Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

גישות הדמיה וניתוח תלת-ממדיות וארבעה מימדים לחקר התארכות צירית וסגמנטציה צירית של בעלי חוליות

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62086
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

Summary

כאן, אנו מתארים כלים ושיטות חישוביות המאפשרים הדמיה וניתוח של נתוני תמונה תלת-ממדיים וארבעה מימדיים של עוברי עכבר בהקשר של התארכות צירית וסגמנטציה, המתקבלים על ידי טומוגרפיה של הקרנה אופטית טוטו, ועל ידי הדמיה חיה וכתם אימונופלואורסצנטי בהר שלם באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית.

Abstract

סומיטוגנזה הוא סימן היכר של התפתחות עוברית חוליות. במשך שנים, חוקרים חקרו את התהליך הזה במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות מגוון רחב של טכניקות המקיפות גישות ex vivo ו במבחנה. עם זאת, רוב המחקרים עדיין מסתמכים על ניתוח של נתוני הדמיה דו-ממדיים (דו-ממדיים), המגבילים הערכה נכונה של תהליך התפתחותי כמו הרחבה צירית וסומיטוגנזה המערבת אינטראקציות דינמיות מאוד במרחב תלת-ממדי מורכב. כאן אנו מתארים טכניקות המאפשרות רכישת הדמיה חיה של עכבר, עיבוד ערכת נתונים, הדמיה וניתוח בתלת-ממד וב-4D כדי לחקור את התאים (למשל, אבות עצביים) המעורבים בתהליכים התפתחותיים אלה. אנו מספקים גם פרוטוקול שלב אחר שלב לטומוגרפיה של הקרנה אופטית ומיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה בעוברי עכבר (מהכנה מדגמית לרכישת תמונה) ומציגים צינור שפיתחנו לעיבוד ולהדמיה של נתוני תמונה תלת-ממדית. אנו מרחיבים את השימוש בכמה מטכניקות אלה ומדגישים תכונות ספציפיות של תוכנות זמינות שונות (למשל, פיג'י / ImageJ, Drishti, Amira ו- Imaris) שניתן להשתמש בהן כדי לשפר את ההבנה הנוכחית שלנו של הרחבה צירית ויצירת somite (למשל, שחזורים תלת-ממדיים). בסך הכל, הטכניקות המתוארות כאן מדגישות את החשיבות של הדמיה וניתוח נתונים תלת-ממדיים בביולוגיה התפתחותית, ועשויות לסייע לחוקרים אחרים לטפל טוב יותר בנתוני תמונה תלת-ממדית ודו-ממדית בהקשר של הרחבה צירית וסגמנטציה של בעלי חוליות. לבסוף, העבודה משתמשת גם בכלים חדשניים כדי להקל על הוראת התפתחות עוברית של בעלי חוליות.

Introduction

היווצרות ציר גוף חוליות היא תהליך מורכב ודינמי ביותר המתרחש במהלך התפתחות עוברית. בסוף גסטרולציה [בעכבר, סביב יום עוברי (E) 8.0], קבוצה של תאי אב אפיבלסט המכונה אבות נוירומסודרמליים (NMPs) הופכים לנהג מפתח של הרחבה צירית ברצף ראש לזנב, יצירת הצינור העצבי ורקמות mesodermal paraxial במהלך היווצרות הצוואר, תא המטען והזנב 1,2,2,3,4 . מעניין, העמדה כי NMPs אלה תופסים epiblast caudal נראה לשחק תפקיד מפתח בהחלטה של הבחנה לתוך mesoderm או neuroectoderm5. למרות שכרגע חסרה לנו טביעת אצבע מולקולרית מדויקת עבור NMPs, תאים אלה נחשבים בדרך כלל ל- Co-express T (Brachyury) ו- Sox2 5,6. המנגנונים המדויקים המסדירים את החלטות הגורל של NMP (כלומר, בין אם הם לוקחים מסלולים עצביים או מסודרמליים) רק מתחילים להיות מוגדרים במדויק. ביטוי Tbx6 באזור הפס הפרימיטיבי הוא סמן מוקדם של החלטת גורל NMP, כמו גן זה מעורב אינדוקציה ומפרט של mesoderm 6,7. מעניין, תאי mesoderm מוקדם נראה לבטא רמות גבוהות של Epha18, Wnt / β-קטנין איתות, כמו גם Msgn1 הוצגו גם לשחק תפקידים חשובים בבידול mesoderm paraxial ו היווצרות somite 9,10. ניתוח מרחבי-זמני מלא של NMPs ברמה של תא יחיד בהחלט יהיה אינסטרומנטלי כדי להבין באופן מלא את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט mesoderm.

היווצרות של somites (מבשרי חוליות) היא תכונה מרכזית של בעלי חוליות. במהלך התארכות צירית, mesoderm paraxial הופך מקוטע בסדרה של יחידות חוזרות דו צדדיות המכונה somites. מספר הסומיטים והזמן הנדרש להיווצרות מקטעים חדשים משתנה בין מינים11,12. Somitogenesis כרוך תנודות איתות תקופתיות (המכונה "שעון פילוח") שניתן לראות על ידי הביטוי המחזורי של מספר גנים של חריץ, Wnt ו Fgf איתות מסלולים במסודרמה presomitic (למשל, Lfng)11,12. המודל הנוכחי של סמיטוגנזה גם מניח את קיומו של "חזית גל התבגרות", סדרה של שיפועי איתותים מורכבים הכוללים Fgf, Wnt ואיתות חומצה רטינואית המגדירים את המיקום של הגבול האחורי של כל סומיט חדש. אינטראקציה מתואמת בין "שעון הפילוח" לבין "חזית גל ההבשלה" היא אפוא בסיסית ליצירת מודולים מבשרים אלה של חוליות, שכן הפרעות בתהליכים מורפוגנטיים מרכזיים אלה עלולות לגרום לקטלניות עוברית או להיווצרות מומים מולדים (למשל, עקמת)13,14,15.

למרות התקדמות משמעותית לאחרונה בטכניקות הדמיה, שיטות ניתוח ביו-דימאז' ותוכנה, רוב המחקרים של התארכות צירית וסומיטוגנזה עדיין מסתמכים על נתוני תמונה דו-ממדיים חד-ממדיים/מבודדים (למשל, מקטעים), שאינם מאפשרים הדמיה מלאה של רקמות רב-ממדיות ומסבך הבחנה ברורה בין מומים פתולוגיים (כלומר עקב מוטציות) לעומת וריאציה מורפולוגית רגילה המתרחשת במהלך התפתחות עוברית16 . הדמיה בתלת-ממד כבר חשפה תנועות מורפוגנטיות חדשניות, שלא זוהו בעבר בשיטות דו-ממדיות סטנדרטיות 17,18,19,20, המדגישות את כוחה של הדמיית טוטו להבין את המנגנונים של סמיטוגנזה חוליות והרחבה צירית.

מיקרוסקופיה תלת-ממדית ותלת-ממדית של עוברי עכבר, במיוחד הדמיה חיה, הם מאתגרים מבחינה טכנית ודורשים צעדים קריטיים במהלך הכנת מדגם, רכישת תמונה ועיבוד נתונים מראש על מנת לאפשר ניתוח מרחבי-זמני מדויק ומשמעותי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להדמיה חיה והכתמת אימונופלואורסצנטיות בהר שלם של עוברים עכברים, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור הן NMPs והן תאים מסודרמליים במהלך הרחבה צירית וסגמנטציה. בנוסף, אנו מתארים גם פרוטוקול לטומוגרפיה של הקרנה אופטית (OPT) של עוברים ועוברים ישנים יותר, המאפשר הדמיה תלת-ממדית של טוטו וכימות של חריגות פתולוגיות שיכולות לנבוע מבעיות במהלך סמיטוגנזה (למשל, היתוך עצם ועקמת)13,21,222. לבסוף, אנו ממחישים את כוחם של שחזורי הדמיה תלת-ממדית במחקר ובהוראת פילוח חוליות והארכה צירית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים הקשורים בבעלי חיים עקבו אחר החקיקה הפורטוגזית (Portaria 1005/92) ואירופאית (הוראה 2010/63/EU) הנוגעת לדיור, גידול ורווחה. הפרויקט נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של 'מכון גולבנקיאן דה Ciência' ועל ידי הישות הלאומית הפורטוגזית, 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (התייחסות רישיון: 014308).

1. הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית ותלת-ממדית

הערה: כאן אנו מספקים תיאור מפורט על איך לנתח ולהכין עכבר E8.25 כדי E10.5 עוברים להדמיה חיה (1.1), E7.5 עד E11.5 עוברים עבור מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית הר שלם (1.2) ועוברים עבור טומוגרפיה הקרנה אופטית (1.3).

  1. הכנה לדוגמה להדמיה חיה
    1. ניתוח עובר עכבר והכנה להדמיה חיה (למשל, כתב LuVeLu 23).
      1. לנתח עוברי עכבר בין E8.25 ו- E10.5 במדיום M2 שחומם מראש (37 °C ).? הסר בעדינות את שק החלמון באמצעות מלקחיים נקיים ושטוף את העובר פעם אחת עם מדיום M2 טרי כדי להסיר דם ופסולת המיוצרים במהלך הניתוח.
        הערה: חשוב להימנע מפגיעה בעובר בכל דרך שהיא, אחרת הוא לא יתפתח כראוי במהלך הליך ההדמיה החיה.
      2. במהלך הליך ההדמיה החיה, עוברים דגירה בתא מחומם (37 °C ), בסביבה 65% O2 ו 5% CO2 (N2 מאוזן), במדיום DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10% HyClone מוגדר סרום בקר עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
        הערה: תנאי תרבות אלה מאפשרים להתפתחות עוברית להתרחש בסביבות 10 שעות. פרוטוקולים אחרים 9,10, תוך שימוש בתנאי תרבות שונים, עשויים לאפשר תקופות ארוכות אף יותר.
  2. הכנת מדגם למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית
    1. הליך ניתוח וקיבוע של עובר עכבר
      1. לנתח עוברי עכבר מ- E7.5 ל- E11.5 בתמיסת מלח קרה (4 °C ) פוספט (PBS) או M2 בינוני. לאחר הסרת כל הממברנות החוץ עובריות (למשל, הממברנה של רייכרט או שק החלמון) לשטוף את העובר PBS טרי כדי להסיר דם ופסולת המיוצרים במהלך הליך הניתוח.
      2. תקן עוברים ב 4 °C (60 °F), ב 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS, עבור הזמן שצוין בטבלה 1.
        זהירות - PFA צריך להיות מטופל בתוך מכסה המנוע אדים
        שלב התפתחותי זמן קיבעון מומלץ (PFA 4%)
        E7.5 שעה וחצי
        E8.5 שעתיים
        E9.5 3 שעות
        E10.5 4 שעות
        E11.5 4 שעות
        טבלה 1 - זמני קיבוע לעוברים בשלבים התפתחותיים שונים
      3. לאחר קיבעון, לשטוף עוברים לפחות פעמיים (5-10 דקות כל אחד) ב- PBS כדי להסיר PFA לחלוטין. בשלב זה, עוברים ניתן לקחת ישירות לתוך פרוטוקול כתמים immunofluorescence (שלב 1.2.2) או יכול להיות מיובש ולאחסן לשימוש עתידי (שלב 1.2.2.1.4).
      4. במידת הצורך, לאחסן עוברים ב -20 °C (60 °F) ב 100% מתנול לתקופות ארוכות.
        1. כדי לשפר את שימור הרקמות, לייבש את העובר בהדרגה עם 10% עליות בריכוז מתנול (מדולל PBS), כל שלב 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר, עד להגיע 100% מתנול. החליפו את המתנול 100% פעם אחת באמצעות aliquot טרי.
        2. לשחזר עוברים קפואים על ידי rehydration בעקבות סדרת מתנול / PBS הפוכה, כל שלב 10 דקות ב RT על שייקר, ועם שטיפות סופיות ב- PBS (פעמיים, 5-10 דקות כל אחד) לפני הכניסה לפרוטוקול החיסוני.
          זהירות - מתנול צריך להיות מטופל בתוך מכסה המנוע אדים.
    2. כתמי אימונופלואורסצנטיות בהרכבה מלאה
      הערה: פרוטוקול הכתמת immunofluorescence הבא הותאם מההליך המתואר באוסורנו ואח '24. כל הכביסות צריכות להתבצע על שייקר. לאחר שלב החסימה, דגירה מבוצעת ב 4 °C (4 °F) כדי להבטיח שלמות /שימור נוגדנים.
      1. לשטוף עוברים שלוש פעמים (30 דקות כל אחד) ב PBS המכיל 0.1% טריטון X-100 (0.1% PBST) ולאחר מכן פעם אחת ב 0.5% PBST במשך שעה אחת (RT) כדי לשפר את permeabilization.
      2. כדי להפחית כריכה לא ספציפית, יש לשטוף ב-1 M גליצין ב-PBS (pH 7.5) למשך 30 דקות ב-RT.
      3. לשטוף שלוש פעמים ב 0.1% PBST במשך 30 דקות כדי להסיר לחלוטין את הגליצין.
      4. לדגור על העוברים לילה ב 4 °C (60 °F) בתמיסת חסימה המכילה: 3% של סרום (מן המין החי שבו הנוגדנים המשניים הופקו), 1% של אלבומין סרום בקר (BSA) ו 0.1% של טריטון X-100, ב- PBS.
      5. לדלל נוגדנים ראשוניים בתמיסת חסימה (בדרך כלל 1:200 עבור נוגדני T ו- Sox2) ודגר במשך יומיים עד שלושה ימים ב 4 °C (4 °F ).
      6. לפני הוספת הנוגדנים המשניים, לשטוף עוברים שלוש פעמים (30 דקות כל אחד) ב 0.1% PBST ב 4 °C (60 °F). לדלל נוגדנים משניים בתמיסת חסימה (1:1000) ולדגור במשך יומיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור.
      7. לשטוף עוברים שש פעמים (30 דקות כל אחד) ב 0.1% PBST ב 4 °C (60 °F).
      8. עבור נגד גרעיני, עוברים דגירה ב 4 ',6-דימידינו-2-פנילינדולה, דיהידרוכלוריד (DAPI), מדולל 1:500 ב PBST, לילה על שייקר ב 4 °C (4 °F), מוגן מפני אור.
      9. לבסוף, לשטוף עוברים שלוש פעמים (30 דקות כל אחד) ב 0.1% PBST ב 4 °C (60 °F).
    3. ניקוי רקמות והכנת שקופיות
      1. ניקוי רקמות באמצעות מתיל סליצילאט או תערובת של אלכוהול בנזיל עם בנזיל בנזואט (BABB)
        1. לפני ניקוי באמצעות מתיל סליצילאט או BABB, לחלוטין לייבש עוברים על ידי הבאתם 100% מתנול, באמצעות סדרת מתנול / PBS המורכבת 10% עליות רצופות בריכוז מתנול (זמני דגירה של 10 דקות כל אחד ב 4 °C (4 °C (4 °C (4 °C ).? כדי להשיג התייבשות מלאה, להחליף את 100% מתנול עבור אחד טרי ולחכות 10 דקות נוספות.
        2. בצע ניקוי עובר על ידי הטמעה בסדרה של מתיל סליצילאט או BABB במתנול עם 20% עלייה רצופה בריכוז, דגירה של 20 דקות לכל שלב. כאשר פתרון מתיל סליצילט או BABB מגיע 100% לבצע שני שינויים נוספים עבור פתרון טרי.
          אזהרה: גם מתיל סליצילאט וגם BABB צריכים להיות מטופלים בתוך מכסה המנוע של אדים.
          הערה: עבור ניקוי נכון, זה חיוני כי העוברים מיובשים לחלוטין. זה גם חיוני כי מתנול מעורבב באופן מלא עם מתיל סליצילאט או BABB בסדרת פתרונות הסליקה.
        3. לאחר העוברים הופכים שקופים לחלוטין, להתמודד איתם בנפרד, באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטיות מועדף, כדי להפחית את הסיכויים של נזק לרקמות.
        4. להדמיה, הר עוברים במגלשת זכוכית קעורה של 75 מ"מ x 25 מ"מ או בקוגלס 20 מ"מ x 60 מ"מ #1.5. האפשרות השנייה תאפשר הדמיה משני הצדדים, במידת הצורך, אבל זה הרבה יותר שביר וקשה לאטום. מעבירים עוברים למגלשות המיקרוסקופ באמצעות קיסם, קצה כותנה משובח, פיפטת פסטר או כל מכשיר דומה אחר.
        5. כדי להימנע מדחיסת העוברים, הוסיפו מרווחים העשויים מרסיסי כיסוי מס' 1 (בעובי 170 מיקרומטר), סיליקון או מכונות כביסה ממתכת דקה. לאחר מכן להוסיף טיפה של מדיום הרכבה, לכסות עם #1 או #0 20x20 מ"מ כיסוי ואטם.
        6. אם משתמשים במרווחי זכוכית או מתכת, יש לאטום עם פרפין מומס כדי לייצב טוב יותר את ההכנה - לא לאטום עם לק כי זה מתמוסס עם מתיל סליצילט או BABB. כדי למנוע בועות, מניחים את כיסוי בצד אחד ולאחר מכן, בהדרגה ובעדינות להחליק אותו לצדדים; הוסף בינוני יותר במידת הצורך.
          הערה: עיין בסרטון כדי להבין טוב יותר כיצד לתפעל את העוברים המנוקים וכיצד לטעון אותם בשקופית המיקרוסקופ.
      2. ניקוי רקמות עם RapiClear
        1. בעת שימוש RapiClear, התייבשות העובר אינה נדרשת. לאחר שלב 1.2.2.9, למקם עוברים במרכז של 75 מ"מ x 25 מ"מ דיכאון קעור שקופית זכוכית, להסיר את כל PBST במגלשת דיכאון מיקרוסקופ ולהוסיף 200 μL של פתרון ניקוי.
        2. לאחר 10 דקות מוגן מפני אור, כאשר עוברים מתחילים להיות שקופים, להחליף את פתרון הסליקה, לחכות 20 דקות נוספות (מוגן מפני אור) ולאחר מכן למעלה עם כיסוי, החל מצד אחד בעדינות נע לכיוון השני.
          הערה: הזמן לנקות את העובר באופן מלא עשוי לעבור מכמה דקות ללילה בהתאם לבמה ולגודל של העוברים. כמו כן, כל התהליך צריך להיעשות תחת סטריאומיקרוסקופ. כדי להבין טוב יותר את הסליקה ואת הכנת שקופיות המיקרוסקופ, עיין בפרוטוקול הווידאו.
  3. הכנה לדוגמה לטומוגרפיה של הקרנה אופטית
    הערה: ההליכים הבאים הותאמו מפרוטוקולים קודמים19,25,26. הפרוטוקול יתואר לניתוח של עוברי עכבר E18.5.
    1. הליך ניתוח וקיבעון של עובר עכבר
      1. לנתח E18.5 עוברי עכבר בקור (4 °C) PBS, להסיר את כל הממברנות העובריות במיוחד ולאחר מכן לשטוף את העוברים מספר פעמים PBS טרי כדי להסיר דם ופסולת המיוצרים במהלך הליך הנתיחה.
      2. לתקן עוברים ב 4% PFA עשה PBS, ב 4 °C (5 °F) במשך 5 עד 7 ימים.
      3. לשטוף עוברים פעם אחת (15 דקות) ב- PBS ולאחר מכן שלוש פעמים (30 דקות כל אחד) במים demineralized או PBS. בצע את הכביסה על שייקר.
      4. לייבש את העוברים על ידי דגירה (25 דקות סדרה ב RT על שייקר) בפתרונות מתנול של הגדלת ריכוזים (10% מגביר מדולל במים demineralized או PBS) עד 100% מתנול.
      5. שנה את פתרון 100% מתנול (השתמש aliquot טרי) שלוש פעמים (20 דקות כל אחד) כדי להבטיח התייבשות מלאה. לאחר מכן ניתן לאחסן עוברים בטמפרטורה של -20 °C (20 °F) או להילקח ישירות (יום אחד לאחר מכן) לתהליך ההלבנה (שלב 1.3.2).
    2. תהליך הלבנה
      1. כדי להסיר את הפיגמנטציה הטבעית, לדגור עוברים (בנפרד) על שייקר, תחילה ליום אחד ב 5% H202 במתנול ולאחר מכן ב 10% H202 במתנול עד 3 ימים עד העוברים לאבד את כל הפיגמנטציה הטבעית.
        אזהרה: H2O2 צריך להיות מטופל בעדינות בתוך מכסה המנוע אדים. פתרון ההלבנה המכיל H2O2 כאשר במגע עם הדגימה יוצר אדים, ולכן, הצינור המכיל את העוברים צריך להישאר פתוח במהלך כל הליך הלבנה. כמה פרוטוקולי הלבנה מציעים את השילוב של H2O2 עם פורממיד. אם נעשה שימוש בחלופה זו, יש לנקוט משנה זהירות, שכן הוספת H2O2 לפורמייד לא מדולל עלולה לגרום לפיצוץ.
      2. בהדרגה rehydrate העוברים בסדרת מתנול הפוכה (עם 10% ירידה) במים demineralized, כל דגירה במשך 20 דקות ב RT על שייקר, ולבסוף לשטוף שלוש פעמים (30 דקות כל אחד) במים demineralized. חכה יום אחד, לשנות את המים demineralized ולהמשיך הלאה.
        הערה: ראו איור 1 משלים לקבלת תוצאה מייצגת של תהליך ההלבנה.
    3. פרוטוקול דה-מינרליזציה
      הערה: Demineralization הוא אופציונלי אך מומלץ עבור עוברים או גורים.
      1. בצע demineralization על ידי שטיפת העוברים ב 0.1 M EDTA ב 42 °C (42 °F) במשך כמה שעות [ראה גם צ'ו ואח ' 27] ואחריו חמש שטיפות (20 דקות כל אחד) עם מים demineralized כדי להסיר לחלוטין את EDTA. בצע את כל ההליכים בשייקר.
    4. הכנה לדוגמה לסליקה
      1. להטמיע עוברים בבלוק של 1% אגרוז. כדי להכין בלוקים אלה למלא צינור פלסטיק 50 מ"ל או מזרק (בניית חלל גלילי על ידי ניתוק צד היציאה של המזרק ושימוש הבוכנה כדי לחסום את הצד הנגדי) עם agarose מומס, למקם את העובר באגרוז במצב אנכי ולשמור על עמדה זו במרכז הבלוק בעזרת מלקחיים במהלך התגבשות של agarose.
      2. מניחים את התבנית עם הבלוק ב 4 °C (30 דקות) עבור agarose כדי להתגנדר באופן מלא. במקרה של מיקום שגוי של העובר בתוך הבלוק או את המראה של בועות אוויר, להמיס את agarose על ידי הצבת הבלוק ב 50 מעלות צלזיוס לילה, ולחזור על ההליך למחרת.
      3. הסר את בלוק האגרוז עם העובר מהתבנית ומניחים אותו במיכל עם מים demineralized. החלף במים מפורקים טריים לאחר 15 דקות.
      4. לפני ניקוי עם BABB, לייבש את הדגימה. כדי לשמור טוב יותר על שלמות הרקמה, בצע התייבשות העובר בהדרגה עם 10% עליות בריכוז מתנול (מדולל במים demineralized או PBS), כל צעד במשך יותר מ 45 דקות ב RT על שייקר, עד להגיע 100% מתנול.
      5. שנה את 100% מתנול (השתמש aliquot טרי), תחילה ארבע פעמים במרווחי שעה אחת ולאחר מכן שוב למחרת כדי להבטיח התייבשות מלאה.
    5. תהליך ניקוי והרכבה מדגמית עבור הדמיית OPT
      1. נקה את העוברים על שייקר באמצעות סדרה (2.5 שעות כל אחד) של פתרון BABB במתנול, עם עלייה של 25% בריכוז BABB, עד שהגיע 100% BABB.
      2. החליפו את תמיסת BABB בתמיסה טרייה מדי יום, עד שהעובר יהיה שקוף לחלוטין. תהליך זה עשוי להימשך 3 עד 5 ימים. שמור את הבלוק המכיל את העובר, על שייקר במהלך כל ההליך. עוברים יכולים להישאר בתמיסת 100% BABB לתקופות ארוכות.
        הערה: אם העובר אינו מיובש כראוי הוא יהפוך שקוף מעט (אמולסיה "לבנבן") לאחר הוספת BABB הראשון. אם זה קורה, צעדו אחורה למתנול טהור ובצעו שתי שטיפות נוספות במתנול טרי. לעולם אל תקרר דגימות בעת ביצוע התייבשות ופינוי, שכן השינויים בטמפרטורה עלולים להוביל לעיבוי מים.
      3. חבר את בלוק האגרוז המנוקה לציר המנוע של סורק OPT, התאם את האופטיקה כדי לקבל תמונה של העובר כולו והמשיך לרכישת ערכת נתוני הקרנה מלאה19,28.

2. רכישת מיקרוסקופ/תמונה

  1. להדמיה תלת-ממדית ותלת-ממדית נכונה, בחרו במיקרוסקופ המתאים ביותר למטרה הניסיונית. טבלה 2 מספקת מידע כללי כדי להנחות את הבחירה.
טכניקות מיקרוסקופיה אופטיות עיקרון הדמיה מטרה ניסיונית ושיקולים
הדמיה של ווידפילד משתמש בפלואורסצנטיות, באור משתקף או משודר. אידיאלי לסקירה מהירה וכללית של העובר (למשל להקרנות ולהעריך שלבים התפתחותיים ופנוטיפים ברורים). עומק השדה המופחת, בהשוואה לעובי הנצפה בהגדלות גבוהות אינו מאפשר פרשנות מדויקת או ניתוח של מורפולוגיה תלת-ממדית.
קונפוקל (סריקת לייזר; CLSM) משתמש בתאורה סריקת לייזר וזיהוי פלואורסצנטיות דרך חור סיכה. מאפשר הדמיה של פרוסות אופטיות של דגימות המסומנות בפלואורסצנטיות, באופן אידיאלי עם אות חזק. הדמיה דרך חור סיכה מסירה את האות מתוך עומק השדה, ובכך מאפשרת אפליה מדויקת של מידע בתלת-ממד. הרכישה היא סדרי גודל איטיים יותר מאשר שדה רחב, אבל עם ניגוד שאין שני לו ואפליה תלת ממדית של מורפולוגיה. רזולוציה זמנית גבוהה אינה ניתנת להשגה מכיוון שתמונות נרכשות בפיקסל אחד בכל פעם. מתאים להדמיה תלת-ממדית של עוברי עכבר קבועים עד E9.5. הדמיה דרך כל המזודררמה הפרה-סוממית או הסומיטית דורשת ניקוי רקמות, בגלל פיזור אור ברקמות עמוקות יותר. פוטוטוקסיה והלבנה היא שיקול. הלבנת פוטו יכולים, בגבולות, להיות מפוצים אחוריים. עם זאת, אפקטים פוטוטוקסיים בדגימות חיות לא יכול, ולעתים קרובות לא קל לקבוע. זה ברור יותר אם דגימות מראות ביטוי נמוך, ויש צורך בכוחות לייזר גבוהים.
פלואורסצנטיות של עירור שני פוטונים (TPEFM) הוא משתמש בעירור לייזר כמעט אינפרא אדום (NIR) פועם במקום תאורת לייזר גלויה. TPEFM מאפשר חיתוך אופטי דרך דגימות עבות יותר מאשר CLSM. הרזולוציה מעט נמוכה יותר, אך הניגודיות ברקמות עמוקות יותר טובה בהרבה, מה שהופך אותה לאידיאלית להדמיה חיה של עוברי עכבר. למרות TPEFM נחשב לעתים קרובות פחות פוטוטוקסי מאשר CLSM קונבנציונאלי, זה דורש כוחות לייזר גבוהים אשר עשויים להיות גם השפעות מזיקות על תאים ורקמות. אידיאלי להדמיה תלת-ממדית של עוברים עד E11.5, אם כי הדמיה דרך המזודרם הפרזומיטי כולו עדיין דורשת ניקוי רקמות.
קונפוקל (דיסק מסתובב) צורה של קונפוקל אשר, במקום לייזר יחיד, משתמש במקורות דמויי נקודה מרובים. השימוש במבנים דמויי נקודה מרובים מאפשר יצירה מהירה יותר של פרוסות אופטיות (מספר מסגרות לשנייה או ערימות לדקה ניתנות להשגה) מאשר CLSM. הרכישה היא כמעט באותה מהירות כמו שדה רחב, עם אפליה 3D סבירה. עם זאת, זה רק מאפשר הדמיה של הרקמות השטחיות ביותר של עובר העכבר. מאפשר זיהוי רגיש יותר מאשר CLSM, מה שהופך אותו לחלופה עבור עוברים עם ביטוי נמוך של חלבוני פלואורסצנטיות.
גיליון אור / מישור יחיד (LSFM / SPIM) במקום תאורה רחבה או נקודתית, המדגם מואר במישור אורתוגונלי אחד בכל פעם. ברוב התצורות, הוא מאפשר הדמיה מזוויות מרובות. כמו כן דורש דגימות עם תווית פלואורסצנטית. רכישת פרוסות אופטיות היא מהירה מאוד (מסגרות מרובות לשנייה) ויש לה השפעות מופחתות של פוטוטוקסיות או הלבנה. עם זאת, אם נדרשת ריבוי-תצוגה, שלבי קדם-עיבוד הבאים של ערכת הנתונים עשויים לדרוש שעות/ימים של חישוב. LSFM/SPIM מאפשר זיהוי טוב יותר של רמות ביטוי נמוכות יותר מאשר CLSM. אידיאלי להדמיה תלת-ממדית של עוברי עכבר טוטו במהלך גסטרולציה. דגימות לעתים קרובות צריך להיות מותקן ומתוחזק בהשעיה (הכנה לא שגרתית).
טומוגרפיה של הקרנה אופטית (OPT) פרוסות אופטיות אינן מזוהות אלא מחושבות מסדרה של תמונות רחבות של העובר כולו מזוויות שונות ("הקרנות"). אידיאלי להדמיה תלת-ממדית של עוברי עכבר/עוברים בשלב מאוחר יותר (>5 מ"מ), אך רק קבוע ומנוקה. יש את היתרון של הפקת ערימות 3D של פרוסות אופטיות של דגימות פלואורסצנטיות ולא פלואורסצנטיות. ערכות נתונים הן איזומטריות (פרוסות עם רזולוציה שווה בכל שלושת הממדים) מה שהופך אותו לאידיאלי לניתוח אנטומי. רכישת ערכת נתוני הקרנה עשויה לדרוש רק כמה דקות, ואחריו 15-30 דקות של שחזור.
טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT) משתמש בתאורה NIR באמצעות המדגם כדי לקבל פרוסות אופטיות המבוססות על הפרעה עם השתקפות אור. OCT מאפשר הדמיה קלה באמצעות רקמה חיה (כמה מילימטרים עמוק לתוך המדגם ללא ניגודיות פלואורסצנטית) עם רזולוציה של כמה עשרות מיקרומטרים. הרכישה מהירה מאוד (כמה פרוסות לשנייה). למרות שזה חלופה אפשרית עבור OPT, טכניקה זו אינה זמינה בדרך כלל.
רזולוציית-על (SR), כוח אטומי (AFM) או הדמיה בשדה קרוב (NSOM) SR מבוסס בדרך כלל על לוקליזציה של מולקולה אחת ו- AFM / NSOM על משטחי סריקה ברזולוציות עקיפה תת-(כמה ננומטרים). מאפשר הדמיה ברמת עקיפה משנה (רזולוציה <200nm), לעתים קרובות עם כוונה לזהות מולקולות בודדות או מולקולות על פני התא. לא אידיאלי לניתוח מורפולוגי של דגימות גדולות כגון עוברי עכבר. הרכישה היא בדרך כלל תהליך איטי (שניות עד דקות לתמונה).

טבלה 2 - מידע כללי להנחיית הבחירה של טכניקת הדמיה / מיקרוסקופ מתאים יותר למטרה הניסיונית הספציפית של החוקר.

3. ערכת נתונים של תמונה טרום עיבוד

הערה: כאן אנו מדגישים כמה מהשלבים העיקריים של ערכת נתונים של תמונה טרום עיבוד, כלומר הפחתת רעש (3.1) ו deconvolution (3.2), ומספקים אלגוריתמים המאפשרים הכנה נכונה ועיבוד מראש של ערכות נתונים תלת-ממדיות של סדרות זמן (3.3) וכתמי אימונופלואורסצנטיות בהר מלא (3.4). לבסוף, אנו מציינים הפניות המתארות בפירוט פרוטוקול עבור ערכת נתונים OPT טרום עיבוד ושחזור.

  1. הפחתת רעשים
    1. אם התמונות מציגות יחס אות-לרעש מופחת, שקול להחיל שיטה קלאסית כגון מסנן "חציון" או "דיפוזיה אניסוטרופית" הזמינה בפיג'י / ImageJ29, או שיטה משוכללת יותר המבוססת על למידת מכונה כגון "CARE"30 או "Noise2Void"31.
      הערה: זה רלוונטי במיוחד עבור ערכות נתונים הדמיה בשידור חי, שבו photoconaching ו photodamage הוא דאגה מרכזית, וחשיפות נמוכות יותר רווחי גלאי גבוהים יותר נחוצים.
  2. דה-מפולת
    1. אם התמונות נרכשו ברזולוציה גבוהה (ליד או בדגימת Nyquist) שקול לבצע שחזור תמונה עם deconvolution כדי לשפר את איכות ערכת הנתונים לפני הניתוח. היזהר כי כמה כלי deconvolution כוללים גם צעד denoising.
      הערה: זה טופל בהרחבה ב Krull et al.32 ובתיעוד זמין באתר התוכנה Huygens deconvolution (https://svi.nl/HomePage).
  3. הכנת סדרת זמן של ערכת נתונים תלת-ממדית להצגה חזותית וניתוח נאותים
    הערה: לעתים קרובות עובר או סחף במה יכול להתרחש במהלך הדמיה בזמן לשגות. יש לתקן זאת לפני ביצוע ניתוח. לפעמים, הסחף הוא חמור מספיק כי הרכישה צריכה להיות מופרעת והתאמות שנעשו. במקרה זה, עדיף לשמור על אותם ממדי X, Y ו- Z.
    1. ניתן לשרשר ערימות 4D נפרדות לערימת יתר 4D אחת באמצעות פונקציית ה"שרשור" של פיג'י. עם זאת, כלי זה אינו מטפל בערימות משולבות/היפר-ערמות, ולכן יש צורך להמיר את כל המקטעים התלת-ממדיים לערימות פשוטות באמצעות הפעולה Image | ערימות יתר | ערימת יתר לערום. שמור על מערכת מספור מסוימת כדי לשמור על הסדר של מקטעים 4D אלה ולשים לב למידע על כל אחד מהם (ערוצים, פרוסות, נקודות זמן). חזור על ההליך עבור כל המקטעים ולאחר מכן שרשר אותם באמצעות ההליך תמונה | ערימות | כלים | שרשור.
    2. שחזור של ערימת העל המשורשרת עם הפעולה Image | ערימות יתר | הערם לערימת יתר ובחר את הסדר הנכון של הממדים השונים. בדוק את ערימת העל כדי לוודא שכל הממדים רצפים כראוי.
      הערה: מספר הערוצים (ג) ופרוסות (z) צריך להיות זהה עבור כל מקטעי התלת-ממד; מספר המסגרות (זמן) (t) צריך להיות שווה לסכום הכולל של נקודות הזמן שנוספו עבור כל המקטעים התלת-ממדיים. חשוב לדפדף בערימה כדי להבין כיצד הממדים השונים מתווספים, לפני ביצוע ההמרה לערימת יתר. ברירת המחדל של פיג'י/ImageJ היא ערוצים מתחלפים, לאחר מכן פרוסות Z לסירוגין ולאחר מכן נקודות זמן לסירוגין ("XYCZT"). ודא כי הדבר חל על הנתונים שנוצרו על-ידי המיקרוסקופ.
    3. בחרו 'מורכבים' כמצב 'תצוגה' ושמרו כתבנית קובץ תמונה מתויגת (TIFF). עבור ערכות נתונים גדולות, שקול להמיר לתבנית BigDataViewer33 , על-ידי ביצוע הפעולה תוספים | BigDataViewer | יצא את התמונה הנוכחית כ- XML/HDF5. פעולה זו יוצרת ערכת נתונים שניתן לעיין בה בצורה יעילה יותר ובתלת-ממד באמצעות BigDataViewer וניתן לטפל בה על ידי כלים אחרים של פיג'י/ImageJ לערכות ביג-דאטה.
    4. רשום את hyperstack משורשר (סדרות זמן של ערימות 3D) כדי לפצות על סחיפה עוברית / במה באמצעות "נכון 3D Drift" תוסף ImageJ34 או תוסף BigStitcher35, בהתאם למידת תיקון הסחף הדרוש. ניתן לפתוח קבצי XML/HDF5 עם BigStitcher.
      הערה: יש צורך לבצע את הרישום של 3D time-מעידות המציגות סחיפה עוברית לפני כל ניסיון לבצע מעקב אחר תאים או ניתוח תנועה; תיקון עבור סחיפה יש צורך גם לפרש כראוי תנועות מורפוגנטיות.
  4. טרום עיבוד של ערכות נתונים של הדמיית immunofluorescence
    1. הנחתת אות עומק Z
      הערה: למרות שהשיטה שאנו מציעים לתקן הנחתת אותות יכולה להיות שימושית, יש להשתמש בכך בזהירות, שכן לעתים קרובות פחות אות לעומק עשוי למעשה לשקף תופעה ביולוגית ולא אופטית. שקול למדוד את הריקבון באזור של רקמה שבו המולקולה של עניין לא צפוי להיות נוכח או לידי ביטוי ולהתאים את הפיצוי עבור אזור זה. אם יש עדיין אות חיובי נמוך יותר לעומק, זה עשוי לחשוף תופעה ביולוגית בפועל. שקול גם כי אזורים מסוימים של המדגם עשוי לייצר יותר פיזור או הנחתת לייזר מאחרים, וכי זה לא יתוקן במלואו עם שיטה פשוטה זו.
      1. עבור עוברים עבים/מאוחרים יותר, הנחתת קרן, הלבנת פוטואורסצנטיות וסטייה כדורית הנגרמת על ידי אי התאמה של מדדי שבירה (בין מדיום ההרכבה לבין מטרת המיקרוסקופ) יכולה לגרום לערכות נתונים שבהן עוצמת הפלואורסצנטיות מוחלשת מאוד בפרוסות העמוקות יותר של מחסנית Z. לכן, לפצות על אובדן זה של אות לפני הניתוח. קביעת ההנחתה המדויקת ביותר מבחינה אנליטית היא מורכבת ותלויה מאוד במדגם36, אך קירוב מהיר ניתן לקבוע אמפירית ב- ImageJ / Fiji באמצעות התהליך | מתמטיקה | פונקציית מאקרו ולחיצה על תצוגה מקדימה.
      2. טען את מחסנית Z בפיג'י/ImageJ ולאחר מכן בצע את ההליך תמונה | ערימות | רזליק. התחל ב: למעלה, שמור על הימנעות מהאינטרפולציה מסומנת ואושר. עכשיו "Z" יהיה ציר "Y". לאחר מכן, בצע | תמונה טבלאות בדיקת מידע (LUT) | אש (או כל LUT צבעוני אחר). זה יעזור להעריך חזותית את הפיצוי הטוב ביותר במהלך השלבים הבאים. עבור לפרוסה באמצע העובר, שם ניתן לראות בבירור את השפעות ההנחתה לעומק (העוצמה יורדת מלמעלה [שטחית] לתחתית [עמוק יותר]).
      3. המשך לקביעת התיקון של שחרור העוצמה האנכית ("y") עם תהליך ההליך | מתמטיקה | מאקרו, והוסף את ה"קוד" הבא בדיוק כפי שנכתב כאן:
        v = v * A * exp ( B * y/h )
        בביטוי זה, "v" הוא המשתנה לעוצמת הפיקסלים (אשר יותאם כפונקציה על עומק), "y" המשתנה עבור עומק, ו- "h" עבור עומק מלא, ו- "exp" הוא פונקציה מעריכית; יש להחליף את "A" במספר שבין 0.5 ל- 1.0 (בחר ערכים נמוכים יותר כדי למנוע רוויית יתר של השכבות העליונות של מחסנית Z); B מוחלף במספר בין 0.5 ל 2.0, תלוי כמה חמורה הנחתת עומק Z - באופן אידיאלי זה צריך להיות 1, אולם במקרים מסוימים פחות (או יותר) יש צורך לפצות כראוי את השכבות התחתונות; ערך גבוה יותר של B יביא לפיצוי הנחתה יותר. לחץ על תצוגה מקדימה כדי לבצע הערכה ראשונה. בדוק ערכים שונים של A ו- B עד לקבלת פיצוי הולם מלמעלה למטה של התמונה ("אש" LUT יכול להיות מועיל להערכה זו). כאשר אתה מרוצה, החל את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור.
        הערה: יש לבצע זאת בכל ערוץ בנפרד, מכיוון שצבעים ולייזרים שהוסטו באדום עשויים להחליש פחות, וצבעים מסוימים מלבינים מהר יותר מאחרים. זכור כי הליך זה לא יכול להיות מדויק מספיק כדי לאפשר כימות אמין של וריאציות עוצמת פלואורסצנטיות לעומק, אם כי זה בהחלט אמין יותר מאשר ביצוע כימות ישירות בערכת הנתונים התלת-ממדית המקורית המושפעת קשות על ידי הנחתת האות לעומק. אחת הדרכים לזהות ולשלוט באפקט זה, היא להשוות הדמיה של עוברים שונים מהצד הגבי או הגחוני.
      4. שחזר את הגיאומטריה המקורית של מחסנית Z מפוצה על-ידי ביצוע | תמונה ערימות | Reslice, להתחיל למעלה, לשמור הימנע אינטרפולציה תקתק , ועכשיו "Y" חייב להיות מטוס "Z" שוב; להחליף את הצבע על-ידי ביצוע "תמונה | טבלאות בדיקת מידע | אפורים" (או LUT האחר של בחירה). בטל את מחסנית z המקורית שאינה מפוצה ושמור את הגירסה המפוצה.
        הערה: ראו איור 2 משלים כתוצאה מייצגת של שיטת הנחתת האות בעומק Z.
    2. תיקון קנה מידה של ציר Z
      1. אם הדמיה עם מטרה המיועדת לאינדקס שבירה שונה מזה המשמש להרכבה על העוברים, יש צורך לבצע שינוי קנה מידה של עובי הפרוסה, אחרת מדידות לעומק יהיו שגויות (פוטנציאל על ידי 50% אם באמצעות מטרה "יבשה" על עובר מנוקה רקמה). זה מוסבר, נבדק ואת השיטות השונות שנדונו, ב 37 ו 38. קביעה אנליטית של סולם העיוות בפועל של ציר Z היא מורכבת, אך ניתן לקבוע בקלות קירוב מקובל על ידי מציאת היחס בין מדד השבירה של המדגם לבין מדד השבירה של המטרה (למשל, 1.53/1.0 עבור עובר מתיל סליצילאט מנוקה בתמונה עם מטרה יבשה של 20 x, או 1.56/1.33 עבור עובר שפונה עם BABB ומצולם עם מטרה טבילה במים).
      2. כאשר ערכת הנתונים Z-stack כבר נפתחה בפיג'י/ImageJ (לתמונות רב-ערוציות, לאחר שהורכבו כ"מרוכבים" עם כל הערוצים), עבור אל Image | מאפיינים ושינוי עומק Voxel לעובי הפרוסה המתקבל במהלך רכישת תמונה כפול תיקון קנה המידה של ציר Z שנקבע בשלב הקודם (4.2.1; המקטע "ערכת נתונים של תמונה לפני עיבוד"). אשר את התוצאה באמצעות | התמונה ערימות | נופים אורתוגונליים.
    3. מיקום מחדש של העובר לעמדה סטנדרטית אנטומית באמצעות פיג'י / ImageJ
      הערה: מיקום מחדש של העובר (ראה את היתרונות המודגשים ב- איור משלים 3) למיקום סטנדרטי של ציר קדמי-אחורי [A-P] וציר הגב-גחוני [D-V] באמצעות פיג'י/ImageJ, דורש התקנה של TransformJ 39 חבילת תוספים מאתר העדכון "ImageScience" של פיג'י.
      הערה: טכניקה זו עדיפה על סיבובים של סיבובים בשלושת המישורים אשר יציגו חפצים כינויים והשפלה של הרזולוציה. עם זאת, מאחר שהתוסף של מציג התלת-ממד של פיג'י/ImageJ אינו יכול לטפל כראוי בערכות נתונים גדולות מ- 200-300 Mb (ייתכן שהתוסף לא יעבד או יציג התנהגות בלתי צפויה בעת ניסיון לסובב את זווית התצוגה), יש לדגום תחילה את ערכת הנתונים התלת-ממדית המקורית.
      1. התחל על-ידי הקטנת גודל ערכת הנתונים | התמונה של פיג'י שנה את קנה המידה ולאחר מכן הוסף את ערכי ה"קנה מידה" של X, Y ו- Z הדרושים כדי להקטין את ערכת הנתונים לפחות מ- 200 Mb (לדוגמה, דגימה של 0.5 x 0.5 x 0.5 x 0.5 למטה תגרום לערכת נתונים קטנה פי 8). ודא שהאפשרות צור חלון חדש מסומנת.
      2. לאחר מכן עבור אל תוספים | מציג תלת-ממד. בתוך חלון מציג התלת-ממד, לחצו על העובר כדי לבחור אותו, ותיבת תלת-ממד אדומה אמורה להופיע. בעת שימוש במצב זה (כאשר התיבה האדומה מופעלת), ניתן לשלוט בסיבוב של ערכת הנתונים באמצעות העכבר, בניגוד להתנהגות ברירת המחדל, שהיא לסובב את זווית התצוגה. בעת מיקום מחדש של העובר באמצעות העכבר, לעולם אל תלחץ בחוץ או שערכת הנתונים תבוטל.
      3. כאשר אתה מרוצה מהמיקום החדש של העובר, בחר ערוך | טרנספורמציה | יצא תמונה שונתה בתפריט של חלון "מציג התלת-ממד". כדי לבדוק את המישורים האורתוגונליים השונים עבור אל Image | ערימות | נופים אורתוגונליים. אם העובר אינו ממוקם כראוי, סגור את החלון וחזור לחלון מציג התלת-ממד והתאם מחדש. חזור על שלב 4.3.2.
      4. כאשר העובר ממוקם כראוי, בחר מתפריט החלון "מציג תלת-ממד" ערוך | טרנספורמציה | שמור שינוי צורה ושמור את מטריצת ההמרה בקובץ טקסט עם הסיומת *.mat. פתח קובץ טקסט זה באמצעות Fiji/ImageJ, הסר את שתי השורות הראשונות (טקסט) ושמור מחדש. פעולה זו יוצרת קובץ מטריצת המרה התואם לתוסף "TransformJ" המתואר ב - 39.
      5. עבור לקבוצת הנתונים ברזולוציה מלאה (יכול להיות ערימת יתר מורכבת מרובת ערוצים) ובצע את הפעולה תוספים | TransformJ | טרנסג'יי אפין. בחלון החדש, דפדף כדי לחפש את קובץ המטריצה שנשמר בעבר, בחר את האינטרפולציה העקבית B-Spline | לדגום מחדש איזוטרופית | טוב, זה בסדר.
        הערה: פעולה זו היא עתירת זיכרון ו- CPU. בהתאם לתחנת העבודה ולגודל ערכת הנתונים, הפעולה עשויה להימשך מדקות עד שעות. השימוש באפשרות הדגימה מחדש איזוטרופית מבטיח כי שום רזולוציה לא תאבד במהלך פעולת הטרנספורמציה, כך שערכת הנתונים תגדל באופן משמעותי ולא תהיה עוד אניסוטרופית כמו מחסנית z הקונפוקל המקורית; צפוי כי מספר הפרוסות בציר Z יגדל לאותו מספר של פיקסלי X ו- Y של כל פרוסה, והערימה תנפח פי 5-10 מהגודל המקורי. זה הכרחי כדי להבטיח כי אין מידע הולך לאיבוד במהלך האינטרפולציה של voxels במהלך סיבוב ותרגום.
      6. לאחר העובר ממוקם מחדש כראוי ניתן לעתים קרובות לקצץ את רוב החלל הריק שנוצר סביב העובר. ביצוע | תמונה מלאה של הקרנת Z ערימות | פרויקט Z... ובחרו בעוצמה מרבית; צייר את ההחזר המינימלי המכיל את העובר כולו ב- X וב- Y. עבור לחלונות התמונה המקוריים של ערכת הנתונים, עבור אל ערוך | | בחירה שחזרו את הקטע הנבחר וחתכו על-ידי בחירה באפשרות 'תמונה | חיתוך'.
      7. חותכים את הפרוסות בהתחלה ובסוף שאינן חוצות רקמות עובריות. לשם כך, בחר תמונה | ערימות | כלים | מסיר פרוסה וציין את הפרוסה הראשונה והאחרונה להסרה, תוך הקפדה על שינוי ה"הגדלה" ל- 1 (אחרת היא מסירה רק כל פרוסה אחרת).
      8. לאחר מיקום מחדש וחיתוך ערכת הנתונים החדשה, הקפד לשמור כקובץ TIFF חדש. אם ערכת נתונים זו גדולה מדי (יותר מזיכרון ה- RAM של המעבד הגרפי) שקול להשתמש ב- BigDataViewer כדי לייצא כ- XML/DHF5, כפי שמוסבר בשלב 3.3 (מהסעיף "ערכת נתונים של תמונה טרום עיבוד").
  5. OPT dataset ערכת נתונים טרום עיבוד ושחזור
    1. השתמש בפרוטוקול עבור ערכת נתונים OPT טרום עיבוד ושחזור המתוארים במרטינס ואח ' 19 וגואלדה ואח '28.

4.3D עיבוד, הדמיה וניתוח

הערה: כאן אנו מספקים רשימה של יישומים אפשריים של כלי תוכנה שונים, המאפשרים או משפרים את ההדמיה החזותית והניתוח של ערכות נתונים של הדמיה תלת-ממדית.

  1. עיבוד ותצוגה חזותית בתלת-ממד באמצעות Drishti
    הערה: Drishti40 היא תוכנת ויזואליזציה מדעית חינמית המיועדת לחקור ולהציג ערכות נתונים תלת-ממדיות ותלת-ממדיות 4D ממיקרו-CT, קונפוקלית/מולטיפוטונית ומיקרוסקופיה של יריעות אור. כאן אנו משתמשים בתוכנה זו לעיבוד 3D והדמיה של כתמים immunofluorescence בהר שלם (שלב 2; סעיף "הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית"). ישנם מדריכים מרובים באינטרנט כדי לעזור למשתמשים להבין כיצד להפעיל Drishti; חפש באינטרנט עבור "Ajay Limaye Drishti הדרכות 3D". Drishti אין אפשרות לקרוא ישירות ערימות של קבצי TIFF, ולכן יש להמיר אותם תחילה לתבנית המקורית "pvl.nc".
    1. הפעל את הכלי "drishtiimport.exe", הממוקם בתיקיית ההתקנה Drishti: קבצים | טען | קבצים | בחרו "קובצי תמונה בגווני אפור TIFF וטענו מחסנית תלת-ממדית בערוץ יחיד, כפי שנשמר מ-Fiji/ImageJ. במקרה של מחסנית מורכבת מרובת ערוצים, פצל את הערוצים בפיג'י/ImageJ ושמור כל אחד מהם בנפרד. סוג Voxel הוא "ushort"; "קובץ"..."שמור כ"..."TIF", ענה "y" לכל השאלות. בחלון מידע נוסף המבקש גודל voxel הקפד להוסיף את הגדלים הנכונים "X Y Z" voxel.
    2. טעינת קבצי *.pvl.nc לדרישתי ועיבוד: בחלון הראשי של Drishti, קובץ | טען | טען אמצעי אחסון 1 ( - 4 ) בהתאם למספר הערוצים הזמינים (כקבצים נפרדים). לאחר הטעינה, הקש F2 לקבלת עיבוד באיכות גבוהה. פעולה זו דורשת כרטיס GPU רב עוצמה. מידע לטיפול בפרמטרי העיבוד, עורך פונקציות ההעברה, חיפוש בערכות הלימוד המקוונות. לאחר שמרוצה ממאפייני העיבוד, המשך ליצירת עיבוד מונפש.
    3. עבור אל תצוגה והפעל את עורך המסגרות הראשיות. לטפל בעובר ולמקם אותו בעמדת ההתחלה הרצויה. השתמש בלחצן העכבר הימני כדי "לגרור" את העובר למרכז במידת הצורך, או בגלולת העכבר כדי להגדיל את התצוגה. הקשה על מסגרת ראשית מוגדרת בעורך המסגרות הראשיות ולאחר מכן בחר מיקום אחר, זווית או מרחק מתצוגה, גרור את סמן קו הזמן לנקודת זמן אחרת והגדר שוב מסגרת ראשית . עכשיו יש 2 מסגרות ראשיות שבהן העובר מיוצג בשני מיקומים שונים / זוויות / זום, ומספר מסגרות בין לבין. לחיצה על לחצן הפעל , Drishti יכול לתפעל את התנאים החסרים ולהפעיל אותו כהנפשה. עבור אל | קבצים שמור רצף תמונות לשמירת רצף ההנפשה של כל המסגרות. ניתן לפתוח רצף מסגרות זה מאוחר יותר בפיג'י/ImageJ ולשמור אותו כ- AVI (קובץ | | ייבוא רצף תמונות ... | קבצים שמירה בשם | דחיסת JPEG עם קצב פריימים סביר (אנו מציעים 15 - 30).
      הערה: למרות Drishti מאפשר שמירה של * קטעי וידאו .wmv, מומלץ במקום לשמור כמסגרות נפרדות ורק מאוחר יותר להמיר את הסדרה לפורמט וידאו AVI או MOV (זה יכול להיעשות באמצעות פיג'י / ImageJ).
  2. שחזורים תלת-ממדיים ופילוח ידני של רקמות באמצעות אמירה
    הערה: תוכנה מסחרית זו מאפשרת, ידנית או אוטומטית/חצי אוטומטית, פילוח תלת-ממדי של רקמות עובריות בערכות נתונים תלת-ממדיות. יש "מרכז למידה" מקוון עבור תוכנה זו עם הדרכות מרובות זמין 41. להלן מתוארים השלבים הבסיסיים הנדרשים כדי לפלח באופן ידני רקמות עובריות מעוברים מוכתמים אימונופלואורסצנטיות (שלב 1.2). פילוח ידני קל בהרבה לאחר שהעובר ממוקם כראוי בציר A-P/D-V סטנדרטי (עיין בסעיף "הערכת נתונים של תמונה מראש לעיבוד מראש", שלב 4.3).
    1. טען ערכת נתונים תלת-ממדית של TIFF. הקפד לציין את ממדי voxel הנכונים, כאשר תתבקש. צור וחבר מודול ויזואליזציה (לדוגמה, "Orthoslice" או "Volren") ובדוק את ערכת הנתונים בתלת-ממד.
    2. חבר את השדה תווית (או ערוך שדה תווית חדשה בגירסאות חדשות יותר של אמירה). בתוכנה זו, תוצאות של פילוח ידני מאוחסנים "חומרים", כך ליצור חומר אחד עבור כל רקמה של עניין. השתמשו בכלי "לאסו" לפילוח ידני. ישנם מספר ערכות לימוד זמינות המסבירות כיצד לבצע זאת (חפש באינטרנט עבור "עמירה פילוח עורך הדרכה").
    3. לאחר סיום הפילוח של כל רקמות העניין, צא מעורך הפילוח על-ידי מעבר חזרה למצב Project . לאחר יצירת גירסה חדשה של ערכת הנתונים ("שדה התוויות", אשר מצורף כעת למודול ערכת הנתונים המקורי) שבו פיקסלים השייכים לכל חומר יש את אותו ערך.
    4. המר "חומרים" אלה לאובייקטים תלת-ממדיים על-ידי יצירת דגמי משטח תלת-ממדיים מקבוצת הנתונים "תוויות". זה יכול להיעשות על ידי צירוף מודול "צור משטח", התאמת פרמטרים לפי הצורך (להפעיל את האפשרויות "דחיסה", "גבול", "התאם מתאמים" ו "החלקה ללא הגבלה"). לחץ על החל ומודול חדש *.surf נוצר.
    5. הדמיה של אובייקטי פני השטח, חילוץ וייצוא בנפרד כקבצי *obj. צירוף | תצוגה מודול SurfaceView למודול *.surf, ולבדוק במציג הראשי. בחלונית "מאפיינים" של מודול "SurfaceView", במאפיין "חומרים" בחר הכל + הכל ולחץ על הסר, כך המאגר של הצופה התרוקן. לאחר מכן, במשיכה השנייה כלפי מטה של המאפיין חומרים , בחר חומר אחד בלבד ולחץ על הוסף למאגר; רק החומר הזה צריך להיות גלוי.
    6. במאפיין סגנון ציור לחץ על אפשרויות נוספות | ליצור משטח ומודול *.surf חדש נוצר ומתווסף לפרוייקט. שנה את שמו לשם הרקמה (הקש F2 בלוח המקשים) וקובץ | ייצוא נתונים כ... ולשמור כסוג: Wavefront ( *.obj). חזור על הפעולה עבור כל חומר.
      הערה: אלה *.obj קבצים, כל אחד המכיל את אחת הרקמות מקוטע Amira, יכול לשמש על ידי כלים אחרים ("3Dviewer" תוסף פיג'י / ImageJ ו SimLab).
  3. תצוגה חזותית אינטראקטיבית תלת-ממדית בתוך תבנית מסמך ניידת (PDF) באמצעות Composer SimLab
    הערה: תוכנה זו של גרפיקה ממוחשבת תלת-ממדית מאפשרת ליצור תמונות, הנפשות וסימולציות מעובדות פני השטח. הדרכות שימושיות ניתן למצוא בקו 42. כאן אנו מתארים כיצד תוכנה זו מאפשרת ליצור איורים אינטראקטיביים 3D PDF, באמצעות קובצי פני השטח התלת-ממדיים של חזית הגל ( *.obj) שנוצרו עם אמירה (שלב 2.3; סעיף "עיבוד, הדמיה וניתוח תלת-ממדיים").
    1. עבור אל | קבצים חדש וליצור סצנה ריקה. לאחר מכן הקובץ | לייבא ולייבא את הקובץ הראשון *.obj שנשמר מאמרה. השאר את כל האפשרויות של חלון קובץ הייבוא ללא סימון ולחץ על אישור.
    2. אם שום דבר לא מופיע בחלון התצוגה של המלחין, לחץ על Ctrl+F או על הסמל להתאמה לכולם. כעת האובייקט המקולח אמור להופיע במרכז החלון. חזור על התהליך כדי להוסיף אובייקט מקוטע אחר ואשר את מיקומו ביחס לאובייקט הראשון (לדוגמה, 2 סומטים סמוכים).
    3. בחר אחד האובייקטים בחלון התצוגה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר השמאלי, שנה את שמו כך שישקף את שם המבנה או הרקמה האנטומיים, ולאחר מכן עבור לייצוג "3DGeom~1" ובאמצעות החלונית Materials , שנה את הצבע על-ידי שינוי ערכי R,G,B.
    4. חזור על הפעולה עבור כל האובייקטים, עד להרכבה מלאה של האיור התלת-ממדי. שים לב כי חומרים מסוימים יכולים גם להיות שקופים על ידי מניפולציה של ערוץ "אלפא", ליד ערכי RGB, ובכך לאפשר התבוננות של אובייקטים פנימיים או סגורים.
    5. עם תוכנה זו ניתן לייצא את איור העובר המורכב כקובץ "3D PDF", אשר ניתן לכלול בפרסומים. ראשית צור "תבנית" עם טקסט וקישורים פעילים כדי לשנות את "מצבי סצנה" כדי להיות מסוגל לכלול הוראות ושלושה שלבים שונים באותו איור. ניתן לעשות זאת על-ידי מעבר ממצב "בניית סצינות" למצב "שיתוף" (לחצנים מימין לחלון המלחין), ולאחר מכן לחיצה על הצג קביעות PDF ויצירת תבנית עמוד חדשה. ליצירת דמות אינטראקטיבית פשוטה שתיכלל בכתב יד, אל תשתמש בתבנית ופשוט יצא PDF.
      הערה: השתמש/י בתוכנת Adobe Acrobat Reader לאינטראקציה עם קובצי PDF תלת-ממדיים (יכולת ההפעלה של הפונקציות באיור PDF התלת-ממדי האינטראקטיבי עשויה להשתנות בהתאם לגרסאות של Acrobat Reader הזמינות). רוב הצופים האחרים אינם תואמים לתבנית PDF תלת-ממדית, כולל דפדפני אינטרנט. איורים אינטראקטיביים תלת-ממדיים כאלה של PDF ניתנים לכלול בפרסומים; שאל את העורכים על אפשרות זו מראש.
  4. הדמיה וניתוח תלת-ממדיים באמצעות Imaris
    הערה: תוכנה זו מאפשרת הדמיה מקיפה, ניתוח ופרשנות של ערכות נתונים מיקרוסקופיות דו-ממדיות-4D, עם ממשק אינטואיטיבי וזרימות עבודה. ישנם מספר ערכות לימוד שימושיות באינטרנט על איך להתחיל עם תוכנה זו, זמין באתר האינטרנט (https://imaris.oxinst.com/tutorials). כדי לטעון ולקיים אינטראקציה בצורה יעילה יותר עם ערכות נתונים גדולות ב- Imaris (בדרך כלל, אלה הגדולות יותר מזיכרון המעבד הגרפי) מומלץ להמיר את ערכת הנתונים תחילה ל- "*.ims", באמצעות התוכנית "ImarisFileConverter.exe" המותקנת בתיקיית ההתקנה של Imaris. ImarisFileConverter יכול לקרוא פורמטים רבים של תמונות מיקרוסקופיות, כולל קבצי OME ו- "h5" כפי שנשמרו על ידי BigDataViewer של פיג'י.
    1. פריט חזותי תלת-ממדי
      1. תוכנה זו יכולה לעבד תצוגה חזותית תלת-ממדית של ערכת הנתונים באמצעות מצב "תצוגת תלת-ממד" והמשתמש יכול לבצע מספר התאמות לאופן ההצגה של ערכת הנתונים [לדוגמה, לבחור בין MIP (הקרנה בעוצמה מרבית) או מצב מיזוג (עיבוד טוב יותר עם רמזי עומק וצללים)].
      2. מצב תצוגות אורתוגונליות - עם מיקום עובר תקין (שלב 4.3; "תמונה dataset טרום עיבוד" סעיף) אפשר להשתמש בכרטיסייה "סעיף" ולנווט דרך העובר כולו ולראות קטעים אופטיים מהמישורים הרגילים (רוחבי, קורונלי ו sagittal). אם עוברים אינם ממוקמים מחדש כראוי, קשה מאוד לפרש את האנטומיה שלהם באמצעות מישורים אורתוגונליים (ראו איור משלים 3). למרות Imaris יש פונקציה המכונה "מסגרת התייחסות" כדי לעקוף בעיה זו בעת ניתוח עוברים 3D, עדיף למקם מחדש את ערכות הנתונים מראש.
    2. ניתוח תלת-ממד
      הערה: תוכנה זו כוללת גם מספר כלים לניתוח עוצמות מורפולוגיה ופלואורסצנטיות. כדוגמה, כאן אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה לניתוח וריאציות של עוצמת פלואורסצנטיות של רקמות לאורך זמן באמצעות הכלי Imaris "כתמים", שבו המשתמש ממקם באופן ידני אזורים כדוריים של עניין (ROIs) בעובר בתלת-ממד, ואז אימריס יכול למדוד את פלואורסצנטיות הרקמה בתוך החזרי ההשקעה הכדוריים האלה.
      1. טענו ערכת נתונים תלת-ממדית או תלת-ממדית ב-Imaris והוסיפו נקודה חדשה במצב תצוגת תלת-ממד . לאחר מכן, ניתן לבחור נקודות ספציפיות של העובר (גם במהלך מספר נקודות זמן אם משתמשים בערכת נתונים 4D) ולכמת בתוך כתמים אלה, למשל, את העוצמה אומר.
        הערה: תוכנה זו מאפשרת גם להתוות את העוצמה לאורך זמן. זה מאפשר למשתמש לענות בקלות על שאלות כמו: "איך הפלואורסצנטיות משתנה בתוך somite לאורך זמן?".
      2. הוסף את מודול הספוט על-ידי לחיצה על לחצן הוסף ספוט חדש או בחירת תצוגת תלת-ממד | כתמים בתפריט אימריס. בחר דלג על תגובה אוטומטית, ערוך באופן ידני. עבור את מצב מצביע Imaris מנווט לבחירה (ניתן לעשות זאת גם על-ידי לחיצה על מקש ESC בלוח המקשים).
      3. בחלון המאפיינים כתמים, בחר את הערוץ הספציפי שאליו יצורף המקום (לדוגמה, "ערוץ 1"), והפעל במעקב ידני אחר ההתחברות האוטומטית לנקודה שנבחרה והאפשרויות אפשר השהיה לפני קידום אוטומטי.
      4. הזז את סמן העכבר לחלון הפריט החזותי והסמן אמור להשתנות לכדור חוט צהוב חלול. עבור לנקודת זמן 1 והוסף נקודה (=כדור) על-ידי לחיצה ברקמת העניין. הספירה ("ספוט") נוספת רק אם לוחצים בעת החזקת מקש ההזזה . חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן הרצויות תוך הקפדה לעקוב אחר אותו חלק של רקמה לאורך זמן.
      5. בחלון מאפייני כתמים, עבור לכרטיסיה סטטיסטיקה ובתוך המעבר סטטיסטיקה מסטטיסטיקה כוללת לסטטיסטיקה מפורטת. מהנסיגה הראשונה בחר ערכים ספציפיים, ומהנסיגה השנייה בחר "Intensity mean Ch=*...", כאשר Ch* הוא הערוץ שבו תבוצע המדידה. לחצן מימין ל"לחץ כדי לפתוח את החלונית 'התוויית זמן' יימצא בפינה הימנית התחתונה של חלון המאפיינים של כתמים. לחיצה על כפתור זה פותחת עלילה עם עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית בתוך "כתמים", המתוווים לאורך זמן. ניתן גם לייצא ערכים אלה לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות הייצוגיות המוצגות במאמר זה הן להדמיית החי והן להדמיית האימונופלואורסצנטית, התקבלו באמצעות מערכת דו-פוטונית, עם יעד מים של 20 × 1.0 NA, לייזר עירור המכוון ל-960 ננומטר, ו-GaAsP photodetectors (כמתואר בדיאס ואח' (2020)43. טומוגרפיה הקרנה אופטית נעשתה באמצעות סורק OPenT שנבנה בהתאמה אישית (כמתואר ב Gualda et al. (2013)28.

הדמיה חיה (ניתוח 4D)
ניתוח מייצג של פעילות הכתב LuVeLu בעוברי עכבר במהלך הארכה צירית, המתקבל על פי הפרוטוקולים המתוארים עבור "הכנה מדגמית להדמיה חיה" (שלב 1.1; סעיף "הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית"), "ערכת נתונים של הדמיה חיה טרום עיבוד" (שלב 3; סעיף "ערכת נתונים של תמונה לפני עיבוד") ו"הדמיה וניתוח תלת-ממדיים באמצעות Imaris" (שלב 4.4; "עיבוד תלת-ממדי, הדמיה וניתוח" ניתן לראות באיור 1 ובווידאו 1.

ויזואליזציה וניתוח תלת-ממדיים
תוצאה מייצגת לשימוש בבדיקות immunofluorescence לאיתור NMPs פוטנציאליים ורגולטורים מרכזיים של בידול mesoderm, המתקבל בעקבות הפרוטוקולים המתוארים עבור "הכנה מדגמית עבור מיקרוסקופיה immunofluorescence" ("הכנה מדגם עבור הדמיה 3D ו 4D" סעיף, שלב 1.2), "Deconvolution" ו "Immunofluorescence הדמיה dataset נתונים מראש עיבוד" ("תמונה dataset מראש עיבוד" סעיף, שלב 3.2 ו 3.4 בהתאמה), ו "הדמיה וניתוח 3D באמצעות Imaris" ("עיבוד, הדמיה וניתוח תלת-ממדיים", שלב 4.4) ניתן לראות באיור 2.

עיבוד תלת מימדי של כתמי אימונופלואורסצנטיות
וידאו 2 מציג תוצאה מייצגת לבדיקת אימונופלואורסצנטיות לאיתור NMPs פוטנציאליים שהושגו על פי הפרוטוקולים המתוארים עבור "הכנה מדגמית למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית" (שלב 1.2; "הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית ו-4D"), הסעיף "Deconvolution" ו-"immunofluorescence הדמיה לפני עיבוד" (שלב 3.2 ו-3.4, בהתאמה; הסעיף "ערכת נתונים של תמונה לפני עיבוד"), והסעיף "עיבוד ותצוגה חזותית בתלת-ממד באמצעות Drishti" (שלב 4.1; סעיף "עיבוד, הדמיה וניתוח תלת-ממדיים").

שחזורים תלת-ממדיים
וידאו 3 נוצר בעקבות השיטות המתוארות עבור "הכנה מדגמית למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית" (שלב 1.2; "הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית ודרביעית"), "ערכת נתונים של הדמיית אימונופלואורסצנטיות לפני העיבוד" (שלב 3.4; "ערכת נתונים תמונה טרום עיבוד" סעיף), ו "שחזורים 3D ופילוח ידני של רקמות באמצעות Amira" (שלב 4.2; "עיבוד 3D, הדמיה וניתוח"). זה מראה שחזור 3D, המבוסס על כתמים immunofluorescence, של רקמות caudal של E9.5 סוג פראי (WT) עובר עכבר.

איורים תלת-ממדיים אינטראקטיביים
באיור 3 אנו מציגים הדמיה תלת-ממדית אינטראקטיבית של שחזור של רקמות הקבורה של עוברי העכבר בתבנית מסמך ניידת (PDF תלת-ממדי), שהוכנה בהתאם לפרוטוקולים המתוארים ל"הכנה מדגמית למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית" (שלב 1.2; "הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית ודרביעית"), "ערכת נתונים של הדמיית אימונופלואורסצנטיות לפני העיבוד" (שלב 3.4; סעיף "עיבוד מראש של ערכת נתונים של תמונה"), "שחזורים תלת-ממדיים ופילוח ידני של רקמות באמצעות אמירה", ו"הדמיה אינטראקטיבית תלת-ממדית בתוך תבנית מסמך ניידת (PDF) באמצעות SimLab" ("עיבוד, ויזואליזציה וניתוח תלת-ממדיים", שלב 4.2 ו-4.3 בהתאמה). סוג זה של פורמט יכול לשמש בקלות כדי להקל על העברת תוכן מדעי לקהל כללי יותר, במיוחד בסביבת הוראה. תצוגה חזותית אינטראקטיבית דורשת שימוש ב- Adobe Acrobat Reader (אפשר את התוסף התלת-ממדי).

תצוגה חזותית של ערכת נתונים של OPT
וידאו 4 מציג דוגמה מייצגת של ערכת נתונים משוחזרת OPT, לאחר הדמיה של עובר עכבר E18.5. הדגימה הוכנה כמתואר בפרוטוקולים עבור "הכנה מדגמית לטומוגרפיה של הקרנה אופטית" ("הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית ודרביעית"; שלב 1.3) "ערכת נתונים OPT טרום עיבוד ושחזור" (שלב 3.5) ומודולים שונים של "עיבוד, ויזואליזציה וניתוח תלת-ממדיים" (שלב 4). ניתוח אנטומי מפורט (למשל, מדידות) יכול להתבצע גם בערכת נתונים זו באמצעות פיג'י / ImageJ, אמירה או תוכנת Imaris. הסרט מכיל ארבעה קטעי וידאו: הראשון מציג רצף של פרוסות קשת בשחור לבן המיוצרות עם פיג'י / ImageJ; השני, תצוגות אורתוגונליות המיוצרות עם Imaris המציגות חיתוך 3D אינטראקטיבי ועיבוד של חלקים רקמה אורתוגונלית; השלישי מראה את העובר "מתאסף" מפרוסות קשת צבעוניות, כפי שהוכן בעמירה; קטע הווידאו האחרון מציג אנימציה של העובר בתלת-ממד מתצוגות שונות, שהוכנה עם Drishti.

וידאו 1 - הדמיה חיה של שני פוטונים של ביטוי כתב LuVeLu ב Snai1-cKO ולשלוט E8.5 עוברים (מותאם משופט 43). המקטעים הראשונים מציגים את פעילות הכתב בזמן = 0 (z-stack של 5 מיקרומטר גודל צעד) והחלקים השניים מכילים את ההדמיה החיה המלאה (10 מיקרומטר z-stacks כל 8.5 דקות). אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 2 - עיבוד תלת-ממדי של כתם אימונופלואורסצנטי בהר שלם עבור T (Brachyury) ו- Sox2 של זנב מסוג E10.5 פראי. ביטוי T מוצג במגנטה, Sox2 בצהוב ו- DAPI באפור. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 3 - שחזור תלת מימדי של החלק הקודלי של עובר עכבר מסוג E9.5 פראי מאוחר E9.5, עם דגש על קווי המתאר של רקמות caudal שונות כולל mesoderm. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה. 

וידאו 4 - E18.5 עובר מסוג פראי כפי שמצולם עם טומוגרפיה הקרנה אופטית, הדגשת הדמיית טוטו in ומספר טכניקות להדמיה ועיבוד ערכות נתונים 3D. הקטע הראשון מציג רצף של פרוסות קשת שהוכנו בפיג'י/ImageJ, השני "חי" תצוגות אורתוגונליות כפי שניתנו באימריס, השלישי עיבוד רציף מפרוסות קשת צבעוניות שהוכנו באמירה, והרביעי עיבוד אנימציה שהוכן בדרישטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Figure 1
איור 1: ניתוח 4D של ביטוי כתב LuVeLu ב- E8.5 Snai1-cKO ובקרת עוברים (מותאם משופט 43). (א) תמונת מצב בנקודת זמן = 0 של כתב LuVeLu , ב - Snai1-cKO(Meox2-Cre+/0::Snai1flox/-) (Aa) ובקרה (Ab) עוברים. בנוסף לאות LuVeLu הרגיל במסודרם הפרזומיטי, עוברים Snai1-cKO מציגים גם ביטוי LuVeLu בבליטה חוץ רחמית הנובעת מהפס הפרימיטיבי (חצים לבנים). (B) Snai1-cKO::LuVeLu+/0 עוצמה זמנית פירושה ניתוח כמותי באזור המודגש על ידי הנקודה האדומה (Ba) מציין את קיומן של שתי פסגות (ב t = 1.3 שעות ו- t = 3.6 שעות של זמן לשגות) וירידה משמעותית ביניהם, ולכן מציע פעילות רכיבה על אופניים בבליטה של העובר מוטציה מותנה. לא נצפו סימנים לפעילות רכיבה על אופניים של LuVeLu ליד הפס הפרימיטיבי (נקודה ירוקה; Bb) בעוברי בקרה LuVeLu+/0 . סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אימונוהיסטוכימיה בהר שלם בעוברי E9.5 Snai1-cKO ו-WT (מותאמים משופט 43). (א) חיסונים עבור T (ירוק) ו- Sox2 (אדום). (B) חיסונים עבור Tbx6 (ירוק) ו- Lam1 (אדום). DAPI מוצג בכחול. רינדור תלת-ממדי (מצב מיזוג) של החלק הקבורלי של העוברים השונים (Aa, Ab, Ba ו- Bb). מקטעים אופטיים רוחביים (Aa1, Ab1, Ba1, Ba2, Bb1 ו- Bb2) וסגיטל (Aa2, Ab2, Ba3 ו- Bb3) יחד עם הגדלות (Mag.) מוצגים גם עבור העוברים השונים. הגדלות מוצגות ללא DAPI. חצים לבנים מדגישים הבדלים במיקום של כמה תאים NMPs (T ו- Sox2 כפול חיובי) בעוברים המוטנטיים. חצים צהובים וראשי חץ מצביעים על ביטוי Tbx6 ו- Lam1 חוץ רחמי/חריג בהתאמה, בעוברי Snai1-cKO . סרגלי קנה מידה תואמים ל- 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 - 3D PDF - איור תלת-ממדי אינטראקטיבי בפורמט PDF תלת-ממדי המציג את השחזורים התלת-ממדיים של רקמות caudal מקוטעות של עוברי עכבר מסוג בר במהלך הרחבה צירית (E8.5, E9.5 ו- E10.5). הפילוח נעשה באופן ידני בעמירה, ומסמך PDF התלת-ממדי הורכב ויצא במלחין Simlab. תצוגה חזותית אינטראקטיבית דורשת Adobe Acrobat Reader (אפשר את התוסף התלת-ממדי). אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 1 - תוצאה מייצגת של עובר מולבן (לאחר שלב 3.2; סעיף "הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית ותלת-ממדית"). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2 - תוצאה מייצגת של הנחתת אות עומק Z (שלב 4.1; המקטע "ערכת נתונים של תמונה לפני עיבוד"). A - לפני הנחתת אות עומק Z; B - הנחתת אות עומק Z טובה; C - הנחתת אות עומק Z שגויה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3 - תוצאה מייצגת של הכתמת אימונופלואורסצנטיות בהר שלם ועובר עכבר E7.5 שהוצב מחדש (A) בעקבות "מיקום מחדש של העובר לעמדה סטנדרטית אנטומית באמצעות פיג'י/ImageJ" (שלב 3.4.3; המקטע "ערכת נתונים של תמונה לפני עיבוד" לעומת אותו עובר מבלי למקם אותו מחדש (B). הדמיה הושגה באמצעות Imaris (ראה שלב 4.1.2; סעיף "עיבוד, הדמיה וניתוח תלת-ממדיים"). T בצהוב, Sox2 במגנטה ו DAPI בכחול. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התארכות צירית וסגמנטציה הם שניים מהתהליכים המורכבים והדינמיים ביותר המתרחשים במהלך התפתחות עוברית של חוליות. השימוש בהדמיה תלת-ממדית ו-4D עם מעקב אחר תאים חד-תאיים הוחל, מזה זמן מה, כדי לחקור תהליכים אלה הן בעוברי זברה והן בעוברי עוף, אשר תנאי הנגישות והתרביות מאפשרים הדמיה מורכבת 19,44,44,45,46,47,48,49 . לעומת זאת, שלבי האורגנוגנזה האמצעית והמאוחרת של עובר העכבר עדיין נחקרים בצורה גרועה בפירוט כזה, אם כי נעשו כמה התפתחויות, למשל בהדמיה תוך-ויטלית50. בכתב יד זה אנו מספקים פרוטוקולים ספציפיים עבור מספר מתודולוגיות שניתן להשתמש בהן לרכישת תמונות רב-ממדיות וניתוחן כדי להקל על חקר ה- NMPs ונגזרות המזודרם שלהם במהלך היווצרות הצוואר, תא המטען והזנב. למרות פרוטוקולים אלה תוכננו עבור עוברי עכבר, הם יכולים להיות מכוונים בקלות לעבוד עבור מערכות explant ומודלים במבחנה כגון אגרגטים תאי גזע עובריים 3D כמו gastruloids51,52. ואכן, אם מוחל על gastruloids אנושי53 שיטות אלה יאפשרו טוב יותר הדמיה טוטו וניתוח נתונים של התארכות צירית אנושית וסגמנטציה, במיוחד בהתחשב בתאימות של מערכות מודל הפריה חוץ גופית אלה עם הדמיה חיה 4D לטווח ארוך. בנוסף לפרוטוקולים אלה, אנו מספקים גם מידע כללי על טכניקות מיקרוסקופיה זמינות שונות וכיצד ניתן להשתמש בהן כדי להתאים למטרות ניסיוניות ספציפיות. אנו מקווים שמידע זה יסייע לחוקרים לשפר את העיצובים הניסיוניים שלהם ולנצל את מלוא הציוד המיקרוסקופי וכלי ניתוח התמונות הזמינים במעבדות ובמוסדות שלהם.

הכנה מדגמית היא אחד השלבים החשובים ביותר של הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה, כמו שימור ועיבוד נאות של העובר במהלך ההליך כולו, מניתוח להרכבה במיקרוסקופ, חיוני כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה. התייבשות (והידרציה), הליכי הלבנה וסליקה הם הצעדים הקריטיים ביותר במהלך הכנת מדגם, המשפיעים מאוד על התוצאה הסופית של ההדמיה. לכן, פירטנו את השלבים האלה בפרוטוקול שלנו וסיפקנו טיפים שיעזרו לחוקרים להשיג הכנה ללא רבב של הדגימות שלהם. במיוחד, פירטנו את השימוש בשלושה פתרונות שונים לניקוי עוברי עכבר לאחר ההשתלה (עד E11.5). למרות מתיל סליצילט ו BABB שימשו במשך מספר שנים והם יעיל ניקוי ריאגנטים, חדירת לייזר מלאה ברקמות מסוימות, במיוחד mesoderm, לפעמים קשה להשיג. לעומת זאת, RapiClear נמצא כיעיל מאוד בפינוי עוברי עכבר בשלבים התפתחותיים אלה. בידיים שלנו, זה הוכיח לאפשר penetrance לייזר מלא ברקמות העובריות השונות, ומכיוון שזה לא רעיל ואינו דורש התייבשות עוברית, זה מאוד מפשט את שלב המפתח של הרכבה של העוברים במגלשת מיקרוסקופיה. כמו כן, כדי להתגבר על הצורך במניפולציה של העוברים בשקופית (עוברים מנוקים הופכים שבירים מאוד וקשה לתמרן ברגע שהם שקופים) או את הצורך לפנות לתוכנה מסחרית (למשל, אמירה או אימריס), סיפקנו צינור פשוט אך יעיל, באמצעות Fiji / ImageJ (תוכנת קוד פתוח בחינם), המאפשרת מיקום מחדש של העובר למצב סטנדרטי / ספציפי אנטומי במהלך עיבוד מראש תמונה מבלי לאבד את איכות הנתונים. לכן, אנו מצפים את השיטות והפרטים שאנו מספקים בכתב יד זה כדי להקל ולתרום כדי לשפר את הצעד העיקרי של הכנת מדגם במהלך בדיקות immunofluorescence.

במהלך רכישת תמונה, חשוב לשקול את התצורה של המערכת, אשר משפיע על איך דגימות צריך להישמר עבור הדמיה חיה או הרכבה לתצפית אופטימלית בתלת-ממד. לדוגמה, עוברי עכבר דורשים מקור חימום, רמות גבוהות של O2 ומדיה עשירה בחומרים מזינים נוזליים (לא מוצקים), מה שמקשה על שמירתם במיקרוסקופ עם תצורה זקופה או סטנדרטית של יריעת אור. להדמיה תלת-ממדית נכונה של עוברים, חשוב גם אימוביליזציה. אופטיקה זמינה היא גם גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון; להדמיה תלת-ממדית נכונה, יש להעדיף יעדי צמצם מספריים גבוהים אולם אלה לא תמיד זמינים, במיוחד כאשר נדרשים מרחקי עבודה גדולים (יותר מכמה מאות מיקרומטרים). עדשות פיזיולוגיות (כלומר, "טבילה") שכיחות מאוד להדמיה חיה, אולם אלה אינן אידיאליות להדמיה באמצעות צלחת תחתית זכוכית או עבור דגימות מנוקות המותקנות על BABB או מתיל סליצילאט. למרות מטרות אופטימיזציה עבור רקמות מנוקות הופכים נפוצים יותר, הם עדיין נדירים יחסית למצוא ברוב המעבדות. ניתן גם לדמיין רקמות מנוקות עם מטרות קונבנציונליות אולם המשתמשים חייבים להיות מודעים למגבלות ולטיפול הדרוש לפני פרשנות וניתוח ערכות הנתונים, כפי שאנו מסבירים בסעיפים לעיל. יתר על כן, זיהוי מדויק ופרשנות של תוצאות הדמיה תמיד דורשים בחירה זהירה לא רק של המכשיר אלא גם של תנאי ההפעלה וקביעת הפרמטרים. המשתמשים מוזמנים לקרוא את הביקורות הבאות 54,55,56,57 כדי להבין באופן מלא את העקרונות של הדמיה דיגיטלית נכונה ופרשנות של ביומיאז'ים.

אימונופלואורסצנטיות החלה על חלקים היסטולוגיים (2D) היו סימן ההיכר של מחקרים המבקשים להבין רקמות וארגון תאים בתוך עוברים. הופעתן של שיטות אימונולבלינג בהר שלם וטכניקות הדמיה תלת-ממדיות לא הרסניות (כפי שתואר כאן) סיפקה לביולוגים התפתחותיים את האמצעים לחקור ארגון מרחבי של רקמות ותאים בעוברים שלמים, שם קל ומדויק יותר להבין ביטוי גנים וחלבון ואת הקשר שלהם לתהליכים מורפוגנטיים. עם הדמיית טוטו, ניתן כעת לבצע היסטולוגיה וירטואלית (חלוקה וירטואלית בפרוסות שרירותיות; איור 3 משלים), וכלי ההדמיה והניתוח התלת-ממדיים יכולים לשמש כדי לחקור בקלות השערות שונות לגבי ארכיטקטורה ותקשורת של תאים ורקמות (ראו איור 2, וידאו 2 ווידאו 4). בהתחשב בכך שיומנים רבים (למשל, eLife and Development) נותנים כעת את ההזדמנות לכלול קטעי וידאו בגירסה המקוונת של המאמר, אנו קוראים לחוקרים לנצל הזדמנות זו ולא רק לבצע ניסויים וניתוח הדמיה תלת-ממדית 4D, אלא גם לעשות קטעי וידאו תלת-ממדיים המדגישים את התוצאות שלהם. שינוי חשוב זה באופן הצגת הנתונים ופרסוםם, יאפשר הבנה טובה יותר של התוצאות על ידי החוקרים ועמיתיהם. בסופו של דבר, שיטות אלה יש פוטנציאל לשפר את ההבנה שלנו של פילוח בעלי חוליות, במיוחד לגבי התפקיד של NMPs (Attardi et al. (2018)45 ו Dias et al. (2020)43 הן שתי דוגמאות טובות).

בעבודה זו הדגשנו כיצד השימוש בכלי תוכנה מסוימים (למשל, אמירה ואימריס, אך גם כלי קוד פתוח בחינם כמו פיג'י / ImageJ ו- Drishti) מאפשר ומשפר הדמיה וניתוח נתונים תלת-ממדיים בהקשר של הרחבה צירית חוליות וסומיטוגנזה. ברוב המקרים, כמו עבור מספר כלים ביו-אינפורמטיים, התוכנה המתוארת כאן יכולה להיות מוחלפת על ידי אחר (כלומר, ישנם מספר פתרונות תוכנה ויתירות). עם זאת, אנו מוצאים כי הפונקציה "תצוגת 3D" ב Imaris מאפשרת ויזואליזציה 3D עם איכות טובה בהרבה מזו המתקבלת באמצעות "מציג 3D" פיג'י / ImageJ תוסף, המאפשר למשל לבחור בין MIP או מצבי מיזוג. בנוסף, אנו מוצאים את הפונקציה "תצוגות אורתוגונליות" ב Imaris ואת הצינור שלה עבור ניתוח 3D וכימות (למשל, מודול "ספוט" ) ידידותי למשתמש. בעניין זה, למרות שכמעט כל כלי התוכנה מאפשרים צורה כלשהי של עיבוד תלת מימדי, אנו ממליצים על Drishti בגלל מודל האור הייחודי שלה והצללה המאפשרים יצירת עיבודים מציאותיים ביותר (ראה קטע אחרון של וידאו 4). כלל האצבע עבור כל עיבוד ביו-אינפורמטי של ערכות נתונים של תמונה (עיבוד מקדים ועיבודים תלת-ממדיים) הוא שהתוצאה הסופית חייבת להישאר ייצוג נאמן של מה שנצפה בעובר. לכן, סיפקנו שיטות פשוטות כדי למתן את הבעיות שנוצרו על ידי עיוות קנה מידה ציר Z (עקב אי התאמה אינדקס שבירה) והחלשת אות עומק (הנגרמת על ידי פיזור אור בדגימות עמוקות) אשר משפיעים קשות על האיכות והפרשנות של ערכות הנתונים של התמונה. באמצעות אלגוריתמים אלה, סיפקנו הוראות למקטע באופן ידני ותלת-ממד לשחזר רקמות mesodermal מ כתמי immunofluorescence הר שלם, על ידי קווי מתאר ידניים (לעתים קרובות לא אפשרי עם כלים של פילוח אוטומטי) באמצעות תוכנת אמירה. אנו מוצאים תוכנה זו שימושית במיוחד עבור ספירה ידנית של רקמות שבו אין הפרדה פיזית ברורה או הבדלי ניגוד ביניהם (למשל, ביטוי של גורם שעתוק ספציפי). חלופה מומלצת לא מסחרית עבור אמירה, אם כי פחות חזקה, היא תוסף LabKIT Fiji / ImageJ (https://imagej.net/Labkit).

כללנו גם בין התוצאות הייצוגיות דוגמה להדמיה תלת-ממדית של עובר עכבר טוטו E18.5 בתמונה עם טומוגרפיה של הקרנה אופטית, המרחיבה את היכולות של הדמיה אופטית וניתוח תמונה תלת-ממדית לכל עובר העכבר22. מתודולוגיות אלה יכולות לשמש כדי להבין ולנתח (למשל, באמצעות מדידות מורפולוגיות) חריגות שלד, כמו חוליות מותכות, עקמת או דיסוסטוזיס ספונדילוקוסטלי, שיכולות להתרחש מאוחר יותר עקב בעיות במהלך סמיטוגנזה (למשל, מוטציה Lfng)13,58,58,59,60,61,62 . חשוב לציין, גישת הדמיה זו מאפשרת תצפית על מומים שלד בהקשר גלובלי, כולל רקמות אחרות (למשל, שרירים) שיכולים גם לתרום פנוטיפים המשפיעים על עמודת החוליות63.

לבסוף, ובהסכמה עם העבודה האחרונה המדגישה מודלים נפחיים שנעשו עם ערכות נתוני הדמיה מפרויקט אטלס eMouse64, תיארנו שיטה מפורטת שלב אחר שלב שניתן להשתמש בה הן כדי להמחיש את העוצמה של מודלים תלת-ממדיים (למשל, PDF תלת-ממדי) לקהל כללי יותר וכדי לסייע במחקר ובהוראת התארכות צירית של בעלי חוליות וסגמנטציה. אנו מקווים שהמידע המוצג בכתב יד זה תורם לשינוי האופן שבו חוקרים מעצבים, מנתחים ומציגים את הניסויים שלהם, וכדי לשפר את הידע שלנו על היווצרות צירי גוף בעלי חוליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לאוליבייה Pourquié ואלכסנדר Aulehla על זן הכתב LuVeLu, מעבדת SunJin עבור מדגם הבדיקה RapiClear, הוגו Pereira על העזרה באמצעות BigStitcher, נונו Granjeiro על שעזר להקים את מנגנון ההדמיה החיה, מתקן בעלי החיים IGC וחברים בעבר ובהווה של מעבדת מאלו עבור הערות שימושיות ותמיכה במהלך עבודה זו.

אנו מודים על התמיכה הטכנית של מתקן ההדמיה המתקדם של IGC, הנתמך על ידי נציג המימון הפורטוגלי# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 ו- ref# PTDC/ BII-BTI/32375/2017, במימון משותף של תוכנית התפעול האזורית של Lisboa (Lisboa 2020), במסגרת הסכם השותפות של פורטוגל 2020, באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (FEDER) ו- Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, פורטוגל). העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי מענקים LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, פורטוגל) ו SCML-MC-60-2014 (סנטה קאסה דה מיסריקורדיה, פורטוגל) ל- M.M., תשתית המחקר קונג'נטו, פרויקט LISBOA-01-0145-FEDER-022170, ואת מלגת הדוקטורט PD / BD / 128426 / 2017 ל- A.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose low gelling temperature Sigma A9414 Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software Thermofisher - Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal) R and D Systems AF2085 RRID:AB_2200235 For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) Abcam ab92494 RRID:AB_10585428 For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) R and D Systems AF4744 RRID:AB_2200834 For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) Sigma L9393 RRID:AB_477163 For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) Molecular Probes A11055 RRID:AB_2534102 For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) ThermoFisher   Scientific A10042 RRID:AB_2534017 For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%) (any) - Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%) (any) - Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin Biowest P6154 For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0 (any) - 100um thick
Coverglass 20x20 mm #1 (any) - 170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5 (any) - To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) Life Technologies D3571 For immunofluorescence
Drishti software (open source) - Free software tool
EDTA Sigma ED2SS For demineralization
Fiji/ImageJ software (open source) - Free software tool
Glycine NZYtech MB01401 For immunofluorescence
Huygens software Scientific Volume Imaging - Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum GE Healthcare #HYCLSH30070.03 For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 % Milipore 1085971000 For clearing
Imaris software Bitplane / Oxford instruments - Commerial software tool
iSpacers SunJin Lab (varies) Use as spacers for preparations
L-glutamine Gibco #25030–024 For live imaging medium
Low glucose DMEM Gibco 11054020 For live imaging medium
M2 medium Sigma M7167 To dissect embryos
Methanol VWR VWRC20847.307 For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate Sigma M6752 Used to clear embryos
Paraformaldehyde Sigma P6148 Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin Sigma #P0781 For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution) Biowest L0615-500 -
RapiClear SunJin Laboratory RapiClear 1.52 Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers Sigma C5474 Use as spacers for preparations
simLab software SimLab soft - Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm (any) - To mount thick embryos.
Triton X-100 Sigma T8787 For immunofluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
  4. Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
  5. Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
  6. Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
  7. Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
  8. de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
  9. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
  10. Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
  11. Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
  12. Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  13. Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
  14. Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
  15. Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
  16. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  17. McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
  18. McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
  19. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
  20. Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
  21. Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
  22. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
  23. Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  24. Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
  25. Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
  26. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
  27. Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
  28. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
  31. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
  32. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
  34. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
  35. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  36. Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
  37. Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
  38. Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
  39. Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
  40. Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
  41. Thermofisher.com. , Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020).
  42. Simlab-soft.com. , Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020).
  43. Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
  44. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  45. Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
  46. Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
  47. Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
  48. Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
  49. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  50. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  51. Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
  52. Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
  53. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
  54. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  55. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  56. Jost, A. P. -T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  58. Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
  59. Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
  60. Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
  61. Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
  62. Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
  63. Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
  64. Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 168 שחזור תלת-ממדי הדמיה חיה חוליות התפתחות עוברית עכבר סמיטוגנזה מזודרם הרחבה צירית NMPs אימונופלואורסצנטיות טכניקות ניקוי ניתוח הדמיה הוראה.
גישות הדמיה וניתוח תלת-ממדיות וארבעה מימדים לחקר התארכות צירית וסגמנטציה צירית של בעלי חוליות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., … More

Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., Mallo, M. Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation. J. Vis. Exp. (168), e62086, doi:10.3791/62086 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter