लाइव स्तनधारी श्रवण बाल कोशिकाओं में नैनोस्केल संकल्प के साथ स्टीरियोसिलिया बंडल इमेजिंग
Summary
यहां हम Hopping प्रोब आयन कंडक्टेंस माइक्रोस्कोपी (HPICM), एक गैर संपर्क स्कैनिंग जांच तकनीक है कि लाइव श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडलों के नैनोस्केल इमेजिंग की अनुमति देता है के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
Abstract
इनर इयर हेयर सेल्स ध्वनि-प्रेरित विस्थापन का पता लगाते हैं और इन उत्तेजनाओं को बालों के बंडल में विद्युत संकेतों में स्थानांतरित करते हैं जिसमें स्टीरियोसिलिया होता है जो बढ़ती ऊंचाई की पंक्तियों में व्यवस्थित होते हैं। जब स्टीरियोसिलिया को विक्षेपित किया जाता है, तो वे छोटे (~ 5 एनएम व्यास में) एक्स्ट्रासेलुलर टिप लिंक पर स्टरेसिलिया को जोड़ने के लिए मिलते हैं, जो मशीनोसेटिव ट्रांसडक्शन चैनलों को बलों को व्यक्त करते हैं। यद्यपि दशकों से जीवित बाल कोशिकाओं में मेकानोट्रांसडक्शन का अध्ययन किया गया है, लेकिन स्टीरियोसिलिया (जैसे टिप लिंक गतिशीलता या ट्रांसडक्शन-निर्भर स्टीरियोसिलिया रीमॉडलिंग) के सुझावों पर मेकानोट्रांसडक्शन मशीनरी के कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरण का अध्ययन अभी भी केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मृत कोशिकाओं में किया जा सकता है। सैद्धांतिक रूप से, स्कैनिंग जांच तकनीकों, जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोपी, स्टीरियोसिलिया की सतह की कल्पना करने के लिए पर्याप्त संकल्प है । हालांकि, इमेजिंग मोड से स्वतंत्र, यहां तक कि स्टीरियोसिलिया बंडल के साथ परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जांच का जरा सा संपर्क आमतौर पर बंडल को नुकसान पहुंचाता है। यहां हम लाइव कृंतक श्रवण बाल कोशिकाओं की हॉपिंग प्रोब आयन कंडक्शन माइक्रोस्कोपी (एचपीआईसीएम) इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह गैर-संपर्क स्कैनिंग जांच तकनीक एक जटिल स्थलाकृति के साथ जीवित कोशिकाओं की सतह की समय चूक इमेजिंग की अनुमति देती है, जैसे बाल कोशिकाएं, एकल नैनोमीटर संकल्प के साथ और नमूने के साथ शारीरिक संपर्क बनाए बिना। HPICM पिपेट के करीब आसपास सेल की सतह का पता लगाने के लिए ग्लास नैनोपिपेट से गुजरने वाले विद्युत प्रवाह का उपयोग करता है, जबकि एक 3डी-पोजिशनिंग पीजोइलेक्ट्रिक सिस्टम सतह को स्कैन करता है और इसकी छवि उत्पन्न करता है। HPICM के साथ, हम स्टीरियोसिलिया बंडलों और लिंक को ध्यान देने योग्य क्षति के बिना कई घंटों के लिए लाइव श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया को जोड़ने के लिए छवि करने में सक्षम थे। हम आशा करते हैं कि एचपीआईसीएम का उपयोग उनके कार्य की बेहतर समझ के लिए जीवित बाल कोशिकाओं के स्टीरियोसिलिया में अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनों की सीधी खोज की अनुमति देगा।
Introduction
इस तथ्य के बावजूद कि श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडल ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करने और पैच क्लैंप प्रयोग में जीवित कोशिकाओं में विक्षेपित होने के लिए काफी बड़े हैं, टिप लिंक जैसे ट्रांसडक्शन मशीनरी के आवश्यक संरचनात्मक घटकों को केवल मृत कोशिकाओं में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ इमेज किया जा सकता है। स्तनधारी श्रवण बाल कोशिकाओं में, ट्रांसडक्शन मशीनरी टिप लिंक के निचले सिरों पर स्थित है, यानी, छोटी पंक्ति स्टीरियोसिलिया1 के सुझावों पर और स्टीरियोसिलिया2,3के सुझावों पर सिग्नलिंग के माध्यम से स्थानीय रूप से विनियमित। फिर भी, जीवित बाल कोशिकाओं में इस स्थान पर सतह संरचनाओं की लेबल-मुक्त इमेजिंग स्टीरियोसिलिया के छोटे आकार के कारण संभव नहीं है।
स्तनधारी कोचलिया में दो प्रकार की श्रवण संवेदी कोशिकाएं होती हैं: आंतरिक और बाहरी बाल कोशिकाएं। भीतरी बाल कोशिकाओं में, स्टीरियोसिलिया बाहरी बाल कोशिकाओं 4 में उन लोगों की तुलना मेंलंबेऔर मोटे हैं। स्टीरियोसिलिया की पहली और दूसरी पंक्ति में माउस या चूहे के भीतरी बाल कोशिकाओं में 300-500 एनएम का व्यास होता है। प्रकाश के विवर्तन के कारण, लेबल-मुक्त ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त अधिकतम संकल्प लगभग 200 एनएम है। इसलिए, आंतरिक बाल कोशिका बंडल की पहली और दूसरी पंक्तियों के भीतर व्यक्तिगत स्टीरियोसिलिया का दृश्य ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ अपेक्षाकृत आसान है। इसके विपरीत, आंतरिक बाल कोशिकाओं में छोटी पंक्ति स्टीरियोसिलिया और बाहरी बाल कोशिकाओं के सभी स्टीरियोसिलिया का व्यास 100-200 एनएम के आसपास होता है और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी5के साथ कल्पना नहीं की जा सकती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में हालिया प्रगति के बावजूद, यह मौलिक सीमा किसी भी ऑप्टिकल लेबल-मुक्त इमेजिंग में बनी हुई है। सभी वर्तमान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों को किसी प्रकार के फ्लोरोसेंट अणुओं की आवश्यकता होतीहै,जो उनके अनुप्रयोगों को सीमित करते हैं। विशिष्ट फ्लोरोसेंटली टैग किए गए अणुओं की आवश्यकता के कारण सीमाओं के अलावा, सेलुलर क्षति को प्रेरित करने के लिए तीव्र प्रकाश विकिरण के संपर्क में दिखाया गया है और सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है, जो लाइव कोशिकाओं का अध्ययन करते समय एक बड़ा नुकसान है7।
हेयर सेल स्टीरियोसिलिया बंडलों के अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरणों का हमारा वर्तमान ज्ञान ज्यादातर विभिन्न इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) तकनीकों के साथ प्राप्त किया गया है, जैसे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम), ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएमई), फ्रीज-फ्रैक्चर ईएम, और हाल ही में 3डी तकनीकों के साथ जैसे केंद्रित आयन बीम या क्रायो-ईएम टोमोग्राफी8,9,10,11,13, 14,15,16. दुर्भाग्य से, इन सभी EM तकनीकों के नमूने के रासायनिक या क्राइसोफिकेशन की आवश्यकता होती है। घटना के समय पैमाने के आधार पर, यह आवश्यकता स्टीरियोसिलिया के सुझावों पर गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करती है या तो असंभव या बहुत श्रम गहन।
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम)17,18के साथ जीवित बाल कोशिकाओं के बालों के बंडलों को चित्रित करने के लिए सीमित प्रयास किए गए हैं । चूंकि एएफएम शारीरिक समाधानों में संचालित होता है, इसलिए यह सिद्धांत रूप में, समय के साथ जीवित बाल कोशिकाओं के स्टीरियोसिलिया बंडलों में गतिशील परिवर्तनों की कल्पना कर सकता है। समस्या उच्च संकल्प AFM के सिद्धांतों में निहित है, जो AFM जांच और नमूने के बीच कुछ शारीरिक संपर्क का तात्पर्य है, यहां तक कि कम से हानिकारक “दोहन” मोड19में । जब एएफएम जांच में स्टीरियोसिलियम का सामना करना पड़ता है, तो यह आमतौर पर इसके खिलाफ दुर्घटनाग्रस्त हो जाता है, बालों के बंडल की संरचना को नुकसान पहुंचाता है। नतीजतन, यह तकनीक लाइव, या यहां तक कि तय कल्पना के लिए उपयुक्त नहीं है, बाल कोशिकाओंबंडलों 17,18। एक बड़ी गेंद के आकार की एएफएम जांच का उपयोग करके समस्या को आंशिक रूप से समाप्त किया जा सकता है जो नमूना20की सतह पर केवल हाइड्रोडायनामिक बल लगाता है। हालांकि, भले ही इस तरह की जांच आदर्श रूप से नमूना21के यांत्रिक गुणों का परीक्षण करने के लिए अनुकूल है, यह केवल एक उप-माइक्रोमीटर रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है जब कोर्टी22 के अंग इमेजिंग और अभी भी नमूना एक बल है कि अत्यधिक संवेदनशील stereocilia बंडलों के लिए पर्याप्त हो सकता है पर लागू होता है ।
स्कैनिंग आयन कंडिशन माइक्रोस्कोपी (एसआईसीएम) स्कैनिंग प्रोब माइक्रोस्कोपी का एक संस्करण है जो एक कंडक्टिव सॉल्यूशन23से भरे ग्लास पिपेट जांच का उपयोग करता है। SICM सतह का पता लगाता है जब पिपेट सेल के पास पहुंचता है और पिपेट के माध्यम से बिजली का करंट कम हो जाता है। चूंकि यह कोशिका को छूने से पहले अच्छी तरह से हो रहा है, इसलिए एसआईसीएम शारीरिक समाधान24में जीवित कोशिकाओं के गैर-संपर्क इमेजिंग के लिए आदर्श रूप से अनुकूल है। एसआईसीएम का सबसे अच्छा संकल्प एकल नैनोमीटर के क्रम पर है, जो जीवित कोशिका25की प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्तिगत प्रोटीन परिसरों को हल करने की अनुमति देता है। हालांकि, अन्य स्कैनिंग जांच तकनीकों के समान, SICM केवल अपेक्षाकृत सपाट सतहों को छवि देने में सक्षम है। हमने हॉपिंग प्रोब आयन कंडक्शन माइक्रोस्कोप (एचपीआईसीएम)26की खोज करके इस सीमा को पार कर लिया, जिसमें नैनोपिपेट प्रत्येक इमेजिंग पॉइंट(चित्रा 1 ए)पर नमूने के पास पहुंचता है। HPICM का उपयोग करना, हम नैनोस्केल संकल्प27के साथ लाइव श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडलों छवि करने में सक्षम थे ।
इस तकनीक का एक और मौलिक लाभ यह है कि एचपीआईसीएम न केवल एक इमेजिंग उपकरण है। अन्य स्कैनिंग जांच तकनीकों के विपरीत, एचपीआईसीएम/एसआईसीएम जांच एक इलेक्ट्रोड है जो विद्युत रिकॉर्डिंग और विभिन्न उत्तेजनाओं के स्थानीय वितरण के लिए सेल फिजियोलॉजी में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है । आयन चैनल गतिविधि आमतौर पर एचपीआईसीएम इमेजिंग में हस्तक्षेप नहीं करती है, क्योंकि एचपीआईसीएम जांच के माध्यम से कुल वर्तमान सबसे बड़े आयन चैनलों द्वारा उत्पन्न बाह्य वर्तमान से बड़े परिमाण के कई आदेश हैं25। हालांकि, HPICM इस संरचना28से ब्याज की संरचना और बाद में एकल चैनल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग पर नैनोपिपेट की सटीक स्थिति की अनुमति देता है। इस तरह हमने बाहरी हेयर सेल स्टीरियोसिलिया29के सुझावों पर एकल चैनल गतिविधि की पहली प्रारंभिक रिकॉर्डिंग प्राप्त की । यह उल्लेखनीय है कि नैनोपिपेट के माध्यम से एक बड़ा वर्तमान भी बाहुलकर माध्यम के भारी विद्युत शंट के कारण प्लाज्मा झिल्ली में क्षमता के महत्वपूर्ण परिवर्तन का उत्पादन नहीं कर सकता है। हालांकि, व्यक्तिगत आयन चैनलों को नैनोपिपेट30 के माध्यम से तरल के प्रवाह या रासायनिक रूप से एक एगोनिस्ट31के स्थानीय अनुप्रयोग द्वारा यांत्रिक रूप से सक्रिय किया जा सकता है।
एचपीआईसीएम में, छवि तब उत्पन्न होती है जब एक नैनोपिपेट क्रमिक रूप से एक बिंदु पर नमूने के पास जाता है, वापस ले जाता है, और फिर दृष्टिकोण(चित्र 1 ए)को दोहराने के लिए पार्श्व दिशा में जाता है। एक पैच क्लैंप एम्पलीफायर लगातार स्नान समाधान में ~ 1 एनए की धारा उत्पन्न करने के लिए पिपेट(चित्रा 1B)में एजीसीएल तार पर वोल्टेज लागू करता है। इस धारा का मूल्य जब पिपेट कोशिका की सतह से दूर होता है तो संदर्भ वर्तमान(आईरेफरी, चित्रा 1सी)के रूप में निर्धारित किया जाता है। फिर, पिपेट जेड एक्सिस में नमूना से संपर्क करने के लिए चलता है जब तक कि वर्तमान उपयोगकर्ता (सेटपॉइंट) द्वारा पूर्वनिर्धारित राशि से कम न हो जाए, आमतौर पर आईरेफरी (चित्रा 1C, शीर्ष ट्रेस) का0.2%-1%। सिस्टम तो नमूना की ऊंचाई के रूप में इस पल में जेड मूल्य बचाता है, एक साथ एक्स और वाई इस इमेजिंग बिंदु के निर्देशांक के साथ । फिर, पिपेट को उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित गति पर सतह(चित्रा 1C,नीचे ट्रेस) से दूर कर दिया जाता है, आमतौर पर 700-900 एनएम/एमएस। पीछे हटने के बाद, पिपेट (या, हमारे मामले में, नमूना – चित्रा 1Bदेखें) को बाद में अगले इमेजिंग पॉइंट पर ले जाया जाता है, एक नया संदर्भ वर्तमान मूल्य प्राप्त किया जाता है, और पिपेट एक बार फिर नमूना का उपयोग करता है, प्रक्रिया को दोहराता है। पिपेट के एक्स-वाई आंदोलन को एक ईमानदार माइक्रोस्कोप सेटअप में पसंद किया जाता है जिसका उपयोग आमतौर पर हेयर सेल मेकेनोट्रांजेक्शन धाराओं की रिकॉर्डिंग के लिए किया जाता है। इस सेटिंग में, HPICM जांच बाल कोशिका बंडलों ऊपर से नहीं बल्कि एक कोण३२पर दृष्टिकोण । हालांकि, एचपीआईसीएम इमेजिंग का सबसे अच्छा संकल्प एक उल्टे माइक्रोस्कोप सेटअप(चित्रा 1A,बी)में हासिल किया जाता है, जहां एक्स-वाई दिशाओं में नमूने की आवाजाही नैनोपिपेट के जेड-मूवमेंट से डी-युग्मित होती है, जिससे संभावित यांत्रिक कलाकृतियों को नष्ट किया जाता है।
एचपीआईसीएम का उपयोग करके, हमने माउस और चूहे के भीतरी और बाहरी बाल कोशिका स्टीरियोसिलिया बंडलों की स्थलाकृतिक छवियां प्राप्त कीं, और यहां तक कि स्टीरियोसिलिया के बीच संबंधों की कल्पना की जो व्यास26,27में लगभग 5 एनएम हैं। इस तकनीक के साथ हेयर सेल बंडल इमेजिंग की सफलता कई कारकों पर निर्भर करती है। सबसे पहले, नैनोपिपेट वर्तमान का शोर (विचरण) एचपीआईसीएम इमेजिंग के लिए सबसे कम संभव सेटपॉइंट की अनुमति देने के लिए जितना संभव हो उतना छोटा होना चाहिए। एक कम सेटपॉइंट एचपीआईसीएम जांच को बड़ी दूरी पर और जांच दृष्टिकोण के किसी भी कोण पर “भावना” स्टीरियोलिया सतह की अनुमति देता है और आश्चर्यजनक रूप से, एचपीआईसीएम इमेजिंग के एक्स-वाई संकल्प में सुधार करता है (चर्चादेखें)। दूसरा, सिस्टम में कंपन और बहाव को 10 एनएम से कम किया जाना चाहिए, क्योंकि वे सीधे इमेजिंग कलाकृतियों में योगदान देते हैं। अंत में, भले ही HPICM जांच और नमूना चरण जेड और एक्स-वाई कुल्हाड़ियों में अंशांकित प्रतिक्रिया नियंत्रित पीजो एक्ट्यूएटर द्वारा स्थानांतरित कर रहे हैं, जिनमें एक नैनोमीटर या बेहतर की सटीकता है, नैनोपिपेट टिप का व्यास वर्तमान (संवेदन मात्रा) के प्रसार को निर्धारित करता है और इसलिए संकल्प(चित्रा 1A)। इसलिए, लाइव हेयर कोशिकाओं को इमेजिंग करने से पहले, पर्याप्त पिपेट खींचना, अंशांकन नमूनों के साथ वांछित संकल्प तक पहुंचना और रिकॉर्डिंग सिस्टम में कम शोर प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।
कुछ दशकों से, SICM तकनीक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है और यह इंपीरियल कॉलेज (यूके) में प्रो कोरचेव की अग्रणी प्रयोगशाला के साथ दुनिया में केवल कुछ प्रयोगशालाओं द्वारा विकसित किया गया है । हाल ही में, कई एसआईसीएम सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए (सामग्री की तालिकादेखें), जिनमें से सभी मूल एचपीआईसीएम सिद्धांतों पर आधारित हैं। हालांकि, बाल कोशिकाओं में इमेजिंग स्टीरियोलिया बंडलों को बंद “रेडी-टू-गो” सिस्टम में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण (या असंभव भी) कई कस्टम संशोधनों की आवश्यकता होती है। इसलिए, कुछ घटक एकीकरण की आवश्यकता है। चूंकि एचपीआईसीएम सेटअप अधिक कठोर कंपन और बहाव आवश्यकताओं और एचपीआईसीएम जांच और नमूना(चित्रा 1D)के एक पीजो-चालित आंदोलन के साथ एक पैच क्लैंप रिग का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए यह एकीकरण किसी भी शोधकर्ता के लिए अपेक्षाकृत आसान है, जो पैच क्लैंपिंग में कुशल है। हालांकि, उचित पृष्ठभूमि के बिना एक वैज्ञानिक निश्चित रूप से पहले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता होगी । इमेजिंग की गति बढ़ाने (चर्चादेखें) जैसी शेष चुनौतियों के बावजूद, हम उन्हें नुकसान पहुंचाए बिना नैनोस्केल संकल्प के साथ जीवित बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडलों को छवि बनाने में सक्षम रहे हैं।
यह कागज हमारे कस्टम सिस्टम का उपयोग करके युवा प्रसवोत्तर चूहे या माउस कॉकलियर एक्सप्लांट में लाइव श्रवण हेयर सेल बंडलों की सफल एचपीआईसीएम इमेजिंग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एकीकृत घटक सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं। कागज भी आम समस्याओं का वर्णन है कि सामना किया जा सकता है और कैसे उंहें समस्या निवारण के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सफल एचपीआईसीएम छवियों को प्राप्त करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को कम शोर और कम कंपन प्रणाली स्थापित करने और उपयुक्त पिपेट का निर्माण करने की आवश्यकता है। हम दृढ़ता से किसी भी लाइव सेल इमेजिंग करने के प्रय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम परियोजना के सभी चरणों में दीर्घकालिक समर्थन और सलाह के लिए प्रो यूरी कोरचेव (इंपीरियल कॉलेज, यूके) को धन्यवाद देते हैं। हम सॉफ्टवेयर विकास के साथ उनकी मदद के लिए डीआरएस पावेल नोवाक और एंड्रयू शेवचुक (इंपीरियल कॉलेज, यूके) के साथ-साथ ओलेग बेलोव (नेशनल रिसर्च सेंटर फॉर ऑडियोलॉजी, रूस) को भी धन्यवाद देते हैं । इस अध्ययन को एनआईडीसीडी/एनआईएच (R01 DC008861 और R01 DC014658 से G.I.F.) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Analog oscilloscope | B&K Precision | 2160C | Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach |
| AFM calibration standards | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system |
| Benchtop vibration Isolator | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Active vibration isolation |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | To be added to the bath solution to adjust osmolarity |
| Digitizer | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Multi-channel input/output digitizer |
| Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers. |
| Faraday cage | AMETEK/TMC | Type II | Required to shield electromagnetic interference |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Used as the dish for the chamber for the tissue |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Extracellular (bath) solution |
| Instrumentation amplifier | Brownlee Precision | Model 440 | Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation |
| Laser-based micropipette puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes. |
| Lebovitz's L-15, without phenol red | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Extracellular (bath) solution |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | Used for "course" positioning of the Z piezo actuator |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Inverted optical microscope |
| Patch amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette |
| Piezo amplifier (XY axes) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509.C2A | Amplification and PID control for XY piezo translation stage |
| Piezo amplifier (Z axis) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA |
| Plastic Coverslips | TED PELLA Inc | 26028 | Used in the fabrication of the chambers for the tissue |
| SICM controller & software* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd |
| Silicone elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue |
| Silicon glue | The Dow Chemical Company | 734 | Used to glue the different parts of the chamber for the tissue |
| Tungsten rod | A-M Systems | 717500 | Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue |
| XY piezo nanopositioner | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY translation stage with capacitive sensors |
| Z piezo nanopositioner | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring piezoactuator with a strain gage sensor |
| *Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems: NX12-Bio and NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original | |||
| HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically | |||
| challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one | |||
| modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. | |||
References
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