Imagerie de faisceaux stéréocilaires avec résolution à l’échelle nanométrique dans des cellules ciliées auditives de mammifères vivants

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la microscopie à conductance ionique à sonde sautillante (HPICM), une technique de sonde à balayage sans contact qui permet l’imagerie à l’échelle nanométrique des faisceaux de stéréocils dans les cellules ciliées auditives vivantes.

Abstract

Les cellules ciliées de l’oreille interne détectent les déplacements induits par le son et transduisent ces stimuli en signaux électriques dans un faisceau de cheveux constitué de stéréocils disposés en rangées de hauteur croissante. Lorsque les stéréocils sont déviés, ils tirent sur de minuscules liens extracellulaires (~ 5 nm de diamètre) interconnectant les stéréocils, qui transmettent des forces aux canaux de transduction mécanosensibles. Bien que la mécanotransduction ait été étudiée dans les cellules ciliées vivantes pendant des décennies, les détails ultrastructuraux fonctionnellement importants de la machinerie de mécanotransduction aux extrémités des stéréocils (tels que la dynamique des liens de pointe ou le remodelage des stéréocils dépendant de la transduction) ne peuvent encore être étudiés que dans les cellules mortes avec microscopie électronique. Théoriquement, les techniques de sonde à balayage, telles que la microscopie à force atomique, ont une résolution suffisante pour visualiser la surface des stéréocils. Cependant, indépendamment du mode d’imagerie, même le moindre contact de la sonde de microscopie à force atomique avec le faisceau stéréocileux endommage généralement le faisceau. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’imagerie par microscopie à conductance ionique à sonde sautillante (HPICM) de cellules ciliées auditives de rongeurs vivants. Cette technique de sonde à balayage sans contact permet l’imagerie en accéléré de la surface de cellules vivantes avec une topographie complexe, comme les cellules ciliées, avec une résolution d’un nanomètre et sans entrer en contact physique avec l’échantillon. Le HPICM utilise un courant électrique traversant la nanopipette en verre pour détecter la surface de la cellule à proximité de la pipette, tandis qu’un système piézoélectrique de positionnement 3D scanne la surface et génère son image. Avec HPICM, nous avons pu imager des faisceaux de stéréocils et les liens interconnectant les stéréocils dans des cellules ciliées auditives en direct pendant plusieurs heures sans dommages notables. Nous prévoyons que l’utilisation de l’IHMHP permettra d’explorer directement les changements ultrastructurels dans les stéréocils des cellules ciliées vivantes pour mieux comprendre leur fonction.

Introduction

Malgré le fait que les faisceaux de stéréocils dans les cellules ciliées auditives sont assez grands pour être visualisés par microscopie optique et déviés dans des cellules vivantes dans une expérience de pince à patch, les composants structurels essentiels de la machinerie de transduction tels que les liens de pointe ne pourraient être imagés qu’avec la microscopie électronique dans les cellules mortes. Dans les cellules ciliées auditives des mammifères, la machine de transduction est située aux extrémités inférieures des maillons de la pointe, c’est-à-dire à l’extrémité des stéréocils de la rangée plus courte¹ et régulée localement par la signalisation aux extrémités des stéréocils^2,3. Pourtant, l’imagerie sans étiquette des structures de surface à cet endroit dans les cellules ciliées vivantes n’est pas possible en raison de la petite taille des stéréocils.

La cochlée de mammifère a deux types de cellules sensorielles auditives: les cellules ciliées internes et externes. Dans les cellules ciliées internes, les stéréocils sont plus longs et plus épais que ceux des cellules ciliées externes⁴. La première et la deuxième rangée de stéréocils ont un diamètre de 300 à 500 nm dans les cellules ciliées internes de souris ou de rats. En raison de la diffraction de la lumière, la résolution maximale réalisable avec une microscopie optique sans étiquette est d’environ 200 nm. Par conséquent, la visualisation des stéréocils individuels dans les première et deuxième rangées du faisceau interne de cellules ciliées est relativement facile avec la microscopie optique. En revanche, les stéréocils de rangée plus courte dans les cellules ciliées internes et tous les stéréocils des cellules ciliées externes ont des diamètres d’environ 100-200 nm et ne peuvent pas être visualisés avec la microscopie optique⁵. Malgré les progrès récents de l’imagerie à super-résolution, cette limitation fondamentale persiste dans toute imagerie optique sans étiquette. Toutes les techniques de super-résolution actuellement disponibles dans le commerce nécessitent une sorte de molécules fluorescentes⁶, ce qui limite leurs applications. En plus des limitations dues à la nécessité de molécules spécifiques marquées par fluorescence, il a été démontré que l’exposition à une irradiation lumineuse intense induit des dommages cellulaires et pourrait influencer les processus cellulaires, ce qui est un grand inconvénient lors de l’étude des cellules vivantes⁷.

Notre connaissance actuelle des détails ultrastructuraux des faisceaux stéréocils des cellules ciliées a été obtenue principalement avec diverses techniques de microscopie électronique (EM), telles que la microscopie électronique à balayage (MEB), la microscopie électronique à transmission (TEM), l’EM par congélation-fracture, et récemment avec des techniques 3D telles que la section en série avec faisceau d’ions focalisés ou la cryo-TOMOGRAPHIE EM⁸,^9,10^{,11,12,13, 14,15,16}. Malheureusement, toutes ces techniques EM nécessitent une fixation chimique ou cryofixation de l’échantillon. Selon l’échelle de temps des phénomènes, cette exigence rend impossible ou très laborieuse l’étude des processus dynamiques aux extrémités des stéréocils.

Des efforts limités ont été faits pour imager des faisceaux de cheveux de cellules ciliées vivantes avec la microscopie à force atomique (AFM)^17,18. Étant donné que l’AFM fonctionne dans des solutions physiologiques, il pourrait, en théorie, visualiser les changements dynamiques dans les faisceaux stéréocilaires des cellules ciliées vivantes au fil du temps. Le problème réside dans les principes de l’AFM haute résolution, qui implique un certain contact physique entre la sonde AFM et l’échantillon, même en mode « tapping » le moins dommageable¹⁹. Lorsque la sonde AFM rencontre un stéréocilium, elle s’écrase généralement contre lui, endommageant la structure du faisceau de cheveux. En conséquence, cette technique ne convient pas à la visualisation de faisceaux de cellules ciliées vivantes, voire fixes,^17,18. Le problème peut être partiellement atténué en utilisant une grande sonde AFM en forme de boule qui n’impose que des forces hydrodynamiques à la surface de l’échantillon²⁰. Cependant, même si une telle sonde est idéale pour tester les propriétés mécaniques de l’échantillon^21,elle ne fournit qu’une résolution inférieure au micromètre lors de l’imagerie de l’organe de Corti²² et applique toujours à l’échantillon une force qui peut être substantielle pour les faisceaux stéréocilaires très sensibles.

La microscopie à conductance ionique à balayage (SICM) est une version de la microscopie à sonde à balayage qui utilise une sonde à pipette en verre remplie d’une solution conductrice²³. SICM détecte la surface lorsque la pipette s’approche de la cellule et que le courant électrique à travers la pipette diminue. Comme cela se produit bien avant de toucher la cellule, le SICM est idéal pour l’imagerie sans contact de cellules vivantes en solution physiologique²⁴. La meilleure résolution du SICM est de l’ordre de nanomètres simples, ce qui permet de résoudre des complexes protéiques individuels au niveau de la membrane plasmique d’une cellule vivante²⁵. Cependant, à l’instar d’autres techniques de sonde de balayage, siCM est capable d’imager uniquement des surfaces relativement planes. Nous avons surmonté cette limitation en inventant le microscope à conductance ionique à sonde sautillante (HPICM)²⁶, dans lequel la nanopipette s’approche de l’échantillon à chaque point d’imagerie(Figure 1A). En utilisant HPICM, nous avons pu imager des faisceaux de stéréocils dans des cellules ciliées auditives vivantes avec une résolution à l’échelle nanométrique²⁷.

Un autre avantage fondamental de cette technique est que HPICM n’est pas seulement un outil d’imagerie. Contrairement à d’autres techniques de sonde à balayage, la sonde HPICM/SICM est une électrode largement utilisée en physiologie cellulaire pour les enregistrements électriques et la livraison locale de divers stimuli. L’activité des canaux ioniques n’interfère généralement pas avec l’imagerie HPICM, car le courant total à travers la sonde HPICM est de plusieurs ordres de grandeur supérieur au courant extracellulaire généré par les plus grands canaux ioniques²⁵. Cependant, HPICM permet un positionnement précis de la nanopipette sur une structure d’intérêt et un enregistrement ultérieur à patch-pince monocanal à partir de cette structure²⁸. C’est ainsi que nous avons obtenu les premiers enregistrements préliminaires de l’activité monocanal aux extrémités des stéréocils externes des cellules^{ciliées 29.} Il convient de mentionner que même un courant important à travers la nanopipette ne peut pas produire de changements significatifs du potentiel à travers la membrane plasmique en raison de l’énorme shunt électrique du milieu extracellulaire. Cependant, les canaux ioniques individuels peuvent être activés mécaniquement par écoulement de liquide à travers la nanopipette³⁰ ou chimiquement par application locale d’un agoniste³¹.

Dans HPICM, l’image est générée lorsqu’une nanopipette s’approche séquentiellement de l’échantillon en un point, se rétracte, puis se déplace dans la direction latérale pour répéter l’approche(Figure 1A). Un amplificateur à pince de raccordement applique constamment une tension à un fil AgCl dans la pipette(Figure 1B)pour générer un courant d’environ 1 nA dans la solution de bain. La valeur de ce courant lorsque la pipette est éloignée de la surface de la cellule est déterminée comme un courant de référence (I_réf, Figure 1C). Ensuite, la pipette se déplace dans l’axe Z pour s’approcher de l’échantillon jusqu’à ce que le courant soit réduit d’une quantité prédéfinie par l’utilisateur (point de consigne), généralement 0,2%-1% de la _référence I (Figure 1C,trace supérieure). Le système enregistre ensuite la valeur Z à ce moment comme la hauteur de l’échantillon, ainsi que les coordonnées X et Y de ce point d’imagerie. Ensuite, la pipette est rétractée loin de la surface(Figure 1C,trace inférieure) à une vitesse définie par l’utilisateur, généralement de 700 à 900 nm/ms. Après la rétraction, la pipette (ou, dans notre cas, l’échantillon – voir figure 1B) est déplacée latéralement vers le point d’imagerie suivant, une nouvelle valeur de courant de référence est obtenue et la pipette s’approche à nouveau de l’échantillon, répétant le processus. Le mouvement X-Y de la pipette est préféré dans une configuration de microscope vertical qui est généralement utilisée pour les enregistrements des courants de mécanotransduction des cellules ciliées. Dans ce contexte, la sonde HPICM s’approche des faisceaux de cellules ciliées non pas par le haut mais à un angle^{de 32}. Cependant, la meilleure résolution de l’imagerie HPICM est obtenue dans une configuration de microscope inversé(Figure 1A,B),où le mouvement de l’échantillon dans les directions X-Y est découplé du mouvement Z de la nanopipette, éliminant ainsi les artefacts mécaniques potentiels.

En utilisant HPICM, nous avons obtenu des images topographiques de faisceaux de stéréocils de cellules ciliées internes et externes de souris et de rats, et avons même visualisé les liens entre les stéréocils d’environ 5 nm de diamètre^26,27. Le succès de l’imagerie des faisceaux de cellules ciliées avec cette technique repose sur plusieurs facteurs. Tout d’abord, le bruit (variance) du courant de la nanopipette doit être aussi faible que possible pour permettre le point de consigne le plus bas possible pour l’imagerie HPICM. Un point de consigne bas permet à la sonde HPICM de « détecter » la surface des stéréocils à une plus grande distance et à n’importe quel angle par rapport à l’approche de la sonde et, étonnamment, améliore la résolution X-Y de l’imagerie HPICM (voir Discussion). Deuxièmement, les vibrations et les dérives dans le système doivent être réduites à moins de 10 nm, car elles contribuent directement aux artefacts d’imagerie. Enfin, même si la sonde HPICM et l’étage de l’échantillon sont déplacés dans les axes Z et X-Y par les actionneurs piézoélectriques calibrés à rétroaction qui ont une précision d’un seul nanomètre ou mieux, le diamètre de la pointe de la nanopipette détermine la propagation du courant (volume de détection) et donc la résolution(Figure 1A). Par conséquent, avant d’imager des cellules ciliées vivantes, il est essentiel de tirer les pipettes adéquates, d’atteindre la résolution souhaitée avec des échantillons d’étalonnage et d’obtenir un faible bruit dans le système d’enregistrement.

Depuis au moins deux décennies, la technique SICM n’est pas disponible dans le commerce et elle n’a été développée que par quelques laboratoires dans le monde avec le laboratoire leader du professeur Korchev à l’Imperial College (Royaume-Uni). Récemment, plusieurs systèmes SICM sont devenus disponibles dans le commerce (voir Tableau des matériaux),qui sont tous basés sur les principes originaux de l’IAHP. Cependant, l’imagerie des faisceaux de stéréocils dans les cellules ciliées nécessite plusieurs modifications personnalisées qui sont techniquement difficiles (voire impossibles) dans les systèmes fermés « prêts à l’emploi ». Par conséquent, une certaine intégration des composants est nécessaire. Étant donné que la configuration HPICM représente un banc de serrage avec des exigences de vibration et de dérive plus strictes et un mouvement piézo-entraîné de la sonde HPICM et de l’échantillon(Figure 1D), cetteintégration est relativement facile pour tout chercheur, qui maîtrise le serrage de patch. Cependant, un scientifique sans formation appropriée aurait certainement besoin d’une formation en électrophysiologie d’abord. Malgré les défis restants tels que l’augmentation de la vitesse d’imagerie (voir Discussion),nous avons été en mesure d’imager des faisceaux de stéréocils dans des cellules ciliées vivantes avec une résolution à l’échelle nanométrique sans les endommager.

Cet article présente un protocole détaillé pour effectuer avec succès l’imagerie HPICM des faisceaux de cellules ciliées auditives vivantes dans les explants cochléaires de jeunes rats ou souris postnatals à l’aide de notre système personnalisé. Les composants intégrés sont répertoriés dans la table des matériaux. Le document décrit également les problèmes courants qui peuvent être rencontrés et comment les résoudre.

Protocol

L’étude a été réalisée conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Toutes les procédures animales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Kentucky (protocole 00903M2005). 1. Fabrication et test des nanopipettes Créer un programme dans l’extracteur de micropipette pour obtenir des pipettes avec une rés…

Representative Results

Le protocole présenté dans cet article peut être utilisé pour visualiser toutes les cellules vivantes avec une topographie complexe. En suivant ces étapes, nous obtenons régulièrement des images de faisceaux de cellules ciliées auditives de rats vivants (Figure 6B, D). Bien qu’ayant une résolution X-Y inférieure à celle des images SEM, nos images HPICM peuvent résoudre avec succès les différentes rangées de stéréocils, la forme des extrémités des stéré…

Discussion

Pour obtenir des images HPICM réussies, les utilisateurs doivent établir un système à faible bruit et à faible vibration et fabriquer des pipettes appropriées. Nous recommandons fortement l’utilisation d’étalons d’étalonnage AFM pour tester la stabilité du système avant d’essayer d’effectuer une imagerie de cellules vivantes. Une fois la résolution du système testée, les utilisateurs peuvent envisager d’imager un organe fixe d’échantillons Corti pour se familiariser avec les paramètres d’im…

Materials

Analog oscilloscope	B&K Precision	2160C	Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards	TED PELLA Inc	HS-100MG; HS-20MG	These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator	AMETEK/TMC	Everstill K-400	Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer	National Instruments Corporation	PCI-6221	Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement	Standford Research Systems	SIM900, SIM960, SIM980	Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage	AMETEK/TMC	Type II	Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier	Brownlee Precision	Model 440	Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller	Sutter Instrument	P-2000/G	Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Extracellular (bath) solution
Micromanipulator	Scientifica	PatchStar	Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope	Nikon	Eclipse TS100	Inverted optical microscope
Patch amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B	The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509.C2A	Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis)	Piezosystem jena	ENT 400 & 800	Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips	TED PELLA Inc	26028	Used in the fabrication of the chambers for the tissue
SICM controller & software*	Ionscope, UK (ionscope.com)	N/A	Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue	The Dow Chemical Company	734	Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod	A-M Systems	717500	Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner	Piezosystem jena	RA 12/24 SG	Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM,
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.