Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi
Chapters
Summary February 11th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.
Transcript
Bağırsak modeli, bağırsakların ne kadar sızdırıcı olduğunu ve lökositlerin farelerde bağırsakta nasıl göç ederek in vivo olduğunu ölçmek için yaygın olarak uyarlanabilir ve fizyolojik bir yoldur. Bu yöntem, artan bağırsak geçirgenliği ve patolojik bağırsak iltihabının altında kalan mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına yardımcı olur. Teknik, ülseratif kolit ve Crohn hastalığında görüldüğü gibi bağırsak bariyeri fonksiyonunun altında kalan mekanizmaları ve patolojik inflamasyonu anlama mekanizmalarımıza yardımcı olmak için kullanılabilir.
Bu model, bağırsak bariyeri fonksiyonunun incelenmesi veya farede bağışıklık hücresi alımı için ileum veya proksimal kolondan oluşan iyi damarlı, dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanır. Bu geniş uygulama ile bağırsak döngüsü modeli, sızdıran bir bağırsak bariyerinin yanı sıra enflamatuar yanıttan kaynaklanan hastalıklar hakkında fikir verebilir. Cerrahi adımlarla mücadeleler aşılabilir.
Tamamen damarlı bir bağırsak segmentini dışsallaştırmak ve kanamayı önlemek için ligasyonlar için uygun yerleri seçmek kritik öneme sahiptir. Bağırsak döngüsü modeli mikrocerrahi bir tekniktir, bu nedenle diğer cerrahi işlemlerde olduğu gibi, görsel gösteriden ve yöntemin adım adım sunumundan büyük fayda sağlar. Cerrahi bir anestezi düzlemine ulaştıktan sonra, karın orta çizgisinin kürkünü alkol sürüntüleri veya% 70 etanol ile ıslatılmış bir gazlı bez süngeri ile ovalayarak başlayın.
Hipotermiyi önlemek için geniş bir kürk alanını alkolle ıslatmayın. Makas kullanarak, orta hat laparotomi gerçekleştirin. Karnın ortasında yatay bir kesi yapın ve karın içi organları yaralamamaya dikkat ederek peritonun ortaya çıkarılması.
Açıkta kalan karın içi boşluğun üzerine önceden kesilmiş ıslak pamuklu gazlı bez yerleştirin. Cecum'u harekete geçirmek ve dışlamak için ıslak pamuklu çubuklar kullanın ve ıslak pamuklu gazlı bez üzerine dikkatlice yerleştirin. Ardından, ileumu harekete geçirin ve hafifçe dışlayın.
Mezenterik damarları ve kan akışını bozmadan ıslak pamuklu gazlı bez üzerine en az altı santimetre terminal ileum dağıtın. Sıcak HBSS ile maruz kalan dokuları her zaman nemli tutun. Mezentery'deki ileum'dan sağlayan ana atardamarı tanımlayın, cecum'a yakın.
Daha sonra, mezentery'de kritik kan damarlarından arındırılmış iki ligasyon bölgesi bulun. Terminal ileumu künt doku tokaları ile sıkıca tutun ve kan damarlarından kaçınarak mezenteri fenestrat etmek için ince uçlu önseziler kullanın. Perforasyon boyunca ipek dikiş yerleştirin ve ilk ligasyonu oluşturmak için cerrahi bir düğüm bağlayın.
İlk bağdan dört santimetre uzağı ölçmek ve ikinci ligatürü oluşturmak için cetveli kullanın. Kan akışını ve mezenterik zarı sağlam tutarak dört santimetre ileal döngüyü izole etmek için her ligasyonun yanında ince makasla dikkatlice kesin. 10 mililitrelik bir şırınna bağlı esnek bir sarı besleme tüpü kullanarak ileal döngü segmentinin içeriğini ılık HBSS ile hafifçe yıkayın.
Cerrahi bölgeyi temiz tutmak için ışık içeriğini karın boşluğundan temiz tuttuğunuzdan emin olun. Yıkanmış ileal halkanın iki kesik ucunu ipek dikişle bir arayan. Fitc-dekstrans veya kemokin gibi 250 mikrolitre reaktifi yavaşça bağırsak lümenine enjekte etmek için 30 kalibrelik iğneli bir mililitre şırınga kullanın.
İleal döngü şişecek ve mukozanın ılımlı bir şekilde dağılmasına neden olacaktır. Ters kesme iğnesi ile bir iğne tutucu, anatomik tokmaklar ve 3.0 emilemez ipek dikiş kullanarak karın duvarını kapatın. Hipotermiyi önlemek için hayvanı kuruttuktan sonra, kuluçka süresi boyunca sıcaklık düzenlemeli bir anestezi odasına yerleştirin.
Fareyi ameliyata hazırlayın ve daha önce gösterildiği gibi cecum'un dış cephesini kullanın. Islak pamuklu çubuklar kullanarak, tüm ileumu dışlaştırın ve ıslak bir pamuklu gazlı bezin üzerine yerleştirin. Proksimal kolonu ve mezokolonda bulunan kan akışını tanımlayın.
Proksimal kolonu harekete geçirin ve mezokolondaki damarlardan arındırılmış bir alanda ilk ligatürü cecumdan yaklaşık 0,5 santimetre distal olarak oluşturun. İlk bağdan iki santimetre ölçün ve mezokolondaki kan kaynağı olmayan bir alanda ikinci bir bağ oluşturun. İnce makas kullanarak, iki santimetre uzunluğunda bir pcLoop'ı izole etmek için her ligasyonun yanında dikkatlice kesin.
10 mililitrelik bir şırıngana bağlı esnek bir sarı besleme tüpü kullanarak dışkıyı çıkarmak için pcLoop'u ılık HBSS ile hafifçe yıkayın. Cerrahi bölgeyi temiz tutmak için ışık içeriğini karın boşluğundan temiz tuttuğunuzdan emin olun. Ardından, ipek dikiş kullanarak yıkanmış pcLoop'un iki kesme ucunu ligat.
Fitc-dektran veya kemokin gibi 200 mikrolitre reaktifi yavaşça bağırsak lümenine enjekte etmek için 30 kalibrelik iğneli bir mililitre şırınga kullanın. pcLoop şişirilecek ve mukozanın orta derecede dağılmasına neden olacaktır. Ligated pcLoop, ileum ve cecum'u hafifçe geri koymak için ıslak pamuklu çubuklar kullanın.
Ters kesme iğnesi ile bir iğne tutucu, anatomik tokmaklar ve 3.0 emilemez ipek dikiş kullanarak karın duvarını kapatın. Kuluçka döneminden sonra, uyuşturuldu fareyi ötenazi yapın ve analiz için dokuları toplayın. Bağırsak geçirgenliğinin değerlendirilmesi için I döngü modelinin doğruluğunu doğrulamak için, in vivo bağırsak bariyer fonksiyonunun düzenlenmesinde sıkı kavşak ilişkili protein Jam-a'nın rolünü değerlendirmek için bir FITC-dextran pcLoop tahlil işlemi gerçekleştirildi.
pcLoop modeli ile Jam-a null farelerde kontrollere kıyasla FITC-dextran serum seviyelerinde 2,5 kat artış ölçüldü. Benzer sonuçlar, bağırsak epitel hücreleri üzerinde seçici Jam-a kaybı barındıran farelerle elde edildi. pcLoop modeli polimorfonuclear nötrofil veya PMN, bağırsak mukozasına işe alım ve daha sonra transepithelial göç in vivo incelemek için kullanıldı.
pcLoop'un ışık içeriğindeki PMN sayısı akış sitometrisi analizi ile ölçüldü. Proksimal kolon segmentinde mevcut PMN sayısı fizyolojik koşullar altında düşüktü. Pro-enflamatuar sitokinler, TNF alfa ve IFN gama ile ameliyat öncesi ön işlem, pcLoop lümeninde işe alınan PMN sayısının arttırıldığı sonucuna vardı.
PMN kemoterapi çekici LTB4'ün yönetimi PMN sayılarında çarpıcı bir artışa yol açtı. Kolonik mukozada PMN'nin immünohistokimyasal lekelenmesi sitokinler ve LTB4 ile uyarılmasını takiben PMN'nin yüksek işe alımını doğrulamaz. Jam-a'nın PMN transepithelial göçüne katkısı, bağırsak epitel hücreleri üzerinde seçici Jam-a kaybı barındıran fareler üzerinde pcLoop modeli kullanılarak çalışılmıştır.
Epitel Jam-a kaybı, kolon lümeninde çöp atma kontrollerine kıyasla transmigran PMN sayısının azalmasına yol açtı. Bu teknik için kritik bir husus, ameliyatı gerçekleştirirken dışlanmış bağırsak segmentine kan akışını korumayı hatırlamaktır. Bu protokolün ardından, bariyer bütünlüğü kaybını ve in vivo bağırsak iltihabını araştırmak için bağırsak geçirgenliği tahlili ve nötrofil transepithelial göç tahlili gibi diğer yöntemler yapılabilir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
