Summary
Vi beskriver teknikk av en ny DNA-bundet T7 RNA-polymerase for å regulere in vitro transkripsjonsreaksjoner. Vi diskuterer trinnene for proteinsyntese og karakterisering, validerer konseptgodkjenningsregulering og diskuterer dens anvendelser innen molekylær databehandling, diagnostikk og molekylær informasjonsbehandling.
Abstract
DNA nanoteknologi muliggjør programmerbar selvmontering av nukleinsyrer i brukerforeskrevne former og dynamikk for ulike bruksområder. Dette arbeidet viser at begreper fra DNA nanoteknologi kan brukes til å programmere den enzymatiske aktiviteten til phage-avledede T7 RNA-polymerase (RNAP) og bygge skalerbare syntetiske genregulatoriske nettverk. For det første er en oligonukleotid-tethered T7 RNAP konstruert via uttrykk for en N-terminalt SNAP-merket RNAP og påfølgende kjemisk kobling av SNAP-taggen med en benzylguanin (BG)-modifisert oligonukleotid. Deretter brukes nukleinsyrestrengforskyvning til å programmere polymerasetranskripsjon på forespørsel. I tillegg kan hjelpekjernesyreenheter brukes som "kunstige transkripsjonsfaktorer" for å regulere interaksjonene mellom den DNA-programmerte T7 RNAP med sine DNA-maler. Denne in vitro-transkripsjonsregulatoriske mekanismen kan implementere en rekke kretsoppførseler som digital logikk, tilbakemelding, kaskade og multipleksing. Komponerbarheten av denne genregulatoriske arkitekturen letter designabstraksjon, standardisering og skalering. Disse funksjonene vil muliggjøre rask prototyping av in vitro genetiske enheter for applikasjoner som bio-sensing, sykdomsdeteksjon og datalagring.
Introduction
DNA-databehandling bruker et sett med designet oligonukleotider som medium for beregning. Disse oligonukleotidene er programmert med sekvenser for dynamisk montering i henhold til brukerspesifikk logikk og reagerer på spesifikke nukleinsyreinnganger. I konseptgodkjenningsstudier består utgangen av beregningen vanligvis av et sett fluorescerende merket oligonukleotider som kan oppdages via gelelektroforese eller fluorescensplatelesere. I løpet av de siste 30 årene har stadig mer komplekse DNA-beregningskretser blitt demonstrert, for eksempel ulike digitale logikkkaskader, kjemiske reaksjonsnettverk og nevrale nettverk1,2,3. For å hjelpe til med utarbeidelsen av disse DNA-kretsene, har matematiske modeller blitt brukt til å forutsi funksjonaliteten til syntetiske genkretser4,5og beregningsverktøy er utviklet for ortogonal DNA-sekvensdesign6,7,8,9,10 . Sammenlignet med silisiumbaserte datamaskiner inkluderer fordelene med DNA-datamaskiner deres evne til å kommunisere direkte med biomolekyler, operere i løsning i fravær av strømforsyning, samt deres generelle kompaktitet og stabilitet. Med ankomsten av neste generasjons sekvensering har kostnadene ved å syntetisere DNA-datamaskiner gått ned de siste to tiårene med en hastighet raskere enn Moores lov11. Anvendelser av slike DNA-baserte datamaskiner begynner nå å dukke opp, for eksempel for sykdomsdiagnose12,13, for å drive molekylær biofysikk14, og som datalagringsplattformer15.
Figur 1: Mekanisme for tåholdmediert DNA-strengforskyvning. Tåholdet, δ, er en gratis, ubundet sekvens på en delvis dupleks. Når et komplementært domene (δ*) innføres på en annen tråd, fungerer det frie δ-domenet som et tåhold for hybridisering, slik at resten av tråden (ɑ*) sakte kan fortrenge konkurrenten gjennom en zipping / unzipping reversibel reaksjon kjent som strandmigrasjon. Etter hvert som lengden på δ øker, reduseres ΔG for fremoverreaksjonen, og forskyvning skjer lettere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Til dags dato bruker flertallet av DNA-datamaskiner et veletablert motiv innen dynamisk DNA nanoteknologi kjent som tåholdmediert DNA-strandforskyvning (TMDSD, figur 1)16. Dette motivet består av en delvis dobbeltstrenget DNA (dsDNA) dupleks som viser korte "tåhold" overheng (dvs. 7- til 10 nukleotider (nt)). Nukleinsyre "input" tråder kan samhandle med de delvise dupleksene gjennom tåholdet. Dette fører til forskyvning av en av trådene fra den delvise dupleksen, og denne frigjorte strengen kan deretter tjene som inngang for nedstrøms delvise duplekser. Dermed muliggjør TMDSD signalkaskade og informasjonsbehandling. I prinsippet kan ortogonale TMDSD-motiver operere uavhengig i løsning, noe som muliggjør parallell informasjonsbehandling. Det har vært en rekke variasjoner på TMDSD-reaksjonen, for eksempel tåholdmediert DNA-strandutveksling (TMDSE)17, "lekkasjeløse" tåhold med dobbeltlange domener18, sekvens-mismatched tåhold19, og "handhold"-mediert strandforskyvning20. Disse innovative designprinsippene gir mer finjustert TMDSD-energi og dynamikk for å forbedre YTELSEN til DNA-databehandling.
Syntetiske genkretser, som transkripsjonelle genkretser, er også i stand til beregning21,22,23. Disse kretsene er regulert av proteintranskripsjonsfaktorer, som aktiverer eller undertrykker transkripsjon av et gen ved å binde seg til spesifikke regulatoriske DNA-elementer. Sammenlignet med DNA-baserte kretser har transkripsjonskretser flere fordeler. For det første har enzymatisk transkripsjon en mye høyere omsetningshastighet enn eksisterende katalytiske DNA-kretser, og genererer dermed flere kopier av utdata per enkelt kopi av inngang og gir et mer effektivt middel for signalforsterkning. I tillegg kan transkripsjonskretser produsere forskjellige funksjonelle molekyler, for eksempel aptamers eller messenger RNA (mRNA) koding for terapeutiske proteiner, som beregningsutganger, som kan utnyttes til forskjellige applikasjoner. Imidlertid er en stor begrensning av nåværende transkripsjonskretser deres mangel på skalerbarhet. Dette er fordi det er et svært begrenset sett med ortogonale proteinbaserte transkripsjonsfaktorer, og de novo-design av nye proteintranskripsjonsfaktorer forblir teknisk utfordrende og tidkrevende.
Figur 2: Abstraksjon og mekanisme for polymerasekomplekset "tether" og "cage". (A og B) En oligonukleotidetets tether er enzymatisk merket til en T7-polymerase gjennom SNAP-tag-reaksjonen. Et bur bestående av en "faux" T7-promotor med et tether-komplementoverheng gjør det mulig å hybridisere til tether og blokkere transkripsjonsaktivitet. (C) Når operatoren (a*b*) er til stede, binder den seg til tåholdet på oligonukleotidets tether (ab) og fortrenger b* -regionen i buret, slik at transkripsjon kan forekomme. Denne figuren er endret fra Chou og Shih27. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Dette dokumentet introduserer en ny byggestein for molekylær databehandling som kombinerer funksjonaliteten til transkripsjonskretser med skalerbarheten til DNA-baserte kretser. Denne byggesteinen er en T7 RNAP som er kovalent festet med en enkeltstrenget DNA-tether (figur 2A). For å syntetisere denne DNA-tethered T7 RNAP, ble polymerasen smeltet sammen til en N-terminal SNAP-tag24 og rekombinant uttrykt i Escherichia coli. SNAP-taggen ble deretter reagert med et oligonukleotid funksjonalisert med BG-substratet. Oligonukleotid-tetheren tillater posisjonering av molekylære gjester i nærheten av polymerasen via DNA-hybridisering. En slik gjest var en konkurransedyktig transkripsjonsblokkering referert til som et "bur", som består av en "faux" T7 promotør DNA-dupleks uten gen nedstrøms (Figur 2B). Når det bindes til RNAP via sin oligonukleotid-tether, stopper buret polymeraseaktivitet ved å utkonkurrere andre DNA-maler for RNAP-binding, noe som gjør RNAP i en "OFF" -tilstand (Figur 2C).
For å aktivere polymerasen til en "ON" tilstand, ble T7 DNA-maler med enkeltstrengede "operatør" domener oppstrøms for T7-promotoren av genet designet. Operatørdomenet (dvs. domene a*b* figur 2C) kan utformes for å fortrenge merden fra RNAP via TMDSD og plassere RNAP-proksimalt til T7-promotoren av genet, og dermed initiere transkripsjon. Alternativt ble DNA-maler også designet der operatørsekvensen var komplementær til hjelpekjernesyrestrenger som kalles "kunstige transkripsjonsfaktorer" (dvs. TFA- og TFB-tråder i figur 3A). Når begge trådene introduseres i reaksjonen, samles de på operatørstedet og oppretter et nytt pseudo-sammenhengende domene a*b*. Dette domenet kan deretter fortrenge merden via TMDSD for å starte transkripsjon (Figur 3B). Disse trådene kan leveres enten eksogent eller produseres.
Figur 3: Selektiv programmering av polymeraseaktivitet gjennom en tre-komponent bryteraktivator. (A) Når transkripsjonsfaktorene (TFA og TFB) er til stede, binder de seg til operatørdomenet oppstrøms for promotoren, og danner en pseudo-enkeltstrenget sekvens ( a *b *) som er i stand til å fortrenge buret gjennom tåhold mediert DNA-forskyvning. (B) Dette a * b * domenet kan fortrenge buret via TMDSD for å starte transkripsjon. Denne figuren er endret fra Chou og Shih27. Forkortelser: TF = transkripsjonsfaktor; RNAP = RNA polymerase; TMDSD = tåholdmediert DNA-strengforskyvning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Bruken av nukleinsyrebaserte transkripsjonsfaktorer for in vitro transkripsjonsregulering tillater skalerbar implementering av sofistikert kretsatferd som digital logikk, tilbakemelding og signalkaskade. For eksempel kan man bygge logikk gate kaskader ved å designe nukleinsyre sekvenser slik at transkripsjoner fra et oppstrøms gen aktiverer et nedstrøms gen. Et program som utnytter kaskade- og multipleksing gjort i stand til denne foreslåtte teknologien er utviklingen av mer sofistikerte molekylære databehandlingskretser for bærbar diagnostikk og molekylær databehandling. I tillegg kan integrering av molekylær databehandling og de novo RNA-syntesefunksjoner muliggjøre nye applikasjoner. For eksempel kan en molekylær krets utformes for å oppdage en eller en kombinasjon av brukerdefinerte RNAer som innganger og utgangsterapeutiske RNAer eller mRNAer som koder funksjonelle peptider eller proteiner for medisinske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av buffer
MERK: Proteinrensing bufferpreparat kan oppstå på hvilken som helst dag; her ble det gjort før du begynte eksperimentene.
- Klargjør lysis/likevektsbuffer som inneholder 50 mM tris (hydroksymetyl)aminometan (Tris), 300 mM natriumklorid (NaCl), 5% glyserol og 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8. Tilsett 1,5 ml 1M Tris, 1,8 ml 5M NaCl, 1,5 ml glyserol, 25,2 ml deionisert vann (ddH2O) i et 50 ml sentrifugerør, og tilsett 10,5 μL 14,2 M BME like før bruk.
MERK: Tris kan forårsake akutt toksisitet; Unngå derfor å puste støv, og unngå hud- og øyekontakt. BME er giftig og skal kun brukes i en avtrekkshette. Det er viktig å legge til BME sist, like før resuspension og cellelys. Se tabell 1 for lysisbufferformel. - Klargjør vaskebuffer (pH 8) som inneholder 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glyserol, 5 mM BME og 20 mM imidazol. Tilsett 1,5 ml 1 M Tris, 4,8 ml 5 M NaCl, 1,5 ml glyserol og 22,2 ml ddH2O i et 50 ml sentrifugerør. Rett før bruk, tilsett 7 μL 14,2 M BME og 200 μL 2 M imidazol til 20 ml av ovennevnte løsning.
MERK: For å forhindre akutt toksisitet på grunn av imidazol, bruk personlig verneutstyr. Det er viktig å legge til BME og imidazol sist, like før du vasker proteinet ut av kolonnen. Se tabell 2 for formel for vaskebuffer. - Klargjør elutionbuffer (pH8) som inneholder 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glyserol, 5 mM BME og 200 mM imidazol. Tilsett 0,5 ml 1 M Tris, 1,6 ml 5 M NaCl, 0,5 ml glyserol og 6,4 ml ddH2O til et 15 ml sentrifugerør. Rett før bruk, tilsett 3,5 μL 14,2 M BME og 1 ml 2 M imidazol til 10 ml av løsningen ovenfor.
MERK: Det er viktig å legge til BME og imidazol sist, like før du unndrar proteinet ut av kolonnen. Se tabell 3 for formel for elutionbuffer. - Forbered 2x lagringsbuffer (blandes 1:1 med glyserol) som inneholder 100 mM Tris, 200 mM NaCl, 40 mM BME og 2 mM etylendiamintetraketisk syre (EDTA), 0,2% av et ikke-ionisk overflateaktivt middel (se materialtabellen). Forbered 50 ml av lagringsbufferen ved å tilsette 5 ml 1 M Tris, 2 ml 5 M NaCl, 42,56 ml ddH2O, 200 μL 0,5 M EDTA, 100 μL av det ikke-ioniske overflateaktive røret til et 50 ml sentrifugerrør. Bland til løsningen er homogen, filtrer lagringsbufferen gjennom et 0,2 μm sprøytefilter, og tilsett 140,8 μL BME til ovennevnte løsning før bruk.
MERK: For å unngå akutt toksisitet på grunn av EDTA, unngå å puste inn støvet og unngå hud- og øyekontakt. Det er viktig å legge til BME sist og blande hele lagringsbufferen 1:1 med glyserol, like før lagring av det rensede proteinet. Se tabell 4 for formel for lagringsbuffer.
2. Kulturvekst over natten: Dag 1
- Forbered 1000x kanamycin lager ved å oppløse 500 mg kanamycin i 10 ml ddH2O.
MERK: Bruk personlig verneutstyr for å forhindre akutt toksisitet på grunn av kanamycin. - Tilsett 20 μL av den 1000x kanamycinbestanden til 20 ml lysogenybuljong. Bruk en steril pipettespiss, poke en forvandlet BL21 E. coli glyserol lager og deretter inokulere kulturen ved å introdusere spissen i vekstmediebuljongen.
Figur 4: Plasmidkart for SNAP T7 RNAP. Plasmiden koder en T7 RNAP som inneholder en N-terminal histidin tag (6x His) og SNAP-tag domene (SNAP T7 RNAP) under en lac repressor (lacI) på en pQE-80L ryggrad. Andre funksjoner inkluderer kanamycinresistens (KanR) og kloramfenikolresistens (CmR) gener. Forkortelse: RNAP = RNA polymerase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
MERK: Plasmiden koder en T7 RNAP som inneholder en N-terminal histidinkode og et SNAP-tag-domene (SNAP T7 RNAP), samt et kanamycinresistensgen under en pQE-80L ryggrad (figur 4)25.
- Igjen, legg til 20 μL av 1000x kanamycin lager til en egen kultur kolbe som inneholder 20 ml lysogeny buljong, og inkubere den som en kontroll.
- Inkuber de to prøvene (fra trinn 2.2 og 2.3) over natten i 12-18 timer ved 37 °C, mens du roterer ved 10 × g.
3. Cellevekst og induksjon: Dag 2
- Inokuler 400 ml lysogenybuljong som inneholder 400 μL kanamycinbestand med 4 ml av vekstkulturen over natten fra trinn 2.4. Inkuber kulturflaskene ved 37 °C, mens du roterer ved 10 × g.
- Når kulturen har nådd en optisk tetthet (OD) på 600 nm på ~ 0,5, ta ut 1 ml prøve fra vekstflasken som en kontroll. Oppbevar kontrollprøven ved 4 °C.
- Induser cellene med isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ved å legge til 40 μL 1M IPTG per 100 ml kultur for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,4 mM IPTG. Inkuber prøven i 3 timer ved 37 °C, roter ved 10 × g, og spinn deretter den induserte kulturen ved 8000 × g i 10 minutter for å pellet cellene. Fjern supernatanten, og oppbevar pelletsen ved -20 °C til videre bruk.
MERK: For å unngå akutt toksisitet på grunn av IPTG, unngå å puste støv og unngå hud- og øyekontakt. Om nødvendig kan du sette eksperimentet på pause her og fortsette neste dag.
4. Cellelys, proteinrensing: Dag 3
- Resuspend den lagrede cellepellet med 10 ml lysisbuffer på is, og virvle forsiktig for å sikre at hele pelletsen blir resuspendert. Deretter pipette 1 ml prøve i ti 1,5 ml rør som holdes på is.
- Soniker hver prøve ved en amplitudeinnstilling på "1", pulsert i 2 s med en 50% driftssyklus over en periode på 30 s. Før og etter hver prøve, rengjør sonikeringsspissen med 70% etanol og ddH2O. Hold alle prøver på is under og etter sonikering.
MERK: Hold 70 % etanol unna varme og åpen flamme. - Likevekt en nikkelladet nitrilotriacetisk syre (Ni-NTA) rensesøyle til en arbeidstemperatur på 4 °C. Plasser/oppbevar søylen ved 4 °C, og hold den på is under bruk.
- Sentrifuger de ti 1 ml prøvene ved 15 000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Rør forsiktig ut supernatanten som inneholder den rekombinante RNAP uten å forstyrre pelletsen. Bruk eventuelt ekstra likevektsbuffer for å justere det totale volumet til ≥ 6 ml.
- Fjern forsiktig den nederste fanen fra Ni-NTA-spinnkolonnen for å tillate flyt gjennom kolonnen. Plasser søylen i et sentrifugerør, og hold den på is.
MERK: Bruk et sentrifugerør på 50 ml med 3 ml Ni-NTA-spinnkolonner. - Sentrifuger kolonnen ved 700 × g og 4 °C i 2 minutter for å fjerne lagringsbufferen. Likevekt kolonnen ved å legge til 6 ml likevektsbuffer i kolonnen. La bufferen komme helt inn i harpikssengen.
- Fjern likevektsbufferen fra kolonnen ved sentrifugering ved 700 × g og 4 °C i 2 minutter. Før du legger til det klargjorte celleekstraktet i kolonnen, plasserer du en bunnplugg på kolonnen for å unngå å miste noe produkt. Legg deretter celleekstraktet til kolonnen, og bland på en orbital shaker mikser i 30 min ved 4 °C.
- Fjern den nederste pluggen fra kolonnen og plasser kolonnen i et 50 ml sentrifugerør merket gjennomstrømning. Sentrifuger kolonnen ved 700 × g i 2 minutter for å samle gjennom strømmen.
- Tilsett 6 ml vaskebuffer i kolonnen for å vaske harpiksen. Sentrifuger kolonnen på 700 × g i 2 min for å samle brøkdelen i et nytt sentrifugerør merket vask 1. Gjenta dette trinnet to ganger til for totalt 3 separate brøker, og samle fraksjonene i separate sentrifugerør (vask 2 og vask 3).
- Tilsett 3 ml elutionbuffer for å unngå de hismerkede proteinene fra harpiksen. Sentrifuger kolonnen på 700 × g i 2 min for å samle brøkdel i et nytt sentrifugerør merket eluate 1. Gjenta dette trinnet to ganger til for totalt 3 separate brøker, og samle brøkene i separate sentrifugerør (eluate 2 og eluate 3).
- Kombiner eluates og utfør avsalting for å fjerne salter fra proteinoppløsningen.
- Pipette 15 ml 0,05 % m/v polysorbat 20 over en 100 kDa sentrifugalfilterenhet. Sentrifuge ved 4000 × g i 40 minutter og kast gjennomstrømningen.
- Bruk det belagte filteret til å konsentrere eluates 1, 2 og 3 (9 ml totalt protein eluate + 6 ml lagringsbuffer) til ~ 1500 μL. Sentrifuger filteret ved 3220 × g i 20 minutter, og forsiktig pipettevask membranen for å forhindre nedbør.
- Fortynn prøven til 15 ml med lagringsbuffer. Utfør en bufferutveksling ved hjelp av lagringsbuffer 1:1 000 ved å gjenta trinn 4.11.2 to ganger til.
- Kvantifisere det rensede proteinet ved å måle absorbansen av fraksjonen ved 280 nm. Tøm spektrofotometeret med lagringsbuffer (2x lagringsbuffer ved 4 °C). Bland forsiktig prøven av de kombinerte eluates og mål absorbansen.
MERK: Utfør tre separate avlesninger ved 1x, 10x og 50x fortynning av proteinprøven for å gjennomsnittlig og kvantifisere proteinet. Fortynn prøver i lagringsbuffer. - Juster proteinprøvene til 100 μM ved hjelp av 2x lagringsbuffer. Fortynn den justerte prøven 1:1 etter volum med 100 % glyserol. Oppbevar den resulterende proteinoppløsningen ved -80 °C.
5. Natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) analyse av proteinprodukt: Dag 3
- Kjør en SDS-PAGE gel for proteinanalyse. Bland 9 μL av prøven med 3 μL 4x litium dodecylsulfat (LDS) proteinbelastningsfargestoff. Varm opp prøvene ved 95 °C i 10 minutter.
- Last prøvene på et 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel-oppsett. Last proteinstigen i brønn 1, deretter med prøver (fra venstre til høyre): gjennomstrømning, vask 1, vask 2, vask 3, elution 1, elution 2, elution 3 og total avsaltet elution.
MERK: Tabell 5 inneholder et prøvelastebord for SDS-PAGE gel. - Kjør de lastede gelprøvene i 2-(N-morpholino) etanesulfonsyre (MES) buffer i 35 min ved 200 V. Skyll gelen i en ren skuff tre ganger i 10 minutter hver ved hjelp av 200 ml ddH2O, med skånsom agitasjon for å fjerne SDS fra gelmatrisen.
MERK: Bruk personlig verneutstyr for å unngå akutt toksisitet på grunn av MES. - Flekk gelen med 20 ml Coomassie blå, og inkuber gelen over natten ved romtemperatur med mild agitasjon. Flekk gelen to ganger i 1 time hver med 200 ml ddH2O med skånsom agitasjon på en orbital shaker.
MERK: Hvis du vasker gelen over lengre tid eller ofte skifter ut vannet, vil det forbedre følsomheten. I tillegg vil det å plassere et brettet delikat tørkevev i beholderen for å absorbere overflødig fargestoff akselerere avfargingsprosessen.
6. Funksjonell verifisering av SNAP T7 RNAP via in vitro transkripsjon
MERK: Denne protokollen bruker DNA-mal, som koder for fluorescerende Broccoli RNA aptamer og tillater bruk av fluorescens for å overvåke kinetikken til transkripsjon på en fluorescensplateleser.
- Sett opp tre in vitro transkripsjon (IVT) reaksjoner for å sammenligne aktiviteten til SNAP T7 RNAP med wild-type (WT) T7 RNAP fra en kommersiell kilde og en bare bufferkontroll. Juster volumet på hver reaksjon til 20 μL.
- Forbered SNAP T7 RNAP IVT-reaksjonen ved å blande 2 μL 10x transkripsjonsbuffer, 0,4 μL 25 mM ribonukleoside triphosfatblanding (rNTP), 5 μL 500 nM DNA-mal, 2 μL 500 nM SNAP T7 RNAP og 10,6 μL ddH2O.
- Forbered WT RNAP IVT-reaksjonen ved å blande 2 μL 10x transkripsjonsbuffer, 0,4 μL 25 mM rNTP-blanding, 5 μL 500 nM DNA-mal, 2 μL WT T7 RNAP og 10,6 μL ddH2O.
- Forbered den bufferbaserte IVT-reaksjonen ved å blande 2 μL 10x transkripsjonsbuffer, 0,4 μL 25 mM rNTP-blanding, 5 μL 500 nM DNA-mal og 12,6 μL ddH2O.
MERK: Tilsett RNAP sist, og hold prøvene på is til introduksjonen. Tabell 6, Tabell 7og Tabell 8 inneholder IVT-reaksjonsformlene.
- Overvåk transkripsjonskinetikken på en fluorescensplateleser i 2 timer ved 2 min intervaller ved 37 °C ved hjelp av en eksitasjonsbølgelengde på 470 nm og en utslippsbølgelengde på 512 nm.
7. Fremstilling av BG-modifiserte oligonukleotider: Dag 1
- Løs opp oligonukleotidet med 3'-amin modifikasjon i ddH2O til en endelig konsentrasjon på 1 mM. Merk denne S1.
- Bland 25 μL 1 M natriumbikarbonat (NaHCO3), 284 μL 100% dimetylsulfoksid (DMSO), 125 μL S1 (oligonukleotid og 66 μL 50 mM BG- N-hydroksysuccinimid (NHS) ester (BG-GLA-NHS) fortynnet med DMSO, juster volumet til 500 μL, og inkubere over natten ved romtemperatur ved 100 × g.
MERK: Hold DMSO unna varme og flamme, da det er en brennbar væske. Tabell 9 inneholder reaksjonsformelen for BG-konjugeringen til oligonukleotidet.
- Bland 25 μL 1 M natriumbikarbonat (NaHCO3), 284 μL 100% dimetylsulfoksid (DMSO), 125 μL S1 (oligonukleotid og 66 μL 50 mM BG- N-hydroksysuccinimid (NHS) ester (BG-GLA-NHS) fortynnet med DMSO, juster volumet til 500 μL, og inkubere over natten ved romtemperatur ved 100 × g.
8. Etanol/aceton nedbør av BG-oligonukleotid konjugat: Dag 2
- Sentrifuger produktet av trinn 7.1.1. ved 13.000 × g i 5 min. Overfør forsiktig supernatanten til et friskt rør og kast eventuelle utfelte BG. Del reaksjonen i to like 250 μL aliquots for å forhindre overløp, og utfør følgende trinn på begge aliquots.
- Tilsett 1/10tonn av volumet på 3 M natriumacetat (25 μL), etterfulgt av 2,5 ganger volumet i 100% etanol (625 μL). Inkuber ved -80 °C i 1 time.
MERK: Bruk personlig verneutstyr ved håndtering av både natriumacetat (kan forårsake irritasjon i øyne, hud, fordøyelses- og luftveier) og etanol (ekstremt brannfarlig, forårsaker irritasjon ved kontakt). Sett om nødvendig eksperimentet på pause her og fortsett neste dag. - Plasser rørene i sentrifugen, og merk ytterkanten. Sentrifuger rørene ved 17.000 × g i 30 min ved 4 °C.
MERK: Oligonukleotidpellet vises på den markerte kanten av røret. - Uten å forstyrre pellets, kast supernatanten. Fyll på med 750 μL kjølt 70% etanol, og spinn på 17.000 × g i 10 min ved 4 °C.
- Uten å forstyrre pellets, kast supernatanten. Fyll på med 750 μL 100% aceton, og spinn på 17.000 × g i 10 min ved 4 °C.
MERK: Bruk personlig verneutstyr ved håndtering av aceton, da det er ekstremt brannfarlig og forårsaker irritasjon ved kontakt. - Med rørlokket åpent, lufttørk i 5 min for å fjerne overflødig aceton gjennom fordampning. Løs opp oligonukleotidet på nytt i 250 μL 1x Tris-EDTA (TE)-buffer for å produsere en ~850 μM BG-oligonukleotidløsning.
- Gjenta trinn 8,2 til 8,6, og løs opp på nytt i 70 μL 1x TE-buffer. Merk denne S2.
9. BG-oligonukleotid opprydding via gelfiltrering kromatografi
- Suspender matrisen ved å invertere kolonnene kraftig flere ganger; fjern den øverste hetten og klikk av den nederste spissen av kolonnen. Plasser søylen i et 1,5 ml sentrifugerør, og sentrifuger røret ved 1000 × g i 1 min ved romtemperatur. Kast den eluterte bufferen og oppsamlingsrøret.
MERK: Det er viktig å forhindre vakuumdannelse. Bruk klargjorte kolonner umiddelbart. - Plasser de pakkede søylene i rene 1,5 ml sentrifugerør. Tilsett 300 μL 1x TE-buffer i midten av søylesengen, og sentrifuger på 1000 × g i 2 minutter for å bytte bufferløsningen. Kast igjen den eluterte bufferen og oppsamlingsrøret.
- Plasser de bufferbyttede søylene i rene 1,5 ml sentrifugerør. Påfør opptil 75 μL prøve til midten av sengen. Spinn på 1000 × g i 4 min.
MERK: Ikke forstyrr sengen eller berør sidene av kolonnen; Det høyeste punktet på gelmediet skal peke mot den ytre rotoren. - Samle eluate fra oppsamlingsrøret, da det inneholder renset nukleinsyre. For å kvantifisere prøven, mål absorbansen ved 260 nm; etiketten denne S3.
MERK: Legg merke til banelengden som brukes i målingen, og beregn konsentrasjonen ved hjelp av Beer-Lambert-loven.
10. Denaturing PAGE analyse av BG-oligonukleotid konjugat
- Kast en 18% Tris-borate-EDTA (TBE)-Urea PAGE gel. Løs opp 4,8 g UREA, 4,5 ml 40 % akrylamid (19:1) og 1 ml 10x TBE i 2,8 ml ddH2O; tilsett 5 μL tetrametyletylendiamin (TEMED) og bland grundig. Gjenta med 100 μL 10% ammoniumpersulfat (APS). Hell løsningen i en tom gelkassett og la polymerisasjon i 40 min.
MERK: Bruk egnet personlig verneutstyr ved håndtering av urea (forårsaker irritasjon i øyne og hud), akrylamid (giftig og kreftfremkallende) og TEMED (giftig, brannfarlig, etsende). Tabell 10 inneholder reaksjonsformelen for en 18 % TBE-UREA polyakrylamidgel. - Mikrobølgeovn 500 ml TBE buffer (0,5x) i 2 min og 30 s eller til ~70 °C og hell i et gelapparat. Forbered formamid (denaturing) lastfargestoff som inneholder 95% formamid + 1 mM EDTA og bromofenolblå. Bland lastfargen med hver prøve, og last blandingen på polyakrylamidgelen.
MERK: Bruk egnet personlig verneutstyr ved håndtering av formamid, da det er kreftfremkallende. Tabell 11 inneholder et prøvegellastebord. - Kjør gelen på 270 V i 35 min, eller til fargefronten migrerer til slutten. Legg gelen i en gelboks og flekk med cyaninfargestoff for nukleinsyrer i 15 min ved romtemperatur før avbildning.
MERK: Bruk egnet personlig verneutstyr ved håndtering av cyaninfarge, da det er brennbart.
11. Konjugering av oligonukleotid til SNAP T7 RNAP og PAGE-analyse
- Forbered reagensene for den analytiske koblingen av BG-oligonukleotid til SNAP T7 RNAP: gjør 9 fortynninger av enkeltstrenget DNA (ssDNA) oligo med ddH2O for å skape oligo:RNAP-forhold fra 5:1 til 1:5. Fortynn proteinbestanden til 50 μM.
MERK: Eksempelforhold finnes i tabell 12; Disse forholdene beregnes ved hjelp av en RNAP-konsentrasjon på 50 μM. - For hver fortynning av ssDNA oligo, gjør 10 μL av reaksjonsblandingen som inneholder 2 μL SNAP-buffer, 4 μL BG-oligonukleotid og 4 μL SNAP T7 RNAP.
MERK: Tabell 13 inneholder reaksjonsformler for SNAP-tag-merkingsreaksjonen.- Forbered ytterligere to kontrollprøver: 1) en RNAP-kontroll ved å erstatte BG-oligonukleotid med ddH2O; 2) en DNA-kontroll ved å erstatte SNAP T7 RNAP med ddH2O (for den laveste oligonukleotidkonsentrasjonen av SNAP T7 RNAP). Inkuber alle prøver ved romtemperatur i 1 time, og hold på is til det er nødvendig.
- Sett opp elleve 10 μL reaksjoner ved å tilsette 2 μL av hver prøve til 4 μL SNAP-buffer og 2 μL proteinbelastningsfargestoff, og varm ved 70 °C i 10 minutter. Last 2 μL av hver prøve på 4-12% Bis-Tris proteingel, og utfør geleelektroforese på is ved 200 V i 35 minutter.
MERK: Tabell 14 inneholder reaksjonsformler for gellasteprøvene.- Vask SDS av via 3x vannutveksling på en shaker, hver vask som varer 10 min hver. Flekk med cyaninfargestoff for nukleinsyrer i 15 minutter før avbildning. Flekk gelen igjen ved hjelp av 20 ml Coomassie blå flekk i 1 time. Avflekking med ddH2O i 1 time (eller over natten) før avbildning.
MERK: I gelen vil en av reaksjonene produsere den mest tethered polymerase sammen med minst mulig overflødig fri BG-oligonukleotid; Dette er det optimale forholdet.
- Vask SDS av via 3x vannutveksling på en shaker, hver vask som varer 10 min hver. Flekk med cyaninfargestoff for nukleinsyrer i 15 minutter før avbildning. Flekk gelen igjen ved hjelp av 20 ml Coomassie blå flekk i 1 time. Avflekking med ddH2O i 1 time (eller over natten) før avbildning.
- Forbered reagenser for den forberedende skalakoblingen BG-oligonukleotid til SNAP T7 RNAP. Utfør koblingsreaksjonen med det optimale forholdet som finnes i den analytiske skalaen.
MERK: Minimer proteineksponeringen for romtemperatur ved å plassere proteinet på is når det ikke er i bruk.
12. Rensing av oligonukleotid-bundet SNAP-T7 ved hjelp av ionbyttekolonner
- Følg produsentens instruksjoner for røroppsett hvis det avviker fra instruksjonene som er oppført her. Forbered en rensebuffer med pH høyere enn proteinets isoelektriske punkt.
MERK: For eksempelproteinet i denne protokollen ble det brukt en rensebuffer på 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 7).- Forbered 1000 μL elutionbuffer som inneholder endelige konsentrasjoner på 50 mM Tris og 0,5 M NaCl. Bland 50 μL av 1 M Tris, 100 μL 5 M NaCl og 850 μL ddH2O.
MERK: Tabell 15 inneholder reaksjonsformelen for elutionbufferen.
- Forbered 1000 μL elutionbuffer som inneholder endelige konsentrasjoner på 50 mM Tris og 0,5 M NaCl. Bland 50 μL av 1 M Tris, 100 μL 5 M NaCl og 850 μL ddH2O.
- Plasser en kolonne i et 2 ml sentrifugerør, og vask med rensebuffer på 2000 × g i 15 minutter, eller til all bufferen er unngått. Forkast den eluterte bufferen.
- Fortynn hvert utvalg med rensebuffer med et 3:1-rensebuffer:utvalgsforhold, og last prøven inn i kolonnen 400 μL om gangen. Spinn på 2000 × g i 10 minutter, eller til all bufferen er unngått. Samle gjennomstrømningen og merk den som gjennomstrømning.
- Legg til 400 μL rensebuffer i midten av kolonnen. Spinn på 2000 × g i 15 min, eller til all bufferen er unngått. Samle gjennomstrømningen og merk den som vask 1. Gjenta to ganger til for vask 2 og vask 3.
- Legg til 50 μL elutionbuffer i midten av kolonnen. Spinn på 2000 × g i 5 min, eller til all bufferen er unngått. Samle gjennomstrømningen og merk den som eluate 1. Gjenta to ganger til for eluate 2 og eluate 3.
- Bassenget eluates 1, 2 og 3 (merk denne totale eluate), forlater en liten brøkdel av hver eluate for gelen, og måler absorbans ved 260 nm (A260) og 280 nm (A280). Etter målingen, tilsett glyserol med et 1:1-forhold og oppbevar ved -20 °C til videre bruk.
- Bruk en sentrifugalfilterenhet (0,5 ml, 30 kDa) til å bufferbytte total eluate med 2x lagringsbuffer (~1:100) (merk dette produktet). Mål A260/280 på nytt. Tilsett glyserol med et forhold på 1:1 og oppbevar ved -20 °C til videre bruk.
- Last hver eluate: gjennomstrømning, vask 1-3, total eluate og produkt i en 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel, sammen med en protein stige. Kjør på 200 V i 35 min, eller til fargefronten migrerer til slutten.
13. Demonstrasjon av behovsbetinget kontroll av tethered RNA polymeraseaktivitet
- Klargjør 5x glødebuffer som inneholder 25 mM Tris, 5 mM EDTA og 25 mM magnesiumklorid (MgCl2). Bland 2,4 μL av hver mal (1 μM) med 5 μL glødebuffer og 14,2 μL ddH2O for å danne 25 μL 1 μM dsDNA-bur. Inkuber denne oppløsningen ved 75 °C i 2 minutter. På samme måte, anneal sans og antisense tråder av promotoren og malakitt grønn aptamer DNA mal. Forbered en 1mM løsning av malakittgrønn oksalat.
MERK: Tabell 16 inneholder reaksjonsformelen for 5x glødebuffer, tabell 17 inneholder reaksjonsformelen for annealing av to ssDNA-maler. - Inkuber den tethered SNAP T7 RNAP med dsDNA-buret i et 1:5 molarforhold ved romtemperatur i 15 minutter til en endelig konsentrasjon på 500 nM RNAP. Hold deg på isen til det er nødvendig.
- Forvarm plateleseren til 37 °C. Sett opp tre 25 μL IVT-reaksjoner på is
- Sett opp en reaksjon som inneholder den burede SNAP T7RNAP med nukleinsyretranskripsjonsfaktorer. Bland 2,5 μL 10x IVT-buffer, 1 μL 25 mM rNTP-blanding, 1 μL 1 mM malakittgrønn, 2,5 μL av RNAP-burblandingen, 2,5 μL hver av 1 μM transkripsjonsfaktor A og B oligonukleotidstrenger og 3 μL 1 mM malakittgrønn aptamermal i 10 μL ddH2O.
- Sett opp en reaksjon som inneholder snap T7RNAP uten nukleinsyretranskripsjonsfaktorer. Bland 2,5 μL 10x IVT-buffer, 1 μL 25 mM rNTP-blanding, 1 μL 1 mM malakittgrønn, 2,5 μL av RNAP-burblandingen og 3 μL 1 mM malakittgrønn aptamermal i 15 μL ddH2O.
- Definer en reaksjon som bare inneholder buffer. Bland 2,5 μL 10x IVT-buffer, 1 μL 25 mM rNTP-blanding, 1 μL 1 mM malakittgrønn og 3 μL 1 mM malakittgrønn aptamermal i 17,5 μL ddH2O.
MERK: Tabell 18 inneholder en generell referanse for in vitro transkripsjonsreaksjonene.
- Overfør hver reaksjon til en 384-brønns plate. Overvåk transkripsjon av malakittgrønn aptamer på en fluorescensplateleser i 2 timer ved 37 °C og med 610 nm eksitasjon og 655 nm utslipp. Når du er ferdig, hold platen på is til det er nødvendig.
- Mikrobølgeovn 0,5x TBE buffer i 2 min 30 s eller til ~70 °C. Kjør RNA-produktene til hver brønn i en denaturerende 12% TBE-Urea polyakrylamidgel i den oppvarmede 0,5x TBE-bufferen ved 280 V i 20 minutter, eller til fargefronten når slutten. Flekk gelen med cyaninfarget nukleinsyreflekk i 10 min på en orbital shaker før avbildning.
MERK: Tabell 19 inneholder reaksjonsformelen for en denaturerende 12 % TBE-Urea PAGE gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5: SDS-PAGE analyse av SNAP T7 RNAP-uttrykk og in vitro transkripsjonsanalyse. (A) SNAP T7 RNAP proteinrensingsanalyse, SNAP T7 RNAP molekylvekt: 119.4kDa. FT = gjennomstrømning fra kolonnen, W1 = elutionfraksjoner av vaskebuffer som inneholder urenheter, E1-3 = elutionfraksjoner som inneholder renset produkt, og DE = 10x fortynnet total avsaltet elution. 4-12% prefabrikkert Bis-Tris proteingel, flekk: Coomassie blå, løpebuffer: MES buffer, forhold: 200 V i 35 min. (B) En in vitro transkripsjonsanalyse ble utført på SNAP T7 RNAP-proteinet ved å måle produksjonen av en fluorescerende aptamer over tid. Transkripsjon kinetikk ble overvåket på en fluorescensplateleser i 2 timer ved 2 min intervaller ved 37 °C ved hjelp av eksitasjonsbølgelengde ved 470 nm og utslippsbølgelengde ved 512 nm. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase; MES = 2-(N-morpholino) etanesulfonsyre; SDS-PAGE = natrium dodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Vellykket uttrykk og rensing av det rekombinante SNAP T7 RNAP-proteinet ble bekreftet ved hjelp av SDS-PAGE (figur 5A). Båndet for SNAP T7 RNAP forventes til ca. 119 kDa, i samsvar med molekylvektene til den ville T7 RNAP og SNAP-taggen er henholdsvis 99 kDa og 20 kDa. His-tag rensingsprosedyren beskrevet her produserte totalt syv brøker, bestående av en gjennomstrømningsfraksjon (FT), tre vaskefraksjoner (W1, W2 og W3) og tre elutionfraksjoner (E1, E2 og E3). I tillegg er et aliquot av proteinet etter bufferutveksling og oppkonsentrasjon (DE) også vanligvis inkludert. Som sett i figur 5A, det mest fremtredende bandet dukket opp på ca 119 kDa i elution fraksjoner, noe som tyder på vellykket proteinuttrykk. De fleste gjennomstrømnings- og vaskefraksjonene inneholdt råcellelysater. En mindre del av cellelysene overføres til elutionfraksjonene, noe som tyder på at strengere vasker måtte utføres, selv om dette kan redusere utbyttet av proteinproduktet. I tillegg til hovedkortet til SNAP T7 RNAP ble det observert et annet, mindre fremtredende bånd på omtrent 20 kDa, som ble tilskrevet avkortet SNAP-tag-protein. Basert på båndintensitet var dette biproduktet betydelig lavere i konsentrasjon sammenlignet med SNAP T7 RNAP. Det kan fjernes ved en ekstra runde med størrelse-eksklusjon kromatografi eller diafiltrasjon med 100 kDa molekylvekt cut-off filtre. Etter SDS-PAGE ble den enzymatiske aktiviteten validert ved hjelp av en in vitro transkripsjonsreaksjon (figur 5B). En T7 DNA-mal som koder en fluorescerende RNA-aptamer (f.eks. malakittgrønn26) ble brukt, noe som gjør det mulig å overvåke RNA-produksjonskinetikk ved hjelp av en fluorescensplateleser, samt sammenligning av transkripsjonskinetikk mellom forskjellige batcher eller design av polymeraser.
Figur 6: SIDEanalyse av BG-oligonukleotidkonjugering og rensing. BG ble konjugert på 3'enden av oligonukleotidet gjennom standard aminkjemi. BG-funksjonaliserte oligonukleotidkonjugater ble renset fra overflødige biprodukter ved hjelp av en størrelseseksklusjonskromatografi spinnkolonne og analysert på en denaturing 18% TBE-Urea PAGE etter cyanin fargestoffkjernesyre flekk. En ultra-lav rekkevidde DNA-stige ble brukt i denne gelen. S1 = oligonukleotid, S2 = pre-rensing BG-oligo, S3 = etterrensing BG-oligo. Forkortelser: PAGE = polyakrylamid gel elektroforese; BG = benzylguanin; TBE = Tris-borate-EDTA; EDTA = etylendiamin tetraedinsyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
BG-funksjonaliserte oligonukleotider ble fremstilt ved hjelp av standard aminreaktiv krysskoblingskjemi (dvs. reagere BG-GLA-NHS estere med aminmodifiserte oligonukleotider). Vellykket kobling ble verifisert via 18 % som denaturing TBE-Urea PAGE (Figur 6). Sammenlignet med det umodifiserte oligonukleotidet (S1), øker tilsetningen av BG-moietyen til oligonukleotidet sin molekylvekt og får den BG-modifiserte oligo (S3) til å reise langsommere i gelen. Bruken av en høy prosentandel denaturering gel er nødvendig for å observere denne enkeltkjerneplidelsen. Denaturing PAGE analyse er også nyttig for å karakterisere batch-til-batch variasjon i konjugering effektivitet, som både konjugert og ukonjugert oligonukleotid kan løses som separate bånd på gelen. Hvis produktet inneholder en betydelig mengde ukonjugert oligonukleotid, kan en andre runde med kjemisk kobling påføres for å drive reaksjonen til ferdigstillelse.
Figur 7: SDS-PAGE analyse av T7 RNAP-oligonukleotidkonjugering og rensing. Et BG-modifisert oligonukleotid er konjugert til en T7 RNAP via SNAP-tag. Konjugatene ble renset fra overflødige oligonukleotider ved hjelp av sterke kationutvekslingsspinsøyler, før de ble analysert av SDS-PAGE farget med bådecyaninfargetnukleinsyreflekk og (B) Coomassie blå flekk. Både en protein stige og en 10-bp DNA stige ble brukt i denne gelen. FT = gjennomstrømning fra kolonnen, W1-W3 = elutionfraksjoner av rensebuffer som inneholder urenheter, E = samlede elutionfraksjoner som inneholder renset produkt, P = renset produkt etter filtreringsbufferutveksling og oppkonsentrasjon, C = SNAP T7 RNAP bare som kontroll. Denne figuren er endret fra Chou og Shih27. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase; SDS-PAGE = natrium dodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter produksjonen av SNAP T7 RNAP og BG-modifisert oligonukleotid var syntesen av den DNA-tethered RNAP en enkel en-potte blandingsreaksjon. Den resulterende DNA-tethered T7 RNAP ble renset fra overflødige BG-oligonukleotider ved hjelp av en sterk kationutveksling spinn kolonne og analysert ved å denaturing SDS-PAGE (Figur 7). Som med His-tag rensing ordningen beskrevet i et tidligere avsnitt, ble totalt syv brøker analysert, inkludert den første gjennomstrømningen (FT), tre vaskefraksjoner (W1 til W3), de samlede elutionfraksjonene (E), det oppkonsentrerte produktet (P) og en kontroll som inneholder ukonjugert T7 RNAP (C). For å verifisere vellykket konjugering ble gelen først farget med cyaninfargestoff for nukleinsyre, etterfulgt av Coomassie blå for proteinet. Som det kan observeres i cyaninfarget gel (figur 7A), inneholdt den første FT for det meste overflødig BG-oligonukleotid, samt en liten del av DNA-bundet polymerase (dvs. RNAP-oligo) som ikke binder seg til kationutvekslingsharpiksen.
Vaskefraksjonene inneholdt en rekke fainterbånd av BG-oligonukleotider (W1-W3) på bunnen av gelen. Dette antyder vellykket fjerning av overflødig oligonukleotid. De samlede elutionfraksjonene (E) inneholdt bare det ene båndet av RNAP-oligo forårsaket av bindingen av cyaninfargen til oligonukleotidet. Hvis bane E inneholder bånd med fritt oligonukleotid, kan det være nødvendig med flere vasketrinn for å fjerne dem fra prøven. Banen som inneholder det filtrerte og oppkonsentrerte produktet (P) viste samme bånd som E, men mye mørkere, noe som indikerer at oppkonsentrasjonsprosedyren var vellykket. Proteinkontrollkolonnen inneholdt bare protein, som viste minimal ikke-spesifikk binding til cyaninfargestoff, sett på som et svakt bånd. De samme mønstrene ble observert i Coomassie blåfarget gel (Figur 7B). Et lite gelmobilitetsskift ble observert ved sammenligning av oligonukleotidkonjugert RNAP med den ikke-konjugede RNAP-kontrollen.
Figur 8: In vitro transkripsjonsanalyse av ON- og OFF-tilstander av innestengt polymerasesystem. (A) Skjematisk som viser T7 RNAP i innstengte og uadresserte tilstander. (B og C) En in vitro transkripsjonsanalyse ble utført på burede og uagede tilstander av polymerasen ved å måle produksjonen av en fluorescerende aptamer. Vist i dette tallet er en 336x økning i transkripsjonshastigheten mellom PÅ- og AV-statene. Feilfelt angir standardavvik (n=3). Denne figuren er endret fra Chou og Shih27. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase; TF = transkripsjonsfaktor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å demonstrere en metode for behovsbetinget veksling av transkripsjonsevne i det tethered RNA-polymerasesystemet, ble det brukt en DNA-maldesign som reagerte på et par nukleinsyreinngangsstrenger TFA og TFB (Figur 8A). Transkripsjonell aktivitet ble overvåket ved å måle produksjonen av den malakittgrønne fluorescerende aptameren i både OFF (dvs. bur) og ON (dvs. uoppnåelige) stater. Mengden fluorescenssignal som produseres på slutten av in vitro-transkripsjonen, er vist i figur 8B, og kinetikken i sanntid er vist i figur 8C. Her kan en 336 ganger aktivering i fluorescenssignal observeres, noe som demonstrerer robust kontroll av polymeraseaktivitet.
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Volum | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 1.8 | Ml | 300 | Mm |
| Glyserol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 10.5 | μL | 5 | Mm |
| ddH2O | -- | -- | 25.2 | Ml | -- | -- |
| Endelig volum | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabell 1: Lysis/likevektsbufferformel.
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Volum | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 4.8 | Ml | 800 | Mm |
| Glyserol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 7.0 | μL | 5 | Mm |
| Imidazol | 2 | M | 200 | μL | 20 | Mm |
| ddH2O | -- | -- | 22.2 | Ml | -- | -- |
| Endelig volum | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabell 2: Formel for vaskebuffer.
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Volum | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter |
| Tris | 1 | M | 0.5 | Ml | 50 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 1.6 | Ml | 800 | Mm |
| Glyserol | 100 | % | 0.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 3.5 | μL | 5 | Mm |
| Imidazol | 2 | M | 1 | Ml | 200 | Mm |
| ddH2O | -- | -- | 6.4 | Ml | -- | -- |
| Endelig volum | -- | -- | 10 | Ml | -- | -- |
Tabell 3: Elution buffer formel.
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Volum | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter |
| Tris | 1 | M | 5 | Ml | 100 | Mm |
| NaCl | 5 | M | 2 | Ml | 200 | Mm |
| BME | 14.2 | M | 140.8 | μL | 40 | Mm |
| Triton X-100 | 100 | % | 100 | μL | 0.2 | % |
| EDTA | 0.5 | M | 200 | μL | 2 | Mm |
| ddH2O | -- | -- | 42.56 | Ml | -- | -- |
| Endelig volum | -- | -- | 50 | Ml | -- | -- |
Tabell 4: Formel for lagringsbuffer.
| Eksempel | Beskrivelse | μL av prøve | μL av lastefargestoff |
| 1 | Protein stige | 9 | -- |
| 2 | FT: Gjennomstrømning | 9 | 3 |
| 3 | W1: Vask 1 | 9 | 3 |
| 4 | W2: Vask 2 | 9 | 3 |
| 5 | W3: Vask 3 | 9 | 3 |
| 6 | E1: Elution 1 | 9 | 3 |
| 7 | E2: Elution 2 | 9 | 3 |
| 8 | E3: Elution 3 | 9 | 3 |
| 9 | DE: Avsaltet elution | 9 | 3 |
Tabell 5: SDS-PAGE prøvelasting for baner fra venstre til høyre.
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter | Endelig volum | Enheter |
| Transkripsjonsbuffer | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| rNTP-blanding | 25 | Mm | 0.5 | Mm | 0.4 | μL |
| DNA-mal | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| SMEKK T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μL |
| Nukleasefritt vann | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μL |
| Totalt volum | 20 | μL |
Tabell 6: In vitro transkripsjon reaksjon formel med SNAP T7 RNAP (master mix).
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter | Endelig volum | Enheter |
| Transkripsjonsbuffer | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| rNTP-blanding | 25 | Mm | 0.5 | Mm | 0.4 | μL |
| DNA-mal | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| WT T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μL |
| Nukleasefritt vann | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μL |
| Totalt volum | 20 | μL |
Tabell 7: In vitro transkripsjon reaksjon formel med wild-type (WT) T7 RNAP (master mix).
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter | Endelig volum | Enheter |
| Transkripsjonsbuffer | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| rNTP-blanding | 25 | Mm | 0.5 | Mm | 0.4 | μL |
| DNA-mal | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| Nukleasefritt vann | -- | -- | -- | -- | 12.6 | μL |
| Totalt volum | 20 | μL |
Tabell 8: In vitro transkripsjon reaksjon formel uten polymerase; bare bufferkontroll.
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Volum | Enheter | Finale | Enheter | Finale | Enheter | Endelig volum | Enheter |
| NaHCO3 | 1 | M | 25 | μL | 0.05 | Mm | 1.25E-05 | Mol | 500 | μL |
| DMSO | 100 | % | 284 | μL | 56.8 | % | --- | --- | 500 | μL |
| Oligo | 1 | Mm | 125 | μL | 0.25 | μM | 6.25E-08 | Mol | 500 | μL |
| BG-GLA-NHS i DMSO | 50 | Mm | 66 | μL | 6.6 | Mm | 1.65E-06 | Mol | 500 | μL |
Tabell 9: Reaksjonsformel for benzylguaninkonjugering til oligonukleotidet.
| Gel volum | 10 ml |
| Akrylamidkonsentrasjon | 18% |
| g UREA | 4.8 |
| ml 40 % akrylamid (19:1) | 4.5 |
| ml 10x TBE | 1 |
| ml ddH2O | 2.8 |
| μL TEMED | 5 |
| μL av 10% APS | 100 |
Tabell 10: Reaksjonsformel for en 18 % TBE-UREA-denatureringsside.
| Eksempel | Beskrivelse | μl prøve | μl lastefargestoff |
| 1 | L: Ultra-lav rekkevidde stige | 3 | -- |
| 2 | S1: 100 nM oligo | 3 | 3 |
| 3 | S2: 100 nM oligo-BG | 3 | 3 |
| 4 | S3: 100 nM oligo-BG + Sentri-Spinn | 3 | 3 |
Tabell 11: Denaturing PAGE prøve lasting for baner fra venstre til høyre.
| Eksempel | Konsentrasjon (M) | oligo:RNAP |
| 1 | 2.50E-04 | 5:1 |
| 2 | 2.00E-04 | 4:1 |
| 3 | 1.50E-04 | 3:1 |
| 4 | 1.00E-04 | 2:1 |
| 5 | 5.00E-05 | 1:1 |
| 6 | 2.50E-05 | 1:2 |
| 7 | 1.68E-05 | 1:3 |
| 8 | 1.25E-05 | 1:4 |
| 9 | 1.00E-06 | 1:5 |
Tabell 12: Reagensforhold for analytisk skalakobling av BG-oligonukleotid til SNAP T7 RNAP.
| Reagent | Volum | Enhet |
| SNAP-buffer | 2 | μL |
| BG-Oligo | 4 | μL |
| SNAP-T7 RNAP | 4 | μL |
| Totalt volum | 10 | μL |
Tabell 13: Reaksjonsformel for snap-tag-merkingsreaksjonen.
| Kjørefelt | Eksempel beskrivelse | Prøvevolum (μL) | SNAP-buffervolum (μL) | Laster fargevolum (μL) |
| 1 | Eksempel 1 | 2 | 4 | 2 |
| 2 | Eksempel 2 | 2 | 4 | 2 |
| 3 | Eksempel 3 | 2 | 4 | 2 |
| 4 | Eksempel 4 | 2 | 4 | 2 |
| 5 | Eksempel 5 | 2 | 4 | 2 |
| 6 | Eksempel 6 | 2 | 4 | 2 |
| 7 | Eksempel 7 | 2 | 4 | 2 |
| 8 | Eksempel 8 | 2 | 4 | 2 |
| 9 | Eksempel 9 | 2 | 4 | 2 |
| 10 | RNAP-kontroll | 2 | 4 | 2 |
| 11 | Oligo-kontroll | 2 | 4 | 2 |
| 12 | Stige | 4 | - |
Tabell 14: Bis-Tris PAGE (4%-12%) reaksjonsformler for gel lane lasting prøver.
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Volum | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter | Endelig volum | Enheter |
| Tris | 1 | M | 50 | μL | 50 | Mm | 1000 | μL |
| NaCl | 5 | M | 100 | μL | 0.5 | M | 1000 | μL |
| ddH2O | -- | -- | 850 | μL | -- | -- | 1000 | μL |
Tabell 15: Reaksjonsformel for elutionbuffer (11,1).
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter | volum til pipette | Enheter |
| Tris | 1000 | Mm | 25 | Mm | 25 | μL |
| EDTA | 500 | Mm | 5 | Mm | 10 | μL |
| MgCl | 1000 | Mm | 25 | Mm | 25 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 940 | μL |
Tabell 16: Reaksjonsformel for 5x glødebuffer.
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter | Volum til pipette | Enheter | Totalt reaksjonsvolum | Enheter |
| glødebuffer | 5 | X | 1 | X | 5 | μL | 24 | μL |
| sans | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μL | 24 | μL |
| antisense | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μL | 24 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 14.2 | μL | 24 | μL |
Tabell 17: Reaksjonsformel som brukes til å anneal to ssDNA maler (sans og antisense tråder).
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Enheter | Endelig konsentrasjon | Enheter | Volum til pipette | Enheter | Totalt reaksjonsvolum | Enheter |
| Buffer for in vitrotranskripsjon (IVT) | 10 | X | 1 | X | 2.5 | μL | 25 | μL |
| rNTP-blanding | 25 | Mm | 1 | Mm | 1 | μL | 25 | μL |
| Malakitt grønn | 1 | Mm | 40 | μM | 1 | μL | 25 | μL |
| RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2.5 | μL | 25 | μL |
| DNA-mal | 1000 | Nm | 120 | Nm | 3 | μL | 25 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 14 | μL | 25 | μL |
Tabell 18: In vitro transkripsjon reaksjon formel (master mix); inkluderer RNAP-konsentrasjon.
| Gel volum | 10 ml |
| Akrylamidkonsentrasjon | 12% |
| g UREA | 4.8 |
| ml 40 % akrylamid (29:1) | 3 |
| ml 10x TBE | 1 |
| ml ddH2O | 4.3 |
| μl TEMED | 5 |
| μl 10% APS | 100 |
Tabell 19: Reaksjonsformel for en 12 % TBE-UREA-denatureringsside.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien demonstrerer en DNA nanoteknologi-inspirert tilnærming for å kontrollere aktiviteten til T7 RNA-polymerase ved å kovalent koble en N-terminalt SNAP-merket rekombinant T7 RNAP med en BG-funksjonalisert oligonukleotid, som senere ble brukt til å programmere TMDSD-reaksjoner. Ved design ble SNAP-taggen plassert ved polymerasens N-terminus, da C-terminus av wild-type T7 RNAP er begravet i proteinstrukturkjernen og gjør viktige kontakter med DNA-malen28. Tidligere forsøk på å modifisere polymerase C-terminus har resultert i fullstendig tap av enzymatisk aktivitet med mindre andre kompenserende mutasjoner blir introdusert. 29,30 Til sammenligning er N-terminale fusjoner av T7 RNAP godt tolerert, selv om valget av fusjonstaggen kan påvirke polymeraseaktiviteten. Hvordan ulike tagger påvirker RNAP-aktivitet er ikke systematisk bestemt. SNAP-taggen ble valgt fordi den er effektiv og robust, noe som muliggjør kvantitativ merking for stoichiometriske forhold mellom protein og oligonukleotid. Alternativt kan andre koblingskjemier brukes til å koble oligonukleotidet til polymerasen, for eksempel Ybbr31-koder, Sortase-koder32og SpyTags33, ellers via introduksjonen av unaturlige aminosyrer som bærer reaktive grupper. Forskjellen i størrelse og sekvens mellom disse taggene kan også påvirke aktiviteten til det resulterende fusjonsproteinet, og det optimale valget for stedsspesifikk RNAP-merking fortjener fremtidig undersøkelse. Til slutt anbefales det å begrense lengden på oligonukleotidet som er bundet til RNAP for å < 30 nt. Dette er designet for å redusere ikke-spesifikke elektrostatiske interaksjoner mellom oligonukleotidet med DNA-bindende domenet til T7 RNAP og for å lette rensing av oligonukleotidet tethered RNAP ved ionutvekslingskromatografi.
Den foreslåtte teknologien som er beskrevet her krever uttrykk for en rekombinant SNAP T7 RNAP, og det er to kritiske trinn under synteseprosessen som påvirker det totale utbyttet av proteinproduktet. For det første kan bruk av sonikering for cellelysis varme opp prøven (avsnitt 4). For å sikre effektiv cellelys og proteinekstraksjon uten varmedemturering av proteinet, bør celleprøven holdes på is gjennom sonikering og temperaturen på sonikeringssonden overvåkes mellom hver prøve. Et annet kritisk skritt er bufferutveksling og oppkonsentrasjon av SNAP T7 RNAP etter his-tag rensing (trinn 4.11.2). Det er viktig å forsiktig pipettevaske membranen til sentrifugalfilterenheten for å forhindre proteinaggregering, noe som vil redusere det totale utbyttet og proteinfunksjonaliteten.
I prinsippet er BG-oligonukleotidreaksjonen med SNAP-tag kvantitativ med et 1:1 molarforhold. Imidlertid bør en rekke oligonukleotid-til-polymerase stoichiometriske forhold testes før du forbereder en større batch av materialet. Dette er fordi proteinkonsentrasjonsestimatene kan være unøyaktige. Dette trinnet kan kreve å utføre SDS-PAGE av koblingsreaksjonen ved forskjellige fortynninger av BG-oligonukleotid med hensyn til en konstant proteinkonsentrasjon for å identifisere det optimale koblingsforholdet. Under PAGE-analyse kan den samme gelen serielt farges med to flekker: en nukleinsyreflekk etterfulgt av en Coomassie Blue proteinflekk. Det er viktig å vaske SDS grundig av gelen før farging med nukleinsyreflekken. Dette er fordi SDS vil fange fargestoffet i gelen, noe som fører til et høyt bakgrunnssignal. Videre må nukleinsyreflekken utføres før Coomassie Blue proteinflekken.
Mens dette foreslåtte systemet samler skalerbarheten til en DNA-krets med funksjonaliteten til en proteinbasert transkripsjonskrets, introduserer det også begrensninger sett i transkripsjonskretser. En av de mange fordelene med DNA-datamaskiner er stabiliteten til nukleinsyrer i en rekke miljøer. Ved tilsetning av polymeraser må det tethered polymerasesystemet lagres under bestemte forhold for å forhindre denaturering. Videre må databehandling skje i et miljø med spesifikke bufferforhold som tillater transkripsjon. Selv om RNA-polymerasen fra T7-bakteriofage brukes i denne demonstrasjonen, kan en annen RNA-polymerase med mer brukstilpassede forhold brukes til å omgå denne begrensningen.
Resultatene viser at dette tethered polymerasesystemet kan veksles mellom OFF (f.eks. bur) og ON (dvs. urørt) tilstander ved hjelp av nukleinsyre "transkripsjonsfaktorer". Bruk av DNA for å regulere transkripsjon gjør det mulig å designe transkripsjonskretser i stor skala, inkludert bygging av signalkaskader og tilbakemeldinger i flere lag. En annen funksjon er selvforsterkning av inngangssignaler mottatt eller passert gjennom kretsen, da en aktivert polymerase som har hybridisert til en mal, vil fortsette å produsere flere kopier av transkripsjonen til den stoppes. Denne signalforsterkningsmekanismen kan utnyttes til å forsterke kretsresponsen på lavkonsentrasjonsinnganger. Til slutt kan denne byggeblokken brukes til å implementere en rekke digitale logikker. Denne studien demonstrerer aktivering av maler via "OG logikk" ved å designe maler som må aktiveres av to nukleinsyrestrenger. På samme måte kan "OR-logikk" utformes ved å gjøre en DNA-mal responsiv mot bare tråd B, og introdusere en "adapter" mellomliggende som sequesters strand A i bytte for å produsere enda en kopi av tråd B. I dette tilfellet vil innføring av enten streng A eller B som innganger i reaksjonen utløse transkripsjon av mål-DNA-malen. Evnen til å rasjonelt designe en rekke kretsatferd i stor skala bør muliggjøre implementering av komplekse molekylære databehandlingsalgoritmer for nye applikasjoner i sykdomsdeteksjon, bærbar bioproduksjon, samt molekylær databehandling og lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen konkurrerende økonomiske interesser å erklære av noen av forfatterne.
Acknowledgments
L.Y.T.C anerkjenner sjenerøs støtte fra New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant, og University of Toronto's Medicine by Design Initiative, som mottar støtte fra Canada First Research Excellence Fund (CFREF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Tablets used to make 10 mM buffer |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% acetone | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% ethanol (EtOH) | House Brand | 39752-P016-EAAN | |
| 10x in vitro transcription (IVT) buffer | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Bio Basic | A0026 | |
| 1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M sodium bicarbonate buffer | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X Tris-EDTA (TE) buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M imidazole | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M sodium acetate | Bio Basic | SRB1611 | |
| 40% acrylamide (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x LDS protein sample loading buffer | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| agarose B powder | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 competent E. coli | Addgene | C2530H | |
| BLUeye prestained protein ladder | FroggaBio | PM007-0500 | |
| bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| coomassie blue (SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
| cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S11494 | |
| cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S33102 | |
| dry dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| formamide | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| glycerol | Bio Basic | GB0232 | |
| kanamycin sulfate | BioShop | KAN201.5 | |
| lysogeny broth | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| malachite green oxalate | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS running buffer (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well | Life Technologies | NP0322BOX | |
| oligonucleotide (cage antisense) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| oligonucleotide (cage sense) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| oligonucleotide (malachite green aptamer antisense) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| oligonucleotide (malachite green aptamer sense) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| oligonucleotide (Transcription Factor A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| oligonucleotide (Transcription Factor B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
| oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce strong ion exchange spin columns | Fisher Scientific | 90008 | |
| plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes | Genscript | N/A | custom gene insert |
| protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP mix | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche mini quick DNA spin column | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| Ultra Low Range DNA ladder | Fisher Scientific | 10597012 | |
| urea | BioShop | URE001.1 |
References
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).
- Chen, Y. -J., et al. Programmable chemical controllers made from DNA. Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).
- di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V.
- Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects. Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).
- Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).
- MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational sequence design with R2oDNA Designer. Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).
- Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach. Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).
- Wetterstrand, K.
- Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics. Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).
- Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. Dynamic and scalable DNA-based information storage. Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).
- Yurke, B., Mills, A. P. Using DNA to power nanostructures. Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).
- Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA. Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).
- Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. Effective design principles for leakless strand displacement systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).
- Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement. Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).
- Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -B. V., Ouldridge, T. E. Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions. bioRxiv. , (2020).
- Brophy, J. A. N., Voigt, C. A.
- Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150 (3), 647-658 (2012).
- Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).
- Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles. Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).
- Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits. Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).
- Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. 2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11. Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).
- Chou, L. Y. T., Shih, W. M. In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors. ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).
- Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis. Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase. Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).
- Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).
- Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step. Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).
- Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).
