Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme
Summary
Burada, canlı işitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin nano ölçekli görüntülenmesini sağlayan temassız tarama probu tekniği olan Zıplayan Prob İyon İletkenliği Mikroskopisi (HPICM) için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
İç kulak kılı hücreleri ses kaynaklı yer değiştirmeleri algılar ve bu uyaranları artan yükseklik sıralarına göre düzenlenmiş stereosiliden oluşan bir saç demetinde elektrik sinyallerine aktarır. Stereosilia saptırıldığında, mekanosensitive transdüksiyon kanallarına kuvvet aktaran stereosilia birbirine bağlı küçük (~5 nm çapında) hücre dışı uç bağlantılarını çekerler. Mechanotransdüksiyon on yıllardır canlı saç hücrelerinde çalışılsa da, stereosilisin uçlarındaki mekanotransdüksiyon makinelerinin işlevsel olarak önemli ultrayapısal detayları (uç bağlantı dinamikleri veya transdüksiyona bağımlı stereosilia remodeling gibi) hala sadece elektron mikroskopisi olan ölü hücrelerde çalışılabilir. Teorik olarak, atomik kuvvet mikroskopisi gibi tarama prob teknikleri stereosilia yüzeyini görselleştirmek için yeterli çözünürlüğe sahiptir. Bununla birlikte, görüntüleme modundan bağımsız olarak, atomik kuvvet mikroskopi probunun stereosilia demetiyle en ufak teması bile genellikle demete zarar verir. Burada canlı kemirgen işitsel saç hücrelerinin zıplayan prob iyon iletim mikroskopisi (HPICM) görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu temassız tarama prob tekniği, saç hücreleri gibi karmaşık bir topografya ile canlı hücrelerin yüzeyinin tek nanometre çözünürlüğüyle ve numuneyle fiziksel temas kurmadan zaman atlamalı görüntülenmesini sağlar. HPICM, pipete yakın çevredeki hücre yüzeyini tespit etmek için cam nanopipetten geçen bir elektrik akımı kullanırken, 3D konumlandırmalı piezoelektrik sistem yüzeyi tarar ve görüntüsünü oluşturur. HPICM ile stereosilia demetlerini ve stereosiliyi canlı işitsel saç hücrelerinde birbirine bağlayan bağlantıları farkedilir bir hasar olmadan birkaç saat boyunca görüntüleyebildik. HPICM kullanımının, işlevlerinin daha iyi anlaşılması için canlı saç hücrelerinin stereosilisinde ultrayapısal değişikliklerin doğrudan araştırılmasına izin vereceğini öngörüyoruz.
Introduction
İşitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin optik mikroskopi ile görselleştirilecek kadar büyük olmasına ve bir yama kelepçesi deneyinde canlı hücrelerde saptırılmasına rağmen, uç bağlantıları gibi transdüksiyon makinelerinin temel yapısal bileşenleri sadece ölü hücrelerdeki elektron mikroskopisi ile görüntülenebilir. Memeli işitsel saç hücrelerinde, transdüksiyon makineleri uç bağlantılarının alt uçlarında, yani daha kısa sıra stereosili1’in uçlarında bulunur ve stereosilia2,3’ünuçlarındaki sinyal yoluyla yerel olarak düzenlenir. Ancak stereosilinin küçük boyutları nedeniyle bu konumdaki yüzey yapılarının canlı saç hücrelerinde etiketsiz görüntülenmesi mümkün değildir.
Memeli koklea iki tür işitsel duyusal hücreye sahiptir: iç ve dış saç hücreleri. İç saç hücrelerinde, stereosili dış saç hücrelerindekilere kıyasla daha uzun ve kalındır4. Stereosilinin birinci ve ikinci sırası fare veya sıçan iç saç hücrelerinde 300-500 nm çapındadır. Işığın kırınımı nedeniyle, etiketsiz optik mikroskopi ile elde edilebilen maksimum çözünürlük yaklaşık 200 nm’dir. Bu nedenle, iç saç hücresi demetinin birinci ve ikinci sıraları içindeki bireysel stereosililerin görselleştirilmesi optik mikroskopi ile nispeten kolaydır. Buna karşılık, iç saç hücrelerinde daha kısa sıra stereosili ve dış saç hücrelerinin tüm stereosilileri 100-200 nm civarında çaplara sahiptir ve optik mikroskopi ile görselleştirilemez5. Süper çözünürlüklü görüntülemedeki son gelişmelere rağmen, bu temel sınırlama herhangi bir optik etiketsiz görüntülemede devam eder. Mevcut tüm ticari süper çözünürlük teknikleri bir tür floresan molekül gerektirir6, uygulamalarını sınırlar. Belirli floresan etiketli moleküllere duyulan ihtiyaç nedeniyle sınırlamalara ek olarak, yoğun ışık ışınlanmasına maruz kalmanın hücresel hasara neden olduğu ve hücresel süreçleri etkileyebileceği gösterilmiştir, bu da canlı hücreleri incelerken büyük bir dezavantajdır7.
Saç hücresi stereosilia demetlerinin ultrayapısal detayları hakkındaki güncel bilgimiz çoğunlukla çeşitli elektron mikroskopisi (EM) teknikleri ile elde edilmiştir, taramalı elektron mikroskopisi (SEM), iletim elektron mikroskopisi (TEM), donma-kırılma EM ve son zamanlarda odaklanmış iyon ışını veya kriyo-EM tomografisi ile seri kesitleme gibi 3D tekniklerle 8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Ne yazık ki, tüm bu EM teknikleri numunenin kimyasal veya kriyofixasyonunu gerektirir. Fenomenin zaman ölçeğine bağlı olarak, bu gereksinim stereosilianın uçlarındaki dinamik süreçlerin incelenmesini imkansız veya çok emek yoğun hale getirir.
Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM)17,18ile canlı saç hücrelerinin saç demetlerini görüntüleyemek için sınırlı çaba sarf edilmiştir. AFM fizyolojik çözümlerle çalıştığından, teoride, zaman içinde canlı saç hücrelerinin stereosilia demetlerindeki dinamik değişiklikleri görselleştirebilir. Sorun, AFM probu ile numune arasında belirli fiziksel teması ima eden yüksek çözünürlüklü AFM ilkelerinde yatmaktadır, hatta en az zarar veren “dokunma” modunda19. AFM probu bir stereosiyumla karşılaştığında, genellikle ona çarpar ve saç demetinin yapısına zarar verir. Sonuç olarak, bu teknik canlı, hatta sabit saç hücreleri demetlerini görselleştirmek için uygun değildir17,18. Numunenin yüzeyine sadece hidrodinamik kuvvetler uygulayan büyük bir top şeklindeki AFM probu kullanılarak sorun kısmen hafifletilebilir20. Bununla birlikte, böyle bir prob numune21’inmekanik özelliklerini test etmek için ideal olsa da, Corti22’nin organını görüntülerken sadece bir mikrometre altı çözünürlük sağlar ve yine de numune için son derece hassas stereosilia demetleri için önemli olabilecek bir kuvvet uygular.
Taramalı iyon iletim mikroskopisi (SICM), iletken bir çözelti23ile doldurulmuş bir cam pipet probu kullanan tarama probu mikroskopisinin bir sürümüdür. SICM, pipet hücreye yaklaştığında yüzeyi algılar ve pipetten geçen elektrik akımı azalır. Bu hücreye dokunmadan önce iyi gerçekleştiğinden, SICM fizyolojik çözelti24’tecanlı hücrelerin temassız görüntülenmesi için idealdir. SICM’nin en iyi çözünürlüğü, canlı bir hücrenin plazma zarında bireysel protein komplekslerinin çözülmesini sağlayan tek nanometreler sırasınagöredir 25. Bununla birlikte, diğer tarama prob tekniklerine benzer şekilde, SICM yalnızca nispeten düz yüzeyleri görüntüleyebilmektedir. Nanopipette’in her görüntüleme noktasında numuneye yaklaştığı atlamalı prob iyon iletkenlik mikroskobu (HPICM)26icat ederek bu sınırlamanın aşısını aştık (Şekil 1A). HPICM kullanarak, stereosilia demetlerini nano ölçekli çözünürlük27ile canlı işitsel saç hücrelerinde görüntüleyebildik.
Bu tekniğin bir diğer temel avantajı, HPICM’nin sadece bir görüntüleme aracı olmamasıdır. Diğer tarama prob tekniklerinin aksine, HPICM/SICM probu, elektrik kayıtları ve çeşitli uyaranların yerel teslimatı için hücre fizyolojisinde yaygın olarak kullanılan bir elektrotdur. İyon kanalı etkinliği genellikle HPICM görüntülemesini engellemez, çünkü HPICM probu aracılığıyla toplam akım, en büyük iyon kanalları25tarafından oluşturulan hücre dışı akımdan daha büyük birkaç büyüklük sırasıdır. Bununla birlikte, HPICM nanopipette’in ilgi çekici bir yapı üzerinde hassas bir şekilde konumlandırılmasına ve daha sonra bu yapıdan tek kanallı yama kelepçesi kaydına izin verir28. Dış saç hücresi stereosili29’unuçlarında tek kanallı aktivitenin ilk ön kayıtlarını bu şekilde elde ettik. Nanopipetten geçen büyük bir akımın bile, hücre dışı ortamın muazzam elektriksel şantları nedeniyle plazma zarı boyunca potansiyelde önemli değişiklikler üretemeyeceğini belirtmek gerekir. Bununla birlikte, bireysel iyon kanalları nanopipette30’dan sıvı akışı veya bir agonist31’inlokal uygulaması ile kimyasal olarak mekanik olarak aktive edilebilir.
HPICM’de görüntü, bir nanopipette bir noktada örneğe ardışık olarak yaklaştığında, geri çekildiğinde ve yaklaşımı tekrarlamak için yanal yönde hareket ettiğinde oluşturulur (Şekil 1A). Bir yama kelepçesi amplifikatörü, banyo çözeltisinde~1 nAakımı oluşturmak için pipetteki bir AgCl teline ( Şekil 1B ) sürekli voltaj uygular. Pipet hücre yüzeyinden uzaktayken bu akımın değeri referans akım olarak belirlenir (Iref, Şekil 1C). Daha sonra pipet, akım kullanıcı (setpoint) tarafından önceden tanımlanmış bir miktar azaltılana kadar örneğe yaklaşmak için Z ekseninde hareket eder, genellikle I hakeminin% 0.2-1’i (Şekil 1C, üst iz). Sistem daha sonra bu görüntüleme noktasının X ve Y koordinatlarıyla birlikte numunenin yüksekliği olarak şu anda Z değerini kaydeder. Daha sonra pipet, genellikle 700-900 nm/ms olmak üzere kullanıcı tarafından tanımlanan bir hızda yüzeyden(Şekil 1C, alt iz) geri çekilir. Geri çekildikten sonra, pipet (veya bizim durumumuzda örnek – bkz. Şekil 1B)yanal olarak bir sonraki görüntüleme noktasına taşınır, yeni bir referans akım değeri elde edilir ve pipet bir kez daha numuneye yaklaşır ve işlemi tekrarlar. Pipet X-Y hareketi, tipik olarak saç hücresi mekanotransdüksiyon akımlarının kayıtları için kullanılan dik bir mikroskop kurulumunda tercih edilir. Bu ayarda, HPICM probu saç hücresi demetlerine yukarıdan değil,32açıyla yaklaşır. Bununla birlikte, HPICM görüntülemenin en iyi çözünürlüğü, numunenin X-Y yönlerinde hareketinin nanopipette’in Z hareketinden birleştiği ve böylece potansiyel mekanik eserlerin ortadan kaldırıldığı ters bir mikroskop kurulumunda (Şekil 1A, B) elde edilir.
HPICM kullanarak, fare ve sıçan iç ve dış saç hücresi stereosilia demetlerinin topografik görüntülerini elde ettik ve hatta stereosili arasındaki yaklaşık 5 nm çapında26,27olan bağlantıları görselleştirdik. Bu teknikle saç hücresi demeti görüntülemenin başarısı çeşitli faktörlere dayanır. İlk olarak, nanopipette akımının gürültüsü (varyansı), HPICM görüntüleme için mümkün olan en düşük setpoint’e izin vermek için mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Düşük bir setpoint, HPICM probunun stereosilia yüzeyini daha büyük bir mesafede ve prob yaklaşımına herhangi bir açıda “hissetmesini” sağlar ve şaşırtıcı bir şekilde HPICM görüntülemenin X-Y çözünürlüğünü iyileştirir (bkz. Tartışma). İkincisi, sistemdeki titreşimler ve sürüklenmeler 10 nm’nin altına düşürilmelidir, çünkü görüntüleme eserlerine doğrudan katkıda bulunurlar. Son olarak, HPICM probu ve numune aşaması, tek bir nanometre veya daha iyi bir hassasiyete sahip kalibre edilmiş geri bildirim kontrollü piezo aktüatörleri tarafından Z ve X-Y eksenlerinde hareket ettirilse de, nanopipette ucunun çapı akımın yayılmasını (algılama hacmi) ve dolayısıyla çözünürlüğü belirler (Şekil 1A). Bu nedenle, canlı saç hücrelerini görüntülemeden önce, yeterli pipetlerin çekilmesi, kalibrasyon örnekleri ile istenen çözünürlüğe ulaşılması ve kayıt sisteminde düşük gürültü elde edilmesi hayati önem taşır.
En az birkaç on yıldır, SICM tekniği ticari olarak mevcut değildir ve Imperial College’daki (İngiltere) Prof. Korchev’in önde gelen laboratuvarı ile dünyada sadece birkaç laboratuvar tarafından geliştirilmektedir. Son zamanlarda, hepsi orijinal HPICM ilkelerine dayanan çeşitli SICM sistemleri ticari olarak kullanılabilir hale geldi (bkz. Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, saç hücrelerindeki stereosilia demetlerini görüntüleme, kapalı “kullanıma hazır” sistemlerde teknik olarak zorlayıcı (hatta imkansız) birkaç özel değişiklik gerektirir. Bu nedenle, bazı bileşen tümleştirmesi gereklidir. HPICM kurulumu, daha sıkı titreşim ve sürüklenme gereksinimlerine ve HPICM probunun ve numunenin piezo güdümlü hareketine sahip bir yama kelepçe makinesini temsil ettiği için (Şekil 1D), bu entegrasyon yama sıkıştırma konusunda yetkin olan herhangi bir araştırmacı için nispeten kolaydır. Bununla birlikte, uygun bir geçmişi olmayan bir bilim adamının kesinlikle önce elektrofizyoloji konusunda eğitime ihtiyacı olacaktır. Görüntüleme hızını artırmak gibi kalan zorluklara rağmen (bkz. Tartışma), canlı saç hücrelerindeki stereosilia demetlerini zarar vermeden nano ölçekli çözünürlükle görüntüleyebildik.
Bu makale, özel sistemimizi kullanarak genç postnatal sıçan veya fare koklear eksplantlarında canlı işitsel saç hücresi demetlerinin başarılı HPICM görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunun. Entegre bileşenler Malzeme Tablosu‘nda listelenmiştir. Makalede ayrıca karşılaşılabilen yaygın sorunlar ve bunların nasıl giderileceği açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı HPICM görüntüleri elde etmek için kullanıcıların düşük gürültü ve düşük titreşim sistemi kurmaları ve uygun pipetler üretmeleri gerekir. Canlı hücre görüntülemeyi denemeden önce sistemin kararlılığını test etmek için AFM kalibrasyon standartlarının kullanılmasını şiddetle öneririz. Sistemin çözünürlüğü test edildikten sonra, kullanıcılar herhangi bir canlı hücre görüntüleme denemeden önce görüntüleme ayarlarını tanımak için Corti örneklerinin sabit …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projenin tüm aşamalarında uzun vadeli destek ve tavsiyeler için Prof. Yuri Korchev’e (Imperial College, UK) teşekkür ederiz. Dr. Pavel Novak ve Andrew Shevchuk’un (Imperial College, UK) yanı sıra Oleg Belov’a (Rusya Ulusal Odyoloji Araştırma Merkezi) yazılım geliştirme konusundaki yardımları için de teşekkür ederiz. Çalışma NIDCD/NIH (R01 DC008861 ve R01 DC014658 ila G.I.F.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Analog oscilloscope | B&K Precision | 2160C | Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach |
| AFM calibration standards | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system |
| Benchtop vibration Isolator | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Active vibration isolation |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | To be added to the bath solution to adjust osmolarity |
| Digitizer | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Multi-channel input/output digitizer |
| Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers. |
| Faraday cage | AMETEK/TMC | Type II | Required to shield electromagnetic interference |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Used as the dish for the chamber for the tissue |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Extracellular (bath) solution |
| Instrumentation amplifier | Brownlee Precision | Model 440 | Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation |
| Laser-based micropipette puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes. |
| Lebovitz's L-15, without phenol red | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Extracellular (bath) solution |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | Used for "course" positioning of the Z piezo actuator |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Inverted optical microscope |
| Patch amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette |
| Piezo amplifier (XY axes) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509.C2A | Amplification and PID control for XY piezo translation stage |
| Piezo amplifier (Z axis) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA |
| Plastic Coverslips | TED PELLA Inc | 26028 | Used in the fabrication of the chambers for the tissue |
| SICM controller & software* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd |
| Silicone elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue |
| Silicon glue | The Dow Chemical Company | 734 | Used to glue the different parts of the chamber for the tissue |
| Tungsten rod | A-M Systems | 717500 | Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue |
| XY piezo nanopositioner | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY translation stage with capacitive sensors |
| Z piezo nanopositioner | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring piezoactuator with a strain gage sensor |
| *Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems: NX12-Bio and NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original | |||
| HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically | |||
| challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one | |||
| modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. | |||
References
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
- Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
- Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
- Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
- Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
- Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
- Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
- Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
- Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).
- Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
- Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
- Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
- Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
- Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
- Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
- Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).
- Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
- Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. The scanning ion-conductance microscope. Science. 243 (4891), 641-643 (1989).
- Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
- Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
- Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
- Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
- Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
- Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
- Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
- Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
- Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
- Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).
