立体纤毛束成像在活哺乳动物听觉毛细胞中的纳米级分辨率
Summary
在这里，我们提出了跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）的方案，这是一种非接触式扫描探针技术，允许对活听觉毛细胞中的立体纤毛束进行纳米级成像。
Abstract
内耳毛细胞检测声音诱导的位移，并将这些刺激转化为发束中的电信号，该发束由立体纤毛组成，这些发束排列成高度增加的行。当立体纤毛偏转时，它们会拉扯微小的（直径约5nm）细胞外尖端连接，这些细胞外尖端链接相互连接立体纤毛，从而将力传递到机械敏感转导通道。尽管机械纵促在活毛细胞中已经研究了几十年，但立体纤毛尖端的机电转导机制在功能上重要的超微结构细节（例如尖端链接动力学或转导依赖性立体纤毛重塑）仍然只能在具有电子显微镜的死细胞中进行研究。从理论上讲，扫描探针技术，如原子力显微镜，具有足够的分辨率来可视化立体纤毛的表面。然而，与成像模式无关，即使原子力显微镜探针与立体纤毛束最轻微的接触通常也会损坏束。在这里，我们提出了活啮齿动物听觉毛细胞的跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）成像的详细方案。这种非接触式扫描探针技术允许对具有复杂形貌的活细胞表面进行延时成像，如毛细胞，具有单纳米分辨率，并且不与样品进行物理接触。HPICM使用通过玻璃纳米移液器的电流来检测移液器附近的细胞表面，而3D定位压电系统扫描表面并生成其图像。使用HPICM，我们能够对立体纤毛束和连接活听觉毛细胞中的立体纤毛束和连接立体纤毛细胞数小时，而不会造成明显的损伤。我们预计，HPICM的使用将允许直接探索活毛细胞立体纤毛的超微结构变化，以更好地了解其功能。
Introduction
尽管听觉毛细胞中的立体纤毛束足够大，可以通过光学显微镜观察，并在膜片钳实验中在活细胞中偏转，但转导机制的基本结构组件（例如尖端链接）只能用死细胞中的电子显微镜成像。在哺乳动物听觉毛细胞中，转导机械位于尖端链接的下端，即在短行立体纤毛1的尖端，并通过立体纤毛2，3的尖端的信号传导局部调节。然而，由于立体纤毛细胞的小尺寸，活毛细胞中该位置的表面结构的无标记成像是不可能的。
哺乳动物耳蜗有两种类型的听觉感觉细胞：内毛细胞和外毛细胞。在内毛细胞中，与外毛细胞中的发丝相比，立体纤毛更长，更厚4。第一排和第二排立体纤毛在小鼠或大鼠内毛细胞中的直径为300-500nm。由于光的衍射，使用无标记光学显微镜可以达到的最大分辨率约为200nm。因此，使用光学显微镜观察内毛细胞束第一排和第二排内的单个立体纤毛相对容易。相反，内毛细胞中较短的行立体纤毛和外毛细胞的所有立体纤毛的直径约为100-200nm，并且无法用光学显微镜5可视化。尽管最近在超分辨率成像方面取得了进展，但这一基本限制在任何光学无标记成像中都存在。目前市售的所有超分辨技术都需要某种荧光分子6，这限制了它们的应用。除了由于需要特定的荧光标记分子而受到限制之外，暴露在强光照射下已被证明会诱导细胞损伤并可能影响细胞过程，这在研究活细胞时是一个很大的缺点7。
我们目前对毛细胞立体纤毛束的超微结构细节的了解主要是通过各种电子显微镜（EM）技术获得的，例如扫描电子显微镜（SEM），透射电子显微镜（TEM），冷冻断裂EM，以及最近使用3D技术，例如使用聚焦离子束或冷冻电镜断层扫描8，9，10，11，12，13， 14，15，16 。不幸的是，所有这些EM技术都需要对样品进行化学或冷冻固定。根据现象的时间尺度，这一要求使得对立体纤毛尖端的动态过程的研究要么不可能，要么非常劳动密集型。
用原子力显微镜（AFM）对活毛细胞的毛束进行成像的努力有限，17，18。由于AFM在生理溶液中起作用，因此从理论上讲，它可以可视化活毛细胞立体纤毛束随时间变化的动态变化。问题在于高分辨率AFM的原理，这意味着AFM探头和样品之间存在一定的物理接触，即使在破坏性最小的”攻丝”模式19中也是如此。当AFM探针遇到立体纤毛时，它通常会撞到它，破坏发束的结构。因此，这种技术不适合可视化活的，甚至是固定的毛细胞束17，18。通过使用仅对样品20表面施加流体动力的大型球形AFM探头，可以部分缓解该问题。然而，即使这样的探针非常适合测试样品21的机械性能，它在对Corti22的器官成像时仅提供亚微米级的分辨率，并且仍然对样品施加对于高度敏感的立体纤毛束来说可能是巨大的力。
扫描离子电导显微镜（SICM）是扫描探针显微镜的一种版本，它使用填充有导电溶液23的玻璃移液器探针。当移液器接近细胞并且通过移液器的电流减少时，SICM会检测表面。由于这在接触细胞之前就已经发生，因此SICM非常适合在生理溶液24中对活细胞进行非接触式成像。SICM的最佳分辨率约为单纳米，这允许在活细胞25的质膜上解析单个蛋白质复合物。然而，与其他扫描探针技术类似，SICM只能对相对平坦的表面进行成像。我们通过发明跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）26克服了这一限制，其中纳米移液器在每个成像点接近样品（图1A）。使用HPICM，我们能够以纳米级分辨率27对活听觉毛细胞中的立体纤毛束进行成像。
这种技术的另一个基本优点是HPICM不仅仅是一种成像工具。与其他扫描探针技术相比，HPICM / SICM探针是一种广泛用于细胞生理学的电极，用于各种刺激的电记录和局部传递。离子通道活性通常不会干扰HPICM成像，因为通过HPICM探针的总电流比最大离子通道25产生的细胞外电流大几个数量级。然而，HPICM允许在感兴趣的结构上精确定位纳米移液器，以及随后从该结构28进行单通道膜片钳记录。这就是我们如何获得外毛细胞立体纤毛29尖端的单通道活动的第一个初步记录。值得一提的是，由于细胞外介质的巨大分流，即使通过纳米移液管的大电流也无法在质膜上产生电位的显着变化。然而，单个离子通道可以通过液体流过纳米移液器30 或通过局部施用激动剂31以化学方式被机械激活。
在HPICM中，当纳米移液器在一个点上依次接近样品，缩回，然后向横向移动以重复接近时，就会生成图像（图1A）。膜片钳放大器不断向移液器中的AgCl线施加电压（图1B），以在浴液中产生~1 nA的电流。当移液器远离电池表面时，该电流的值被确定为参考电流（Iref，图1C）。然后，移液器在Z轴上移动以接近样品，直到电流减少用户预定义的量（设定值），通常为Iref的0.2%-1%（图1C，顶部迹线）。然后，系统将此时的Z值保存为样品的高度，以及该成像点的X和Y坐标。然后，移液器以用户定义的速度（通常为700-900 nm / ms）从表面缩回（图1C，底部迹线）。在缩回后，移液器（或者，在我们的例子中，样品 – 见图1B）被横向移动到下一个成像点，获得新的参考电流值，移液器再次接近样品，重复该过程。移液器的X-Y运动在直置显微镜设置中是首选，通常用于记录毛细胞机械转导电流。在这种情况下，HPICM探针不是从顶部以32的角度接近毛细胞束。然而，HPICM成像的最佳分辨率是在倒置显微镜设置中实现的（图1A，B），其中样品在X-Y方向上的运动与纳米移液器的Z运动脱耦合，从而消除了潜在的机械伪影。
使用HPICM，我们获得了小鼠和大鼠内外毛细胞立体纤毛束的地形图像，甚至可视化了直径约为5nm的立体纤毛之间的联系26，27。使用这种技术进行毛细胞束成像的成功取决于几个因素。首先，纳米移液器电流的噪声（方差）应尽可能小，以便为HPICM成像提供尽可能低的设定点。低设定值允许HPICM探针在更远的距离和与探针方法的任何角度”感知”立体纤毛表面，并且令人惊讶的是，提高了HPICM成像的X-Y分辨率（参见讨论）。其次，系统中的振动和漂移应减少到小于10nm，因为它们直接导致成像伪影。最后，即使HPICM探头和样品台通过具有单个纳米或更高精度的校准反馈控制压电致动器在Z轴和X-Y轴上移动，纳米移液器尖端的直径也决定了电流的扩散（传感体积）和分辨率（图1A）。因此，在对活毛细胞进行成像之前，至关重要的是要拉动足够的移液器，用校准样品达到所需的分辨率，并在记录系统中实现低噪声。
至少几十年来，SICM技术尚未商业化，世界上只有少数几个实验室与帝国理工学院（英国）的Korchev教授的领先实验室一起开发。最近，几种SICM系统开始商业化（见 材料表），所有这些都基于原始的HPICM原理。然而，对毛细胞中的立体纤毛束进行成像需要进行一些定制修改，这些修改在封闭的”准备就绪”系统中在技术上具有挑战性（甚至是不可能的）。因此，需要一些组件集成。由于HPICM设置代表了一个具有更严格的振动和漂移要求以及HPICM探头和样品的压电驱动运动的膜片钳装置（图1D），因此对于任何精通膜片钳的研究人员来说，这种集成都相对容易。然而，一个没有适当背景的科学家肯定首先需要一些电生理学培训。尽管仍然存在挑战，例如提高成像速度（参见 讨论），但我们已经能够以纳米级分辨率对活毛细胞中的立体纤毛束进行成像而不会损坏它们。
本文提出了一个详细的方案，使用我们的定制系统对年轻的产后大鼠或小鼠耳蜗外植体中的活听觉毛细胞束进行成功的HPICM成像。集成组件列在 材料表。本文还介绍了可能遇到的常见问题以及如何排除故障。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了获得成功的HPICM图像，用户需要建立一个低噪音和低振动的系统，并制造合适的移液器。我们强烈建议在尝试进行任何活细胞成像之前使用AFM校准标准品来测试系统的稳定性。一旦测试了系统的分辨率，用户就可以考虑对Corti样本的固定器官进行成像，以熟悉成像设置，然后再尝试任何活细胞成像。
成像的最佳设定点因移液器而异，这取决于其吸头的各个形状（在电子显?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Yuri Korchev教授（英国帝国理工学院）在项目的所有阶段提供的长期支持和建议。我们还感谢Pavel Novak博士和Andrew Shevchuk博士（英国帝国理工学院）以及Oleg Belov博士（俄罗斯国家听力学研究中心）在软件开发方面的帮助。该研究得到了NIDCD / NIH的支持（R01 DC008861和R01 DC014658至G.I.F.）。
Materials
| Analog oscilloscope | B&K Precision | 2160C | Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach |
| AFM calibration standards | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system |
| Benchtop vibration Isolator | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Active vibration isolation |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | To be added to the bath solution to adjust osmolarity |
| Digitizer | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Multi-channel input/output digitizer |
| Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers. |
| Faraday cage | AMETEK/TMC | Type II | Required to shield electromagnetic interference |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Used as the dish for the chamber for the tissue |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Extracellular (bath) solution |
| Instrumentation amplifier | Brownlee Precision | Model 440 | Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation |
| Laser-based micropipette puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes. |
| Lebovitz's L-15, without phenol red | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Extracellular (bath) solution |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | Used for "course" positioning of the Z piezo actuator |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Inverted optical microscope |
| Patch amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette |
| Piezo amplifier (XY axes) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509.C2A | Amplification and PID control for XY piezo translation stage |
| Piezo amplifier (Z axis) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA |
| Plastic Coverslips | TED PELLA Inc | 26028 | Used in the fabrication of the chambers for the tissue |
| SICM controller & software* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd |
| Silicone elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue |
| Silicon glue | The Dow Chemical Company | 734 | Used to glue the different parts of the chamber for the tissue |
| Tungsten rod | A-M Systems | 717500 | Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue |
| XY piezo nanopositioner | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY translation stage with capacitive sensors |
| Z piezo nanopositioner | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring piezoactuator with a strain gage sensor |
| *Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems: NX12-Bio and NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original | |||
| HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically | |||
| challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one | |||
| modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. | |||
References
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