Summary
We beschrijven de engineering van een nieuw DNA-gebonden T7-RNA-polymerase om in vitro transcriptiereacties te reguleren. We bespreken de stappen voor eiwitsynthese en karakterisering, valideren proof-of-concept transcriptionele regulatie en bespreken de toepassingen ervan in moleculaire computing, diagnostiek en moleculaire informatieverwerking.
Abstract
DNA-nanotechnologie maakt programmeerbare zelfassemblage van nucleïnezuren in door de gebruiker voorgeschreven vormen en dynamieken voor diverse toepassingen mogelijk. Dit werk toont aan dat concepten uit de DNA-nanotechnologie kunnen worden gebruikt om de enzymatische activiteit van het faag-afgeleide T7-RNA-polymerase (RNAP) te programmeren en schaalbare synthetische genregulerende netwerken te bouwen. Ten eerste wordt een oligonucleotide-gebonden T7 RNAP ontworpen via expressie van een N-terminale SNAP-gelabelde RNAP en daaropvolgende chemische koppeling van de SNAP-tag met een benzylguanine (BG)-gemodificeerd oligonucleotide. Vervolgens wordt nucleïnezuurstrengverplaatsing gebruikt om polymerasetranscriptie op aanvraag te programmeren. Bovendien kunnen hulpnucleïnezuurassemblages worden gebruikt als "kunstmatige transcriptiefactoren" om de interacties tussen de DNA-geprogrammeerde T7 RNAP met zijn DNA-sjablonen te reguleren. Dit in vitro transcriptie regulerende mechanisme kan een verscheidenheid aan circuitgedragingen implementeren, zoals digitale logica, feedback, cascadering en multiplexing. De composability van deze genregulerende architectuur vergemakkelijkt ontwerpabstractie, standaardisatie en schaling. Deze functies zullen de snelle prototyping van in vitro genetische apparaten mogelijk maken voor toepassingen zoals bio-sensing, ziektedetectie en gegevensopslag.
Introduction
DNA-computing maakt gebruik van een set ontworpen oligonucleotiden als medium voor berekening. Deze oligonucleotiden zijn geprogrammeerd met sequenties om dynamisch te assembleren volgens door de gebruiker gespecificeerde logica en te reageren op specifieke nucleïnezuurinputs. In proof-of-concept studies bestaat de output van de berekening meestal uit een set fluorescerend gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gedetecteerd via gel-elektroforese of fluorescentieplaatlezers. In de afgelopen 30 jaar zijn steeds complexere DNA-computationele circuits aangetoond, zoals verschillende digitale logische cascades, chemische reactienetwerken en neurale netwerken1,2,3. Om te helpen bij de voorbereiding van deze DNA-circuits, zijn wiskundige modellen gebruikt om de functionaliteit van synthetische gencircuits te voorspellen4,5,en computationele hulpmiddelen zijn ontwikkeld voor orthogonaal DNA-sequentieontwerp6,7,8,9,10 . In vergelijking met op silicium gebaseerde computers omvatten de voordelen van DNA-computers hun vermogen om rechtstreeks met biomoleculen te communiceren, in oplossing te werken bij afwezigheid van een voeding, evenals hun algehele compactheid en stabiliteit. Met de komst van next-generation sequencing zijn de kosten van het synthetiseren van DNA-computers de afgelopen twee decennia sneller gedaald dan de wet van Moore11. Toepassingen van dergelijke DNA-gebaseerde computers beginnen nu op te komen, zoals voor ziektediagnose12,13,voor het aandrijven van moleculaire biofysica14en als gegevensopslagplatforms15.
Figuur 1: Mechanisme van door de retentie gemedieerde verplaatsing van DNA-strengen. De toehold, δ, is een vrije, ongebonden reeks op een gedeeltelijke duplex. Wanneer een complementair domein (δ*) op een tweede streng wordt geïntroduceerd, dient het vrije δ domein als houvast voor hybridisatie, waardoor de rest van de streng (ɑ*) zijn concurrent langzaam kan verdringen door een ritsende / unzipping omkeerbare reactie die bekend staat als strengmigratie. Naarmate de lengte van δ toeneemt, neemt de ΔG voor de voorwaartse reactie af en vindt verplaatsing gemakkelijker plaats. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tot op heden gebruiken de meeste DNA-computers een gevestigd motief op het gebied van dynamische DNA-nanotechnologie dat bekend staat als teenhold-gemedieerde DNA-strengverplaatsing (TMDSD, figuur 1)16. Dit motief bestaat uit een gedeeltelijk dubbelstrengs DNA (dsDNA) duplex met korte "teenvaste" overhangen (d.w.z. 7- tot 10 nucleotiden (nt)). Nucleïnezuur "input" strengen kunnen interageren met de partiële duplexen door de teen. Dit leidt tot de verplaatsing van een van de strengen van de gedeeltelijke duplex, en deze bevrijde streng kan dan dienen als input voor stroomafwaartse gedeeltelijke duplexen. TMDSD maakt dus signaalcassering en informatieverwerking mogelijk. In principe kunnen orthogonale TMDSD-motieven onafhankelijk in oplossing werken, waardoor parallelle informatieverwerking mogelijk is. Er zijn een aantal variaties geweest op de TMDSD-reactie, zoals teenhold-gemedieerde DNA-strenguitwisseling (TMDSE)17,"lekloze" teengrepen met dubbellangedomeinen 18,sequentie-niet-overeenkomende teengrepen19en "handhold"-gemedieerde strengverplaatsing20. Deze innovatieve ontwerpprincipes maken nauwkeuriger afgestemde TMDSD-energetica en dynamiek mogelijk voor het verbeteren van dna-rekenprestaties.
Synthetische gencircuits, zoals transcriptionele gencircuits, zijn ook in staat om21,22,23teberekenen. Deze circuits worden gereguleerd door eiwittranscriptiefactoren, die transcriptie van een gen activeren of onderdrukken door zich te binden aan specifieke regulerende DNA-elementen. In vergelijking met DNA-gebaseerde circuits hebben transcriptionele circuits verschillende voordelen. Ten eerste heeft enzymatische transcriptie een veel hogere omloopsnelheid dan bestaande katalytische DNA-circuits, waardoor meer kopieën van de output per enkele kopie van de ingang worden gegenereerd en een efficiëntere manier van signaalversterking wordt geboden. Bovendien kunnen transcriptionele circuits verschillende functionele moleculen produceren, zoals aptameren of boodschapper-RNA (mRNA) die coderen voor therapeutische eiwitten, als berekeningsoutputs, die voor verschillende toepassingen kunnen worden gebruikt. Een belangrijke beperking van de huidige transcriptionele circuits is echter hun gebrek aan schaalbaarheid. Dit komt omdat er een zeer beperkte set orthogonale eiwitgebaseerde transcriptiefactoren is en het de novo ontwerp van nieuwe eiwittranscriptiefactoren technisch uitdagend en tijdrovend blijft.
Figuur 2: Abstractie en mechanisme van "tether" en "cage" polymerase complex. (A en B) Een oligonucleotide tether wordt enzymatisch gelabeld op een T7 polymerase door middel van de SNAP-tag reactie. Een kooi bestaande uit een "faux" T7-promotor met een tether-complementoverhang maakt het mogelijk om te hybridiseren naar de tether en transcriptionele activiteit te blokkeren. (C) Wanneer de operator (a*b*) aanwezig is, bindt hij zich aan de teengreep op de oligonucleotide tether (ab) en verplaatst het b* gebied van de kooi, waardoor transcriptie kan plaatsvinden. Dit cijfer is aangepast van Chou en Shih27. Afkortingen: RNAP = RNA polymerase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dit artikel introduceert een nieuwe bouwsteen voor moleculaire computing die de functionaliteiten van transcriptionele circuits combineert met de schaalbaarheid van dna-gebaseerde circuits. Deze bouwsteen is een T7 RNAP covalent bevestigd met een enkelstrengs DNA-tether(Figuur 2A). Om deze DNA-gebonden T7 RNAP te synthetiseren, werd het polymerase gefuseerd tot een N-terminal SNAP-tag24 en recombinant uitgedrukt in Escherichia coli. De SNAP-tag werd vervolgens gereageerd met een oligonucleotide gefunctionaliseerd met het BG-substraat. De oligonucleotide-tether maakt de positionering van moleculaire gasten in de nabijheid van het polymerase mogelijk via DNA-hybridisatie. Een van die gasten was een competitieve transcriptionele blokker die een "kooi" wordt genoemd, die bestaat uit een "faux" T7 promotor DNA-duplex zonder gen stroomafwaarts(Figuur 2B). Wanneer de kooi via zijn oligonucleotide-tether aan de RNAP wordt gebonden, blokkeert de kooi de polymeraseactiviteit door andere DNA-sjablonen voor RNAP-binding te overtreffen, waardoor de RNAP in een "OFF" -toestand wordt weergegeven(Figuur 2C).
Om het polymerase tot een "ON" -toestand te activeren, werden T7 DNA-sjablonen met enkelstrengs "operator" -domeinen stroomopwaarts van de T7-promotor van het gen ontworpen. Het operatordomein (d.w.z. domein a*b* Figuur 2C)kan worden ontworpen om de kooi via TMDSD van de RNAP te verplaatsen en de RNAP proximaal aan de T7-promotor van het gen te plaatsen, waardoor transcriptie wordt geïnitieerd. Als alternatief werden ook DNA-sjablonen ontworpen waarbij de operatorsequentie complementair was aan hulpnucleïnezuurstrengen die worden aangeduid als "kunstmatige transcriptiefactoren" (d.w.z. TFA- en TFB-strengen in figuur 3A). Wanneer beide strengen in de reactie worden geïntroduceerd, zullen ze zich op de operatorlocatie verzamelen, waardoor een nieuw pseudo-aaneengesloten domein a * b *ontstaat. Dit domein kan vervolgens de kooi verplaatsen via TMDSD om transcriptie te initiëren(Figuur 3B). Deze strengen kunnen zowel exogene als geproduceerd worden geleverd.
Figuur 3: Selectieve programmering van polymeraseactiviteit door middel van een driecomponentenschakelaaractivator. (A) Wanneer de transcriptiefactoren (TFA en TFB) aanwezig zijn, binden ze zich aan het operatordomein stroomopwaarts van de promotor en vormen ze een pseudo-enkelstrengssequentie ( a *b *) die in staat is de kooi te verplaatsen door middel van teengemedieerde DNA-verplaatsing. (B) Dit a*b*-domein kan de kooi via TMDSD verplaatsen om transcriptie te initiëren. Dit cijfer is aangepast van Chou en Shih27. Afkortingen: TF = transcriptiefactor; RNAP = RNA-polymerase; TMDSD = tenen-gemedieerde DNA-strengverplaatsing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het gebruik van op nucleïnezuur gebaseerde transcriptiefactoren voor in vitro transcriptionele regulatie maakt de schaalbare implementatie van geavanceerd circuitgedrag mogelijk, zoals digitale logica, feedback en signaalcassalisatie. Men kan bijvoorbeeld logische poortcascades bouwen door nucleïnezuursequenties zo te ontwerpen dat de transcripties van een stroomopwaarts gen een stroomafwaarts gen activeren. Een toepassing die gebruik maakt van de cascadering en multiplexing die door deze voorgestelde technologie mogelijk wordt gemaakt, is de ontwikkeling van meer geavanceerde moleculaire computercircuits voor draagbare diagnostiek en moleculaire gegevensverwerking. Bovendien kan de integratie van de moleculaire computing en de novo RNA-synthesemogelijkheden nieuwe toepassingen mogelijk maken. Een moleculair circuit kan bijvoorbeeld worden ontworpen om één of een combinatie van door de gebruiker gedefinieerde RNA's te detecteren als inputs en output therapeutische RNA's of mRNA's die coderen voor functionele peptiden of eiwitten voor point-of-care medische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffervoorbereiding
OPMERKING: Eiwitzuiveringsbuffervoorbereiding kan op elke dag plaatsvinden; hier werd het gedaan voordat de experimenten begonnen.
- Bereid lysis/equilibratiebuffer met 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris), 300 mM natriumchloride (NaCl), 5% glycerol en 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8. Voeg 1,5 ml 1M Tris, 1,8 ml 5M NaCl, 1,5 ml glycerol, 25,2 ml gedeïoniseerd water (ddH2O) toe aan een centrifugebuis van 50 ml en voeg vlak voor gebruik 10,5 μL 14,2 M BME toe.
OPMERKING: Tris kan acute toxiciteit veroorzaken; vermijd daarom het inademen van het stof en vermijd huid- en oogcontact. BME is giftig en mag alleen in een zuurkast worden gebruikt. Het is belangrijk om BME als laatste toe te voegen, vlak voor resuspensie en cellysis. Zie tabel 1 voor de lysisbufferformule. - Bereid wasbuffer (pH 8) voor met 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glycerol, 5 mM BME en 20 mM imidazool. Voeg 1,5 ml 1 m Tris, 4,8 ml 5 M NaCl, 1,5 ml glycerol en 22,2 ml ddH2O toe aan een centrifugebuis van 50 ml. Voeg vlak voor gebruik 7 μL 14,2 M BME en 200 μL 2 M imidazool toe aan 20 ml van de bovenstaande oplossing.
OPMERKING: Om acute toxiciteit als gevolg van imidazool te voorkomen, gebruikt u persoonlijke beschermingsmiddelen. Het is belangrijk om BME en imidazool als laatste toe te voegen, net voordat het eiwit uit de kolom wordt gewassen. Zie tabel 2 voor de wasbufferformule. - Bereid elutiebuffer (pH8) voor met 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glycerol, 5 mM BME en 200 mM imidazool. Voeg 0,5 ml 1 m Tris, 1,6 ml 5 M NaCl, 0,5 ml glycerol en 6,4 ml ddH2O toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Voeg vlak voor gebruik 3,5 μL 14,2 M BME en 1 ml 2 M imidazool toe aan 10 ml van de bovenstaande oplossing.
OPMERKING: Het is belangrijk om BME en imidazool als laatste toe te voegen, net voordat u het eiwit uit de kolom eluteert. Zie tabel 3 voor de elutiebufferformule. - Bereid 2x opslagbuffer (te mengen 1:1 met glycerol) met 100 mM Tris, 200 mM NaCl, 40 mM BME en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 0,2% van een niet-ionische oppervlakteactieve stof (zie de tabel met materialen). Bereid 50 ml van de opslagbuffer door 5 ml 1 m Tris, 2 ml 5 M NaCl, 42,56 ml ddH 2 O,200μl 0,5 M EDTA, 100 μl van de niet-ionische oppervlakteactieve stof toe te voegen aan een centrifugebuis van 50 ml. Meng tot de oplossing homogeen is, filtreer de opslagbuffer door een spuitfilter van 0,2 μm en voeg vóór gebruik 140,8 μL BME toe aan de bovenstaande oplossing.
OPMERKING: Om acute toxiciteit als gevolg van EDTA te voorkomen, vermijd het inademen van het stof en vermijd huid- en oogcontact. Het is belangrijk om BME als laatste toe te voegen en de volledige opslagbuffer 1:1 te mengen met glycerol, net voordat het gezuiverde eiwit wordt opgeslagen. Zie tabel 4 voor de opslagbufferformule.
2. Cultuurgroei van de ene op de andere dag: Dag 1
- Bereid 1.000x kanamycine voorraad door het oplossen van 500 mg kanamycine in 10 ml ddH2O.
OPMERKING: Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen om acute toxiciteit als gevolg van kanamycine te voorkomen. - Voeg 20 μL van de 1.000x kanamycine bouillon toe aan 20 ml lysogenese bouillon. Prik met behulp van een steriele pipetpunt een getransformeerde BL21 E. coli-glycerolbouillon en en ent vervolgens de cultuur door de tip in de groeimediabouillon te introduceren.
Figuur 4: Plasmide kaart voor SNAP T7 RNAP. Het plasmide codeert voor een T7 RNAP met een N-terminal histidine tag (6x His) en SNAP-tag domein (SNAP T7 RNAP) onder een lac repressor (lacI) op een pQE-80L backbone. Andere kenmerken zijn kanamycineresistentie (KanR) en chlooramfenicolresistentie (CmR) genen. Afkorting: RNAP = RNA polymerase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OPMERKING: Het plasmide codeert voor een T7 RNAP met een N-terminale histidine-tag en een SNAP-tag-domein (SNAP T7 RNAP), evenals een kanamycineresistentiegen onder een pQE-80L-backbone (Figuur 4)25.
- Voeg nogmaals 20 μL van de 1.000x kanamycine-bouillon toe aan een aparte kweekkolf met 20 ml lysogenesebouillon en incubeer het als een controle.
- Incubeer de twee monsters (uit stap 2.2 en 2.3) gedurende 12-18 uur bij 37 °C, terwijl ze draaien bij 10 × g.
3. Celgroei en inductie: Dag 2
- Ent 400 ml lysogenesebouillon met 400 μL kanamycinebouillon met 4 ml van de nachtelijke groeicultuur vanaf stap 2.4. Incubeer de kweekkolven bij 37 °C en draai bij 10 × g.
- Zodra de cultuur een optische dichtheid (OD) bij 600 nm van ~0,5 heeft bereikt, neemt u ter controle 1 ml monster uit de groeikolf. Bewaar het controlemonster bij 4 °C.
- Induceer de cellen met isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) door 40 μL 1M IPTG per 100 ml cultuur toe te voegen om een eindconcentratie van 0,4 mM IPTG te bereiken. Incubeer het monster gedurende 3 uur bij 37 °C, roteer bij 10 × gen draai vervolgens de geïnduceerde cultuur gedurende 10 minuten bij 8.000 × g om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en bewaar de pellet bij -20 °C tot verder gebruik.
OPMERKING: Om acute toxiciteit als gevolg van IPTG te voorkomen, vermijd het inademen van stof en vermijd huid- en oogcontact. Indien nodig kunt u het experiment hier pauzeren en de volgende dag doorgaan.
4. Cellyse, eiwitzuivering: Dag 3
- Resuspend de opgeslagen celkorrel met 10 ml lysisbuffer op ijs en draai voorzichtig om ervoor te zorgen dat de hele pellet opnieuw wordt gesuspendeerd. Pipetteer vervolgens 1 ml monster in tien buizen van 1,5 ml die op ijs worden bewaard.
- Soniceer elk monster met een amplitude-instelling van "1", gepulseerd gedurende 2 s met een inschakelduur van 50% over een periode van 30 s. Reinig voor en na elk monster de ultrasoonapparaattip met 70% ethanol en ddH2O. Houd alle monsters op ijs tijdens en na de ultrasoonapparaat.
OPMERKING: Houd 70% ethanol uit de buurt van hitte en open vuur. - Breng een met nikkel geladen nitrilotriacetinezuur (Ni-NTA) zuiveringsspilkolom in evenwicht tot een werktemperatuur van 4 °C. Plaats/bewaar de kolom bij 4 °C en houd deze tijdens het gebruik op ijs.
- Centrifugeer de tien monsters van 1 ml bij 15.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Pipetteer voorzichtig het supernatant met de recombinant RNAP zonder de pellet te verstoren. Gebruik indien nodig een extra evenwichtsbuffer om het totale volume aan te passen aan ≥ 6 ml.
- Verwijder voorzichtig het onderste tabblad uit de Ni-NTA-spinkolom om de kolom door te laten stromen. Plaats de kolom in een centrifugebuis en houd deze op ijs.
OPMERKING: Gebruik een centrifugebuis van 50 ml met de Ni-NTA-spinkolommen van 3 ml. - Centrifugeer de kolom bij 700 × g en 4 °C gedurende 2 minuten om de opslagbuffer te verwijderen. Breng de kolom in evenwicht door 6 ml equilibratiebuffer aan de kolom toe te voegen. Laat de buffer volledig in het harsbed komen.
- Verwijder de evenwichtsbuffer uit de kolom door centrifugeren bij 700 × g en 4 °C gedurende 2 minuten. Voordat u het geprepareerde celextract aan de kolom toevoegt, plaatst u een onderste plug op de kolom om te voorkomen dat u een product verliest. Voeg vervolgens het celextract toe aan de kolom en meng gedurende 30 minuten bij 4 °C op een orbitale shakermixer.
- Verwijder de onderste plug uit de kolom en plaats de kolom in een centrifugebuis van 50 ml met het label doorstroom. Centrifugeer de kolom gedurende 2 minuten bij 700 × g om de stroom op te vangen.
- Voeg 6 ml wasbuffer toe aan de kolom om de hars te wassen. Centrifugeer de kolom gedurende 2 minuten bij 700 × g om de fractie te verzamelen in een nieuwe centrifugebuis met het label wash 1. Herhaal deze stap nog twee keer voor een totaal van 3 afzonderlijke fracties en verzamel de fracties in afzonderlijke centrifugebuizen (wassen 2 en wassen 3).
- Voeg 3 ml elutiebuffer toe om de His-tagged eiwitten uit de hars te elueren. Centrifugeer de kolom gedurende 2 minuten bij 700 × g om fractie te verzamelen in een nieuwe centrifugebuis met het label eluaat 1. Herhaal deze stap nog twee keer voor een totaal van 3 afzonderlijke fracties en verzamel de fracties in afzonderlijke centrifugebuizen (elueer 2 en eluate 3).
- Combineer de eluaten en voer ontzouting uit om zouten uit de eiwitoplossing te verwijderen.
- Pipet 15 ml van 0,05 % w/v polysorbaat 20 over een centrifugaalfiltereenheid van 100 kDa. Centrifugeer bij 4.000 × g gedurende 40 minuten en gooi de doorstroming weg.
- Gebruik het gecoate filter om de eluaten 1, 2 en 3 (9 ml eiwitelekaat + 6 ml opslagbuffer) te concentreren tot ~ 1.500 μL. Centrifugeer het filter gedurende 20 minuten op 3.220 × g en pipetteer voorzichtig het membraan om neerslag te voorkomen.
- Verdun het monster tot 15 ml met opslagbuffer. Voer een bufferuitwisseling uit met opslagbuffer 1:1.000 door stap 4.11.2 nog twee keer te herhalen.
- Kwantificeer het gezuiverde eiwit door de absorptie van de fractie bij 280 nm te meten. Leeg de spectrofotometer met opslagbuffer (2x opslagbuffer bij 4 °C). Meng het monster van de gecombineerde eluaten voorzichtig en meet de absorptie ervan.
OPMERKING: Voer drie afzonderlijke metingen uit bij 1x, 10x en 50x verdunningen van het eiwitmonster om het eiwit te gemiddelden en te kwantificeren. Verdun monsters in opslagbuffer. - Stel de eiwitmonsters in op 100 μM met behulp van 2x opslagbuffer. Verdun het aangepaste monster 1:1 van het volume met 100% glycerol. Bewaar de resulterende eiwitoplossing bij -80 °C.
5. Natriumdodecylacylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) analyse van eiwitproduct: Dag 3
- Voer een SDS-PAGE-gel uit voor eiwitanalyse. Meng 9 μL van het monster met 3 μL 4x lithium dodecylsulfaat (LDS) eiwit loading kleurstof. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 95 °C.
- Laad de monsters op een 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel setup. Laad de eiwitladder in put 1 en vervolgens met monsters (van links naar rechts): doorstroom, was 1, was 2, was 3, elutie 1, elutie 2, elutie 3 en totale ontzoute elutie.
OPMERKING: Tabel 5 bevat een tabel voor het laden van monsters voor de SDS-PAGE gel. - Voer de geladen gelmonsters uit in 2-(N- morpholino) ethaansulfonzuur (MES) buffer gedurende 35 minuten bij 200 V. Spoel de gel drie keer in een schone lade gedurende 10 minuten elk met 200 ml ddH2O, met zachte agitatie om eventuele SDS uit de gelmatrix te verwijderen.
OPMERKING: Draag persoonlijke beschermingsmiddelen om acute toxiciteit als gevolg van de MES te voorkomen. - Kleur de gel met 20 ml Coomassie blauw en incubeer de gel een nacht bij kamertemperatuur met zachte agitatie. De-stain de gel tweemaal gedurende 1 uur elk met 200 ml ddH2O met zachte agitatie op een orbitale shaker.
OPMERKING: Het wassen van de gel voor een langere periode of het regelmatig vervangen van het water zal de gevoeligheid verbeteren. Bovendien zal het plaatsen van een gevouwen doekje in de container om overtollige kleurstof te absorberen het dekleuringsproces versnellen.
6. Functionele verificatie van SNAP T7 RNAP via in vitro transcriptie
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van DNA-sjabloon, dat codeert voor het fluorescerende Broccoli RNA-aptamer en het gebruik van fluorescentie mogelijk maakt om de kinetiek van transcriptie op een fluorescentieplaatlezer te controleren.
- Stel drie in vitro transcriptie (IVT) reacties in om de activiteit van SNAP T7 RNAP te vergelijken met wild-type (WT) T7 RNAP van een commerciële bron en een buffer-only controle. Stel het volume van elke reactie in op 20 μL.
- Bereid de SNAP T7 RNAP IVT-reactie voor door 2 μL 10x transcriptiebuffer, 0,4 μL 25 mM ribonucleosidetrifosfaat (rNTP) mix, 5 μL 500 nM DNA-sjabloon, 2 μL 500 nM SNAP T7 RNAP en 10,6 μL ddH2O te mengen.
- Bereid de WT RNAP IVT-reactie voor door 2 μL 10x transcriptiebuffer, 0,4 μL 25 mM rNTP-mix, 5 μL 500 nM DNA-sjabloon, 2 μL WT T7 RNAP en 10,6 μL ddH2O te mengen.
- Bereid de buffer-only IVT-reactie voor door 2 μL 10x transcriptiebuffer, 0,4 μL 25 mM rNTP-mix, 5 μL 500 nM DNA-sjabloon en 12,6 μL ddH2O te mengen.
OPMERKING: Voeg de RNAP als laatste toe en houd de monsters op ijs totdat deze wordt geïntroduceerd. Tabel 6, tabel 7en tabel 8 bevatten de IVT-reactieformules.
- Bewaak de transcriptiekinetiek op een fluorescentieplaatlezer gedurende 2 uur met intervallen van 2 minuten bij 37 °C met een excitatiegolflengte van 470 nm en een emissiegolflengte van 512 nm.
7. Bereiding van BG-gemodificeerde oligonucleotiden: dag 1
- Los het oligonucleotide op met 3'-aminemodificatie in ddH2O tot een eindconcentratie van 1 mM. Label dit S1.
- Meng 25 μL 1 M natriumbicarbonaat (NaHCO3),284 μL 100% dimethylsulfoxide (DMSO), 125 μL S1 (oligonucleotidebouillon) en 66 μL 50 mM van de BG- N-hydroxysuccinimide (NHS) ester (BG-GLA-NHS) verdund met DMSO, pas het volume aan op 500 μL en incubeer 's nachts bij kamertemperatuur bij 100 × g.
OPMERKING: Houd DMSO uit de buurt van hitte en vlammen, omdat het een brandbare vloeistof is. Tabel 9 bevat de reactieformule voor de BG-conjugatie met het oligonucleotide.
- Meng 25 μL 1 M natriumbicarbonaat (NaHCO3),284 μL 100% dimethylsulfoxide (DMSO), 125 μL S1 (oligonucleotidebouillon) en 66 μL 50 mM van de BG- N-hydroxysuccinimide (NHS) ester (BG-GLA-NHS) verdund met DMSO, pas het volume aan op 500 μL en incubeer 's nachts bij kamertemperatuur bij 100 × g.
8. Ethanol/aceton precipitatie van BG-oligonucleotide conjugaat: Dag 2
- Centrifugeer het product van stap 7.1.1. bij 13.000 × g gedurende 5 min. Breng het supernatant voorzichtig over naar een verse buis en gooi alle neergeslagen BG weg. Splits de reactie in twee gelijke aliquots van 250 μL om overloop te voorkomen en voer de volgende stappen uit op beide aliquots.
- Voeg 1/10e van het volume van 3 M natriumacetaat (25 μL), gevolgd door 2,5x het volume in 100% ethanol (625 μL). Incubeer bij -80 °C gedurende 1 uur.
OPMERKING: Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van zowel natriumacetaat (kan irritatie van ogen, huid, spijsvertering en luchtwegen veroorzaken) als ethanol (zeer ontvlambaar, veroorzaakt irritatie bij contact). Pauzeer indien nodig het experiment hier en ga de volgende dag verder. - Plaats de buizen in de centrifuge en markeer de buitenrand. Centrifugeer de buizen bij 17.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: De oligonucleotidekorrel verschijnt op de gemarkeerde rand van de buis. - Zonder de pellet te storen, gooit u het supernatant weg. Vul aan met 750 μL gekoelde 70% ethanol en draai met 17.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Zonder de pellet te storen, gooit u het supernatant weg. Vul aan met 750 μL 100% aceton en draai met 17.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van aceton omdat het zeer licht ontvlambaar is en irritatie veroorzaakt bij contact. - Met het deksel van de buis open, droog gedurende 5 minuten aan de lucht om overtollige aceton door verdamping te verwijderen. Los het oligonucleotide opnieuw op in 250 μL 1x Tris-EDTA (TE) buffer om een BG-oligonucleotideoplossing van ~850 μM te produceren.
- Herhaal stap 8.2 tot en met 8.6 en los opnieuw op in 70 μL 1x TE buffer. Label dit S2.
9. BG-oligonucleotide reiniging via gelfiltratiechromatografie
- Hang de matrix op door de kolommen meerdere keren krachtig om te keren; verwijder de bovenste dop en klik de onderste punt van de kolom af. Plaats de kolom in een centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer de buis gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur op 1.000 × g. Gooi de geëlueerde buffer en opvangbuis weg.
OPMERKING: Het is belangrijk om vacuümvorming te voorkomen. Gebruik voorbereide kolommen onmiddellijk. - Plaats de verpakte kolommen in schone centrifugebuizen van 1,5 ml. Voeg 300 μL 1x TE buffer toe aan het midden van het kolombed en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 × g om de bufferoplossing te vervangen. Gooi nogmaals de geëlueerde buffer en opvangbuis weg.
- Plaats de bufferverwisselde kolommen in schone centrifugebuizen van 1,5 ml. Breng tot 75 μL monster aan op het midden van het bed. Draai op 1.000 × g gedurende 4 minuten.
OPMERKING: Verstoor het bed niet en raak de zijkanten van de kolom niet aan; het hoogste punt van het gelmedium moet naar de buitenrotor wijzen. - Verzamel het eluaat uit de opvangbuis, omdat het het gezuiverde nucleïnezuur bevat. Om het monster te kwantificeren, meet u de absorptie bij 260 nm; label deze S3.
OPMERKING: Noteer de padlengte die bij de meting wordt gebruikt en bereken de concentratie met behulp van de wet van Beer-Lambert.
10. Denaturering PAGE analyse van BG-oligonucleotide conjugaat
- Giet een 18% Tris-boraat-EDTA (TBE)-Urea PAGE gel. Los 4,8 g UREUM, 4,5 ml 40% acrylamide (19:1) en 1 ml 10x TBE op in 2,8 ml ddH2O; voeg 5 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe en meng grondig. Herhaal dit met 100 μL 10% ammoniumperssulfaat (APS). Giet de oplossing in een lege gelcassette en laat polymeriseren gedurende 40 minuten.
OPMERKING: Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van ureum (veroorzaakt irritatie van ogen en huid), acrylamide (giftig en carcinogeen) en TEMED (giftig, ontvlambaar, bijtend). Tabel 10 bevat de reactieformule voor een 18% TBE-UREA polyacrylamide gel. - Magnetron 500 ml TBE-buffer (0,5x) gedurende 2 minuten en 30 s of tot ~ 70 °C en giet in een gelapparaat. Bereid formamide (denatureren) ladende kleurstof met 95% formamide + 1 mM EDTA en broomfenolblauw. Meng de ladingskleurstof met elk monster en laad het mengsel op de polyacrylamidegel.
OPMERKING: Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van formamide omdat het kankerverwekkend is. Tabel 11 bevat een tabel voor het laden van monsters voor gel. - Laat de gel 35 minuten op 270 V lopen, of totdat de voorkant van de kleurstof naar het einde migreert. Plaats de gel in een geldoos en bevlek met cyaninekleurstof voor nucleïnezuren gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voordat u deze afbeeldt.
OPMERKING: Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van cyaninekleurstof omdat het brandbaar is.
11. Vervoeging van oligonucleotide naar SNAP T7 RNAP en PAGE-analyse
- Bereid de reagentia voor op analytische schaal koppeling van BG-oligonucleotide aan SNAP T7 RNAP: maak 9 verdunningen van single-stranded DNA (ssDNA) oligo met ddH2O om oligo:RNAP-verhoudingen te creëren variërend van 5:1 tot 1:5. Verdun de eiwitvoorraad tot 50 μM.
OPMERKING: Voorbeeldverhoudingen zijn te vinden in tabel 12; deze verhoudingen worden berekend met behulp van een RNAP-concentratie van 50 μM. - Maak voor elke verdunning van ssDNA oligo 10 μL van het reactiemengsel dat 2 μL SNAP-buffer, 4 μL BG-oligonucleotide en 4 μL SNAP T7 RNAP bevat.
OPMERKING: Tabel 13 bevat reactieformules voor de SNAP-tag labeling reactie.- Bereid nog twee controlemonsters voor: 1) een RNAP-controle door BG-oligonucleotide te vervangen door ddH2O; 2) een DNA-controle door SNAP T7 RNAP te vervangen door ddH2O (voor de laagste oligonucleotideconcentratie van SNAP T7 RNAP). Incubeer alle monsters bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en blijf op ijs totdat het nodig is.
- Stel elf reacties van 10 μL in door 2 μL van elk monster toe te voegen aan 4 μL SNAP-buffer en 2 μL eiwitbeladende kleurstof, en verwarm bij 70 °C gedurende 10 minuten. Laad 2 μL van elk monster op de 4-12% Bis-Tris-eiwitgel en voer gel-elektroforese uit op ijs bij 200 V gedurende 35 minuten.
OPMERKING: Tabel 14 bevat reactieformules voor de gelbelastingsmonsters.- Was SDS af via 3x waterverversing op een shaker, elke wasbeurt duurt elk 10 minuten. Kleur met cyaninekleurstof voor nucleïnezuren gedurende 15 minuten vóór beeldvorming. Kleur de gel opnieuw met 20 ml Coomassie blauwe vlek gedurende 1 uur. De-vlek met ddH2O gedurende 1 uur (of 's nachts) vóór beeldvorming.
OPMERKING: In de gel zal een van de reacties het meest vastgebonden polymerase produceren, samen met de minste hoeveelheid overtollig vrij BG-oligonucleotide; dit is de optimale verhouding.
- Was SDS af via 3x waterverversing op een shaker, elke wasbeurt duurt elk 10 minuten. Kleur met cyaninekleurstof voor nucleïnezuren gedurende 15 minuten vóór beeldvorming. Kleur de gel opnieuw met 20 ml Coomassie blauwe vlek gedurende 1 uur. De-vlek met ddH2O gedurende 1 uur (of 's nachts) vóór beeldvorming.
- Bereid reagentia voor op de preparatieve schaalkoppeling van BG-oligonucleotide aan SNAP T7 RNAP. Voer de koppelingsreactie uit met de optimale verhouding die in de analytische schaal wordt gevonden.
OPMERKING: Minimaliseer de blootstelling aan eiwitten aan kamertemperatuur door het eiwit op ijs te plaatsen wanneer het niet in gebruik is.
12. Zuivering van oligonucleotide-gebonden SNAP-T7 met behulp van ionenuitwisselingskolommen
- Volg de instructies van de fabrikant voor het instellen van de buis als deze afwijkt van de instructies die hier worden vermeld. Bereid een zuiveringsbuffer voor met een pH hoger dan het iso-elektrische punt van het eiwit.
OPMERKING: Voor het voorbeeldeiwit in dit protocol werd een zuiveringsbuffer van 10 mM natriumfosfaatbuffer (pH 7) gebruikt.- Bereid 1.000 μL elutiebuffer met eindconcentraties van 50 mM Tris en 0,5 M NaCl. Meng 50 μL van 1 M Tris, 100 μL van 5 M NaCl en 850 μL van ddH2O.
OPMERKING: Tabel 15 bevat de reactieformule voor de elutiebuffer.
- Bereid 1.000 μL elutiebuffer met eindconcentraties van 50 mM Tris en 0,5 M NaCl. Meng 50 μL van 1 M Tris, 100 μL van 5 M NaCl en 850 μL van ddH2O.
- Plaats een kolom in een centrifugebuis van 2 ml en was met zuiveringsbuffer op 2.000 × g gedurende 15 minuten, of totdat alle buffer is geëlueerd. Gooi de geëlueerde buffer weg.
- Verdun elk monster met zuiveringsbuffer met een verhouding van 3:1 zuiveringsbuffer:monster en laad het monster per keer in de kolom 400 μL. Draai op 2.000 × g gedurende 10 minuten, of totdat alle buffer is geëlueerd. Verzamel de doorstroming en label deze als doorstroom.
- Voeg 400 μL zuiveringsbuffer toe aan het midden van de kolom. Draai op 2.000 × g gedurende 15 minuten, of totdat alle buffer is geëlueerd. Verzamel de doorstroom en label deze als was 1. Herhaal dit nog twee keer voor was 2 en was 3.
- Voeg 50 μL elutiebuffer toe aan het midden van de kolom. Draai op 2.000 × g gedurende 5 minuten, of totdat alle buffer is geëlueerd. Verzamel de doorstroom en label deze als eluate 1. Herhaal nog twee keer voor eluate 2 en eluate 3.
- Pool elueert 1, 2 en 3 (label dit totale eluaat), laat een kleine fractie van elk eluaat achter voor de gel en meet de absorptie bij 260 nm (A260) en 280 nm (A280). Voeg na de meting glycerol toe in een verhouding van 1:1 en bewaar bij -20 °C tot verder gebruik.
- Gebruik een centrifugaalfiltereenheid (0,5 ml; 30 kDa) om het totale eluaat te bufferen met 2x opslagbuffer (~ 1:100) (label dit product). Maatregel A260/280 opnieuw. Voeg glycerol toe in een verhouding van 1:1 en bewaar bij -20 °C tot verder gebruik.
- Laad elk eluaat: doorstroming, was 1-3, totaal eluaat en product in een 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel, samen met een eiwitladder. Draai op 200 V gedurende 35 minuten, of totdat de voorkant van de kleurstof naar het einde migreert.
13. Demonstratie van on-demand controle van vastgebonden RNA-polymeraseactiviteit
- Bereid 5x gloeibuffer met 25 mM Tris, 5 mM EDTA en 25 mM magnesiumchloride (MgCl2). Meng 2,4 μL van elke sjabloon (1 μM) met 5 μL gloeibuffer en 14,2 μL ddH2O tot een 25 μL van 1 μM dsDNA-kooi. Incubeer deze oplossing bij 75 °C gedurende 2 min. Op dezelfde manier gloeien de zintuiglijke en antisense strengen van de promotor en malachiet groene aptamer DNA-sjabloon. Bereid een 1mM-oplossing van malachietgroen oxalaat.
OPMERKING: Tabel 16 bevat de reactieformule voor 5x gloeibuffer, tabel 17 bevat de reactieformule voor het gloeien van twee ssDNA-sjablonen. - Incubeer de vastgebonden SNAP T7 RNAP met de dsDNA-kooi in een molaire verhouding van 1:5 bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten tot een eindconcentratie van 500 nM RNAP. Blijf op ijs tot het nodig is.
- Verwarm de plaatlezer voor op 37 °C. Stel drie 25 μL IVT-reacties in op ijs
- Stel een reactie in met de gekooide SNAP T7RNAP met nucleïnezuurtranscriptiefactoren. Meng 2,5 μL 10x IVT-buffer, 1 μL 25 mM rNTP-mix, 1 μL 1 mM malachietgroen, 2,5 μL van het RNAP-kooimengsel, 2,5 μL elk van 1 μM transcriptiefactor A en B oligonucleotide strengen, en 3 μL 1 mM malachiet groen aptaamaat sjabloon in 10 μL ddH2O.
- Stel een reactie in met de gekooide SNAP T7RNAP zonder nucleïnezuurtranscriptiefactoren. Meng 2,5 μL 10x IVT-buffer, 1 μL 25 mM rNTP-mix, 1 μL 1 mM malachietgroen, 2,5 μL van het RNAP-kooimengsel en 3 μL 1 mM malachietgroen aptaamersjabloon in 15 μL ddH2O.
- Stel een reactie in die alleen buffer bevat. Meng 2,5 μL 10x IVT-buffer, 1 μL 25 mM rNTP-mix, 1 μL 1 mM malachietgroen en 3 μL 1 mM malachietgroen aptaamaatsjabloon in 17,5 μL ddH2O.
OPMERKING: Tabel 18 bevat een algemene referentie voor de in vitro transcriptiereacties.
- Breng elke reactie over op een plaat met 384 putten. Monitor de transcriptie van het malachietgroene aptamer op een fluorescentieplaatlezer gedurende 2 uur bij 37 °C en met 610 nm excitatie en 655 nm emissie. Als je klaar bent, houd je de plaat op ijs totdat het nodig is.
- Magnetron 0.5x TBE buffer voor 2 min 30 s of tot ~70 °C. Voer de RNA-producten van elke put uit in een denaturerende 12% TBE-Urea polyacrylamide-gel in de verwarmde 0,5x TBE-buffer op 280 V gedurende 20 minuten, of totdat de voorkant van de kleurstof het einde bereikt. Kleur de gel met cyaninekleurstof nucleïnezuurvlek gedurende 10 minuten op een orbitale shaker voordat u deze afbeeldt.
OPMERKING: Tabel 19 bevat de reactieformule voor een denaturerende 12% TBE-Urea PAGE gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 5: SDS-PAGE analyse van SNAP T7 RNAP expressie en in vitro transcriptie assay. (A) SNAP T7 RNAP eiwitzuiveringsanalyse, SNAP T7 RNAP molecuulgewicht: 119.4kDa. FT = doorstroming uit de kolom, W1 = elutiefracties van wasbuffer die onzuiverheden bevatten, E1-3 = elutiefracties die gezuiverd product bevatten en DE = 10x verdunde totale ontzoute elutie. 4-12% prefab Bis-Tris eiwitgel, kleuring: Coomassie blauw, lopende buffer: MES buffer, condities: 200 V gedurende 35 min. (B) Een in vitro transcriptietest werd uitgevoerd op het SNAP T7 RNAP eiwit door de productie van een fluorescerend aptameer in de loop van de tijd te meten. Transcriptiekinetiek werd gedurende 2 uur met intervallen van 2 minuten bij 37 °C gemonitord op een fluorescentieplaatlezer met behulp van excitatiegolflengte bij 470 nm en emissiegolflengte bij 512 nm. Afkortingen: RNAP = RNA polymerase; MES = 2-(N-morfolino) ethaansulfonzuur; SDS-PAGE = natrium dodecylodeylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Succesvolle expressie en zuivering van het recombinante SNAP T7 RNAP-eiwit werd bevestigd met behulp van SDS-PAGE(Figuur 5A). De band voor SNAP T7 RNAP wordt verwacht op ongeveer 119 kDa, consistent met de molecuulgewichten van de wild-type T7 RNAP en de SNAP-tag van respectievelijk 99 kDa en 20 kDa. De hier beschreven His-tag zuiveringsprocedure produceerde in totaal zeven fracties, bestaande uit een doorstroomfractie (FT), drie wasfracties (W1, W2 en W3) en drie elutiedracties (E1, E2 en E3). Bovendien wordt meestal ook een aliquot van het eiwit na bufferuitwisseling en upconcentratie (DE) opgenomen. Zoals te zien is in figuur 5A,verscheen de meest prominente band bij ongeveer 119 kDa in de elutiedracties, wat wijst op succesvolle eiwitexpressie. Het merendeel van de doorstroom- en wasfracties bevatte ruwe cellysaten. Een klein deel van de cellysaten werd overgedragen naar de elutiefracties, wat suggereert dat er strengere wasbeurten moesten worden uitgevoerd, hoewel dit de opbrengst van het eiwitproduct kan verminderen. Naast de belangrijkste SNAP T7 RNAP-band werd een tweede, minder prominente band waargenomen bij ongeveer 20 kDa, die werd toegeschreven aan afgekapt SNAP-tag-eiwit. Op basis van de bandintensiteit was dit bijproduct significant lager in concentratie in vergelijking met de SNAP T7 RNAP. Het kan worden verwijderd door een extra ronde van grootte-uitsluiting chromatografie of diafiltratie met 100 kDa moleculair gewicht cut-off filters. Na SDS-PAGE werd de enzymatische activiteit gevalideerd met behulp van een in vitro transcriptiereactie(figuur 5B). Een T7 DNA-sjabloon dat codeert voor een fluorescerend RNA-aptamer (bijv. Malachietgroen26) werd gebruikt, waarmee de kinetiek van de RNA-productie kan worden bewaakt met behulp van een fluorescentieplaatlezer, evenals vergelijking van transcriptiekinetiek tussen verschillende batches of ontwerpen van polymerasen.
Figuur 6: PAGE analyse van BG-oligonucleotide conjugatie en zuivering. BG werd geconjugeerd op het 3'-uiteinde van het oligonucleotide door middel van standaard aminechemie. BG-gefunctionaliseerde oligonucleotideconjugaten werden gezuiverd van overtollige bijproducten met behulp van een maatuitsluiting chromatografie spinkolom en geanalyseerd op een denaturerende 18% TBE-ureum PAGE na cyaninekleurstof nucleïnezuurkleuring. In deze gel werd een ultra-low range DNA ladder gebruikt. S1 = oligonucleotide, S2 = voorzuivering BG-oligo, S3 = postzuivering BG-oligo. Afkortingen: PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis; BG = benzylguanine; TBE = Tris-boraat-EDTA; EDTA = ethyleendiamine tetra-azijnzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
BG-gefunctionaliseerde oligonucleotiden werden bereid met behulp van standaard amine-reactieve crosslinking-chemie (d.w.z. reagerende BG-GLA-NHS-esters met amine-gemodificeerde oligonucleotiden). Succesvolle koppeling werd geverifieerd via 18% denaturering TBE-Urea PAGE(Figuur 6). In vergelijking met het ongewijzigde oligonucleotide (S1) verhoogt de toevoeging van het BG-deel aan het oligonucleotide het molecuulgewicht en zorgt ervoor dat het BG-gemodificeerde oligo (S3) langzamer in de gel reist. Het gebruik van een denaturerende gel met een hoog percentage is noodzakelijk om dit verschil in single-nucleotide waar te nemen. Denaturerende PAGE-analyse is ook nuttig om batch-to-batch variabiliteit in conjugatie-efficiëntie te karakteriseren, omdat zowel geconjugeerd als ongeconjugeerd oligonucleotide als afzonderlijke banden op de gel kan worden opgelost. Als het product een aanzienlijke hoeveelheid ongeconjugeerd oligonucleotide bevat, kan een tweede ronde chemische koppeling worden toegepast om de reactie tot voltooiing te brengen.
Figuur 7: SDS-PAGE analyse van T7 RNAP-oligonucleotide conjugatie en zuivering. Een BG-gemodificeerd oligonucleotide wordt geconjugeerd aan een T7 RNAP via SNAP-tag. De conjugaten werden gezuiverd van overtollige oligonucleotiden met behulp van sterke kationenuitwisselingsspinkolommen, voordat ze werden geanalyseerd door SDS-PAGE gekleurd met zowel (A) cyaninekleurstof nucleïnezuurkleuring als (B) Coomassie blauwe kleuring. Zowel een eiwitladder als een 10-bp DNA-ladder werden gebruikt in deze gel. FT = doorstroming uit de kolom, W1-W3 = elutiefracties van zuiveringsbuffer die onzuiverheden bevatten, E = gepoolde elutiefracties die gezuiverd product bevatten, P = gezuiverd product na filtratiebufferuitwisseling en upconcentratie, C = SNAP T7 RNAP alleen als controle. Dit cijfer is aangepast van Chou en Shih27. Afkortingen: RNAP = RNA polymerase; SDS-PAGE = natrium dodecylodeylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Na de productie van de SNAP T7 RNAP en BG-gemodificeerd oligonucleotide was de synthese van de DNA-gebonden RNAP een eenvoudige eenpansmengreactie. De resulterende DNA-gebonden T7 RNAP werd gezuiverd van overtollige BG-oligonucleotiden met behulp van een sterke kationenuitwisselingsspinkolom en geanalyseerd door SDS-PAGE te denatureren (Figuur 7). Net als bij het His-tag zuiveringsschema dat in een vorige paragraaf werd beschreven, werden in totaal zeven fracties geanalyseerd, waaronder de initiële doorstroom (FT), drie wasfracties (W1 tot W3), de gepoolde elutiedracties (E), het up-geconcentreerde product (P) en een controle met niet-geconjugeerde T7 RNAP (C). Om een succesvolle vervoeging te verifiëren, werd de gel eerst gekleurd met cyaninekleurstof voor nucleïnezuur, gevolgd door Coomassie-blauw voor het eiwit. Zoals kan worden waargenomen in de met cyaninekleurstof bevlekte gel (figuur 7A), bevatte de initiële FT meestal overtollig BG-oligonucleotide, evenals een klein deel van het DNA-gebonden polymerase (d.w.z. RNAP-oligo) dat niet aan de kationenuitwisselingshars bond.
De wasfracties bevatten een reeks zwakkere banden van de BG-oligonucleotiden (W1-W3) op de bodem van de gel. Dit suggereert een succesvolle verwijdering van overtollig oligonucleotide. De gepoolde elutiedracties (E) bevatten alleen de enkele band van RNAP-oligo veroorzaakt door de binding van het cyaankleurmiddel aan de oligonucleotide-tether. Als baan E banden van vrij oligonucleotide bevat, kunnen meer wasstappen nodig zijn om ze uit het monster te verwijderen. De baan met het gefilterde en up-geconcentreerde product (P) vertoonde dezelfde band als E, maar veel donkerder, wat aangeeft dat de up-concentration procedure succesvol was. De eiwitcontrolekolom bevatte alleen eiwit, dat minimale niet-specifieke binding aan cyaninekleurstof vertoonde, gezien als een zwakke band. Dezelfde patronen werden waargenomen in de Coomassie blauwgekleurde gel (figuur 7B). Een kleine gelmobiliteitsverschuiving werd waargenomen bij vergelijking van de oligonucleotide-geconjugeerde RNAP met de niet-geconjugeerde RNAP-controle.
Figuur 8: In vitro transcriptietest van aan- en uit-toestanden van het gekooide polymerasesysteem. (A) Schema dat T7 RNAP weergeeft in gekooide en niet-afgedekte toestanden. (B en C) Een in vitro transcriptietest werd uitgevoerd op gekooide en niet-afgedekte toestanden van het polymerase door de productie van een fluorescerend aptamer te meten. In deze figuur wordt een toename van 336x in transcriptiesnelheid weergegeven tussen de AAN- en UIT-toestanden. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan (n=3). Dit cijfer is aangepast van Chou en Shih27. Afkortingen: RNAP = RNA polymerase; TF = transcriptiefactor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om een methode voor on-demand schakelen van transcriptievermogen in het vastgebonden RNA-polymerasesysteem te demonstreren, werd een DNA-sjabloonontwerp gebruikt dat reageerde op een paar nucleïnezuurinvoerstrengen TFA en TFB (Figuur 8A). Transcriptionele activiteit werd gecontroleerd door de productie van het malachietgroen fluorescerende aptamer te meten in zowel OFF (d.w.z. gekooide) als ON (d.w.z. niet-afgekapte) toestanden. De hoeveelheid fluorescentiesignaal die aan het einde van de in vitro transcriptie wordt geproduceerd, wordt weergegeven in figuur 8Ben de real-time kinetiek wordt weergegeven in figuur 8C. Hier kan een 336-voudige activering in fluorescentiesignaal worden waargenomen, wat een robuuste controle van polymeraseactiviteit aantoont.
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Volume | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 1.8 | Ml | 300 | Mm |
| Glycerol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 10.5 | μl | 5 | Mm |
| DDH2O | -- | -- | 25.2 | Ml | -- | -- |
| Laatste deel | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabel 1: Lysis/equilibratie bufferformule.
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Volume | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 4.8 | Ml | 800 | Mm |
| Glycerol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 7.0 | μl | 5 | Mm |
| Imidazool | 2 | M | 200 | μl | 20 | Mm |
| DDH2O | -- | -- | 22.2 | Ml | -- | -- |
| Laatste deel | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabel 2: Wasbufferformule.
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Volume | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden |
| Tris | 1 | M | 0.5 | Ml | 50 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 1.6 | Ml | 800 | Mm |
| Glycerol | 100 | % | 0.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 3.5 | μl | 5 | Mm |
| Imidazool | 2 | M | 1 | Ml | 200 | Mm |
| DDH2O | -- | -- | 6.4 | Ml | -- | -- |
| Laatste deel | -- | -- | 10 | Ml | -- | -- |
Tabel 3: Elutiebufferformule.
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Volume | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden |
| Tris | 1 | M | 5 | Ml | 100 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 2 | Ml | 200 | Mm |
| BME | 14.2 | M | 140.8 | μl | 40 | Mm |
| Triton X-100 | 100 | % | 100 | μl | 0.2 | % |
| EDTA | 0.5 | M | 200 | μl | 2 | Mm |
| DDH2O | -- | -- | 42.56 | Ml | -- | -- |
| Laatste deel | -- | -- | 50 | Ml | -- | -- |
Tabel 4: Opslagbufferformule.
| Monster | Beschrijving | μL monster | μL ladende kleurstof |
| 1 | Eiwit Ladder | 9 | -- |
| 2 | FT: Doorstroming | 9 | 3 |
| 3 | W1: Wassen 1 | 9 | 3 |
| 4 | W2: Wassen 2 | 9 | 3 |
| 5 | W3: Wassen 3 | 9 | 3 |
| 6 | E1: Oplossing 1 | 9 | 3 |
| 7 | E2: Oplossing 2 | 9 | 3 |
| 8 | E3: Oplossing 3 | 9 | 3 |
| 9 | DE: Ontzoute elutie | 9 | 3 |
Tabel 5: SDS-PAGE sample loading voor rijstroken van links naar rechts.
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden | Laatste deel | Eenheden |
| Transcriptiebuffer | 10 | X | 1 | X | 2 | μl |
| rNTP-mix | 25 | Mm | 0.5 | Mm | 0.4 | μl |
| DNA sjabloon | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μl |
| SNAP T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μl |
| Nucleasevrij water | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μl |
| Totaal volume | 20 | μl |
Tabel 6: In vitro transcriptiereactieformule met SNAP T7 RNAP (mastermix).
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden | Laatste deel | Eenheden |
| Transcriptiebuffer | 10 | X | 1 | X | 2 | μl |
| rNTP-mix | 25 | Mm | 0.5 | Mm | 0.4 | μl |
| DNA sjabloon | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μl |
| WT T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μl |
| Nucleasevrij water | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μl |
| Totaal volume | 20 | μl |
Tabel 7: In vitro transcriptiereactie formule met wild-type (WT) T7 RNAP (master mix).
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden | Laatste deel | Eenheden |
| Transcriptiebuffer | 10 | X | 1 | X | 2 | μl |
| rNTP-mix | 25 | Mm | 0.5 | Mm | 0.4 | μl |
| DNA sjabloon | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μl |
| Nucleasevrij water | -- | -- | -- | -- | 12.6 | μl |
| Totaal volume | 20 | μl |
Tabel 8: In vitro transcriptiereactieformule zonder polymerase; buffer-only controle.
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Volume | Eenheden | Finaal | Eenheden | Finaal | Eenheden | Laatste deel | Eenheden |
| NaHCO3 Zoekertjes | 1 | M | 25 | μl | 0.05 | Mm | 1,25e-05 | Mol | 500 | μl |
| DMSO | 100 | % | 284 | μl | 56.8 | % | --- | --- | 500 | μl |
| Oligo | 1 | Mm | 125 | μl | 0.25 | μM | 6,25e-08 | Mol | 500 | μl |
| BG-GLA-NHS in DMSO | 50 | Mm | 66 | μl | 6.6 | Mm | 1,65e-06 | Mol | 500 | μl |
Tabel 9: Reactieformule voor benzylguanineconjugatie met het oligonucleotide.
| Gel volume | 10 ml |
| Acrylamide concentratie | 18% |
| g UREUM | 4.8 |
| ml 40% acrylamide (19:1) | 4.5 |
| ml van 10x TBE | 1 |
| ml ddH2O | 2.8 |
| μL TEMED | 5 |
| μL van 10% APS | 100 |
Tabel 10: Reactieformule voor een 18% TBE-UREA denatureringsPAGINA.
| Monster | Beschrijving | μl monster | μl ladende kleurstof |
| 1 | L: Ultra-Low Range Ladder | 3 | -- |
| 2 | S1: 100 nM oligo | 3 | 3 |
| 3 | S2: 100 nM oligo-BG | 3 | 3 |
| 4 | S3: 100 nM oligo-BG + Centri-Spin | 3 | 3 |
Tabel 11: Denatureren van PAGE-monsterbelasting voor rijstroken van links naar rechts.
| Monster | Concentratie (M) | oligo:RNAP |
| 1 | 2,50e-04 | 5:1 |
| 2 | 2,00e-04 | 4:1 |
| 3 | 1,50e-04 | 3:1 |
| 4 | 1,00e-04 | 2:1 |
| 5 | 5,00e-05 | 1:1 |
| 6 | 2,50e-05 | 1:2 |
| 7 | 1,68e-05 | 1:3 |
| 8 | 1,25e-05 | 1:4 |
| 9 | 1,00e-06 | 1:5 |
Tabel 12: Reagensverhoudingen voor analytische schaalkoppeling van BG-oligonucleotide aan SNAP T7 RNAP.
| Reagens | Volume | Eenheid |
| SNAP-buffer | 2 | μl |
| BG-Oligo | 4 | μl |
| SNAP-T7 RNAP | 4 | μl |
| Totaal volume | 10 | μl |
Tabel 13: Reactieformule voor de SNAP-tag labelreactie.
| Steeg | Voorbeeldbeschrijving | Monstervolume (μL) | SNAP-buffervolume (μL) | Laadkleurstofvolume (μL) |
| 1 | Voorbeeld 1 | 2 | 4 | 2 |
| 2 | Voorbeeld 2 | 2 | 4 | 2 |
| 3 | Voorbeeld 3 | 2 | 4 | 2 |
| 4 | Voorbeeld 4 | 2 | 4 | 2 |
| 5 | Voorbeeld 5 | 2 | 4 | 2 |
| 6 | Voorbeeld 6 | 2 | 4 | 2 |
| 7 | Voorbeeld 7 | 2 | 4 | 2 |
| 8 | Voorbeeld 8 | 2 | 4 | 2 |
| 9 | Voorbeeld 9 | 2 | 4 | 2 |
| 10 | RNAP-besturing | 2 | 4 | 2 |
| 11 | Oligocontrole | 2 | 4 | 2 |
| 12 | Ladder | 4 | - |
Tabel 14: Bis-Tris PAGE (4%-12%) reactieformules voor gel lane loading monsters.
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Volume | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden | Laatste deel | Eenheden |
| Tris | 1 | M | 50 | μl | 50 | Mm | 1000 | μl |
| NaCl | 5 | M | 100 | μl | 0.5 | M | 1000 | μl |
| DDH2O | -- | -- | 850 | μl | -- | -- | 1000 | μl |
Tabel 15: Reactieformule voor elutiebuffer (11.1).
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden | volume tot pipet | Eenheden |
| Tris | 1000 | Mm | 25 | Mm | 25 | μl |
| EDTA | 500 | Mm | 5 | Mm | 10 | μl |
| MgCl | 1000 | Mm | 25 | Mm | 25 | μl |
| DDH2O | -- | -- | -- | -- | 940 | μl |
Tabel 16: Reactieformule voor 5x gloeibuffer.
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden | Volume naar pipet | Eenheden | Totaal reactievolume | Eenheden |
| gloeibuffer | 5 | X | 1 | X | 5 | μl | 24 | μl |
| zin | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μl | 24 | μl |
| AntiSense | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μl | 24 | μl |
| DDH2O | -- | -- | -- | -- | 14.2 | μl | 24 | μl |
Tabel 17: Reactieformule die wordt gebruikt om twee ssDNA-sjablonen (sense- en antisense-strengen) te gloeien.
| Reagens | Initiële concentratie | Eenheden | Eindconcentratie | Eenheden | Volume naar pipet | Eenheden | Totaal reactievolume | Eenheden |
| In vitro transcriptie (IVT) buffer | 10 | X | 1 | X | 2.5 | μl | 25 | μl |
| rNTP-mix | 25 | Mm | 1 | Mm | 1 | μl | 25 | μl |
| Malachiet Groen | 1 | Mm | 40 | μM | 1 | μl | 25 | μl |
| RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2.5 | μl | 25 | μl |
| DNA sjabloon | 1000 | Nm | 120 | Nm | 3 | μl | 25 | μl |
| DDH2O | -- | -- | -- | -- | 14 | μl | 25 | μl |
Tabel 18: In vitro transcriptiereactie formule (master mix); omvat RNAP-concentratie.
| Gel Volume | 10 ml |
| Acrylamide concentratie | 12% |
| g UREUM | 4.8 |
| ml 40% acrylamide (29:1) | 3 |
| ml 10x TBE | 1 |
| ml ddH2O | 4.3 |
| μl TEMED | 5 |
| μl 10% APS | 100 |
Tabel 19: Reactieformule voor een 12% TBE-UREA denatureringsPAGINA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie demonstreert een dna-nanotechnologie-geïnspireerde benadering om de activiteit van T7 RNA-polymerase te beheersen door covalent een N-terminaal SNAP-gelabelde recombinant T7 RNAP te koppelen aan een BG-gefunctionaliseerd oligonucleotide, dat vervolgens werd gebruikt om TMDSD-reacties te programmeren. Door het ontwerp werd de SNAP-tag gepositioneerd op het N-eindpunt van het polymerase, omdat het C-eindpunt van wild-type T7 RNAP begraven ligt in de kern van de eiwitstructuur en belangrijke contacten legt met het DNA-sjabloon28. Eerdere pogingen om het polymerase C-terminus te wijzigen hebben geresulteerd in volledig verlies van enzymatische activiteit, tenzij andere compenserende mutaties worden geïntroduceerd. 29,30 Daarentegen worden N-terminale fusies van de T7 RNAP goed verdragen, hoewel de keuze van de fusietag de polymeraseactiviteit kan beïnvloeden. Hoe verschillende tags de RNAP-activiteit beïnvloeden, is niet systematisch vastgesteld. De SNAP-tag is gekozen omdat deze efficiënt en robuust is, waardoor kwantitatieve tagging mogelijk is voor stoichiometrische verhoudingen van het eiwit en oligonucleotide. Als alternatief kunnen andere koppelingschemie worden gebruikt om het oligonucleotide aan het polymerase te koppelen, zoals Ybbr31-tags, Sortase-tags32en SpyTags33,of anders via de introductie van onnatuurlijke aminozuren met reactieve groepen. Het verschil in grootte en volgorde tussen deze tags kan ook van invloed zijn op de activiteit van het resulterende fusie-eiwit, en de optimale keuze voor locatiespecifieke RNAP-tagging verdient toekomstig onderzoek. Ten slotte wordt aanbevolen om de lengte van het oligonucleotide dat aan de RNAP is vastgemaakt, te beperken tot < 30 nt. Dit is ontworpen om niet-specifieke elektrostatische interacties tussen het oligonucleotide en het DNA-bindende domein van de T7 RNAP te verminderen en om de zuivering van het oligonucleotide aangebonden RNAP door ionenwisselingschromatografie te vergemakkelijken.
De voorgestelde technologie die hier wordt beschreven, vereist de expressie van een recombinant SNAP T7 RNAP en er zijn twee kritieke stappen tijdens het syntheseproces die de totale opbrengst van het eiwitproduct beïnvloeden. Ten eerste kan het gebruik van ultrasoonapparaat voor cellysis het monster opwarmen (sectie 4). Om een efficiënte cellysis en eiwitextractie te garanderen zonder het eiwit warmte te denatureren, moet het celmonster tijdens de ultrasoonapparaat op ijs worden gehouden en moet de temperatuur van de ultrasoonapparaatsonde tussen elk monster worden bewaakt. Een tweede kritische stap is de bufferuitwisseling en up-concentratie van de SNAP T7 RNAP na His-tag zuivering (stap 4.11.2). Het is belangrijk om het membraan van de centrifugaalfiltereenheid voorzichtig te pipetteren om eiwitaggregatie te voorkomen, wat de totale opbrengst en eiwitfunctionaliteit zou verminderen.
In principe is de BG-oligonucleotidereactie met SNAP-tag kwantitatief bij een molaire verhouding van 1:1. Een reeks oligonucleotide-polymerase stoichiometrische verhoudingen moet echter worden getest voordat een grotere partij van het materiaal wordt voorbereid. Dit komt omdat de schattingen van de eiwitconcentratie onnauwkeurig kunnen zijn. Deze stap kan het uitvoeren van SDS-PAGE van de koppelingsreactie bij verschillende verdunningen van het BG-oligonucleotide met betrekking tot een constante eiwitconcentratie vereisen om de optimale koppelingsverhouding te identificeren. Tijdens PAGE-analyse kan dezelfde gel serieel worden gekleurd met twee vlekken: een nucleïnezuurvlek gevolgd door een Coomassie Blue-eiwitvlek. Het is belangrijk om SDS grondig van de gel af te wassen voordat u met de nucleïnezuurvlek kleurt. Dit komt omdat het SDS de kleurstof in de gel zal vangen, wat leidt tot een hoog achtergrondsignaal. Verder moet de nucleïnezuurvlek voorafgaand aan de Coomassie Blue eiwitvlek worden uitgevoerd.
Hoewel dit voorgestelde systeem de schaalbaarheid van een DNA-circuit samenbrengt met de functionaliteit van een op eiwitten gebaseerd transcriptiecircuit, introduceert het ook beperkingen die te zien zijn in transcriptionele circuits. Een van de vele voordelen van DNA-computers is de stabiliteit van nucleïnezuren in verschillende omgevingen. Met de toevoeging van polymerasen moet het vastgebonden polymerasesysteem onder specifieke omstandigheden worden opgeslagen om denaturatie te voorkomen. Bovendien moet computing plaatsvinden in een omgeving met specifieke buffercondities die transcriptie mogelijk maken. Hoewel het RNA-polymerase uit de T7-bacteriofaag in deze demonstratie wordt gebruikt, kan een ander RNA-polymerase met meer toepassingsgeschikte omstandigheden worden gebruikt om deze beperking te omzeilen.
De resultaten tonen aan dat dit vastgebonden polymerasesysteem kan worden geschakeld tussen OFF (bijv. Caged) en ON (d.w.z. niet-afgedekte) toestanden met behulp van nucleïnezuur "transcriptiefactoren". Het gebruik van DNA om transcriptie te reguleren maakt het mogelijk om transcriptionele circuits op schaal te ontwerpen, inclusief het bouwen van meerlaagse signaalcascades en feedback. Een ander kenmerk is de zelfversterking van ingangssignalen die worden ontvangen of door het circuit worden geleid, omdat een geactiveerd polymerase dat is gehybridiseerd naar een sjabloon meer kopieën van zijn transcript zal blijven produceren totdat het wordt gestopt. Dit signaalversterkingsmechanisme kan worden gebruikt om de circuitrespons op ingangen met een lage concentratie te versterken. Ten slotte kan deze bouwsteen worden gebruikt om een reeks digitale logica's te implementeren. Deze studie demonstreert de activering van sjablonen via "AND logic" door sjablonen te ontwerpen die moeten worden geactiveerd door twee nucleïnezuurstrengen. Op dezelfde manier kan "OR-logica" worden ontworpen door een DNA-sjabloon te maken dat alleen reageert op streng B en een "adapter" -tussenproduct te introduceren dat streng A vastlegt in ruil voor het produceren van nog een kopie van streng B. In dit geval zou het introduceren van streng A of B als input in de reactie leiden tot transcriptie van het doel-DNA-sjabloon. Het vermogen om rationeel een verscheidenheid aan circuitgedrag op schaal te ontwerpen, zou de implementatie van complexe moleculaire computeralgoritmen mogelijk moeten maken voor opkomende toepassingen in ziektedetectie, draagbare biomanufacturing, evenals moleculaire gegevensverwerking en -opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen concurrerende financiële belangen om door een van de auteurs te verklaren.
Acknowledgments
L.Y.T.C erkent genereuze steun van de New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant en het Medicine by Design Initiative van de Universiteit van Toronto, dat financiering ontvangt van het Canada First Research Excellence Fund (CFREF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Tablets used to make 10 mM buffer |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% acetone | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% ethanol (EtOH) | House Brand | 39752-P016-EAAN | |
| 10x in vitro transcription (IVT) buffer | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Bio Basic | A0026 | |
| 1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M sodium bicarbonate buffer | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X Tris-EDTA (TE) buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M imidazole | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M sodium acetate | Bio Basic | SRB1611 | |
| 40% acrylamide (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x LDS protein sample loading buffer | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| agarose B powder | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 competent E. coli | Addgene | C2530H | |
| BLUeye prestained protein ladder | FroggaBio | PM007-0500 | |
| bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| coomassie blue (SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
| cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S11494 | |
| cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S33102 | |
| dry dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| formamide | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| glycerol | Bio Basic | GB0232 | |
| kanamycin sulfate | BioShop | KAN201.5 | |
| lysogeny broth | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| malachite green oxalate | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS running buffer (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well | Life Technologies | NP0322BOX | |
| oligonucleotide (cage antisense) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| oligonucleotide (cage sense) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| oligonucleotide (malachite green aptamer antisense) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| oligonucleotide (malachite green aptamer sense) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| oligonucleotide (Transcription Factor A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| oligonucleotide (Transcription Factor B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
| oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce strong ion exchange spin columns | Fisher Scientific | 90008 | |
| plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes | Genscript | N/A | custom gene insert |
| protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP mix | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche mini quick DNA spin column | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| Ultra Low Range DNA ladder | Fisher Scientific | 10597012 | |
| urea | BioShop | URE001.1 |
References
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).
- Chen, Y. -J., et al. Programmable chemical controllers made from DNA. Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).
- di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V.
- Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects. Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).
- Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).
- MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational sequence design with R2oDNA Designer. Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).
- Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach. Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).
- Wetterstrand, K.
- Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics. Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).
- Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. Dynamic and scalable DNA-based information storage. Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).
- Yurke, B., Mills, A. P. Using DNA to power nanostructures. Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).
- Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA. Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).
- Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. Effective design principles for leakless strand displacement systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).
- Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement. Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).
- Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -B. V., Ouldridge, T. E. Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions. bioRxiv. , (2020).
- Brophy, J. A. N., Voigt, C. A.
- Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150 (3), 647-658 (2012).
- Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).
- Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles. Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).
- Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits. Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).
- Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. 2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11. Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).
- Chou, L. Y. T., Shih, W. M. In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors. ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).
- Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis. Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase. Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).
- Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).
- Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step. Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).
- Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).
