt met DAPI (blauw). Elke afbeelding vertegenwoordigt een maximale projectie gereconstrueerd uit confocale beeldstapels (dikte = 3 μm). Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: SARS-CoV-2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende figuur 1: SARS-CoV-2 N gensequentie (5'-3') Klik hier om dit bestand te downloaden.
| buffer | Volume methanol [ml] | Volume PBST [ml] |
| 75% MeOH/25% PBST | 75 | 25 |
| 50% MeOH/50% PBST | 50 | 50 |
| 25% MeOH/75% PBST | 25 | 75 |
| 100% PBST | 0 | 100 |
| totaal | 100 ml | |
Tabel 1: Bereiding van gradiëntmethanol/PBST-oplossingen voor rehydratatie. Om menselijke luchtwegepitheelmonsters na nachtelijke incubatie in absolute methanol (MeOH) te rehydrateren, is een langzame uitwisseling van de omgeving noodzakelijk. Om dit te doen, moet langzame uitwisseling plaatsvinden door te broeden met buffers waarin de verhoudingen van MeOH en PBST (0,1% Tween-20 in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing) geleidelijk veranderen. Reagensvolumes die voldoende zijn om 100 ml van elke oplossing voor te bereiden, genoeg om verschillende experimenten uit te voeren, worden vermeld.
| module | stap | Vero cellen | HAE culturen |
| RNA Fluorescentie in situ hybridisatie (RNA FISH) | fixatie | (3,7% PFA) 10-40 min bij kamertemperatuur of 's nachts bij kamertemperatuur | |
| Permeabilisatie | (PBST: 0,1% Tween-20 in 1x PBS) 10 min bij kamertemperatuur | (0,1% Tween-20 in 1x PBS) 2 × 5 min bij kamertemperatuur | |
| (100% MeOH) 's nachts bij -20 °C | |||
| Rehydratatie | (Gegradueerd methanol (MeOH)/PBST) 5 x 5 min, 50% 5x SSCT/PBST wassen 5 min, 5x SSCT wassen 5 min op ijs | ||
| Detectie (pre-hybridisatie) | (Probe hybridisatiebuffer) 30 min bij 37 °C, 200-300 μL | (Probe hybridisatiebuffer) 5 min op ijs, dan 30 min bij 37 °C, 100 μL | |
| opsporing | (Sondeoplossing) 12-18 uur bij 37 °C, 30 - 50 μL | (Sondeoplossing) 12-18 uur bij 37 °C, 100 μL | |
| Sonde wassen | (Sondewasbuffer) 4 x 5 min | (Sondewasbuffer) 4 x 15 min | |
| (5 × SSCT) 2 x 5 min | |||
| Versterking (pre-amplificatie) | (Versterkingsbuffer) 30 min bij kamertemperatuur, 200-300 μL | (Versterkingsbuffer) 30 min bij kamertemperatuur, 100 μL | |
| amplificatie | (Versterkeroplossing) 12-18 uur bij kamertemperatuur op donkere plaats, 30-50 μL | (Versterkeroplossing) 12-18 uur bij kamertemperatuur op donkere plaats, 100 μL | |
| Versterkers wassen | (5x SSCT) 5 x 5 min | (5x SSCT) 2 x 5 min, 2 x 15 min, 1 x 5 min | |
| ImmunoFluorescentie (ALS) | Blokkeren | (1% BSA in PBST) 30 min bij 37 °C | |
| Primaire antilichaam incubatie | (Antilichaamoplossing van apropriaatconcentratie in blokkerende oplossing) 2 uur bij kamertemperatuur / 's nachts bij 4 °C, 30-50 μL | (Antilichaamoplossing van apropriaatconcentratie in blokkerende oplossing) 2 uur bij kamertemperatuur / 's nachts bij 4 °C, 100 μL | |
| Primaire antilichaamwas | (PBST) 3 x 5 min bij kamertemperatuur | ||
| Secundaire antilichaam incubatie | (Antilichaamoplossing met apropriaatconcentratie in blokkerende oplossing) 1 uur bij 37 °C, 30-50 μL | (Antilichaamoplossing met een geschikte concentratie in blokkeeroplossing) 1 uur bij 37 °C, 100 μL | |
| Secundaire antilichaamwas | (PBST) 3 x 5 min bij kamertemperatuur | ||
| Nucleaire kleuring | (DAPI-oplossing) 10 min bij kamertemperatuur, daarna 2 x 5 min met 1x PBS | ||
Tabel 2: Workflow van het Immuno-RNA-FISH protocol in cellijnen en HAE culturen. Immuno-RNA-FISH is haalbaar in beide cellulaire modellen, maar vereist verschillende benaderingen. De belangrijkste stappen worden weergegeven, samen met de gebruikte buffers (tussen haakjes), gevolgd door de duur en temperatuur van de incubatie. In verschillende stappen worden kritische verschillen in het volume incubatiereagens per monster gegeven om de berekeningen te vereenvoudigen. Als het volume niet is opgegeven, wordt het willekeurig geselecteerd, zodat het het monster (meestal 200 μL) volledig bedekt met agitatie. Afkortingen: FISH = fluorescentie in situ hybridisatie; HAE = menselijk luchtwegepitheel; PFA = paraformaldehyde; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; BSA = runderserumalbumine; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; MeOH = methanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immuno-RNA-FISH is een betrouwbare methode voor dubbele kleuring van RNA en cellulaire eiwitten. Hier is een aangepast immuno-RNA-FISH protocol beschreven dat detectie van SARS-CoV-2 RNA en cellulaire eiwitten in cellijnen en HAE-culturen mogelijk maakt. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik in verschillende celmodellen, waaronder celmonolagen of specifieke weefsels. De methode is gebaseerd op het concept van een HCR die is geïnitieerd door de juiste sondelokalisatie. Vervolgens resulteert het gebruik van split-initiator sondes om te beginnen met het versterken van het signaal door fluorescerend gelabelde versterkers in minimale tot geen achtergrondfluorescentie wanneer waargenomen met behulp van een confocale microscoop. Versterkers kunnen worden gelabeld met verschillende fluorescerende kleurstoffen en zijn compatibel met verschillende sondes die zijn ontworpen om verschillende doelen te herkennen; daarom mogen ze tegelijkertijd worden gebruikt. De procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn eenvoudig, maar tijdrovend (3-4 dagen). Niettemin worden de resultaten gekenmerkt door een lage ruis-signaalverhouding, in tegenstelling tot andere protocollen die direct gelabelde fluorescentiesondes gebruiken.
Vero-cellen en HAE-culturen werden hier gebruikt. Er zijn verschillende protocollen nodig voor cellen op een coverslip en cellen in weefselkweek. De meeste verschillen worden ondervonden bij het hanteren van de cellen (op de afdeklip of op een membraan) en de gebruikte hoeveelheden materiaal. Algemene RNA-FISH-protocollen vereisen permeabilisatie met ethanol- of methanoloplossingen en een nachtelijke incubatie bij -20 °C. Belangrijk is dat het gebruik van wasmiddel voor permeabilisatie gunstiger is voor immunofluorescentie, de procedure met 1 dag verkort en een efficiëntere planning van het experiment mogelijk maakt. De primaire aanpak was om algemene protocollen te volgen met betrekking tot permeabilisatie met alcohol of wasmiddel om te zien of er ongewenste effecten merkbaar waren. Belangrijk is dat nachtelijke permeabilisatie van Vero-cellen met 70% ethanoloplossing resulteerde in een niet-specifiek, wazig signaal; permeabilisatie met Tween20 maakte daarentegen een duidelijke en specifieke visualisatie van SARS-CoV-2 RNA mogelijk en verkortte het protocol met 1 dag (figuur 3).
Dezelfde aanpak werd getest op HAE-culturen na nachtelijke incubatie met absolute methanol bij -20 °C (volgens algemene RNA-FISH-protocollen voor weefselmonsters) en 0,1% Tween20 gedurende 5 minuten bij RT. Incubatie met Tween20 resulteerde in een niet-specifiek signaal, dat dit reagens diskwalificeert (gegevens niet weergegeven). Nachtelijke incubatie met methanol leidde tot een zeer specifiek signaal zonder artefacten. Belangrijk is dat het Transwell-membraan werd losgemaakt omdat methanol de lijm oploste. Dit probleem werd opgelost door het membraan los te maken en door te gaan met het coverslip-protocol. Klassieke RNA-FISH-procedures gebruiken proteïnase K om de gevoeligheid te verbeteren, omdat dit eiwitten verwijdert en RNA-eiwitcomplexen verwijdert, waardoor cellen door chemicaliën en kleurstoffen kunnen worden doordrenkt. Het huidige protocol heeft deze stap weggelaten omdat proteïnase K eiwitkleuring voorkomt. Er werden geen verschillen waargenomen in de gevoeligheid van RNA-FISH wanneer proteïnase K afwezig was (gegevens niet getoond).
Het uitvoeren van immunofluorescentietesten na RNA-FISH had geen invloed op het RNA-signaal en resulteerde in een succesvolle combinatie van beide methoden. Daarom vertegenwoordigt het volledige protocol een handige manier om RNA en zijn interacties met eiwitten op ééncellig niveau te visualiseren. Van belang is dat fixatie van cellen (vereist voor immuno-RNA-FISH) geen time-lapse-experimenten toestaat om dynamische gebeurtenissen op het niveau van één cel te onderzoeken. Visualisatie van SARS-CoV-2 RNA maakt analyse van SARS-CoV-2 replicatie in een cel mogelijk en, in combinatie met immunofluorescentie, maakt de studie van intracellulaire SARS-CoV-2 RNA/host eiwitinteracties mogelijk, inclusief interactie met het epigenoom. Ten slotte heeft dit protocol een breed scala aan toepassingen, waaronder de detectie van SARS-CoV-2 en andere opkomende virussen bij eencellige resolutie. Dankzij gevoelige en specifieke HCR-technologie kan het ook worden gebruikt als diagnostisch hulpmiddel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs voor onderzoek naar SARS-CoV-2, en door subsidies van het National Science Center (subsidies UMO2017/27/B/NZ6/02488 aan K.P. en UMO-2018/30/E/NZ1/00874 aan A.K.-P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
