Summary
Burada, canlı işitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin nano ölçekli görüntülenmesini sağlayan temassız tarama probu tekniği olan Zıplayan Prob İyon İletkenliği Mikroskopisi (HPICM) için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
İç kulak kılı hücreleri ses kaynaklı yer değiştirmeleri algılar ve bu uyaranları artan yükseklik sıralarına göre düzenlenmiş stereosiliden oluşan bir saç demetinde elektrik sinyallerine aktarır. Stereosilia saptırıldığında, mekanosensitive transdüksiyon kanallarına kuvvet aktaran stereosilia birbirine bağlı küçük (~5 nm çapında) hücre dışı uç bağlantılarını çekerler. Mechanotransdüksiyon on yıllardır canlı saç hücrelerinde çalışılsa da, stereosilisin uçlarındaki mekanotransdüksiyon makinelerinin işlevsel olarak önemli ultrayapısal detayları (uç bağlantı dinamikleri veya transdüksiyona bağımlı stereosilia remodeling gibi) hala sadece elektron mikroskopisi olan ölü hücrelerde çalışılabilir. Teorik olarak, atomik kuvvet mikroskopisi gibi tarama prob teknikleri stereosilia yüzeyini görselleştirmek için yeterli çözünürlüğe sahiptir. Bununla birlikte, görüntüleme modundan bağımsız olarak, atomik kuvvet mikroskopi probunun stereosilia demetiyle en ufak teması bile genellikle demete zarar verir. Burada canlı kemirgen işitsel saç hücrelerinin zıplayan prob iyon iletim mikroskopisi (HPICM) görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu temassız tarama prob tekniği, saç hücreleri gibi karmaşık bir topografya ile canlı hücrelerin yüzeyinin tek nanometre çözünürlüğüyle ve numuneyle fiziksel temas kurmadan zaman atlamalı görüntülenmesini sağlar. HPICM, pipete yakın çevredeki hücre yüzeyini tespit etmek için cam nanopipetten geçen bir elektrik akımı kullanırken, 3D konumlandırmalı piezoelektrik sistem yüzeyi tarar ve görüntüsünü oluşturur. HPICM ile stereosilia demetlerini ve stereosiliyi canlı işitsel saç hücrelerinde birbirine bağlayan bağlantıları farkedilir bir hasar olmadan birkaç saat boyunca görüntüleyebildik. HPICM kullanımının, işlevlerinin daha iyi anlaşılması için canlı saç hücrelerinin stereosilisinde ultrayapısal değişikliklerin doğrudan araştırılmasına izin vereceğini öngörüyoruz.
Introduction
İşitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin optik mikroskopi ile görselleştirilecek kadar büyük olmasına ve bir yama kelepçesi deneyinde canlı hücrelerde saptırılmasına rağmen, uç bağlantıları gibi transdüksiyon makinelerinin temel yapısal bileşenleri sadece ölü hücrelerdeki elektron mikroskopisi ile görüntülenebilir. Memeli işitsel saç hücrelerinde, transdüksiyon makineleri uç bağlantılarının alt uçlarında, yani daha kısa sıra stereosili1'in uçlarında bulunur ve stereosilia2,3'ünuçlarındaki sinyal yoluyla yerel olarak düzenlenir. Ancak stereosilinin küçük boyutları nedeniyle bu konumdaki yüzey yapılarının canlı saç hücrelerinde etiketsiz görüntülenmesi mümkün değildir.
Memeli koklea iki tür işitsel duyusal hücreye sahiptir: iç ve dış saç hücreleri. İç saç hücrelerinde, stereosili dış saç hücrelerindekilere kıyasla daha uzun ve kalındır4. Stereosilinin birinci ve ikinci sırası fare veya sıçan iç saç hücrelerinde 300-500 nm çapındadır. Işığın kırınımı nedeniyle, etiketsiz optik mikroskopi ile elde edilebilen maksimum çözünürlük yaklaşık 200 nm'dir. Bu nedenle, iç saç hücresi demetinin birinci ve ikinci sıraları içindeki bireysel stereosililerin görselleştirilmesi optik mikroskopi ile nispeten kolaydır. Buna karşılık, iç saç hücrelerinde daha kısa sıra stereosili ve dış saç hücrelerinin tüm stereosilileri 100-200 nm civarında çaplara sahiptir ve optik mikroskopi ile görselleştirilemez5. Süper çözünürlüklü görüntülemedeki son gelişmelere rağmen, bu temel sınırlama herhangi bir optik etiketsiz görüntülemede devam eder. Mevcut tüm ticari süper çözünürlük teknikleri bir tür floresan molekül gerektirir6, uygulamalarını sınırlar. Belirli floresan etiketli moleküllere duyulan ihtiyaç nedeniyle sınırlamalara ek olarak, yoğun ışık ışınlanmasına maruz kalmanın hücresel hasara neden olduğu ve hücresel süreçleri etkileyebileceği gösterilmiştir, bu da canlı hücreleri incelerken büyük bir dezavantajdır7.
Saç hücresi stereosilia demetlerinin ultrayapısal detayları hakkındaki güncel bilgimiz çoğunlukla çeşitli elektron mikroskopisi (EM) teknikleri ile elde edilmiştir, taramalı elektron mikroskopisi (SEM), iletim elektron mikroskopisi (TEM), donma-kırılma EM ve son zamanlarda odaklanmış iyon ışını veya kriyo-EM tomografisi ile seri kesitleme gibi 3D tekniklerle 8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Ne yazık ki, tüm bu EM teknikleri numunenin kimyasal veya kriyofixasyonunu gerektirir. Fenomenin zaman ölçeğine bağlı olarak, bu gereksinim stereosilianın uçlarındaki dinamik süreçlerin incelenmesini imkansız veya çok emek yoğun hale getirir.
Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM)17,18ile canlı saç hücrelerinin saç demetlerini görüntüleyemek için sınırlı çaba sarf edilmiştir. AFM fizyolojik çözümlerle çalıştığından, teoride, zaman içinde canlı saç hücrelerinin stereosilia demetlerindeki dinamik değişiklikleri görselleştirebilir. Sorun, AFM probu ile numune arasında belirli fiziksel teması ima eden yüksek çözünürlüklü AFM ilkelerinde yatmaktadır, hatta en az zarar veren "dokunma" modunda19. AFM probu bir stereosiyumla karşılaştığında, genellikle ona çarpar ve saç demetinin yapısına zarar verir. Sonuç olarak, bu teknik canlı, hatta sabit saç hücreleri demetlerini görselleştirmek için uygun değildir17,18. Numunenin yüzeyine sadece hidrodinamik kuvvetler uygulayan büyük bir top şeklindeki AFM probu kullanılarak sorun kısmen hafifletilebilir20. Bununla birlikte, böyle bir prob numune21'inmekanik özelliklerini test etmek için ideal olsa da, Corti22'nin organını görüntülerken sadece bir mikrometre altı çözünürlük sağlar ve yine de numune için son derece hassas stereosilia demetleri için önemli olabilecek bir kuvvet uygular.
Taramalı iyon iletim mikroskopisi (SICM), iletken bir çözelti23ile doldurulmuş bir cam pipet probu kullanan tarama probu mikroskopisinin bir sürümüdür. SICM, pipet hücreye yaklaştığında yüzeyi algılar ve pipetten geçen elektrik akımı azalır. Bu hücreye dokunmadan önce iyi gerçekleştiğinden, SICM fizyolojik çözelti24'tecanlı hücrelerin temassız görüntülenmesi için idealdir. SICM'nin en iyi çözünürlüğü, canlı bir hücrenin plazma zarında bireysel protein komplekslerinin çözülmesini sağlayan tek nanometreler sırasınagöredir 25. Bununla birlikte, diğer tarama prob tekniklerine benzer şekilde, SICM yalnızca nispeten düz yüzeyleri görüntüleyebilmektedir. Nanopipette'in her görüntüleme noktasında numuneye yaklaştığı atlamalı prob iyon iletkenlik mikroskobu (HPICM)26icat ederek bu sınırlamanın aşısını aştık (Şekil 1A). HPICM kullanarak, stereosilia demetlerini nano ölçekli çözünürlük27ile canlı işitsel saç hücrelerinde görüntüleyebildik.
Bu tekniğin bir diğer temel avantajı, HPICM'nin sadece bir görüntüleme aracı olmamasıdır. Diğer tarama prob tekniklerinin aksine, HPICM/SICM probu, elektrik kayıtları ve çeşitli uyaranların yerel teslimatı için hücre fizyolojisinde yaygın olarak kullanılan bir elektrotdur. İyon kanalı etkinliği genellikle HPICM görüntülemesini engellemez, çünkü HPICM probu aracılığıyla toplam akım, en büyük iyon kanalları25tarafından oluşturulan hücre dışı akımdan daha büyük birkaç büyüklük sırasıdır. Bununla birlikte, HPICM nanopipette'in ilgi çekici bir yapı üzerinde hassas bir şekilde konumlandırılmasına ve daha sonra bu yapıdan tek kanallı yama kelepçesi kaydına izin verir28. Dış saç hücresi stereosili29'unuçlarında tek kanallı aktivitenin ilk ön kayıtlarını bu şekilde elde ettik. Nanopipetten geçen büyük bir akımın bile, hücre dışı ortamın muazzam elektriksel şantları nedeniyle plazma zarı boyunca potansiyelde önemli değişiklikler üretemeyeceğini belirtmek gerekir. Bununla birlikte, bireysel iyon kanalları nanopipette30'dan sıvı akışı veya bir agonist31'inlokal uygulaması ile kimyasal olarak mekanik olarak aktive edilebilir.
HPICM'de görüntü, bir nanopipette bir noktada örneğe ardışık olarak yaklaştığında, geri çekildiğinde ve yaklaşımı tekrarlamak için yanal yönde hareket ettiğinde oluşturulur (Şekil 1A). Bir yama kelepçesi amplifikatörü, banyo çözeltisinde~1 nAakımı oluşturmak için pipetteki bir AgCl teline ( Şekil 1B ) sürekli voltaj uygular. Pipet hücre yüzeyinden uzaktayken bu akımın değeri referans akım olarak belirlenir (Iref, Şekil 1C). Daha sonra pipet, akım kullanıcı (setpoint) tarafından önceden tanımlanmış bir miktar azaltılana kadar örneğe yaklaşmak için Z ekseninde hareket eder, genellikle I hakeminin% 0.2-1'i (Şekil 1C, üst iz). Sistem daha sonra bu görüntüleme noktasının X ve Y koordinatlarıyla birlikte numunenin yüksekliği olarak şu anda Z değerini kaydeder. Daha sonra pipet, genellikle 700-900 nm/ms olmak üzere kullanıcı tarafından tanımlanan bir hızda yüzeyden(Şekil 1C, alt iz) geri çekilir. Geri çekildikten sonra, pipet (veya bizim durumumuzda örnek - bkz. Şekil 1B)yanal olarak bir sonraki görüntüleme noktasına taşınır, yeni bir referans akım değeri elde edilir ve pipet bir kez daha numuneye yaklaşır ve işlemi tekrarlar. Pipet X-Y hareketi, tipik olarak saç hücresi mekanotransdüksiyon akımlarının kayıtları için kullanılan dik bir mikroskop kurulumunda tercih edilir. Bu ayarda, HPICM probu saç hücresi demetlerine yukarıdan değil,32açıyla yaklaşır. Bununla birlikte, HPICM görüntülemenin en iyi çözünürlüğü, numunenin X-Y yönlerinde hareketinin nanopipette'in Z hareketinden birleştiği ve böylece potansiyel mekanik eserlerin ortadan kaldırıldığı ters bir mikroskop kurulumunda (Şekil 1A, B) elde edilir.
HPICM kullanarak, fare ve sıçan iç ve dış saç hücresi stereosilia demetlerinin topografik görüntülerini elde ettik ve hatta stereosili arasındaki yaklaşık 5 nm çapında26,27olan bağlantıları görselleştirdik. Bu teknikle saç hücresi demeti görüntülemenin başarısı çeşitli faktörlere dayanır. İlk olarak, nanopipette akımının gürültüsü (varyansı), HPICM görüntüleme için mümkün olan en düşük setpoint'e izin vermek için mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Düşük bir setpoint, HPICM probunun stereosilia yüzeyini daha büyük bir mesafede ve prob yaklaşımına herhangi bir açıda "hissetmesini" sağlar ve şaşırtıcı bir şekilde HPICM görüntülemenin X-Y çözünürlüğünü iyileştirir (bkz. Tartışma). İkincisi, sistemdeki titreşimler ve sürüklenmeler 10 nm'nin altına düşürilmelidir, çünkü görüntüleme eserlerine doğrudan katkıda bulunurlar. Son olarak, HPICM probu ve numune aşaması, tek bir nanometre veya daha iyi bir hassasiyete sahip kalibre edilmiş geri bildirim kontrollü piezo aktüatörleri tarafından Z ve X-Y eksenlerinde hareket ettirilse de, nanopipette ucunun çapı akımın yayılmasını (algılama hacmi) ve dolayısıyla çözünürlüğü belirler (Şekil 1A). Bu nedenle, canlı saç hücrelerini görüntülemeden önce, yeterli pipetlerin çekilmesi, kalibrasyon örnekleri ile istenen çözünürlüğe ulaşılması ve kayıt sisteminde düşük gürültü elde edilmesi hayati önem taşır.
En az birkaç on yıldır, SICM tekniği ticari olarak mevcut değildir ve Imperial College'daki (İngiltere) Prof. Korchev'in önde gelen laboratuvarı ile dünyada sadece birkaç laboratuvar tarafından geliştirilmektedir. Son zamanlarda, hepsi orijinal HPICM ilkelerine dayanan çeşitli SICM sistemleri ticari olarak kullanılabilir hale geldi (bkz. Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, saç hücrelerindeki stereosilia demetlerini görüntüleme, kapalı "kullanıma hazır" sistemlerde teknik olarak zorlayıcı (hatta imkansız) birkaç özel değişiklik gerektirir. Bu nedenle, bazı bileşen tümleştirmesi gereklidir. HPICM kurulumu, daha sıkı titreşim ve sürüklenme gereksinimlerine ve HPICM probunun ve numunenin piezo güdümlü hareketine sahip bir yama kelepçe makinesini temsil ettiği için (Şekil 1D), bu entegrasyon yama sıkıştırma konusunda yetkin olan herhangi bir araştırmacı için nispeten kolaydır. Bununla birlikte, uygun bir geçmişi olmayan bir bilim adamının kesinlikle önce elektrofizyoloji konusunda eğitime ihtiyacı olacaktır. Görüntüleme hızını artırmak gibi kalan zorluklara rağmen (bkz. Tartışma), canlı saç hücrelerindeki stereosilia demetlerini zarar vermeden nano ölçekli çözünürlükle görüntüleyebildik.
Bu makale, özel sistemimizi kullanarak genç postnatal sıçan veya fare koklear eksplantlarında canlı işitsel saç hücresi demetlerinin başarılı HPICM görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunun. Entegre bileşenler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Makalede ayrıca karşılaşılabilen yaygın sorunlar ve bunların nasıl giderileceği açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki öneriler doğrultusunda gerçekleştirildi. Tüm hayvan prosedürleri Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol 00903M2005).
1. Nanopipettes imalatı ve testi
- Mikropipette puller'da, yaklaşık 50-70 nm iç uç çaplarına karşılık gelen 200 ila 400 MΩ arasında bir dirence sahip pipetler elde etmek için bir program oluşturun. Parametreler mikropipette puller'a bağlı olacaktır. Esnek olmayan ince uçlu kısa pipetler elde etmek için, çekmenin çalışma kılavuzunu kontrol edin.
- Dolguyu kolaylaştırmak için dış/iç çapları 1/0,58 mm olan borosilikat cam kılcal damarları ve iç filament kullanın. Pipet uzunluğu çok önemlidir, çünkü pipet lateral mekanik rezonansın sıklığını belirler. Pipet ne kadar uzunsa, rezonans frekansı o kadar düşüktür ve bu rezonansı önlemek o kadar zordur.
NOT: Kullanıcı, tutucunun kabul edebileceği en kısa pipetleri üretmeye çalışmalıdır. Bu deneydeki nanoipletlerin uzunluğu genellikle 15-25 mm'dir(Şekil 2A). - Nanopipette'i orta noktasına kadar (Şekil 2A) Leibovitz'in L-15'i veya Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile 20 mM D-glikozla (ozmolariteyi ayarlamak için) bir banyo çözeltisi ile doldurun. Olası eserlerden kaçınmak için, kayıtlar için banyoda kullanılacak aynı çözeltiyi kullanın.
- 10x büyütmeli optik mikroskop kullanarak, pipet ucunda kabarcık olup olmadığını kontrol edin (Şekil 2B). Kabarcıklar mevcut akışı engeller. Deneyden birkaç saat önce çekilen pipetlerdeki kabarcıkları çıkarmak daha zordur. Bu nedenle, her deneyde yeni pipetlerin çekilmesi önerilir.
- Pipet kabarcıklardan arındırdıktan sonra, HPICM pipet tutucusuna monte edin (Şekil 2C).
- Numuneyi (doku veya kalibrasyon standardı) özel yapım odaya yerleştirin ve yukarıda belirtilen banyo çözeltisinin 4 mL'lik kısmını ekleyin.
- Özel yapım hazneyi HPICM aşamasına yerleştirin ve çözeltiye zemin elektrotünü sonun.
- Patch kelepçe amplifikatörü ile pipetlere uygulanan voltajın sıfır olduğundan emin olun.
- Pipet sıvıya temas edene kadar Z'de hareket ettinin.
- Amplifikatör uzaklığını sıfıra ayarlayın ve pipet akımını kontrol etmek için +100 mV ekleyin.
- Ohm yasasına dayanarak pipet direncini ve çapını hesaplayın:
R = V/I
burada R dirençtir (MOhm), V nanopipette (mV) uygulanan voltajdır ve ben nanopipetten (nA) akan akımdır.- Pipet iç çapını aşağıdaki formül12'yegöre başka bir yerde açıklandığı gibi hesaplayın:
Kimlikİpucu = 1000/ √R
NOT: İdeal direnç değeri 200 ila 400 MΩ arasındadır. 400 MΩ'dan daha yüksek bir direndirmeye sahip pipetler, küçük boyutları (< 50 nm iç çapı) nedeniyle kararsız bir akıma yol açabilir. Aksine, 200 MΩ'dan daha küçük dirençlere sahip pipetler çok büyüktür (> 70 nm iç çapı) ve küçük özellikleri çözmez. Üretimi daha kolay olduğu ve daha az elektrik gürültüsü sağlama eğiliminde oldukları için 200 MΩ direncin pipetleriyle görüntülemeye başlamaları önerilir.
- Pipet iç çapını aşağıdaki formül12'yegöre başka bir yerde açıklandığı gibi hesaplayın:
2. Numune sürüklenmelerini ve titreşimlerini en aza indirme
NOT: Görüntüleme sırasında sistemdeki mekanik gürültüyü azaltmak için, numuneleri kalın cam slaytlar (~1,2 mm) kullanan özel yapım odalara monte edin:
- Cam kısmını 50 mm'lik cam tabanlı bir tabaktan çıkarın ve plastik duvarları sağlam bırakın.
- Hücre kültürü çanağının plastik kısmını silikon tutkalla kalın cam kaydırağın üzerine yapıştırın.
- Kalibrasyon örneğini silikon yapıştırıcı veya ince çift taraflı bant kullanarak odanın ortasına (cam kaydırağın üstüne) monte edin.
- Çift taraflı bant kullanarak hazneyi HPICM aşamasına sıkıca sabitleyin.
- Görüntüleme sırasında Faraday kafesini kapatın ve elektriksel paraziti ve termal sürüklenmeyi en aza indirmek için bir battaniye ile örtün.
3.Çözünürlüğün AFM kalibrasyon standartlarıyla test edilmesi
NOT: Sistem sorunlarını gidermek ve X-Z-Y eksenlerinde çözünürlüğünü test etmek için canlı hücreleri görüntülemeden önce AFM standartlarının (bkz. Malzeme Tablosu)görüntülenmesi şiddetle tavsiye edilir. Kalibrasyon standartları silikon dioksit sütunlarına ve farklı şekillerde deliklere sahiptir, ancak 5 x 5 mm silikon çip üzerinde sabit yüksekliklere /derinliklere (yani 20 veya 100 nm) sahiptir. Z çözünürlüğünün 100 nm'nin altında olmasını garanti etmek için 100 nm kalibrasyon standardı ile başlayarak önerilir. Bu kalibrasyon numuneslerindeki sütunların veya deliklerin başarılı bir yüksek çözünürlüklü görüntüsünü elde ettikten sonra (Şekil 3A), 20 nm standardına geçin. İkinci standardın görüntülenmesi başarılı olursa (Şekil 3B), Z eksenindeki çözünürlüğün 20 nm'nin altında ve saç hücresi stereosilia demetlerinin görüntülenmesi için uygun olması garanti edilir12. Aşağıdaki adımlar her iki kalibrasyon standardını da görüntülemek için kullanılır.
- Kalibrasyon standardını silikon tutkal ile odaya takın.
- Kalibrasyon numunesini kapsayacak şekilde hazneye 4 mL HBSS ekleyin. Ardından, çift taraflı bant kullanarak hazneyi HPICM kurulumunun XY aşamasına sabitleyin.
- Yer elektrodunun manyetik tutucusunun odanın yakınındaki aşamaya kenetleyin ve elektrodu banyo çözeltisinedaldırın ( Şekil 1B).
- Nanopipette'i tutucuya monte edin, banyo çözeltisine daldırın ve Bölüm 1'de açıklanan adımları izleyerek akımını ~1 nA olarak ayarlayın.
- Nanopipette'i bir ders yama kelepçe manipülatörü kullanarak kalibrasyon standardının merkezinin yaklaşık üstüne yerleştirin. Silikon dioksit yapılarının kapladığı alan nispeten büyük (1 x 1 mm) olduğundan, görsel muayene genellikle bu konumlandırma için yeterlidir. Corti eksplantlarının organının aksine (aşağıya bakın), kalibrasyon standardı şeffaf değildir ve bu nedenle bu örnek için optik görüntüleme ile yönlendirilen daha hassas bir konumlandırma mümkün değildir.
- Osiloskoptaki Z piezo aktüatör sensöründen gelen sinyali gerçek zamanlı olarak izlerken setpu artırın. Kararlı bir tekrarlanabilir Z yaklaşım döngüsü oluşturduktan sonra (Şekil 1C'deolduğu gibi , altta), setpoint'i kararsızlık noktasının hemen üzerindeki değere düşürin. Bu prosedür, bu nanopipette için en uygun setpoint'i sağlayacaktır.
- Pipeti numuneye ulaşana kadar bir yama kelepçe mikromanipülatörü ile ~5 μm/s hızda aşağı hareket ettirin. Şu anda, gerçek zamanlı Z konumlandırma sinyalinin alt seviyesi (Şekil 1C) artacak ve nanopipette'in numune yüzeyini "algılaması" nedeniyle geri çekildiğini gösterecektir. Nanopipette'in daha fazla hareketi, Z konumlandırma sinyalinin daha fazla pozitif kaymasına neden olacaktır.
NOT: Z piezo aktüatör hareketinin üst sınırını aşmamaya dikkat edin. - Görüntülemeyi düşük çözünürlükte başlatın (bkz. Tablo 1). AFM standardının düzensiz montajı nedeniyle, ilgi alanının en yüksek noktası bilinmemeyebilir. Bu nedenle, pipet geri çekme (hop genliği) genliğini en az 200-500 nm olarak ayarlayın.
- Görüntüleme alanındaki örneğin en yüksek noktası belirlendikten sonra, atlama genliğini azaltın. Daha küçük bir atlama genliği, sürüklenmelerin ve azaltılmış titreşimin azaltılmış etkileri nedeniyle yüksek çözünürlüklü görüntüleme için tercih edilen daha hızlı tarama sağlar.
- Pipeti yeni bir X-Y konumuna taşımadan önce, numuneyle istenmeyen çarpışmaları önlemek için Z ekseninde yaklaşık 200 μm geri çek.
NOT: Nanopipette kalibrasyon standardının merkezi ile hizalanmamış durumlarda, taramanın yüzey özelliklerinin alanının hemen dışında başlaması mümkündür. - İlgi alanı bulunduktan sonra, görüntülemeye daha yüksek çözünürlükte başlayın (bkz. Tablo 1).
4. Koklear eksplantları güvence altına almak için özel yapım odalar yapmak
NOT: Koklear eksplantları, esnek cam pipetler (adım 4.1) ( Şekil 4A ) veya diş ipi (adım4.2)(Şekil 4B)kullanan özel yapım sıkma sistemleri ile odalara monte edin. Cam pipet odası sterilize edilebilir ve Corti'nin kültür organları için kullanılabilirken, diş ipi odası numunenin daha güvenli tutulmasını ve montaj sırasında stereosilia demet oryantasyonu üzerinde bir kontrol sağlar. Bu özel yapım odaların önceden hazırlanması gerekir, ancak çeşitli görüntüleme seanslarında temizlenebilir ve yeniden kullanılabilir.
- Esnek cam pipetler kullanarak bir oda yapın
- Pipet çekeceği kullanarak cam kılcal damarlardan iki ince ve esnek cam elyafı çekin. Çekilen cam elyaflarımız tipik olarak 1 ila 2 cm uzunluğundadır ve oldukça esnektir.
- Silikon elastomer'den küçük bir damlayı bir cam kapak kapağının üzerine yerleştirin. 2 cm çapında kapak kılıfları kullanın.
- İki cam elyafın uçlarını silikon damlasına yerleştirin ve lifleri aralarında küçük bir ayrım derecesine sahip olacak şekilde düzenleyin (Şekil 4A).
- Elastomer'ı (1 ila 3 dk) hızlı bir şekilde iyileştirmek için kapak kapağını sıcak bir tabağa yerleştirin.
- Kapak kapağını Bölüm 2'de açıklanan odanın cam tabanına az miktarda (1-3 μL) silikon elastomer kullanarak yapıştırın ve bir gecede iyileşmesini sağlar.
- Diş ipi kullanarak oda yapmak:
- 50 mm'lik cam tabanlı bir kabın cam kısmını çıkarın ve plastik duvarları sağlam bırakın. Daha sonra hücre kültürü çanağının plastik kısmını silikon tutkalla 1,2 mm kalınlığında bir cam kaydırağın üzerine yapıştırın.
- Odanın ortasına aynı tutkalla bir plastik kapak kapağı (6,5 x 6,5 mm) monte edin. Ardından işlemi bir öncekinin üzerine başka bir kapakla tekrarlayın.
- Her biri kapak slaytlarının zıt taraflarında bulunan silikon tutkallı iki küçük tungsten veya altın kaplama tel (12 mm uzunluğunda ve ~0,5 mm çapında) monte edin. Kapak slaytlarından yeterince (> 10-15 mm) yapıştırın (Şekil 4B).
- İki diş ipi telini ayırın ve kapak slaytlarının üzerine yerleştirin ve bir düğüm yaparak tellere sabitleyin. Her iki iplikçik arasında küçük bir boşluk bırakın(Şekil 4B, kısa oklar).
- Her kullanımdan sonra odaları temizleyin
- İnce cımbız kullanarak dokuyu odadan hafifçe çıkarın ve geride kalan doku kalıntılarını hafifçe kazıyın.
- Odayı önce% 70 etanol ve daha sonra damıtılmış su ile durulayın.
- Gerekirse durulama döngüsünü tekrarlayın.
- Bir sonraki deneye kadar kurumasını sağlamak için odayı bir filtre kağıdına baş aşağı yerleştirin. Görüntülemeden sonra Corti organının kültleştirilmesi planlanmadıkça odaların sterilize edilmesine gerek yoktur.
5. Corti'nin kemirgen organını parçalamak
- Genç postnatal koklear eksplantların diseksiyonu başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibigerçekleştirin 13.
- HPICM görüntüleme için, Corti organını doğum sonrası 3 ve 6 (P3-6) günleri arasında farelerden ve doğum sonrası 3 ila 8 (P3-8) arasındaki sıçanlardan parçalara ayırt edin.
NOT: Eski saç hücreleri diseksiyon sırasında hasara karşı daha hassastır ve bu nedenle saatlerce hpicm görüntüleme için kullanılamaz. - HPICM görüntülemeden önce tectorial membranı çıkarmayı unutmayın.
- Diseksiyondan hemen sonra, dokuyu Bölüm 4'te açıklanan odalardan birine sabitleyin, esnek cam pipetlerin altına veya iki diş ipi telinin altına yerleştirin (Şekil 4). Bu odaları oda sıcaklığı banyo çözeltisinin 4 mL'si ile önceden doldurun (kabarcık oluşumunu en aza indirmek için).
6. İşitsel saç hücrelerinin görüntülenmesi
- Odayı çift taraflı bant kullanarak X-Y piezo sahnesine yeni izole edilmiş bir Corti organı ile monte edin ve X ve Y eksenlerinde oda sürüklenmesini en aza indirmek için sıkıca sabitlenmiş olduğundan emin olun (Şekil 1B).
- Yeni bir nanopipette yerleştirmek ve doğru pipet direncini kontrol etmek için Bölüm 1'deki adımları izleyin.
- Patch clamp mikromanipülatör kullanarak, nanopipette'i saç hücresi bölgesinin üzerine yerleştirin, corti explant organını ters bir mikroskopta gözlemleyin.
- Osiloskopta gerçek zamanlı akım ve Z konumlandırma sinyalini kaydederek sistemin %0,5 veya daha düşük bir setpoint ile stabil olup olmadığını kontrol edin (Şekil 1C'deolduğu gibi). Z sinyali kararlı değilse, yama kelepçesi amplifikatörünün düşük geçiş filtresinin kesme frekansını azaltmaya çalışın. Bununla birlikte, Z piezo aktüatörsunun yanıt süresinden daha düşük olamaz (gecikmiş akım okumaları nedeniyle numuneyle pipet çarpışmasını önlemek için).
NOT: Uygulamada, bu filtrenin 5 kHz ayarının en uygun olduğu bulunmuştur. Z sinyali hala kararsızsa, nanopipette'i değiştirmek daha iyidir. - Kararlı bir kayıt elde edildikten sonra, en uygun set noktasını belirleyin ve yukarıdaki 3.6-3.7 adımlarında açıklandığı gibi HPICM pipet ile örneğe yaklaşın.
- İlk olarak, en az 6 ila 8 μm'lik bir atlama genliği kullanarak düşük çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirin (bkz. Tablo 1). Saç hücresi stereosilia demetleri gibi uzun yapıları görüntülemek için, bu yapılarla çarpışmayı önlemek için şerbetçiotu genliğinin yeterli olduğundan emin olun.
NOT: Atlama genliği yeterli değilse, pipet bir stereosiyumun üzerinden atlayamayacak ve yakın bir çarpışma olacaktır. HPICM probunun stereosilüzyum ile çarpışması saç demetine zarar verebilir. Bu nedenle, stereosilia paketinin yüksekliğinin belirsiz olduğu durumlarda, daha büyük bir atlama genliği kullanın. - Taramalı elektron mikroskopisi ile elde edilen görüntüleri ilk kez gerçekleştirerek ve/veya inceleyerek Corti organının topografyasına aşina olun (Şekil 5).
NOT: HPICM görüntüsü her görüntüleme noktasında 1 μm'den küçük yüksekliklerle düzgünse, pipet muhtemelen dokuyu değil, cam tabanı tarar. Alternatif olarak, pipet saç hücrelerinden uzakta koklear eksplant'ın farklı bir bölgesine "inebilir". - Pipet yeni bir X-Y konumuna taşınması gerekiyorsa, dokudaki herhangi bir uzun özellik ile çarpışmaları önlemek için yaklaşık 500 nm geri çek. Saç hücrelerinin ilgi alanı bulunana kadar düşük çözünürlüklü HPICM görüntülemeyi tekrarlayın.
- İlgi alanı bulunduktan sonra, görüntülemeye daha yüksek çözünürlükte başlayın (bkz. Tablo 1). Bütün bir saç demetini görüntülerken 15 dakikadan daha az zaman harcamaya çalışın.
NOT: Canlı dokudaki saç hücresi demetleri hala değildir, ancak örneğin alttaki destekleyici hücrelerdeki şekil değişiklikleri nedeniyle yönelimlerini değiştirebilir. Bu nedenle, görüntü alma çok yavaşsa görüntüler hareket eserleri gösterebilir. - Bir kez daha, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için atlama genliği azalmadan önce düşük çözünürlüklü görüntülerdeki en uzun özellikleri belirleyin. Tüm saç hücresi demetini kapsayan bir ilgi alanı için, atlama genliğini 4-5 μm'ye düşürün, demet içindeki nispeten küçük ve "düz" bir bölge için (örneğin, 2 x 2 μm) atlama genliğini daha da azaltarak 1 μm'nin altına düşürün, böylece görüntüleme hızını ve çözünürlüğünü artırın.
7. Görüntü işleme
NOT: HPICM görüntülemede görüntüleme eserleri yaygındır. Bazıları görüntü alma parametreleriyle düzeltilebilirken, diğerleri özel bir SICM görüntüleyiciyle veya ImageJ veya MatLab gibi daha genel veri işleme programlarıyla işlem sonrası işlem gerektirir. Burada en yaygın eserleri ve bunları SICM görüntüleyici ile nasıl düzeltdiğimizi açıklıyoruz.
- Eğim düzeltmesi gerçekleştir
NOT: Yeni başlayanlar için belirgin değildir, ancak görüntüleme alanı eşit veya daha büyük boyutta genel bir eğime sahipse, insan gözü bir hücrenin yüzeyindeki mikrometre altı boyut özelliklerini çözemez(Şekil 3A,B, sol). Bu nedenle, görüntülenmiş bir alanın ortalama eğimini belirlemek (HPICM 3D görüntü verilerini tek bir düzleme sığdırarak) ve HPICM görüntüsünden çıkarmak gerekir(Şekil 3A,B, ortada).- SICM görüntüleyicili bir görüntüyü açmak için Aç'ı tıklatın.
- Görüntü Düzeltme sekmesini seçin.
- Eğimi Düzelt sekmesini seçin.
- Otomatik eğim düzeltmesi için Eğimi Düzelt düğmesine basın.
- Çizgi hizalamasını gerçekleştirme
NOT: Daha önce de belirtildiği gibi, mekanik ve/veya termal sürüklenmelerin yanı sıra hücre hareketi eserleri HPICM görüntülemede önemli bir sorunu temsil eder. Dakikada bir mikrometreden daha az hıza sahip küçük bir sürüklenme genellikle normal bir yama kelepçesi kurulumunda fark edilmez. Bununla birlikte, HPICM görüntülemesinde, HPICM çözünürlüğünden önemli ölçüde daha büyük olan onlarca nanometreden eserler üretebilir. Bu nedenle, görüntüleme sırasında iki komşu HPICM tarama hattı arasında Z ekseninde ani sıçramalarla karşılaşmak nadir değildir. Bu, bu komşu tarama satırlarında Z değerlerini başlatma (ve/veya sonlandırma) arasındaki farklar analiz edilerek düzeltilebilir.- SICM görüntüleyicili bir görüntüyü açmak için Aç'ı tıklatın.
- Görüntü Düzeltme sekmesini seçin.
- Eğimi Düzelt sekmesini seçin.
- Hizalanacak çizgilerin genişliğini seçin. Otomatik çizgi hizalama düzeltmesi için ButtonDestripeLineFit düğmesine basın.
- Gürültü azaltma gerçekleştirin
NOT: HPICM ile görüntü elde ederken, nanopipette akımındaki küçük dalgalanmalar, nanopipette'in numunenin yüzeyinden uzakta, özellikle düşük set noktalarıyla durmasına neden olabilir. Görüntüde küçük beyaz noktaların ortaya çıkmasına neden olur. Bu görüntüleme yapıtını düzeltmek için, görüntüleme noktalarının komşularınkinden önemli ölçüde daha büyük olan Z değeri ile tanımlanması ve bu değerin komşuların ortalamasıyla değiştirilmesi gerekir. Bu ayarlanabilir bir ortanca filtre ile yapılır.- SICM görüntüleyicili bir görüntüyü açmak için Aç'ı tıklatın.
- Görüntü İşleme sekmesini seçin.
- Gürültü azaltma sekmesini seçin.
- Kaldırılacak pikseller için Eşik filtresini (μm) ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede sunulan protokol, karmaşık topografya ile canlı hücreleri görselleştirmek için kullanılabilir. Bu adımları izleyerek, rutin olarak canlı sıçan işitsel saç hücresi demetlerinin görüntülerini elde ediyoruz (Şekil 6B, D). SEM görüntülerle karşılaştırıldığında daha düşük X-Y çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, HPICM görüntülerimiz farklı stereosiliya sıralarını, stereosilia ipuçlarının şeklini ve hatta bitişik stereosiliyi(Şekil 6F)bağlayan küçük bağlantıları (~5 nm çapında) başarıyla çözebilir. Buna ek olarak, HPICM görüntüleri 3D olarak SEM görüntülerinin eksik olduğu bilgilere sahiptir. Bu tür görüntüleme tekniğinin temassız doğası göz önüne alındığında, demet uyumluluğuna zarar vermeden aynı saç hücresi demetinin sürekli zaman atlamalı HPICM görüntülemesini birkaç saat (yani düzenli olarak 5-6 saat) gerçekleştirebildik (Şekil 7). Böylece HPICM, saç hücresi demetlerinin zaman içinde dinamik yapısal değişikliklerinin incelenmesi için büyük bir potansiyel sergiler.
Pipet boyutu, mevcut setpoint, düşük ve yüksek çözünürlüklü parametreler ve atlama genlikleri için çeşitli aralıklar sağlamamıza rağmen, her kullanıcının canlı saç hücresi demetlerinin başarılı HPICM görüntülerini elde etmek için ayarlarını biraz optimize etmesi gerekebilir. Daha küçük set noktaları daha kaliteli görüntüler üretir. Bununla birlikte, çok düşük bir setpoint ile sistem, akımdaki küçük dalgalanmaları hücre yüzeyiyle karşılaşmak olarak yorumlayabilir ve bu görüntüdeki "beyaz nokta" gürültüsüne yol açar (Şekil 8A). Benzer şekilde, büyük atlama genlikleri pipetin yanal rezonansını artırabilir ve ayrıca gürültülü pikseller üretebilir (Şekil 8B). Buna karşılık, atlama genliği çok küçükse veya setpoint çok yüksekse, nanopipette örnekle çarpışabilir ve görüntüleme eserlerine yol açabilir veya hatta saç demetine zarar verebilir (Şekil 8C, D). Numuneye veya nanopipetteki hasarı en aza indirmek için tüm bu parametreleri ince ayarlarken görüntülemeyi daha düşük çözünürlükte gerçekleştirmenizi öneririz.
Şekil 1: Atlamalı prob iyon iletimi mikroskopisi (HPICM) prensipleri. (A) Nanopipetten geçen bir elektrik akımı pipet ucunda bir "algılama hacmi" oluşturur. Saç hücresi stereosilia demetleri gibi karmaşık yapıları görüntülemek için pipet yukarıdan hücre yüzeyine yaklaşır ve yüzeyi algıladıktan sonra geri çekilir. Her adımda yanal bir hareketten sonra, pipet hücrenin görüntüsünü oluşturan örneğin üzerine "atlama" yapmaya devam eder. Pipet stereosiyuma "tırmanmak" için şerbetçiotu genliğinin yeterli olması gerektiğine dikkat edin. Resimli atlama genliği soldan sağa tarama için çalışır (en küçüğünden en uzun stereosilüme kadar, okla gösterilir). Ancak, pipet önce en yüksek stereosilüzyumla buluştuğunda sağdan sola tarama için çok küçüktür. (B) Deneysel kurulum. Corti explant'ın organına sahip özel yapım bir oda, optik mikroskopi gözlemi için diyafram açıklığına sahip bir XY nanopozisyon aşamasına monte edilir. Nanopipette ayrı bir ultra hızlı Z piezo aktüatör tarafından hareket ettirilir. Nanopipette'i ilgi alanına yerleştirmek için, Z aktüatörü, yama kelepçesi amplifikatörü başlığıile birlikte geleneksel bir mikromanipülatöre (gösterilmez) monte edilir. Zemin elektrozu manyetik bir tutucuya monte edilir ve banyoya yerleştirilir. (C) Görüntüleme sırasında pipet akımının temsili kayıtları(üst iz) ve pipetin Z konumu (alt iz). Pipet hücre yüzeyinden uzak olduğunda, pipetten geçen akımın referans değeri belirlenir (Iref). Daha sonra pipet örneğe (yaklaşıma) doğru hareket ettirilir. "Algılama hacmi" hücre yüzeyi ile buluştuğunda pipet akımı azalmaya başlar. Para çekme komutu, geçerli düşüş genellikle% 0.2 - 1% Irefolan bir setpoint'e ulaştığında verilir. (D) HPICM görüntüleme için geleneksel bir yama kelepçe kurulumuna eklenmesi gereken ekipmanın şemaları. Özel bir yama kelepçesi amplifikatörü, HPICM modunda SICM denetleyicisi tarafından X, Yve Z eksenlerine komut sinyalleri oluşturmak için kullanılan nanopipette akımını (I) kaydeder. Enstrümantasyon amplifikatörü, gerekirse bu sinyallere ofset, ölçekleme ve düşük geçiş filtrelemesi sağlar. Ne yazık ki, denetleyiciden gelen X/Y/Z sinyalleri, piezo seramiğine özgü histez ve sürünmenin neden olduğu büyük hatalar nedeniyle doğrudan piezo aktüatörlerine uygulanamaz. Bu nedenle, her piezo aktüatörü (çeviri aşaması),bu hataları düzeltmek için komut sinyalini önceden şekillendiren orantılı integral türev (PID) denetleyicisine geri bildirim sinyali gönderen yerleşik bir hareket sensörüne sahiptir. Nispeten yavaş X ve Y eksenlerinin piezo amplifikatördeyerleşik PID denetleyicileri , daha hızlı bir Z ekseni özel bir hızlı PID denetleyicisigerektirir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nanopipette imalatı ve dolgusu. (A) intrapipette çözeltisi (HBSS) ile doldurulmuş yaklaşık 2 cm uzunluğunda bir nanopipette. (B) Pipet doldurulduktan sonra tipik olarak oluşan kabarcık (ok) görüntüsü. Kabarcık genellikle mikroskop aydınlatması (10x'te bir LCD dijital mikroskop) birkaç dakika içinde hareket eder. (C) SICM kafasına monte edilmiş bir nanopipette. Ok, pipet içindeki AgCl elektrotini işaret eder. Pipet tutucusuna dikkat edin gümüş boyalı ve Z piezo aktüatörden radyatif elektrikli pikapı en aza indirmek için topraklanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sistemde yeterli stabiliteyi, titreşim yalıtımını ve elektriksel gürültüyü belirlemek için AFM kalibrasyon standartlarının görüntülenmesi. (A) HS-100MG kalibrasyon standardının ham (solda), işlenmiş (ortada) ve 3D (sağ) görüntüleri. Standardın yüzey profili şematik olarak üstte gösterilir. Standart hiçbir zaman nanopipette dik olarak mükemmel bir şekilde hizalanmadığı için, numunenin küçük dikey özelliklerini ortaya çıkarmak için işlem sonrası eğim düzeltmesi gereklidir. (B) Daha küçük, 20-nm derin girintilere sahip HS-20MG kalibrasyon standardının benzer ham (sol), post-işlenmiş (orta) ve 3D (sağ) görüntüleri. HPICM görüntüsündeki bir pikselin gri tonlamalılığının, örneğin o noktadaki yüksekliğini gösterdiğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Corti explant organının montajı. (A) Eksplant, cam tabanlı Petri kabına yapıştırılan iki cam pipetle tutulur. (B) Eksplant, özel yapım bir görüntüleme odasında iki diş ipi teli (kısa ok) ile sabitlenmektedir. Inset, Corti'nin organının büyütülmüş görüntüsünü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: HPICM probunun saç hücresi bölgesine navigasyonu. (A) İç (IHC' ler) ve dış (İT'ler) saç hücrelerinin satırlarını ve farklı destekleyici hücre türlerini gösteren koklear eksplant'ın SEM görüntüsü. (B) Kolliker'in organındaki hücrelerin temsili HPICM görüntüsü. (C) Hensen hücrelerinin HPICM görüntüsü. Bu iki tür destekleyici hücrenin çok farklı şekillere sahip olduğunu unutmayın, bu da HPICM probunun saç hücrelerine radyal veya periferik bir alana inip inmediğini belirlemeye yardımcı olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ile stereosilia demetlerinin genç postnatal kemirgen iç saç hücrelerinde zıplayan prob iyon iletim mikroskopisi (HPICM) görüntülemesi arasında karşılaştırma. (A,C) SEM görüntüler, yüzey ayrıntılarının alt nanometre çözünürlüğünü sağlar, ancak kritik nokta kuruması nedeniyle sabitlenmiş ve küçülmüş hücrelerde. Ayrıca, SEM görüntüleri 3D analize izin vermez. (B,D) HPICM görüntüleri (solda) daha kötü bir çözünürlüğe (~5-10 nm) sahiptir, ancak canlı hücrelerde elde edilir, zaman atlamalı görüntülemeye izin verir ve 3D rekonstrüksiyon ve ölçümlere izin veren tam yükseklikler hakkında bilgi taşır (sağda). (E,F) Stereosilia arasındaki hücre dışı bağlantılar hem SEM (E) hem de HPICM (F) görüntülerinde (oklarda) belirgindir. Hücre yaşları: A, doğum sonrası gün 5 (P5) fare; B, P6 sıçanı; C, P8 fare; D, P5 faresi; E, P7 fare; ve F, P5 faresi. Tüm HPICM görüntülerinde, bir pikselin gri tonlamalı olması, numunenin o noktadaki yüksekliğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Stereosilia demetinin sürekli zaman atlamalı HPICM görüntülemesi. (A) P5 sıçanından belirgin daha kısa sıra stereosili gösteren bir iç saç hücresi demetine genel bakış. (B) Altı saat boyunca (A) ile belirtilen ilgi bölgesinin zaman atlamalı görüntülenmesi. Tipik bir yama kampı deneyinin aksine, saç hücrelerinin birkaç saat boyunca in vitro bozulma belirtisi göstermediğini unutmayın. Bunun nedeni dikkatli diseksiyon ve hücrede herhangi bir mekanik bozukluğun olmamasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: HPICM ile görüntüleme sırasında yaygın eserler. (A) Çok düşük bir setpoint etkisi. %0,05 (solda) ve %0,07 (sağda) setpoint ile elde edilen P3 farelerinde aynı canlı iç saç hücresi demetlerinin düşük çözünürlüklü HPICM görüntüleri. Daha yüksek setpoint ile kaybolan beyaz nokta gürültüsüne dikkat edin. (B) Çok yüksek bir atlama genliğinin etkisi. Beyaz nokta gürültüsü ayrıca 5,8 μm (solda) büyük bir şerbetçiotu genliği ile elde edilen bir P7 sıçan iç saç hücresi demetinin HPICM görüntüsünde de görünür. Bu gürültü, sistemdeki titreşimlerin azalması nedeniyle aynı demet 3,4 μm (sağda) şerbetçiotu genliği ile görüntülendiğinde kaybolur. (C) Çok düşük atlama genliği, HPICM probunun stereosilia ile çarpışmasına ve sürüklenmesine neden olur (sol paneldeki oklar). Hop genliği stereosilia'nın "üzerine tırmanmak" için yeterince artırmak bu eseri ortadan kaldırır (sağda) ancak görüntüleme süresini de artırabilir ve gözle görülür bir sürüklenmeye neden olabilir (sağ paneldeki dikey çizgiler). P7 faresinden canlı bir dış saç hücresinin stereosilia demeti. (D) Çok yüksek setpoint, yine nanopipette stereosilia ile çarpışması nedeniyle, hpicm görüntüsünde (solda) stereosilia uçlarının (okların) kare şeklinde bir şekline neden olur. Setpoint'in azalması (beyaz gürültüyü ortadan kaldırmak için umut genliğinin aynı anda azalmasıyla) görüntülemeyi geliştirir (sağda). P6 faresinden canlı bir iç saç hücresinin stereosilia demeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözünürlük | Görüntü alanı (μm) | Yanal Çözünürlük (nm) | Resim başına süre (dakika) |
| Alçak | 20×20 | ≥300 | ≤20 |
| Alçak | 10×10 | ≥156 | ≤15 |
| Alçak | 5×5 | ≥75 | ≤4 |
| Yüksek | 20×20 | ≤200 | ≤20 |
| Yüksek | 10×10 | ≤110 | ≤15 |
| Yüksek | 5×5 | ≤55 | ≤4 |
Tablo 1: Görüntüleme alanının boyutuna ve tarama çözünürlüğüne bağlı olarak hpicm görüntülemenin tipik süreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başarılı HPICM görüntüleri elde etmek için kullanıcıların düşük gürültü ve düşük titreşim sistemi kurmaları ve uygun pipetler üretmeleri gerekir. Canlı hücre görüntülemeyi denemeden önce sistemin kararlılığını test etmek için AFM kalibrasyon standartlarının kullanılmasını şiddetle öneririz. Sistemin çözünürlüğü test edildikten sonra, kullanıcılar herhangi bir canlı hücre görüntüleme denemeden önce görüntüleme ayarlarını tanımak için Corti örneklerinin sabit organını görüntülemeyi düşünebilirler.
Görüntüleme için en uygun ayar noktası, uçlarının bireysel şekline (elektron mikroskopisi ile incelenene kadar bilinmeyen) ve ucuna bağlı kir miktarına bağlı olarak farklı pipetler arasında değişir, bu da öngörülemezdir. %0,7'den daha yüksek optimum setpoint'e sahip nanopipetler atılmalıdır.
Canlı hücrelerin görüntülenmesi sırasında hücre dışı çözeltideki toz ve döküntü miktarı zamanla artar. Tüm bu parçacıklar pipet ucuna kadar gelebilir, akımda bir azalmaya neden olabilir ve dokuyu taramaya devam etmeyi imkansız hale getirebilir - geri bildirim nanopipette'in her zaman numunenin yakınında olduğunu "düşüneceğinden" görüntü tamamen beyaza dönecektir. Bu durumda, pipet Z ekseninde dokunun o bölgesinden geri çekilmesi önerilir. Bu geri çekilme "kirliği" temizleyebilir. Pipet hala kirliyse, pipet değiştirmek ve numunenin farklı bir alanına geçmek gerekir. Daha sonra, kullanıcı dokuyu taramaya devam edebilir.
Bugün itibariyle, HPICM'nin en önemli sınırlaması, karmaşık topografyaya sahip örneklerle çalışırken yüksek çözünürlükte görüntü almak için gereken süredir. İstenilen çözünürlüğe bağlı olarak, görüntüler yarım saat veya daha fazla sürebilir. On beş dakikadan uzun süre elde edilen görüntülerde, sürüklenme belirginleşebilir ve belirli yapılar kaydırılabilir ve ayırt edilmesi zor olabilir. Bu, canlı hücrelerin zaman içinde sürekli hareket etmeleri veya şekillerini değiştirmeleri nedeniyle oluyor. Zaman içinde moleküler olayları ve hücrelerin yapılarındaki değişiklikleri görselleştirmek için, HPICM11'inzamansal çözünürlüğünü optimize etmek için daha fazla gelişmeye ihtiyaç vardır.
Nanopipette akımının gürültüsü başka bir sınırlamayı temsil eder, çünkü pratik olarak ulaşılabilir minimum setpoint'i ayarlar. Çözeltideki nanopipette tarafından üretilen akım hızla zayıflar (pipet ucundan kübik mesafe ile ters orantılı), böylece nanopipette'in yüzeyi "hissedemediği" bir "algılama hacmi" oluşturur. Daha önce bu fenomenin bir modelini geliştirdik ve SICM probunun yanal çözünürlüğünün, düşük set noktalarında son derece küçük olabilen hücre yüzeyi ile bu "algılama hacminin" kesitleri tarafından belirlendiğinigösterdik 25. Bu, özellikle ~5 nm12,33çapında saç hücresi uç bağlantılarını görüntülemek için önemlidir. İlk bakışta, daha küçük iç çapa sahip pipetler HPICM görüntülemenin daha iyi çözülmesini sağlayacaktır. Bu gerçekten nispeten büyük pipetler (>50 nm) için geçerlidir. Bununla birlikte, nanopipette'in iç çapının ~50 nm'nin altına düşmesi, pipet gürültüsünün orantısız derecede büyük bir artışa ve dolayısıyla stereosilia demetlerini görüntülemek için gerekli olan düşük set noktalarında çözünürlük kaybına neden olur. Bugün itibariyle bu sorunu nasıl çözeceğimizi bilmiyoruz ve uygun çözümü bulmak için çalışıyoruz.
Özetle, bu makale HPICM ile canlı memeli işitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin görselleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunun. HPICM'nin en büyük avantajları şunlardır: i) canlı hücrelerin yüzeyindeki etiketsiz nano ölçekli yapıları dokunmadan görselleştirme yeteneği; ve ii) bu yapıların işlevini yama kelepçe kayıtları ve/veya mekanik veya kimyasal uyaranların yerel nano ölçekli teslimatı ile araştırmak. Bilgimiz dahilinde, bu avantajlar HPICM'ye özgüdir. Tabii ki, bazı dezavantajları var. İlk olarak, görüntülenecek yapıların yüksekliğindeki sınırlamalar nedeniyle, HPICM, memeli ampullae'deki vestibüler saç hücrelerinin stereosilya demetleri gibi son derece yüksek yapıları görüntülemek için uygun olmayabilir. İkinci olarak, HPICM hala gelişmektedir ve görüntüleme hızında ve çözünürlüğünde daha fazla iyileştirmeye ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, HPICM'nin fiziksel ilkeleri ve kendi deneyimimiz bunun mümkün olduğunu göstermektedir. HPICM'nin stereosilia yüzeyindeki bireysel protein komplekslerinin işlevi hakkında benzersiz veriler sağlayacağına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rakip çıkarları yok.
Acknowledgments
Projenin tüm aşamalarında uzun vadeli destek ve tavsiyeler için Prof. Yuri Korchev'e (Imperial College, UK) teşekkür ederiz. Dr. Pavel Novak ve Andrew Shevchuk'un (Imperial College, UK) yanı sıra Oleg Belov'a (Rusya Ulusal Odyoloji Araştırma Merkezi) yazılım geliştirme konusundaki yardımları için de teşekkür ederiz. Çalışma NIDCD/NIH (R01 DC008861 ve R01 DC014658 ila G.I.F.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analog oscilloscope | B&K Precision | 2160C | Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach |
| AFM calibration standards | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system |
| Benchtop vibration Isolator | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Active vibration isolation |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | To be added to the bath solution to adjust osmolarity |
| Digitizer | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Multi-channel input/output digitizer |
| Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers. |
| Faraday cage | AMETEK/TMC | Type II | Required to shield electromagnetic interference |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Used as the dish for the chamber for the tissue |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Extracellular (bath) solution |
| Instrumentation amplifier | Brownlee Precision | Model 440 | Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation |
| Laser-based micropipette puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes. |
| Lebovitz's L-15, without phenol red | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Extracellular (bath) solution |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | Used for "course" positioning of the Z piezo actuator |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Inverted optical microscope |
| Patch amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette |
| Piezo amplifier (XY axes) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509.C2A | Amplification and PID control for XY piezo translation stage |
| Piezo amplifier (Z axis) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA |
| Plastic Coverslips | TED PELLA Inc | 26028 | Used in the fabrication of the chambers for the tissue |
| SICM controller & software* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd |
| Silicone elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue |
| Silicon glue | The Dow Chemical Company | 734 | Used to glue the different parts of the chamber for the tissue |
| Tungsten rod | A-M Systems | 717500 | Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue |
| XY piezo nanopositioner | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY translation stage with capacitive sensors |
| Z piezo nanopositioner | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring piezoactuator with a strain gage sensor |
| *Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems: NX12-Bio and NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original | |||
| HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically | |||
| challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one | |||
| modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. |
References
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
- Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
- Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W.
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
- Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
- Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
- Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
- Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
- Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
- Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).
- Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
- Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
- Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
- Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
- Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
- Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
- Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).
- Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
- Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B.
- Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
- Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
- Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
- Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
- Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
- Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
- Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
- Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
- Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
- Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).
