Burada, canlı işitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin nano ölçekli görüntülenmesini sağlayan temassız tarama probu tekniği olan Zıplayan Prob İyon İletkenliği Mikroskopisi (HPICM) için bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
İç kulak kılı hücreleri ses kaynaklı yer değiştirmeleri algılar ve bu uyaranları artan yükseklik sıralarına göre düzenlenmiş stereosiliden oluşan bir saç demetinde elektrik sinyallerine aktarır. Stereosilia saptırıldığında, mekanosensitive transdüksiyon kanallarına kuvvet aktaran stereosilia birbirine bağlı küçük (~5 nm çapında) hücre dışı uç bağlantılarını çekerler. Mechanotransdüksiyon on yıllardır canlı saç hücrelerinde çalışılsa da, stereosilisin uçlarındaki mekanotransdüksiyon makinelerinin işlevsel olarak önemli ultrayapısal detayları (uç bağlantı dinamikleri veya transdüksiyona bağımlı stereosilia remodeling gibi) hala sadece elektron mikroskopisi olan ölü hücrelerde çalışılabilir. Teorik olarak, atomik kuvvet mikroskopisi gibi tarama prob teknikleri stereosilia yüzeyini görselleştirmek için yeterli çözünürlüğe sahiptir. Bununla birlikte, görüntüleme modundan bağımsız olarak, atomik kuvvet mikroskopi probunun stereosilia demetiyle en ufak teması bile genellikle demete zarar verir. Burada canlı kemirgen işitsel saç hücrelerinin zıplayan prob iyon iletim mikroskopisi (HPICM) görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu temassız tarama prob tekniği, saç hücreleri gibi karmaşık bir topografya ile canlı hücrelerin yüzeyinin tek nanometre çözünürlüğüyle ve numuneyle fiziksel temas kurmadan zaman atlamalı görüntülenmesini sağlar. HPICM, pipete yakın çevredeki hücre yüzeyini tespit etmek için cam nanopipetten geçen bir elektrik akımı kullanırken, 3D konumlandırmalı piezoelektrik sistem yüzeyi tarar ve görüntüsünü oluşturur. HPICM ile stereosilia demetlerini ve stereosiliyi canlı işitsel saç hücrelerinde birbirine bağlayan bağlantıları farkedilir bir hasar olmadan birkaç saat boyunca görüntüleyebildik. HPICM kullanımının, işlevlerinin daha iyi anlaşılması için canlı saç hücrelerinin stereosilisinde ultrayapısal değişikliklerin doğrudan araştırılmasına izin vereceğini öngörüyoruz.
Giriş
İşitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin optik mikroskopi ile görselleştirilecek kadar büyük olmasına ve bir yama kelepçesi deneyinde canlı hücrelerde saptırılmasına rağmen, uç bağlantıları gibi transdüksiyon makinelerinin temel yapısal bileşenleri sadece ölü hücrelerdeki elektron mikroskopisi ile görüntülenebilir. Memeli işitsel saç hücrelerinde, transdüksiyon makineleri uç bağlantılarının alt uçlarında, yani daha kısa sıra stereosili1'in uçlarında bulunur ve stereosilia2,3'ünuçlarındaki sinyal yoluyla yerel olarak düzenlenir. Ancak stereosilinin küçük boyutları nedeniyle bu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki öneriler doğrultusunda gerçekleştirildi. Tüm hayvan prosedürleri Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol 00903M2005).
1. Nanopipettes imalatı ve testi
- Mikropipette puller'da, yaklaşık 50-70 nm iç uç çaplarına karşılık gelen 200 ila 400 MΩ arasında bir dirence sahip pipetler elde etmek için bir program oluşturun. Parametreler mikropipette puller'a bağlı olacaktır. Esnek olmayan ince uçlu kısa pipetler elde etmek için, çekmenin çalışma kılavuzunu kontrol ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu makalede sunulan protokol, karmaşık topografya ile canlı hücreleri görselleştirmek için kullanılabilir. Bu adımları izleyerek, rutin olarak canlı sıçan işitsel saç hücresi demetlerinin görüntülerini elde ediyoruz (Şekil 6B, D). SEM görüntülerle karşılaştırıldığında daha düşük X-Y çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, HPICM görüntülerimiz farklı stereosiliya sıralarını, stereosilia ipuçlarının şeklini ve hatta bitişik stereosiliyi(Şekil 6F)bağlay.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Başarılı HPICM görüntüleri elde etmek için kullanıcıların düşük gürültü ve düşük titreşim sistemi kurmaları ve uygun pipetler üretmeleri gerekir. Canlı hücre görüntülemeyi denemeden önce sistemin kararlılığını test etmek için AFM kalibrasyon standartlarının kullanılmasını şiddetle öneririz. Sistemin çözünürlüğü test edildikten sonra, kullanıcılar herhangi bir canlı hücre görüntüleme denemeden önce görüntüleme ayarlarını tanımak için Corti örneklerinin sabit organını görüntülemeyi düşünebilirler.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların rakip çıkarları yok.
Teşekkürler
Projenin tüm aşamalarında uzun vadeli destek ve tavsiyeler için Prof. Yuri Korchev'e (Imperial College, UK) teşekkür ederiz. Dr. Pavel Novak ve Andrew Shevchuk'un (Imperial College, UK) yanı sıra Oleg Belov'a (Rusya Ulusal Odyoloji Araştırma Merkezi) yazılım geliştirme konusundaki yardımları için de teşekkür ederiz. Çalışma NIDCD/NIH (R01 DC008861 ve R01 DC014658 ila G.I.F.) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Analog osiloskop | B & Nanopipet | akımının ve Z ekseni yaklaşımının gerçek zamanlı izlenmesi için K | 2160C |
| AFM kalibrasyon standartları | TED PELLA, Inc | HS-100MG; HS-20MG | Bu 100 ve 20 nm kalibrasyon standartları, HPICM sisteminin performansını test etmek için kullanılır. |
| Tezgah üstü titreşim İzolatörü | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Aktif titreşim izolasyonu |
| Borosilikat cam kılcal damarlar | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Nanopipetler için borosilikat cam kılcal damarlar |
| D-(+)-Glukoz | Sigma-Aldrich | G8270 | Ozmolariteyi ayarlamak için banyo çözümüne eklenecek |
| Sayısallaştırıcı | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Çok kanallı giriş/çıkış sayısallaştırıcı |
| Z hareketi için hızlı analog Oransal-İntegral-Türev (PID) kontrolü | Standford Araştırma Sistemleri | SIM900, SIM960, SIM980 | Z hareketi için harici bir PID kontrol cihazına entegre edilmiş enstrümantasyon modülleri. Genellikle ticari piezo amplifikatörlerde uygulanmayan hızlı bir yanıt gerektirir. |
| Faraday kafesi | AMETEK / TMC | Tip II | Elektromanyetik girişimi korumak için gereklidir |
| Cam alt tabak | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Doku için hazne için çanak olarak kullanılır |
| Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Hücre dışı (banyo) çözeltisi |
| Enstrümantasyon amplifikatörü | Brownlee Hassas | Model 440 | Enstrümantasyon amplifikatörü, gerekli ofsetleri, filtrelemeyi ve ikincil büyütme veya zayıflamayı sağlar |
| Lazer tabanlı mikropipet çektirme | Sutter Instrument | P-2000/G | Nanopipetleri imal etmek için mikropipet çektirmesi. Keskin kuvars pipetler için lazer gereklidir. |
| Lebovitz'in L-15'i, fenol kırmızısı Gibco olmadan | , Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Hücre dışı (banyo) çözelti |
| Mikromanipülatör | Scientifica | PatchStar | Z piezo aktüatörünün "rota" konumlandırması için kullanılır |
| Mikroskop | Nikon | Eclipse TS100 | Ters optik mikroskop |
| Yama amplifikatörü | Moleküler Cihazlar | Axopatch 200B | Yama kelepçesi amplifikatörü, nanopipet |
| Piezo amplifikatörü (XY eksenleri) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509 aracılığıyla akımı ölçer. | XY piezo çeviri aşaması için C2A Amplifikasyon ve PID kontrolü |
| Piezo amplifikatör (Z ekseni) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Maksimum 1.6 nA akım elde etmek için paralel olarak ENT 400 güç kaynağı ve iki ENT 800 amplifikatörden oluşan özel amplifikatör |
| Plastik Lameller | TED PELLA Inc | 26028 | Doku odalarının imalatında kullanılır |
| SICM denetleyici ve yazılım | *Ionscope, Birleşik Krallık (ionscope.com) | N/ | A Innovative Integration Ltd'den SBC6711 dijital sinyal işleme kartına dayalı özel denetleyici |
| Silikon elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Esnek cam elyafları doku haznesine tutturmak için kullanılır |
| Silikon yapıştırıcı | Dow Kimya Şirketi | 734 | Doku için odanın farklı kısımlarını yapıştırmak için kullanılır |
| Tungsten çubuk | A-M Sistemleri | 717500 | Diş ipi iplerini doku haznesinde tutmak için kullanılır |
| XY piezo nano konumlandırıcı | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | Kapasitif sensörlü XY çeviri aşaması |
| Z piezo nano konumlandırıcı | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Gerinim ölçer sensörlü halka piezoaktüatör |
| *Ionscope artık ayrı SICM kontrolörleri satmamaktadır. Birkaç başka ticari sistem daha var: NX12-Bio ve NX10 SICM, | |||
| Park Sistemleri, Kore ve ICAPPIC Limited, İngiltere'den (icappic.com) SICM modülleri. Tüm bu sistemler orijinal | |||
| HPICM ilkeleri. Bununla birlikte, saç hücrelerindeki stereocilia demetlerinin görüntülenmesi, teknik olarak birkaç özel değişiklik gerektirir | |||
| kapalı alanda zorlu (hatta imkansız) " Gitmeye hazır" Ionscope veya NX12-Bio/NX10 gibi sistemler. Şu anda sadece bir tane var | |||
| herhangi bir SICM/HPICM deneyine uyacak esnekliğe sahip ancak bazı bileşen entegrasyonu gerektiren modüler sistem (ICAPPIC); |
Kaynaklar
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
