Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering av SARS-CoV-2 ved hjelp av Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/62067
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1,2, 3,4, 3,4, 1
1Malopolska Centre of Biotechnology, Jagiellonian University, 2Microbiology Department Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 3Department of Cardiac, Vascular and Endovascular Surgery and Transplantology, The Medical University of Silesia in Katowice, 4Silesian Centre for Heart Diseases

Summary

Her beskriver vi en enkel metode som kombinerer RNA fluorescens in situ hybridisering (RNA-FISH) med immunfluorescens for å visualisere alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Denne protokollen kan øke forståelsen av de molekylære egenskapene til SARS-CoV-2 RNA-vert interaksjoner på et enkeltcellet nivå.

Abstract

Dette manuskriptet gir en protokoll for in situ hybridiseringskjedereaksjon (HCR) kombinert med immunfluorescens for å visualisere alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA i cellelinje og tredimensjonale (3D) kulturer av menneskelig luftveisepiteli. Metoden tillater svært spesifikk og sensitiv visualisering av viral RNA ved å stole på HCR initiert av sondelokalisering. Split-initiator sonder bidrar til å forsterke signalet av fluorescerende merkede forsterkere, noe som resulterer i ubetydelig bakgrunnsfluorescens i konfektmikroskopi. Merking av forsterkere med forskjellige fluorescerende fargestoffer letter samtidig anerkjennelse av ulike mål. Dette gjør det igjen mulig å kartlegge infeksjonen i vev for bedre å forstå viral patogenese og replikasjon på encellet nivå. Kobling av denne metoden med immunfluorescens kan lette bedre forståelse av vert-virus interaksjoner, inkludert veksling av verten epigenom og immunrespons veier. På grunn av sensitiv og spesifikk HCR-teknologi kan denne protokollen også brukes som et diagnostisk verktøy. Det er også viktig å huske at teknikken lett kan endres for å muliggjøre deteksjon av RNA, inkludert ikke-kodende RNAer og RNA-virus som kan dukke opp i fremtiden.

Introduction

SARS-CoV-2 er et nytt humant betacoronavirus som dukket opp i slutten av 2019, noe som førte til en enestående pandemi noen måneder senere. Fordi viruset er nytt for vitenskapen, forblir mye av biologien og dens innvirkning på vertsceller ukjent. Derfor er kartlegging av viruscelle- og vevtropismen under infeksjon viktig hvis dens grunnleggende biologiske egenskaper og dens effekter på verten skal forstås. Flere teknikker brukes til å undersøke virus-vert samspill inkludert biokjemiske, biologiske og fysiske analyser. In situ hybridisering er en vanlig metode som bruker merket komplementært DNA, RNA eller modifiserte nukleinsyresonder, som lokaliserer til spesifikke DNA- eller RNA-sekvenser i en celle eller et vev.

En ny RNA fluorescerende in situ hybridisering (RNA-FISH) metode er utviklet som inkorporerer modifikasjoner for å øke følsomheten ved å forsterke signal-til-støy-forholdet via en HCR1. HCR tillater studiet av RNA lokalisering på et enkeltcellet nivå. På grunn av sin høye spesifisitet, følsomhet og oppløsning er denne metoden nyttig ikke bare for grunnleggende vitenskapsstudier, men også for applikatoriske prosjekter, for eksempel diagnostikk. Nylig ble muligheten for denne metoden demonstrert for å oppdage SARS-CoV-2 RNA lokalisert til ciliated celler innenfor fullt differensierte 3D human airway epitel (HAE) kulturer2. HAE-kulturer utgjør et av de mest avanserte verktøyene som brukes til å studere virusinfeksjon i sammenheng med "naturlig infeksjon" mikromiljøet3,4.

Flere rapporter om humane koronavirus (HCoV), inkludert SARS-CoV-2, fremhever viktigheten av epigenetiske modifikasjoner med hensyn til HCoV-infeksjon og patofysiologi [gjennomgått i 5], for eksempel metyleringsmønsteret til genet som koder angiotensinkonverterende enzym 2 (ACE-2)reseptor 6,7. Interessant nok identifiserte massespektrometrisk screening flere epigenetiske faktorer som samhandler med SARS-CoV-2 proteom8. Mer spesifikt binder ikke-strukturelt protein 5 (NSP5) seg til den epigenetiske regulatoren, histondeacetylase 2 og den katalytisk inaktive NSP5 (C145A) samhandler med tRNA metyltransferase 1 (24). I tillegg er NSP16 metyltransferaseaktivitet blokkert av metyltransferasehemmeren, sinfungin9. Imidlertid er den eksakte rollen til disse epigenetiske faktorene i COVID-19 fortsatt uklar. Replikasjon av HCoV foregår i cytoplasma av den infiserte cellen, og utløser inflammatoriske responser som reguleres av epigenetiske modifikasjoner10.

For eksempel, HCoV-229E fine-tunes kjernefysisk faktor-kappa B signalering og dypt omprogrammerer verten cellulært kromatin landskap ved å øke acetylering av H3K36 og H4K5 i visse regioner11. Midtøsten respiratorisk syndrom-relatert coronavirus infeksjon øker nivåene av H3K27me3 og tømmer H3K4me3 på promotorregioner av undergrupper av spesifikke interferon-sensitive gener12. I tillegg utløser virale RNA celleimmuneresponser, som vist for flavivirus13, retrovirus14,15og koronavirus16. De epigenetiske markørene på viral RNA kan spille en rolle i anerkjennelse av cellulære sensorer, som vist for m7A metylering av human immunsviktvirus-1 RNA17. Spørsmålene gjenstår imidlertid: Hva er virkningen av SARS-CoV-2 RNA på immunresponsen, og er epigenetiske merker involvert?

Her er en optimalisert RNA-FISH-metode kombinert med immunfluorescensanalyse av cellelinjer og 3D-vev (fullt differensiert HAE) beskrevet. Selv om cytologiske metoder, som FISK og immunfluorescens, brukes mye, har denne nye generasjonen in situ hybridiseringsmetode basert på HCR aldri blitt brukt til virusdeteksjon (unntatt i en nylig publikasjon)2. Generelt krever immunoppfatning og FISK følgende trinn: permeabilisering for å muliggjøre penetrasjon av sonder eller antistoffer; fiksering der cellulært materiale er festet og bevart; deteksjon der antistoffer eller nukleinsyresonder påføres; og til slutt montering av prøvene for visualisering.

Selv om eksisterende protokoller deler disse generelle funksjonene, varierer de markant med hensyn til de involverte parameterne. Her er en optimalisert, enkel, immuno-RNA-FISH-protokoll beskrevet for å oppdage SARS-CoV-2 RNA i HAE-kulturer og Vero-celler. Teknikken består av følgende trinn: (1) fiksering av celler med paraformaldehyd; (2) permeabilisering med vaskemiddel eller metanol (MeOH); (3) rehydrering gjennom en gradert serie MeOH-løsninger (kun HAE-kulturer); (4) deteksjon; (5) forsterkning ved hjelp av HCR-teknologi for å oppdage SARS-CoV-2 RNA; (6) immunstaining; og (7) avbildning under et konfokalt mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjøring av buffer

  1. For 500 ml 2x PHEM-buffer, kombinere 18,14 g piperazin-N,N′-bis(2-etanesulfonsyre) (RØR), 6,5 g 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazin etanesulfonsyre (HEPES), 3,8 g etylenglykol tetraacetisk syre (EGTA) og 0,99 g magnesiumsulfat (MgSO4). Lag volumet opp til ~ 400 ml med destillert vann (dH2O), rør og juster pH til 7,0 ved hjelp av 10 M kaliumhydroksid (KOH) eller natriumhydroksid (NaOH). Gjør det endelige volumet opp til 500 ml, og del deretter i 50 ml aliquots. Oppbevars ved -20 °C til det er nødvendig.
    MERK: Bufferen vil ikke være klar før pH når 7.0.
  2. Forbered en lagerløsning på 37% m / v paraformaldehyd (PFA). For 50 ml blander du 18,5 g PFA og 35 ml dH2O i en glassflaske. Plasser flasken på en magnetisk rører med oppvarming. Tilsett 900 μL 1 M KOH eller NaOH, og rør til løsningen blir klar. La det avkjøles og overføres til et 50 ml konisk sentrifugerør; opptil 50 ml med dH2O. Oppløsningen kan oppbevares ved -20 °C til det er nødvendig.
    MERK: Formaldehyd skal håndteres i en avtrekkshette mens du bruker vernehansker og en labfrakk.
  3. Klargjør fikseringsbuffer (3,7 % PFA bufret med PHEM). For 50 ml kombinerer du 5 ml 37 % PFA-oppløsning, 25 ml 2x PHEM-buffer og 20 ml dH2O i et konisk sentrifugerør på 50 ml. Oppbevars ved -20 °C til det er nødvendig.
    MERK: Etter opptining kan bufferen oppbevares ved 4 °C i opptil 3 måneder.
  4. Klargjør PBST (0,1 % Tween-20 i 1x fosfatbufret saltvann [PBS]). For 50 ml tilsett 50 μL 100% Tween-20 til 50 ml 1x PBS og bland godt.
    MERK: Oppløsningen kan oppbevares ved romtemperatur (RT).
  5. Klargjør rehydreringsbuffere ved å kombinere MeOH/PBST i forholdet 3:1, 1:1 og 1:3 (siste volum på 100 ml av hver; se tabell 1).
    MERK: MeOH er veldig giftig og brannfarlig. Da det kan skade synsnerven, bør den håndteres i en avtrekkshette og unngå åpne flammer. Når blanding av MeOH og PBST genererer en eksotermisk reaksjon, kan du kombinere løsningene på is.
  6. For 1000 ml 20x SSC, kombiner 175,3 g natriumklorid (NaCl) og 88,2 g natriumsitrat i et beger, og fyll opp med 800 ml dH2O. Rør til oppløst, og juster pH til 7,2 ved hjelp av NaOH. Tilsett dH2O i et totalt volum på 1000 ml, og autoklaver eller filtrer gjennom et 0,22 μm filter i en autoklavert flaske.
  7. For 50 ml 5x SSCT kombinerer du 12,5 ml 20x SSC-buffer med 37,5 ml dH2O og tilsetter 50 μL 100 % Tween-20. Bland godt.
  8. For 50 ml 50% 5x SSCT / 50% PBST, kombiner 25 ml 5x SSCT med 25 ml PBST.
  9. For 50 ml 2x SSC kombinerer du 5 ml 10x SSC-buffer med 45 ml dH2O. Bland godt.
    MERK: Alle SSC-buffere skal lagres på RT i mørket.

2. Måldefinisjon, sonder og forsterkere

  1. Bruk verktøyene som er tilgjengelige på produsentens nettsted for å designe forsterkere og sonder. Påse at sondene er komplementære til den omvendte DNA-strengen til SARS-CoV-2 N-genet (Supplerende figur 1).
  2. Bestem den beste sondesettstørrelsen (et sett med 20 sonder er tilstrekkelig for visualisering).
  3. Still inn forsterkerne som brukes til mål-RNA-deteksjon.
    1. Bruk HCR-forsterker B1 merket med Alexa Fluor 647.
      MERK: En HCR-forsterker består av metastabile HCR-hårnåler h1 og h2. Multipleksede eksperimenter kan utformes ved hjelp av denne protokollen. Hvis dette er planlagt, velger du en annen HCR-forsterker (B1, B2, ...) for hvert mål RNA skal avbildes i samme prøve (f.eks. forsterker B1 for mål 1, forsterker B2 for mål 2, ...).

3. Cellekultur og infeksjon med SARS-CoV-2

  1. Kultur Vero (ape nyre epitelceller) celler i Dulbecco modifisert Eagle medium inneholder 5% foster bovint serum.
    1. Frø 50.000 celler på deksler (nr. 1, 15 × 15 mm) i en 12-brønns plate.
  2. Forbered fullt differensierte HAE-kulturer som beskrevet18 på gjennomtrengelige Transwell-innsatsstøtter med en membran (diameter = 6,5 mm) og kultur i bronkial epitelvekstmedium til den er fullstendig flytende.
  3. Virusinfeksjon
    1. Inokuler celler med SARS-CoV-2 ved 1000x median vevskultur smittsom dose (TCID50) per ml
    2. Inkuber celler i 2 timer ved 37 °C.
    3. Vask celler to ganger med PBS for å fjerne ubundet virus.
    4. Kulturceller i 48 timer.

4. SARS-CoV-2 RNA-FISH i Vero-celler dyrket på deksler

DAG 1

  1. Feste og permeabilisere celler
    1. Løs infiserte celler med 3,7% m / v PFA-løsning i 1 time ved RT.
    2. Aspirer 3,7% PFA-løsningen, og vask cellene to ganger ved hjelp av 1x PBS.
    3. Permeabiliser cellene med PBST-oppløsning i 10 min ved RT med agitasjon.
    4. Aspirer PBST, og vask cellene to ganger med 1x PBS.
  2. påvisning
    1. Aspirer 1x PBS-løsningen, og vask cellene to ganger med 2x SSC ved RT.
    2. Aspirer 2x SSC-løsningen, og prehybridiser prøvene ved å legge til minst 300 μL sondehybriiseringsbuffer. Dekk brønnene som inneholder cellene, og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
    3. Forbered sondeløsningen ved å tilsette 1,2 pmol sondeblanding til probehybridiseringsbufferen.
      1. Bruk 1,2 μL av 1 μM sondelageret til å klargjøre 300 μL arbeidslager.
    4. Fjern prehybridiseringsløsningen, og overfør dekslene til et fuktet kammer.
      1. Pipette 30-50 μL sondeoppløsning på parafilm for å danne individuelle dråper.
    5. Inkuber prøvene over natten (12-18 timer) ved 37 °C.

      DAG 2
    6. Overfør dekslene tilbake til en 12-brønns plate, og fjern overflødig sondeløsning ved å vaske i 4 x 5 min med 400 μL sondevaskbuffer ved 37 °C.
      MERK: Som et alternativ til å plassere 30-50 μl aliquots på parafilm og under deksler for inkubasjon, tilsett 300 μL sondeoppløsning direkte til deksler i en 12-brønns plate. Denne prosedyren er enklere, men krever betydelige mengder reagenser. Varm opp probevaskbufferen til 37 °C før bruk. Beregn mengden buffer som trengs, og overfør den til et konisk sentrifugerør på 15 ml.
    7. Vask prøver i 2 x 5 min med 5x SSCT ved RT.
    8. Bytt ut 5x SSCT-oppløsningen med 1x PBS, og oppbevar prøvene ved 4 °C til forsterkning.
  3. forsterkning
    1. Fjern 1x PBS-løsningen fra brønnene, og tilsett minst 300 μL forsterkningsbuffer til hver brønn. Inkuber prøvene i 30 min ved RT.
    2. Forbered hver HCR hårnål (h1 og h2) ved å knipse det ønskede volumet i separate rør.
      1. For å klargjøre 300 μL for forsterkningsløsning, bruk 18 pmol av hver hårnål (f.eks. for 300 μL, bruk 6 μL av en 3 μM lager hårnålløsning).
      2. Overfør hårnålløsningen til rør.
      3. Inkuber ved 95 °C i 90 s.
      4. Avkjøl til RT i 30 min i mørket.
    3. Forbered en hårnålblanding ved å legge til de snapkjølte "h1" og "h2" hårnålene til forsterkningsbufferen.
    4. Legg dråper på 30-50 μL hårnålblanding på parafilm.
    5. Inkuber prøvene over natten (12-18 timer) i mørket på RT.

      DAG 3
    6. Overfør dekslene tilbake til 12 brønnplaten, og fjern overflødige hårnåler ved å vaske i 5 x 5 min med 5x SSCT ved RT med agitasjon.
    7. Aspirer 5x SSCT-bufferen, og erstatt den med 1x PBS.
      MERK: Bruk om nødvendig RNA-FISH-prøvene i en standard immunfluorescensanalyse, etterfulgt av farging av kjerner (se avsnitt 5).
  4. Kjernefysisk farging og skredmontering
    1. Aspirer 1x PBS-løsningen, og erstatt den med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 0,2 μg/ml) i 1x PBS-oppløsning.
    2. Inkuber prøvene i 10 min på RT i mørket.
    3. Aspirer DAPI-løsningen, og vask cellene to ganger med 1x PBS.
    4. Plasser to dråper på 10 μL hver av monteringsmediet; sørg for at dråpene er separert tilstrekkelig til at to deksler kan plasseres på ett enkelt lysbilde.
    5. Fjern overflødig væske ved å trykke på dekslene på et rent håndkle, og legg dem deretter i antifade monteringsmedium med cellene vendt ned.
    6. Plasser de monterte prøvene på en tørr, flat overflate i mørket og la dem kurere.
    7. Etter herding forsegler du kantene på dekslene med VALAP-tetningsmasse eller neglelakk for å forhindre at prøvene tørker ut.

5. SARS-CoV-2 RNA-FISH i HAE-kulturer

DAG 1

  1. Fiksering og permeabilisering av HAE-kulturen
    1. Aspirer mediet, og fest de infiserte cellene ved hjelp av 3,7% PFA-løsning i 1 time ved RT.
    2. Aspirer 3,7% PFA-løsningen, og vask cellene to ganger med 1x PBS.
      1. Bytt ut 3,7 % PFA-oppløsning med 1x PBS under en Transwell-innsats.
    3. Kast PBS, og dehydrer prøvene ved hjelp av 2 x 5 min vasker med 100% MeOH prechilled til -20 °C.
    4. Etter den andre vasken, erstatt bufferen med frisk, kjølt MeOH for permeabilisering under Transwell-innsatsen. Oppbevars over natten ved -20 °C.

DAG 2

  1. Rehydrering
    Rehydrer prøvene gjennom en gradert serie MeOH/PBST-løsninger (hver i 5 min) på is: 75 % MeOH/25 % PBST, 50 % MeOH/50 % PBST, 25 % MeOH/75 % PBTS og 100 % PBST (to ganger).
    1. Vask cellene i 5 min på is med 50% 5x SSCT / 50% PBST.
    2. Vask celler i 5 min på is med 5x SSCT.
    3. Bytt ut 5x SSCT-bufferen med 1x PBS.
  2. påvisning
    1. Inkuber cellene (inne i Transwell-innsatsen) i 5 min på is med 100 μL sondehybridiseringsbuffer. Deretter overfører du platen til inkubatoren i 30 min ved 37 °C (prehybridisering).
      MERK: Probehybridiseringsbufferen må forvarmes til 37 °C før bruk. Beregn ønsket volum: 100 μL er nødvendig for en enkelt Transwell-innsats.
    2. Forbered sondeløsningen. Siden 1 ml sondeløsning krever 4 pmol sonde, tilsett 4 μL 1 μM sondelagerløsning til 1 ml sondehybridiseringsbuffer, og bland godt.
      MERK: For RNA-deteksjon, bruk 100 μL sondeoppløsning per Transwell-innsats. La sondeløsningen ligge på is til slutten av prehybridiseringstrinnet.
    3. Fjern prehybridiseringsløsningen, og legg til sondeløsningen.
    4. Inkuber cellene over natten (12-18 h) ved 37 °C.

      DAG 3
    5. Fjern overflødig sonde ved å vaske i 4 x 15 min med 100 μL sondevaskbuffer ved 37 °C.
    6. Vask prøvene i 2 x 5 min med 5x SSCT ved RT.
    7. Bytt ut 5x SSCT med 1x PBS, og oppbevar prøvene ved 4 °C til forsterkning.
  3. forsterkning
    1. Forsterk prøvene ved å inkubere dem med forsterkningsbuffer i 30 min ved RT.
    2. Forbered hver hårnål ved å knipse de ønskede volumene i separate rør.
      1. For å tilberede 500 μL forsterkningsløsning, bruk 30 pmol av hver hårnål (f.eks. for 500 μL, bruk 10 μL 3 μM lager hårnålløsning).
      2. Overfør hårnålløsningen til rørene.
      3. Inkuber ved 95 °C i 90 s.
      4. Avkjøl til RT i 30 min i mørket.
    3. Forbered hårnålløsningen ved å legge til alle snap-avkjølte hårnåler til 500 μL forsterkningsbuffer ved RT.
    4. Fjern forforsterkningsløsningen, og tilsett den komplette hårnålsoppløsningen.
    5. Inkuber prøvene over natten (12-18 timer) på RT i mørket.
    6. Fjern overflødige hårnåler ved å vaske med 5x SSCT ved RT som følger: 2 x 5 min, 2 x 15 min og 1 x 5 min.
    7. Bytt ut 5x SSCT-oppløsningen med 1x PBS, og oppbevar den ved 4 °C i ikke mer enn 2-3 dager eller fortsett direkte til kjernefysisk farging.
      MERK: Bruk om nødvendig RNA-FISH-prøvene i en standard immunfluorescensanalyse, etterfulgt av kjernefysisk farging (se avsnitt 6).
  4. Kjernefysisk farging og skredmontering
    1. Aspirer 1x PBS-løsningen, og erstatt den med DAPI-oppløsning (0,2 μg/ml) i 1x PBS.
    2. Inkuber prøvene i 10 min på RT i mørket.
    3. Aspirer DAPI-løsningen, og vask cellene to ganger med 1x PBS.
    4. Plasser utsparingsmembranen fra Transwell-innsatsene på 10 μL antifademonteringsmedium med cellene vendt opp, og tilsett ekstra monteringsmedium (5 μL) til membranen.
    5. Dekk membranene med deksler.
    6. Herd de monterte prøvene på en tørr, flat overflate i mørket.
    7. Etter herding forsegler du kantene på dekslene med VALAP-tetningsmasse eller neglelakk for å forhindre at prøvene tørker ut.

6. Immunfluorescensanalyse av Vero-celler og HAE-kulturer

MERK: Utfør immunfluorescensanalysen på dag 3 for cellelinjer eller dag 4 for HAE-kulturer. Bruk forskjellige fremgangsmåter for hver modell. Alle forskjeller er tydelig angitt.

  1. Aspirer 1x PBS-løsningen fra brønnene.
  2. Blokker prøvene ved inkubasjon med 1% m/v bovint serumalbumin i PBST-oppløsning i 30 min ved 37 °C.
  3. Forbered primære antistoffer ved å forberede passende fortynninger i blokkeringsløsning og inkubere.
    1. For Vero-celler på deksler:
      1. Legg dråper (30-50 μL) antistoffoppløsning på parafilm i et fuktighetskammer.
      2. Plasser deksler på antistoffdråpene med cellene vendt ned.
    2. For HAE, bytt ut blokkeringsmiddelet i innsatsene med antistoffoppløsning (100 μL), og inkuber prøvene i et fuktet kammer.
      MERK: Juster tid og temperatur for hver inkubasjon med primært antistoff. Typiske parametere er 2 timer ved RT eller over natten ved 4 °C.
  4. Vask prøvene i 3 x 5 min med PBST.
    1. For celler på deksler, overfør til en 12-brønns plate og tilsett PBST-løsning.
    2. For HAE-kulturer må antistoffløsningen erstattes med PBST-oppløsning.
  5. Kontroller lyskildene og filtrene som er tilgjengelige for det konfiske mikroskopet.
  6. Velg sekundære antistoffer i henhold til vertsartene. Velg fluoroforparametere (eksitasjons- og utslippsbølgelengder, spektrumbredde og eksitasjonseffektivitet i henhold til den tilgjengelige lyskilden).
    MERK: Spektralparametere kan modelleres ved hjelp av nettbaserte verktøy (se Materialtabell).
  7. Forbered passende sekundære antistoffløsninger ved å fortynne dem med blokkeringsløsning.
  8. Inkuber med sekundære antistoffer (som i 6,3), men inkuber i 1 time ved 37 °C.
  9. Vask prøvene som i trinn 6.4.
  10. Kjernefysisk farging og skredmontering
    1. For celler på deksler
      1. Aspirer PBST, og erstatt den med DAPI (0,2 μg/ml) i 1x PBS-oppløsning.
      2. Inkuber prøvene i 10 min på RT i mørket.
      3. Aspirer DAPI-løsningen, og vask cellene to ganger med 1x PBS.
      4. Plasser dekslene på dråper på 10 μL monteringsmedium med cellene vendt ned.
      5. Forsegle dekslene med neglelakk.
    2. For HAE-kulturer
      1. Aspirer 1x PBST, og erstatt den med DAPI (0,2 μg/ml) i 1x PBS-oppløsning.
      2. Inkuber prøvene i 10 min på RT i mørket.
      3. Aspirer DAPI-løsningen, og vask cellene to ganger med 1x PBS.
      4. Plasser de utskårne membranene på dråper på 10 μL monteringsmedium med cellene vendt opp, og tilsett ekstra (5 μL) monteringsmedium til membranen.
      5. Dekk membranene med deksler.
      6. Forsegle dekslene med neglelakk.

7. Konfekt mikroskopi

  1. Definer sporene ved å spesifisere fluoroforene som brukes.
  2. Velg skannemodus og hastighet.
  3. Juster laserkraften, forsterkningen og offset-verdiene for hver fluorofor ved å sammenligne dem med respektive negative kontroller: for virus, mock-infiserte celler; for cellulære proteiner, prøver farget med isotypekontrollantistoffer fra en passende vert.
  4. Hvis du vil skaffe deg et 3D-bilde, aktiverer du z-stack-modus og angir øvre og nedre grense. Angi trinnstørrelse/-nummer.
    MERK: Hvis du vil ha mer informasjon om avbildning av koronaviruset, kan du se19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immuno-RNA-FISH-protokollen beskrevet i dette manuskriptet ble utført ved hjelp av to cellulære systemer: en Vero-cellelinje og en 3D HAE-kultur. Hovedtrinnene for begge mobilmodellene vises i tabell 2. RNA-FISH-protokollen for visualisering av SARS-CoV-2 i HAE-kulturer inkluderer trinn som er typiske for vevsprøver, det vil si permeabilisering med 100% MeOH og rehydrering gjennom en gradert serie MeOH-PBS og 0,1% Tween-løsninger. Immunfluorescens ble utført etter at RNA-FISH var fullført. Zstack-bilder ble anskaffet og behandlet.

Figur 1 viser immun RNA FISH i mock-inokulert kontroll Vero celler eller celler infisert med SARS-CoV-2. Figur 2 viser immun RNA FISH i mock-inokulert kontroll HAE kulturer eller kulturer infisert med SARS-CoV-2. Figur 3 viser optimalisering av permeabiliseringsprotokollen i Vero-celler: 70 % etanol over natten ved -20 °C eller 0,1 % Tween-20 i PBS i 5 minutter ved RT. Permeabilisering med vaskemiddel resulterer i et klart, spesifikt signal for SARS-CoV-2 subgenomisk RNA, mens bruk av etanol resulterer i et uskarpt, ufokusert bilde.

Figure 1
Figur 1: Immuno-RNA-FISH for å oppdage SARS-CoV-2 RNA og β-tubulin i Vero-celler. Lokalisering av SARS-CoV-2 subgenomiske RNA i (A) infiserte og (B) mock-inokulerte Vero-celler. Viral RNA ble visualisert av FISH (rød). β-tubulin er farget med antistoffer mot mus β5tubulin (1:100, natt inkubasjon ved 4 °C) og med Alexa fluorophore 488-konjugerte sekundære antistoffer (1:400, 1 t inkubasjon ved RT). Nuclei ble farget med DAPI (blå). Hvert bilde er et enkelt konfokalt plan. Skalastang = 20 μm. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2; FISK = fluorescens in situ hybridisering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Epitelceller i human luftveier infisert med SARS-CoV-2. Lokalisering av SARS-CoV-2 subgenomiske RNA i (A) infiserte og (B) mock-inokulerte HAE-kulturer. Viral RNA ble visualisert av FISH (rød). Ciliated celler visualiseres ved hjelp av antistoffer mot mus β5-tubulin (1:100, over natten inkubasjon ved 4 °C) og med Alexa fluorophore 488-konjugerte sekundære antistoffer (1:400, 1 h inkubasjon ved RT). Nuclei ble farget med DAPI (blå). Hvert bilde representerer en maksimal projeksjon rekonstruert fra konfokale bildestakker (tykkelse = 3 μm). Skalastang = 10 μm. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2; FISK = fluorescens in situ hybridisering; HAE = humant luftveisepitel; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Optimalisering av permeabiliseringsbetingelser for Vero-celler. Permeabilisering av Vero-celler med (A) 70% etanol og (B) med 0,1% Tween-20 i PBS. Permeabilisering med vaskemiddel resulterer i et klart spesifikt signal for SARS-CoV-2 subgenomisk RNA, mens etanol resulterer i et uklart bilde. Viral RNA er vist i rødt. Nuclei ble farget med DAPI (blå). Hvert bilde representerer en maksimal projeksjon rekonstruert fra konfokale bildestakker (tykkelse = 3 μm). Skalastang = 10 μm. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2; PBS = fosfatbufret saltvann; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: SARS-CoV-2 N gensekvens (5'-3')   Klikk her for å laste ned denne filen.

buffer Volumet av metanol [ml] Volum av PBST [ml]
75% MeOH / 25% PBST 75 25
50% MeOH / 50% PBST 50 50
25% MeOH / 75% PBST 25 75
100 % PBST 0 100
total 100 ml

Tabell 1: Fremstilling av gradient metanol/PBST-løsninger for rehydrering. For å rehydrere humane luftveis epitelprøver etter nattinkubasjon i absolutt metanol (MeOH), er det nødvendig med en langsom utveksling av miljøet. For å gjøre dette må langsom utveksling skje ved å inkubere med buffere der proporsjonene av MeOH og PBST (0,1% Tween-20 i 1x fosfatbufret saltvann) endres gradvis. Reagensvolumer tilstrekkelig til å forberede 100 ml av hver løsning, nok til å utføre flere eksperimenter, er oppført.

Modul skritt Vero celler HAE-kulturer
RNA Fluorescens in situ hybridisering (RNA FISH) fiksering (3,7 % PFA) 10-40 min ved romtemperatur eller over natten ved romtemperatur
Permeabilisering (PBST: 0,1 % Tween-20 i 1x PBS) 10 min ved romtemperatur (0,1 % Tween-20 i 1x PBS) 2 × 5 min ved romtemperatur
(100 % MeOH) over natten ved -20 °C
Rehydrering (Gradert metanol (MeOH)/PBST) 5 x 5 min, 50% 5x SSCT/PBST vask 5 min, 5x SSCT vask 5 min på is
Gjenkjenning (forhåndshybridisering) (Probe hybridisering buffer) 30 min ved 37 °C, 200-300 μL (Probe hybridisering buffer) 5 min på is, deretter 30 min ved 37 °C, 100 μL
påvisning (Probeoppløsning) 12-18 timer ved 37 °C, 30 –50 μL (Probeoppløsning) 12-18 timer ved 37 °C, 100 μL
Sondevask (Probevaskbuffer) 4 x 5 min (Probevaskbuffer) 4 x 15 min
(5 × SSCT) 2 x 5 min
Forsterkning (forsterkning) (Forsterkningsbuffer) 30 min ved romtemperatur, 200-300 μL (Forsterkningsbuffer) 30 min ved romtemperatur, 100 μL
forsterkning (Forsterkere løsning) 12-18 h ved romtemperatur på mørkt sted, 30-50 μL (Forsterkere løsning) 12-18 h ved romtemperatur på mørkt sted, 100 μL
Forsterkere vasker (5x SSCT) 5 x 5 min (5x SSCT) 2 x 5 min, 2 x 15 min, 1 x 5 min
Immunfluorescens (IF) Blokkerer (1 % BSA i PBST) 30 min ved 37 °C
Primær antistoffinkubasjon (Antistoffoppløsning av aproprieringskonsentrasjon i blokkeringsløsning) 2 timer ved romtemperatur / over natten ved 4 °C, 30–50 μL (Antistoffløsning av aproprieringskonsentrasjon i blokkeringsløsning) 2 timer ved romtemperatur / over natten ved 4 °C, 100 μL
Primær antistoffvask (PBST) 3 x 5 min ved romtemperatur
Sekundær antistoffinkubasjon (Antistoffoppløsning av aproprieringskonsentrasjon ved blokkeringsløsning) 1 t ved 37 °C, 30–50 μL (Antistoffløsning med passende konsentrasjon i blokkeringsløsning) 1 t ved 37 °C, 100 μL
Sekundær antistoffvask (PBST) 3 x 5 min ved romtemperatur
Kjernefysisk farging (DAPI-løsning) 10 min ved romtemperatur, deretter 2 x 5 min med 1x PBS

Tabell 2: Arbeidsflyt av Immuno-RNA-FISH-protokollen i cellelinjer og HAE-kulturer. Immuno-RNA-FISH er mulig i begge cellulære modeller, men krever forskjellige tilnærminger. Hovedtrinnene vises, sammen med bufferne som brukes (i parentes), etterfulgt av varigheten og temperaturen på inkubasjon. I flere trinn gis kritiske forskjeller i volumet av inkubasjonsreagens per prøve for å forenkle beregningene. Hvis volumet ikke er spesifisert, velges det vilkårlig slik at det helt dekker prøven (vanligvis 200 μL) med agitasjon. Forkortelser: FISH = fluorescens in situ hybridisering; HAE = humant luftveisepitel; PFA = paraformaldehyd; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; BSA = bovint serumalbumin; PBS = fosfatbufret saltvann; MeOH = metanol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immuno-RNA-FISH er en pålitelig metode for dobbeltfarging av RNA og cellulære proteiner. Her er det beskrevet en modifisert immuno-RNA-FISH-protokoll som gjør det mulig å oppdage SARS-CoV-2 RNA og cellulære proteiner i cellelinjer og HAE-kulturer. Denne protokollen kan tilpasses for bruk i forskjellige cellemodeller, inkludert cellemonolayers eller spesifikke vev. Metoden er avhengig av konseptet med en HCR initiert av passende sondelokalisering. Deretter resulterer bruken av split-initiator sonder for å begynne forsterkning av signalet av fluorescerende merkede forsterkere i minimal-til-ingen bakgrunnsfluorescens når de observeres ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Forsterkere kan merkes med forskjellige fluorescerende fargestoffer og er kompatible med forskjellige sonder designet for å gjenkjenne ulike mål; Derfor kan de brukes samtidig. Prosedyrene beskrevet i denne protokollen er enkle, men tidkrevende (3-4 dager). Likevel er resultatene preget av et lavt støy-til-signal-forhold, i motsetning til andre protokoller som bruker direkte merkede fluorescerende sonder.

Her ble det brukt veroceller og HAE-kulturer. Ulike protokoller kreves for celler på en coverlip og celler i vevskultur. De fleste forskjellene oppstår ved håndtering av cellene (enten på deksler eller en membran) og mengden materiale som brukes. Generelle RNA-FISH-protokoller krever permeabilisering ved hjelp av etanol- eller metanolløsninger samt en inkubering over natten ved -20 °C. Viktig, bruk av vaskemiddel for permeabilisering er mer gunstig for immunfluorescens, forkorter prosedyren med 1 dag, og tillater mer effektiv planlegging av eksperimentet. Den primære tilnærmingen var å følge generelle protokoller som involverer permeabilisering med alkohol eller vaskemiddel for å se om uønskede effekter var merkbare. Viktigst, permeabilisering av Vero-celler med 70% etanolløsning over natten resulterte i et uspesifisert, uskarpt signal; Permeabilisering med Tween20 tillot derimot klar og spesifikk visualisering av SARS-CoV-2 RNA og forkortet protokollen med 1 dag (figur 3).

Den samme tilnærmingen ble testet på HAE-kulturer etter inkubering over natten med absolutt metanol ved -20 °C (i henhold til generelle RNA-FISH-protokoller for vevsprøver) og 0,1% Tween20 i 5 min ved RT. Inkubasjon med Tween20 resulterte i et ikke-spesifikt signal, som diskvalifiserer dette reagenset (data ikke vist). Overnight inkubasjon med metanol førte til et svært spesifikt signal uten gjenstander. Det er viktig at løsrivelse av Transwell-membranen ble observert fordi metanol oppløste limet. Dette problemet ble håndtert ved å løsne membranen og fortsette med coverlip-protokollen. Klassiske RNA-FISH prosedyrer bruker proteinase K for å forbedre følsomheten da dette fjerner proteiner og fjerner RNA-proteinkomplekser, noe som gjør celler gjennomførbare av kjemikalier og fargestoffer. Den nåværende protokollen utelot dette trinnet da proteinase K forhindrer proteinfarging. Det ble ikke observert forskjeller i følsomheten til RNA-FISH når proteinase K var fraværende (data ikke vist).

Å utføre immunfluorescensanalyser etter RNA-FISH påvirket ikke RNA-signalet og resulterte i en vellykket kombinasjon av begge metodene. Derfor representerer hele protokollen en praktisk måte å visualisere RNA og dens interaksjoner med proteiner på encellet nivå. Vær oppmerksom på at fiksering av celler (kreves for immuno-RNA-FISH) ikke tillater tidsforløpeksperimenter å undersøke dynamiske hendelser på encellet nivå. Visualisering av SARS-CoV-2 RNA tillater analyse av SARS-CoV-2-replikasjon i en celle, og når den kombineres med immunfluorescens, tillater studiet av intracellulær SARS-CoV-2 RNA/ vertsproteininteraksjoner inkludert samspill med epigenomet. Til slutt har denne protokollen et bredt utvalg av applikasjoner, inkludert deteksjon av SARS-CoV-2 og andre nye virus med encellet oppløsning. Takket være sensitiv og spesifikk HCR-teknologi kan den også brukes som et diagnostisk verktøy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Vitenskaps- og høyere utdanningsdepartementet for forskning på SARS-CoV-2, og av tilskudd fra National Science Center (tilskudd UMO2017/27/B/NZ6/02488 til K.P. og UMO-2018/30/E/NZ1/00874 til A.K.-P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880 ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- Shaker Fisher Scientific 12965501
Incubator Galaxy170R New Brunswick CO170R-230-1000
Thermomixer Comfort Eppendorf 5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips LabSolute 7695022
1.5 mL tubes FL-MEDICAL 5.350.023.053
12-well plate TTP 92412
Conical centrifuge tube Sarstedt 5.332.547.254
parafilm Sigma P7793-1EA
serological pipets VWR Collection 612-5523P, 612-5827P
slide glass PTH CHEMLAND 04-296.202.03
Transwell ThinCerts Grainer bio-one 665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies Invitrogen
β5-tubulin Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPI Thermo Scientific D1306
Disodium phosphate Sigma S51136-500G
EGTA BioShop EGT101.25
HCR Amplification Buffer Molecular Instruments, Inc. BAM01522 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 Molecular Instruments, Inc. S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 Molecular Instruments, Inc. S012522
HCR Probe Hybridization Buffer Molecular Instruments, Inc. BPH03821 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid Molecular Instruments, Inc. PRE134
HCR Probe Wash Buffer Molecular Instruments, Inc. BPW01522 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPES BioShop HEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma 63138-250G
Methanol Sigma 32213-1L-M
Monopotassium phosphate Sigma P5655-100G
Paraformaldehyde Sigma P6148-1KG
PIPES BioShop PIP666.100
Potassium Chloride Sigma P5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting Medium Invitrogen P36970
Sodium Chloride BioShop SOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydrate POCH 6132-04-3
Tween-20 BioShop TWN580.500
Software
Fluorescence Spectraviewer Modeling spectral parameters
ImageJ Fiji Acquiring and processing z-stack images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
  3. Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
  4. Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
  5. El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
  6. Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
  7. Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
  8. Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
  9. Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
  10. Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
  11. Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
  12. Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
  13. Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
  14. Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
  15. Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
  16. Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
  17. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
  18. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  19. Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 166 SARS-CoV-2 RNA-FISH Hybridiseringskjedereaksjon Immunfluorescence Human Airway Epithelium (HAE) Permeabilization Konfiskert mikroskopi
Visualisering av SARS-CoV-2 ved hjelp av Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kula-Pacurar, A., Wadas, J., Suder,… More

Kula-Pacurar, A., Wadas, J., Suder, A., Szczepanski, A., Milewska, A., Ochman, M., Stacel, T., Pyrc, K. Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (166), e62067, doi:10.3791/62067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter