Summary
Här presenterar vi ett protokoll för Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), en beröringsfri skanningssondteknik som möjliggör nanoskala av avbildning av stereocilia-buntar i levande hörselhårceller.
Abstract
Innerörat hårceller upptäcker ljudinducerade förskjutningar och omvandlar dessa stimuli till elektriska signaler i ett hårpaket som består av stereocilia som är ordnade i rader med ökande höjd. När stereocilia avböjs rycker de på små (~ 5 nm i diameter) extracellulära spetslänkar som förbinder stereocilia, som förmedlar krafter till de mekanosensitiva flyttningskanalerna. Även om mekanotransduktion har studerats i levande hårceller i årtionden, kan de funktionellt viktiga strukturella detaljerna i mekanotransduktionsmaskineriet vid spetsen av stereocilia (såsom tip link dynamics eller transduction-dependent stereocilia remodeling) fortfarande studeras endast i döda celler med elektronmikroskopi. Teoretiskt sett har skanningssondtekniker, såsom atomkraftmikroskopi, tillräckligt med upplösning för att visualisera ytan av stereocilia. Men oberoende av bildframställningsläge skadar även den minsta kontakten av atomkraftmikroskopisonden med stereocilia-bunten vanligtvis bunten. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för hopping sond jonledning mikroskopi (HPICM) imaging av levande gnagare auditiva hårceller. Denna beröringsfria skanningssondteknik möjliggör tidsfördröjning av ytan av levande celler med en komplex topografi, som hårceller, med en enda nanometerupplösning och utan att göra fysisk kontakt med provet. HPICM använder en elektrisk ström som passerar genom glasnanopipetten för att upptäcka cellytan i närheten av pipetten, medan ett 3D-positionerande piezoelektriskt system skannar ytan och genererar dess bild. Med HPICM kunde vi avbilda stereocilia buntar och länkarna sammankopplade stereocilia i levande auditiva hårceller i flera timmar utan märkbar skada. Vi förväntar oss att användningen av HPICM kommer att möjliggöra direkt utforskning av strukturella förändringar i stereocilia av levande hårceller för bättre förståelse av deras funktion.
Introduction
Trots det faktum att stereocilia buntar i hörselhårcellerna är tillräckligt stora för att visualiseras av optisk mikroskopi och avledas i levande celler i ett patch clamp experiment, de väsentliga strukturella komponenterna i återgivningsmaskineriet såsom spetslänkar kunde endast avbildas med elektronmikroskopi i döda celler. I däggdjurssalongens hörselhåriga hårceller är givaren placerad i de nedre ändarna av spetslänkarna, dvs. vid spetsarna på den kortare radstereocilia1 och regleras lokalt genom signalering vid spetsarna av stereocilia2,3. Ändå är etikettfri avbildning av ytstrukturerna på denna plats i levande hårceller inte möjlig på grund av de små storlekarna av stereocilia.
Däggdjurs cochlea har två typer av auditiva sensoriska celler: inre och yttre hårceller. I de inre hårcellerna är stereocilia längre och tjockare jämfört med dem i de yttre hårcellerna4. Den första och andra raden av stereocilia har en diameter på 300-500 nm i mus- eller råtta inre hårceller. På grund av ljusets diffraktion är den maximala upplösningen som kan uppnås med en etikettfri optisk mikroskopi cirka 200 nm. Därför är visualisering av enskilda stereocilier inom första och andra raden i det inre hårcellspaketet relativt enkelt med optisk mikroskopi. Däremot har kortare radstereocilier i de inre hårcellerna och all stereocilia i de yttre hårcellerna diametrar runt 100-200 nm och kan inte visualiseras med optisk mikroskopi5. Trots de senaste framstegen inom superupplösning imaging, denna grundläggande begränsning kvarstår i alla optiska etikett-fria imaging. Alla nuvarande kommersiellt tillgängliga superupplösningstekniker kräver någon form av fluorescerande molekyler6, vilket begränsar deras applikationer. Förutom begränsningar på grund av behovet av specifika fluorescerande märkta molekyler har exponering för intensiv ljusbestrålning visat sig inducera cellskador och kan påverka cellulära processer, vilket är en stor nackdel när man studerar levande celler7.
Vår nuvarande kunskap om de strukturella detaljerna i hårcellstereocilia buntar har erhållits mestadels med olika elektronmikroskopi (EM) tekniker, såsom scanning elektronmikroskopi (SEM), transmission elektronmikroskopi (TEM), frys-fraktur EM, och nyligen med 3D-tekniker såsom seriell sektionering med fokuserad jonstråle eller kryo-EM-tomografi8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Tyvärr kräver alla dessa EM-tekniker kemisk eller kryofixering av provet. Beroende på fenomenens tidsskala gör detta krav en studie av de dynamiska processerna vid spetsarna av stereocilia antingen omöjligt eller mycket arbetsintensivt.
Begränsade ansträngningar har gjorts för att avbilda hår buntar av levande hårceller med atomkraftmikroskopi (AFM)17,18. Eftersom AFM arbetar i fysiologiska lösningar kan det i teorin visualisera dynamiska förändringar i stereociliabuntarna av levande hårceller över tid. Problemet ligger i principerna för högupplöst AFM, vilket innebär viss fysisk kontakt mellan AFM-sonden och provet, även i det minst skadliga "tappning" -läget19. När AFM-sonden stöter på ett stereocilium kraschar den vanligtvis mot den och skadar hårbuntens struktur. Som ett resultat är denna teknik inte lämplig för att visualisera levande, eller ens fasta, hårceller buntar17,18. Problemet kan delvis lindras genom att använda en stor kulformad AFM-sond som endast inför hydrodynamiska krafter påprovytan 20. Även om en sådan sond är idealisk för att testa prov21mekaniska egenskaper, ger den dock endast en submikrometerupplösning vid avbildning av corti22-organet och gäller fortfarande för provet en kraft som kan vara betydande för de mycket känsliga stereociliabuntarna.
Scanning jonledningsmikroskopi (SICM) är en version av scanning sondmikroskopi som använder en glaspipett sond fylld med en ledande lösning23. SICM detekterar ytan när pipetten närmar sig cellen och den elektriska strömmen genom pipetten minskar. Eftersom detta händer långt innan du rör vid cellen är SICM idealisk för beröringsfri avbildning av levande celler i fysiologisk lösning24. Den bästa upplösningen av SICM är i ordningen av enstaka nanometer, vilket gör det möjligt att lösa enskilda proteinkomplex vid plasmamembranet i en levande cell25. Men i likhet med andra skanningssondtekniker kan SICM endast avbilda relativt plana ytor. Vi övervann denna begränsning genom att uppfinna hoppningssondjonledningsmikroskop (HPICM)26, där nanopipetten närmar sig provet vid varje bildpunkt (figur 1A). Med hjälp av HPICM kunde vi avbilda stereocilia-buntar i levande hörselhårceller med nanoupplösning27.
En annan grundläggande fördel med denna teknik är att HPICM inte bara är ett bildverktyg. I motsats till andra skanningssondtekniker är HPICM/ SICM-sonden en elektrod som ofta används i cellfysiologi för elektriska inspelningar och lokal leverans av olika stimuli. Jonkanalaktivitet stör vanligtvis inte HPICM-avbildning, eftersom den totala strömmen genom HPICM-sonden är flera storleksordningar större än den extracellulära strömmen som genereras av de största jonkanalerna25. HPICM tillåter dock exakt positionering av nanopipetten över en struktur av intresse och efterföljande enkanalig patchklämmainspelning från denna struktur28. Så här fick vi de första preliminära inspelningarna av enkanalsaktivitet vid spetsarna på den yttre hårcellen stereocilia29. Det är värt att nämna att även en stor ström genom nanopipetten inte kan producera betydande förändringar av potentialen över plasmamembranet på grund av enorm elektrisk shunt av det extracellulära mediet. Enskilda jonkanaler kan dock aktiveras mekaniskt genom vätskeflöde genom nanopipetten30 eller kemiskt genom lokal applicering av en agonist31.
I HPICM genereras bilden när en nanopipette sekventiellt närmar sig provet vid en punkt, drar sig tillbaka och sedan rör sig i lateral riktning för att upprepa tillvägagångssättet (figur 1A). En patchklämmaförstärkare applicerar konstant spänning på en AgCl-tråd i pipetten(figur 1B) för att generera en ström på ~1 nA i badlösningen. Värdet på denna ström när pipetten är borta från cellens yta bestäms som en referensström (Iref, figur 1C). Pipetten flyttas sedan i Z-axeln för att närma sig provet tills strömmen minskas med en mängd som fördefinierats av användaren (börvärde), vanligtvis 0,2%-1% av Iref (bild 1C, toppspårning). Systemet sparar sedan Z-värde just nu som provets höjd, tillsammans med X- och Y-koordinater för denna bildpunkt. Därefter dras pipetten bort från ytan (bild 1C, bottenspår) med en hastighet som definieras av användaren, vanligtvis 700-900 nm/ms. Efter återkallelse flyttas pipetten (eller i vårt fall provet - se figur 1B) i sidled till nästa bildpunkt, ett nytt referensströmvärde erhålls och pipetten närmar sig återigen provet och upprepar processen. Pipettens X-Y-rörelse föredras i en upprätt mikroskopinställning som vanligtvis används för inspelningar av hårcellens mekanotransduktionsströmmar. I den här inställningen närmar sig HPICM-sonden hårcellsbuntarna inte uppifrån utan i en vinkel32. Den bästa upplösningen av HPICM-avbildning uppnås dock i en inverterad mikroskopinställning (figur 1A, B), där provets rörelse i X-Y-riktningar kopplas bort från nanopipettens Z-rörelse, vilket eliminerar potentiella mekaniska artefakter.
Med hjälp av HPICM fick vi topografiska bilder av mus och råtta inre och yttre hårcell stereocilia buntar, och även visualiserade länkarna mellan stereocilia som är ca 5 nm i diameter26,27. Framgången för hårcell bunt imaging med denna teknik beror på flera faktorer. För det första bör nanopipetströmmens brus (varians) vara så litet som möjligt för att möjliggöra lägsta möjliga börvärde för HPICM-avbildning. Ett lågt börvärde gör det möjligt för HPICM-sonden att "känna" stereociliaytan på ett större avstånd och i vilken vinkel som helst mot sondens tillvägagångssätt och förbättrar överraskande X-Y-upplösningen av HPICM-avbildning (se Diskussion). För det andra bör vibrationerna och drivorna i systemet minskas till mindre än 10 nm, eftersom de bidrar direkt till bildföremålen. Slutligen, även om HPICM-sonden och provstadiet flyttas i Z- och X-Y-axlar av de kalibrerade återkopplingskontrollerade piezo-ställdonen som har en noggrannhet på en enda nanometer eller bättre, bestämmer nanopipettspetsens diameter spridningen av strömmen (avkänningsvolymen) och därmed upplösningen (figur 1A). Därför, innan du avbildar levande hårceller, är det viktigt att dra lämpliga pipetter, nå önskad upplösning med kalibreringsprover och uppnå lågt brus i inspelningssystemet.
Under minst ett par decennier har SICM-tekniken inte varit kommersiellt tillgänglig och den har utvecklats av endast få laboratorier i världen med det ledande labbet av Prof. Korchev i Imperial College (UK). Nyligen blev flera SICM-system kommersiellt tillgängliga (se Materialförteckningen), som alla är baserade på de ursprungliga HPICM-principerna. Att avbilda stereociliabuntar i hårcellerna kräver dock flera anpassade modifieringar som är tekniskt utmanande (eller till och med omöjliga) i de slutna "ready-to-go"-systemen. Därför behövs viss komponentintegration. Eftersom HPICM-installationen representerar en patchklämma med strängare vibrations- och driftkrav och en piezodriven rörelse av HPICM-sonden och provet (figur 1D), är denna integration relativt enkel för alla forskare, som är skickliga på patchklämmor. Men en forskare utan ordentlig bakgrund skulle definitivt behöva lite utbildning i elektrofysiologi först. Trots återstående utmaningar som att öka hastigheten på avbildning (se Diskussion) har vi kunnat avbilda stereocilia-buntar i levande hårceller med upplösning i nanoskala utan att skada dem.
Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll för att utföra framgångsrika HPICM imaging av levande auditiva hår cell buntar i unga postnatala råtta eller mus cochlear explants med hjälp av vårt anpassade system. De integrerade komponenterna listas i tabellen över material. I dokumentet beskrivs också vanliga problem som kan uppstå och hur du felsöker dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien utfördes i enlighet med rekommendationerna i guiden för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Kentucky (protokoll 00903M2005).
1. Tillverkning och testning av nanopipetter
- Skapa ett program i mikropipettens puller för att erhålla pipetter med ett motstånd mellan 200 och 400 MΩ, vilket motsvarar innerspetsdiametrar på cirka 50-70 nm. Parametrarna beror på mikropipettens puller. För att få korta pipetter med icke-flexibla fina spetsar, kontrollera dragarens bruksanvisning.
- Använd borosilikatglaskapillärer med ytterdiametrar på 1/0,58 mm och en inre glödtråd för att underlätta fyllningen. Pipettens längd är avgörande eftersom den bestämmer frekvensen av pipettens laterala mekaniska resonans. Ju längre pipetten är, desto lägre är resonansfrekvensen och desto svårare är det att undvika denna resonans.
OBS: Användaren bör försöka tillverka den kortaste pipett som hållaren kan acceptera. Längden på nanopipetter i detta experiment är vanligtvis 15-25 mm (figur 2A). - Fyll nanopipetten upp till mittenpunkten (figur 2A) med en badlösning, antingen Leibovitz L-15 eller med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) kompletterad med 20 mM D-glukos (för att justera osmolaritet). För att undvika potentiella artefakter, använd samma lösning som kommer att användas i badet för inspelningar.
- Använd ett optiskt mikroskop med en förstoring på 10x och kontrollera om det finns bubblor vid pipettens spets (figur 2B). Bubblorna skulle förhindra det aktuella flödet. Det är svårare att ta bort bubblor i pipetterna som har dragits flera timmar före experimentet. Därför rekommenderas att dra nya pipetter med varje experiment.
- När pipetten är fri från bubblor monterar du den i HPICM-pipettens hållare(figur 2C).
- Placera provet (vävnads- eller kalibreringsstandard) på den specialbyggda kammaren och tillsätt 4 ml av ovannämnda badlösning.
- Placera den specialbyggda kammaren på HPICM-scenen och introducera markelektroden i lösningen.
- Se till att spänningen som appliceras på pipetten av plåsterförstärkaren är noll.
- Flytta pipetten i Z tills den vidrör vätskan.
- Ställ in förstärkarens förskjutning på noll och lägg sedan till +100 mV för att kontrollera pipettströmmen.
- Beräkna pipettens motstånd och diameter, baserat på Ohms lag:
R = V/I
där R är motståndet (MOhm), V är den spänning som appliceras på nanopipetten (mV) och jag är den ström som strömmar genom nanopipetten (nA).- Beräkna pipettens innerdiameter enligt beskrivningen någon annanstans enligt följande formel12:
ID-tips = 1000/ √R
OBS: Det ideala motståndsvärdet är mellan 200 och 400 MΩ. Pipetter med ett motstånd som är högre än 400 MΩ kan leda till en instabil ström på grund av deras lilla storlek (< 50 nm innerdiameter). Tvärtom är pipetter med motstånd mindre än 200 MΩ för stora (> 70 nm innerdiameter) och skulle inte lösa små funktioner. Det rekommenderas att börja avbilda med pipetter med 200 MΩ-motstånd, eftersom de är lättare att tillverka och tenderar att ge mindre elektriskt brus.
- Beräkna pipettens innerdiameter enligt beskrivningen någon annanstans enligt följande formel12:
2. Minimera provdrifter och vibrationer
OBS: För att minska det mekaniska bruset i systemet under avbildning, montera proverna på de specialbyggda kamrarna som använder tjocka glasrutschbanor (~ 1,2 mm):
- Ta bort glasdelen från en 50 mm glasbottenskål och lämna plastväggarna intakta.
- Limma plastdelen av cellodlingsformen ovanpå den tjocka glasrutschbanan med silikonlim.
- Montera kalibreringsprovet i mitten av kammaren (ovanpå glasrutschbanan) med antingen silikonlim eller tunt dubbelsidigt tejp.
- Fäst kammaren ordentligt på HPICM-scenen med dubbelhäftande tejp.
- Stäng Faraday-buren under avbildningen och täck den med en filt för att minimera elektriska störningar och termisk drift, på motsvarande sätt.
3.Testa upplösningen med AFM-kalibreringsstandarder
OBS: Det rekommenderas starkt att avbilda AFM-standarder (se Tabell över material)innan du avbildar levande celler för att felsöka systemet och testa dess upplösning i X-Z-Y-axlarna. Kalibreringsstandarderna har kiseldioxidpelare och hål av olika former men fasta höjder/djup (dvs. 20 eller 100 nm) på ett 5 x 5 mm kiselchip. Från och med kalibreringsstandarden 100 nm rekommenderas för att garantera att Z-upplösningen är under 100 nm. Efter att ha uppnått en lyckad högupplöst bild av pelarna eller hålen i detta kalibreringsprov (figur 3A), gå vidare till 20 nm-standarden. Om avbildningen av den senare standarden lyckas (figur 3B), är upplösningen i Z-axeln garanterad under 20 nm och lämplig för avbildning av hårcellsstereociliabuntar12. Följande steg används för att avbilda båda kalibreringsstandarderna.
- Fäst kalibreringsstandarden på kammaren med silikonlim.
- Tillsätt 4 ml HBSS i kammaren för att täcka kalibreringsprovet. Fäst sedan kammaren till XY-stadiet i HPICM-installationen med dubbelhäftande tejp.
- Kläm fast markelektrodens magnetiska hållare på scenen nära kammaren och sänk ner elektroden i badlösningen (figur 1B).
- Montera nanopipetten i hållaren, sänk ner den i badlösningen och ställ in dess ström på ~1 nA enligt de steg som beskrivs i avsnitt 1.
- Placera nanopipetten ungefär ovanför kalibreringsstandardens mitt med hjälp av en kursplåster-klämmanipulatör. Visuell inspektion är vanligtvis tillräckligt för denna positionering, eftersom det område som täcks av kiseldioxidstrukturer är relativt stort (1 x 1 mm). Till skillnad från Corti-explanternas organ (se nedan) är kalibreringsstandarden icke-transparent och därför är en mer exakt positionering styrd av optisk avbildning inte möjlig för detta prov.
- Öka börvärdet samtidigt som du övervakar signalen från Z piezo-ställdonets sensor på ett oscilloskop i realtid. När du har etablerat en stabil repeterbar Z-inflygningscykel (som i figur 1C, nederkant), minska börvärdet till det värde som ligger strax ovanför instabilitetspunkten. Detta förfarande skulle säkerställa ett optimalt börvärde för just denna nanopipette.
- Flytta pipetten nedåt med en hastighet av ~5 μm/s med en patchklämma mikromanipulator tills den når provet. För närvarande kommer bottennivån för Z-positioneringssignalen i realtid (figur 1C) att öka, vilket indikerar att nanopipetten dras tillbaka på grund av att provytan "känner av". Varje ytterligare rörelse av nanopipetten kommer att resultera i ytterligare positiv förskjutning av Z-positioneringssignalen.
OBS: Var försiktig så att du inte överskrider den övre gränsen för Z piezo-ställdonsrörelsen. - Börja avbildningen med låg upplösning (se tabell 1). På grund av ojämn montering av AFM-standarden kan den högsta punkten i intresseområdet vara okänd. Ställ därför in amplituden för pipetterupprullning (humleamplitud) på minst 200-500 nm.
- När den högsta punkten för provet i bildområdet har identifierats minskar du humleamplituden. En mindre humleamplitud möjliggör snabbare skanning, vilket är att föredra för högupplöst avbildning på grund av minskade effekter av drivorna och minskad vibration.
- Innan pipetten flyttas till en ny X-Y-plats, dra tillbaka den ca 200 μm i Z-axeln för att förhindra oönskade kollisioner med provet.
OBS: I de fall nanopipetten inte är i linje med kalibreringsstandardens mitt är det möjligt att skanningen startar precis utanför ytans egenskaper. - När intresseområdet har hittats börjar du avbilda med högre upplösning (se tabell 1).
4. Göra specialbyggda kammare för att säkra cochlea explants
OBS: Montera cochlea-explanterna i kamrarna med specialbyggda fastspänningssystem som använder antingen flexibla glaspipetter (steg 4.1) (figur 4A) eller tandtråd (steg 4.2) (figur 4B). Glaspipettens kammare kan steriliseras och användas för Cortis odlade organ, medan tandtrådskammaren ger en säkrare håll i provet och en kontroll över stereociliabuntorientering under montering. Dessa specialbyggda kammare måste förberedas i förväg, men de kan rengöras och återanvändas i flera bildbehandlingssessioner.
- Gör en kammare med flexibla glaspipetter
- Dra två tunna och flexibla glasfibrer från kapillärer av glas med hjälp av en pipettdragare. Våra dragna glasfibrer är vanligtvis 1 till 2 cm långa och är ganska flexibla.
- Placera en liten droppe silikonelastomer ovanpå ett glasöverdrag. Använd täckglas med en diameter på 2 cm.
- Placera ändarna av två glasfibrer på silikondroppen och ordna fibrerna så att de har en liten grad av separation mellan dem (figur 4A).
- Placera täcket på en kokplatta för att snabbt härda elastomer (1 till 3 min).
- Limma täcket på glasbotten i kammaren som beskrivs i avsnitt 2 med hjälp av en liten mängd (1-3 μL) silikonelastomer och låt den härda över natten.
- Göra en kammare med tandtråd:
- Ta bort glasdelen av en 50 mm glasbottenskål och lämna plastväggarna intakta. Limma sedan plastdelen av cellodlingsfatet ovanpå en 1,2 mm tjock glasrutschbana med silikonlim.
- Montera ett plastöverdrag (6,5 x 6,5 mm) med samma lim i mitten av kammaren. Upprepa sedan processen med ett annat täckslip ovanpå det föregående.
- Montera två små volfram- eller guldpläterade trådar (12 mm långa och ~ 0,5 mm i diameter) med kisellim, var och en på motsatta sidor av täckbilderna. Limma dem tillräckligt långt (> 10-15 mm) från täckbilderna (figur 4B).
- Separera två tandtrådssträngar och placera dem ovanpå täckbilderna och fäst dem på ledningarna genom att göra en knut. Lämna ett litet mellanrum mellan båda strängarna (figur 4B, korta pilar).
- Rengör kamrarna efter varje användning
- Ta försiktigt bort vävnaden från kammaren med fina pincett och skrapa lätt eventuella vävnadsrester som lämnas kvar.
- Skölj kammaren först med 70% etanol och sedan med destillerat vatten.
- Upprepa sköljcykeln om det behövs.
- Placera kammaren upp och ner på ett filterpapper för att låta den torka till nästa experiment. Kamrarna behöver inte steriliseras, såvida inte odling av Cortis organ planeras efter avbildningen.
5. Dissekera Cortis gnagareorgan
- Utför dissekering av de unga postnatala cochlear explants som beskrivs i detalj någon annanstans13.
- För HPICM-avbildning dissekerar Cortis organ från möss mellan postnatala dagar 3 och 6 (P3-6) och från råttor mellan postnatala dagar 3 och 8 (P3-8).
OBS: Äldre hårceller är mer mottagliga för skadan under dissekering och kan därför inte användas för timmar lång tidsfördröjning HPICM-avbildning. - Glöm inte att ta bort tectorialmembranet före HPICM-avbildning.
- Omedelbart efter dissekeringen, fäst vävnaden i en av de kammare som beskrivs i avsnitt 4, antingen placera den under de flexibla glaspipetterna eller under de två tandtrådssträngarna(figur 4). Förfyll dessa kammare med 4 ml av rumstemperaturbadlösningen (för att minimera bubbelbildning).
6. Avbildning av hörselhåriga hårceller
- Montera kammaren med ett nyisolerat organ av Corti på X-Y piezo-scenen med dubbelhäftande tejp och se till att den är ordentligt fastsatt för att minimera kammardrift i X- och Y-axlar (figur 1B).
- Följ stegen i avsnitt 1 för att placera en ny nanopipette och kontrollera om det finns rätt pipettmotstånd.
- Använd patch clamp micromanipulator, placera nanopipette över hårcellsregionen, samtidigt observera organ av Corti explant i ett inverterat mikroskop.
- Kontrollera om systemet är stabilt med ett börvärde på 0,5 % eller lägre genom att registrera realtidsströmmen och Z-positioneringssignalen på oscilloskopet (som i figur 1C). Om Z-signalen inte är stabil, försök att minska cutoff-frekvensen för lågpassfiltret på plåsterförstärkaren. Det kan dock inte vara lägre än responstiden för Z piezo-ställdon (för att undvika pipettkollision med provet på grund av fördröjda strömavläsningar).
OBS: I praktiken visar det sig att 5 kHz-inställningen för detta filter är optimal. Det är bättre att byta ut nanopipetten, om Z-signalen fortfarande är instabil. - När en stabil registrering har uppnåtts bestämmer du det optimala börvärdet och närmar dig provet med HPICM-pipett enligt beskrivningen i stegen 3.6-3.7 ovan.
- Utför först lågupplöst avbildning (se tabell 1) med en humleamplitud på minst 6–8 μm. Om du vill avbilda höga strukturer som hårcellsstereociliabuntar, se till att humleamplituden är tillräcklig för att undvika kollision med dessa strukturer.
OBS: Om humleamplituden inte räcker kommer pipetten inte att kunna hoppa över ett stereocilium och det kommer att bli en överhängande kollision. Kollisionen mellan HPICM-sonden med ett stereocilium kan skada hårfästet. Använd därför en större humleamplitud i de fall då höjden på stereocilia-paketet är osäker. - Bekanta dig med topografin hos Cortis organ genom att först utföra och/eller studera bilder erhållna med scanningelektronmikroskopi (figur 5).
OBS: Om HPICM-bilden är enhetlig med höjderna mindre än 1 μm i varje bildpunkt, skannar pipetten sannolikt glasbotten och inte vävnaden. Alternativt kan pipetten "landa" på en annan region i cochlea-explanten, bort från hårcellerna. - Om pipetten behöver flyttas till en ny X-Y-plats, dra tillbaka den ca 500 nm för att undvika kollisioner med några höga funktioner i vävnaden. Upprepa lågupplöst HPICM-avbildning tills den region som är av intresse med hårcellerna hittas.
- När intresseområdet har hittats börjar du avbildningen med en högre upplösning (se tabell 1). Försök att spendera mindre än 15 minuter när du avbildar en hel hårbunt.
OBS: Hårcellsbuntarna i den levande vävnaden är inte stilla men kan ändra deras orientering, till exempel på grund av formförändringar i de underliggande stödcellerna. Därför kan bilderna uppvisa rörelseföremål om bildförvärvet är för långsamt. - Återigen bestämmer du de högsta funktionerna i lågupplösta bilder innan du minskar humleamplituden för högupplöst avbildning. För en region av intresse som täcker hela hårcellsbunten, minska humleamplituden till 4-5 μm, medan för en relativt liten och "platt" region inom bunten (t.ex. 2 x 2 μm) minska humleamplituden ytterligare, ner till mindre än 1 μm, vilket ökar hastigheten och upplösningen på avbildningen.
7. Bildbehandling
OBS: Imaging artefakter är vanliga i HPICM imaging. Vissa av dem kan korrigeras med bildförvärvsparametrar, medan andra kräver efterbehandling antingen med en specialiserad SICM-tittare eller med mer allmänna databehandlingsprogram som ImageJ eller MatLab. Här beskriver vi de vanligaste artefakterna och hur vi fixar dem med SICM-tittare.
- Utföra lutningskorrigering
OBS: Det är inte uppenbart för en nybörjare, men mänskligt öga kan inte lösa submikrometerstorleksfunktioner vid ytan av en cell, om bildområdet har en övergripande lutning av lika eller större storlek(figur 3A,B, vänster). Därför är det nödvändigt att bestämma den genomsnittliga lutningen för ett avbildat område (genom att montera HPICM 3D-bilddata på ett enda plan) och subtrahera den från HPICM-bilden(figur 3A,B, mitten).- Klicka på Öppna om du vill öppna en bild med SICM-visningsprogrammet.
- Välj fliken Bildkorrigering.
- Välj fliken Rätt lutning.
- Tryck på knappen Rätt lutning för en automatisk lutningskorrigering.
- Utför linjejustering
OBS: Som nämnts tidigare utgör mekaniska och/eller termiska drivor samt cellrörelseföremål ett betydande problem vid HPICM-avbildning. En liten drift med en hastighet på mindre än en mikrometer per minut märks vanligtvis inte i en vanlig patchklämma. Ändå kan det producera artefakter av flera tiotals nanometer i HPICM imaging, som är betydligt större än upplösningen av HPICM. Därför är det inte ovanligt att stöta på plötsliga hopp i Z-axeln mellan två närliggande HPICM-skanningslinjer under avbildning. Detta kan korrigeras genom att analysera skillnader mellan start (och/eller slut) Z-värden i dessa närliggande genomsöknings linjer.- Klicka på Öppna om du vill öppna en bild med SICM-visningsprogrammet.
- Välj fliken Bildkorrigering.
- Välj fliken Rätt lutning.
- Välj bredden på de linjer som ska justeras. Tryck på knappen ButtonDestripeLineFit för en automatisk justeringskorrigering för linje.
- Utför brusreducering
OBS: När du får bilder med HPICM kan små fluktuationer i nanopipettens ström leda till att nanopipetten stannar långt från provets yta, särskilt med låga börvärde. Det resulterar i utseendet på små vita prickar i bilden. För att korrigera denna bildbehandlingsartefakt är det nödvändigt att identifiera bildpunkterna med Z-värdet betydligt större än grannarnas och ersätta detta värde med ett genomsnitt av grannarna. Detta görs med ett justerbart mittfilter.- Klicka på Öppna om du vill öppna en bild med SICM-visningsprogrammet.
- Välj fliken Bildbehandling.
- Välj fliken Brusreducering.
- Ställ in tröskelvärdesfiltret (μm) för de pixlar som ska tas bort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som presenteras i detta dokument kan användas för att visualisera alla levande celler med komplex topografi. Efter dessa steg får vi rutinmässigt bilder av levande råtta auditiva hårcellsbuntar(Figur 6B, D). Trots att vi har lägre X-Y-upplösning jämfört med SEM-bilder kan våra HPICM-bilder framgångsrikt lösa de olika raderna av stereocilia, formen på stereociliaspetsarna och till och med de små länkarna (~ 5 nm i diameter) som förbinder intilliggande stereocilia(figur 6F). Dessutom har HPICM-bilder information i 3D som SEM-bilder saknar. Med tanke på den beröringsfria karaktären hos denna typ av bildteknik kunde vi också utföra kontinuerlig hpicm-avbildning av samma hårcellsbunt i flera timmar (dvs. 5-6 h regelbundet) utan att skada buntsammanhållningen (figur 7). Hpicm uppvisar således en stor potential för studier av dynamiska strukturella förändringar av hårcellsbuntarna över tid.
Även om vi tillhandahåller flera intervall för pipettstorlek, nuvarande börvärde, låg- och högupplösta parametrar och humleamplituder, kan varje användare behöva optimera sina inställningar något för att få framgångsrika HPICM-bilder av levande hårcellspaket. Mindre börsvärde ger bilder av bättre kvalitet. Men med ett mycket lågt börvärde kan systemet tolka små fluktuationer i strömmen som att stöta på cellytan och detta kommer att leda till det "vita prickljudet" i bilden (figur 8A). På samma sätt kan stora humleamplituder öka pipettens laterala resonans och även producera bullriga pixlar (figur 8B). Om humleamplitituden däremot är för liten eller börvärdet är för högt kan nanopipetten kollidera med provet och leda till bildföremål eller till och med skada hårfästet (figur 8C,D). Vi rekommenderar att du utför avbildningen med lägre upplösning samtidigt som du justerar alla dessa parametrar för att minimera skador på provet eller nanopipetten.
Figur 1: Principer för hoppningssondjonledningsmikroskopi (HPICM). ( A) En elektrisk ström som passerar genom nanopipetten genererar en "avkänningsvolym" vid pipettens spets. För att avbilda komplexa strukturer som hårcellsstereociliabuntar närmar sig pipetten mot cellytan ovanifrån och dras tillbaka efter att ha upptäckt ytan. Efter en lateral rörelse i varje steg fortsätter pipetten att "hoppa" ovanför provet som genererar bilden av cellen. Observera att humleamplituden måste vara tillräcklig för att pipetten ska "klättra" till ett stereocilium. Illustrerad hoppamplitud skulle fungera för vänster till höger-skanning (från minsta till ett högsta stereocilium, indikerat av en pil). Den är dock för liten för höger-till-vänster-skanning när pipetten möter det högsta stereociliumet först. (B)Experimentell installation. En specialtillverkad kammare med Corti-explantens organ är monterad på ett XY-nanopositioneringssteg med en bländare för optisk mikroskopiobservation. Nanopipetten flyttas av ett separat ultrasnabbt Z piezo-ställdon. För att placera nanopipetten över den intresseområde som är av intresse är Z-ställdon monterat på en konventionell mikromanipulator (visas inte) tillsammans med plåsterförstärkarens huvudställning. Jordelektroden monteras på en magnetisk hållare och sätts in i badet. (C) Representativa registreringar av pipettens ström(toppspår) och Z-positionen för pipetten (bottenspår) under avbildningen. När pipetten är borta från cellytan bestäms referensvärdet för den ström som passerar genom pipetten (Iref). Sedan flyttas pipetten mot provet (tillvägagångssätt). När "avkänningsvolymen" möter cellytan börjar pipettens ström minska. Kommandot för uttag utfärdas när den aktuella minskningen når ett börvärde, vilket vanligtvis är 0,2% - 1% av Iref. (D) Scheman för den utrustning som behöver läggas till en konventionell patchklämmainställning för HPICM-avbildning. En dedikerad patchklämmaförstärkare registrerar nanopipettströmmen (I) som används av SICM-styrenhet i HPICM-läge för att generera kommandosignaler till X-, Y-och Z-axlar. Instrumenteringsförstärkare ger offset, skalning och lågpassfiltrering till dessa signaler, om det behövs. Tyvärr kan X/Y/Z-signaler från styrenheten inte appliceras direkt på piezo-ställdonen på grund av stora fel orsakade av hysteres och krypning som är inneboende i piezokeramik. Därför har varje piezo-ställdon (översättningssteg) en inbyggd rörelsesensor som skickar feedbacksignal till den proportionella integralderivatstyrenheten (PID) som förformar kommandosignalen för att korrigera för dessa fel. Observera att relativt långsamma X- och Y-axlar kan använda PID-styrenheter som är byggda i piezoförstärkaren, medan en snabbare Z-axel kräver en dedikerad snabb PID-styrenhet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Nanopipettetillverkning och fyllning. (A) En cirka 2 cm lång nanopipett fylld med intrapipettlösningen (HBSS). (B) En bild av bubblan (pilen) som vanligtvis bildas efter fyllning av pipetten. Bubblan rör sig vanligtvis bort inom några minuter efter mikroskopbelysning (ett LCD-digitalt mikroskop vid 10x). (C) En nanopipette monterad i SICM-huvudet. Pilen pekar på AgCl-elektroden inuti pipetten. Observera att pipettens hållare är silvermålad och jordad för att minimera strålningselektriv från Z piezo-ställdonet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Avbildning av AFM-kalibreringsstandarder för att bestämma tillräcklig stabilitet, vibrationsisolering och elektriskt brus i systemet. (A) Råa (vänster), efterbehandlade (mitten) och 3D(höger) bilder av HS-100MG kalibreringsstandarden. Standardens ytprofil visas schematiskt högst upp. Eftersom standarden aldrig är perfekt vinkelrät mot nanopipetten behövs korrigeringen efter bearbetningen för att avslöja små vertikala egenskaper hos provet. (B) Liknande råa (vänster), efterbehandlade (mitten) och 3D (höger) bilder av HS-20MG kalibreringsstandard som har mindre, 20 nm djupa indrag. Observera att gråskalan för en pixel i en HPICM-bild anger provets höjd vid den punkten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Montering av Cortis organ. ( A) Explanten hålls av två glaspipetter som limmas på petriskålen med glasbotten. (B) Explanten säkras av två tandtrådssträngar (korta pilar) i en specialtillverkad bildkammare. Infälld visar förstorad bild av Cortis organ. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: Navigering av HPICM-sonden till hårcellsområdet. ( A) SEM-bild av cochlea-explanten som visar rader av inre (IHCs) och yttre (OHC) hårceller och distinkta typer av stödjande celler. (B)Representativ HPICM-bild av cellerna i Kollikers organ. C) En HPICM-bild av Hensens celler. Observera att dessa två typer av stödceller har mycket distinkta former, vilket hjälper till att avgöra om HPICM-sonden landade i ett område som är radiellt eller perifert för hårcellerna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Jämförelse mellan scanningelektronmikroskopi (SEM) och hoppning sondjonjonledningsmikroskopi (HPICM) avbildning av stereocilia buntar i unga postnatala gnagare inre hårceller. (A,C) SEM-bilder ger sub-nanometerupplösning av ytdetaljerna men i cellerna som är fasta och krympta på grund av kritisk punkttorkning. Dessutom tillåter SEM-bilder inte 3D-analys. (B,D) HPICM-bilder (vänster) har en sämre upplösning (~ 5-10 nm) men de erhålls i levande celler, tillåter tidsfördröjning och bär information om exakta höjder, vilket möjliggör 3D-rekonstruktion och mätningar (höger). (E,F) Extracellulära länkar mellan stereocilia är uppenbara i både SEM (E) och HPICM (F) bilder (pilar). Cellålder: A, postnatal dag 5 (P5) mus; B, P6 råtta; C, P8 mus; D, P5 råtta; E, P7 mus; och F, P5 råtta. I alla HPICM-bilder anger gråskalan för en pixel höjden på provet vid den punkten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Kontinuerlig tidsfördröjning HPICM-avbildning av stereociliabunt. (A) En översikt över ett inre hårcellspaket från P5 råtta som visar distinkt kortare rad stereocilia. b)Tidsfördröjning av den intresseregion som anges i A under sex timmar. Observera att hårcellerna, i motsats till ett typiskt patchlägerexperiment, inte visar några tecken på försämring under flera timmar in vitro. Detta beror på noggrann dissekering och frånvaron av mekaniska störningar i cellen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Vanliga artefakter vid avbildning med HPICM. (A) Effekten av ett för lågt börvärde. Lågupplösta HPICM-bilder av samma levande inre hårcellsbuntar i P3-möss förvärvade med börvärde 0,05% (vänster) och 0,07% (höger). Lägg märke till ett vitt punktljud som försvinner med högre börvärde. (B)Effekten av en för hög humleamplitud. Vitt punktljud visas också i en HPICM-bild av en P7 råtta inre hårcell bunt erhållen med en stor humle amplitud på 5,8 μm (vänster). Detta brus försvinner när samma bunt avbildas med humleamplituden på 3,4 μm (höger) på grund av minskningen av vibrationer i systemet. (C) För låg humleamplitud resulterar i att HPICM-sonden kolliderar med stereocilia och drar dem (pilar på vänster panel). Genom att öka humleamplituden tillräckligt för att "klättra över" eliminerar stereocilier denna artefakt (höger) men kan också öka bildtiden, vilket resulterar i en märkbar drift (vertikala linjer i den högra panelen). Stereocilia bunt av en levande yttre hårcell från P7 råtta. (D) För hög börvärde orsakar en kvadratisk form av stereociliaspetsar (pilar) i en HPICM-bild (vänster), återigen på grund av att nanopipetten kolliderar med stereocilia. Minskande börvärde (med samtidig minskning av hoppamplituden för att eliminera vitt brus) förbättrar avbildningen (höger). Stereocilia bunt av en levande inre hårcell från P6 råtta. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Resolution | Bildområde (μm) | Lateral upplösning (nm) | Tid per bild (minuter) |
| Låg | 20×20 | ≥300 | ≤20 |
| Låg | 10×10 | 156 ≥ | 15 ≤ |
| Låg | 5×5 | ≥75 | ≤4 |
| Hög | 20×20 | ≤200 | ≤20 |
| Hög | 10×10 | ≤110 | 15 ≤ |
| Hög | 5×5 | ≤55 | ≤4 |
Tabell 1: Typiska tider för HPICM-avbildning beroende på storleken på bildområdet och skanningsupplösningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att få framgångsrika HPICM-bilder måste användarna upprätta ett system med lågt brus och låg vibration och tillverka lämpliga pipetter. Vi rekommenderar starkt användning av AFM-kalibreringsstandarder för att testa systemets stabilitet innan du försöker utföra någon live cellavbildning. När systemets upplösning har testats kan användare överväga att avbilda fast organ av Corti-prover för att bekanta sig med bildinställningarna innan de försöker någon live-cellavbildning.
Den optimala börvärdet för avbildning varierar mellan olika pipetter, beroende på den individuella formen på deras spetsar (som är okänd tills den undersöks av elektronmikroskopi) och på mängden smuts som fästs på spetsen, vilket också är oförutsägbart. Nanopipetter med ett optimalt börvärde över 0,7 % ska kasseras.
Vid avbildning av levande celler ökar mängden damm och skräp i den extracellulära lösningen med tiden. Alla dessa partiklar kan hamna vid pipettens spets, vilket orsakar en minskning av strömmen och gör det omöjligt att fortsätta skanna vävnaden - bilden blir helt vit eftersom feedbacken kommer att "tro" att nanopipetten alltid är i närheten av provet. Om detta händer rekommenderas att dra tillbaka pipetten i Z-axeln från det området av vävnaden. Denna tillbakadragande kan rensa "smutsen". Om pipetten fortfarande är smutsig är det nödvändigt att byta pipett och flytta till ett annat område av provet. Sedan kan användaren fortsätta att skanna vävnaden.
Från och med idag är den viktigaste begränsningen av HPICM den tid som krävs för att ta en bild med hög upplösning medan du arbetar med prover med komplex topografi. Beroende på önskad upplösning kan det ta upp till en halvtimme eller mer att ta upp till en halvtimme eller mer. I bilder som förvärvats längre än femton minuter kan avdriften bli uppenbar och specifika strukturer kan skiftas och vara svårare att skilja. Detta händer eftersom de levande cellerna ständigt rör sig eller ändrar sin form över tiden. För att visualisera molekylära händelser och förändringar i cellernas strukturer över tid krävs ytterligare utveckling för att optimera den tidsmässiga upplösningen av HPICM11.
Bullret från nanopipettens ström utgör en annan begränsning eftersom den sätter det minimala praktiskt uppnåeliga börvärdet. Strömmen som genereras av nanopipetten i lösningen dämpas snabbt (omvänt proportionellt mot kubikavståndet från pipettspetsen), vilket skapar en "avkänningsvolym", bortom vilken nanopipetten inte kan "känna" ytan. Vi har tidigare utvecklat en modell av detta fenomen och visat att sicm-sondens laterala upplösning bestäms av tvärsnittet av denna "avkänningsvolym" med cellytan, som kan vara extremt liten vid låga bört25. Detta är särskilt viktigt för att avbilda hårcellsspetslänkar som har en diameter på ~ 5 nm12,33. Vid första anblicken skulle pipetter med mindre innerdiameter resultera i bättre upplösning av HPICM-avbildning. Detta gäller verkligen för relativt stora pipetter (>50 nm). Att minska nanopipettens inre diameter under ~50 nm resulterar dock i en oproportionellt stor ökning av pipettljudet och därmed förlust av upplösning vid låga bört som är väsentliga för avbildning av stereocilia-buntar. Från och med i dag vet vi inte hur vi ska lösa detta problem och vi arbetar med att hitta rätt lösning.
Sammanfattningsvis presenterar detta dokument ett detaljerat protokoll för visualisering av stereocilia buntar i levande däggdjur auditiva hårceller med HPICM. De största fördelarna med HPICM är: i) dess förmåga att visualisera etikettfria strukturer i nanoskala vid ytan av levande celler utan att röra vid dem; och ii) att undersöka dessa konstruktioners funktion med patchklämmaregistreringar och/eller lokal nanoskalaleverans av mekaniska eller kemiska stimuli. Såvitt vi vet är dessa fördelar unika för HPICM. Naturligtvis finns det vissa nackdelar. För det första, på grund av begränsningar av höjden på de strukturer som ska avbildas, kan HPICM inte vara lämplig för avbildning av extremt höga strukturer, såsom stereocilia buntar av vestibulära hårceller i däggdjur ampullae. För det andra utvecklas HPICM fortfarande och ytterligare förbättringar av hastigheten och upplösningen av avbildning behövs. De fysiska principerna för HPICM och vår egen erfarenhet tyder dock på att det är möjligt. Vi tror att HPICM kommer att ge unika data om funktionen hos enskilda proteinkomplex på stereociliaytan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar prof. Yuri Korchev (Imperial College, Storbritannien) för det långsiktiga stödet och råden i alla skeden av projektet. Vi tackar också Drs. Pavel Novak och Andrew Shevchuk (Imperial College, Storbritannien) samt Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Ryssland) för deras hjälp med mjukvaruutveckling. Studien stöddes av NIDCD/NIH (R01 DC008861 och R01 DC014658 till G.I.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analog oscilloscope | B&K Precision | 2160C | Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach |
| AFM calibration standards | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system |
| Benchtop vibration Isolator | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Active vibration isolation |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | To be added to the bath solution to adjust osmolarity |
| Digitizer | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Multi-channel input/output digitizer |
| Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers. |
| Faraday cage | AMETEK/TMC | Type II | Required to shield electromagnetic interference |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Used as the dish for the chamber for the tissue |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Extracellular (bath) solution |
| Instrumentation amplifier | Brownlee Precision | Model 440 | Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation |
| Laser-based micropipette puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes. |
| Lebovitz's L-15, without phenol red | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Extracellular (bath) solution |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | Used for "course" positioning of the Z piezo actuator |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Inverted optical microscope |
| Patch amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette |
| Piezo amplifier (XY axes) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509.C2A | Amplification and PID control for XY piezo translation stage |
| Piezo amplifier (Z axis) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA |
| Plastic Coverslips | TED PELLA Inc | 26028 | Used in the fabrication of the chambers for the tissue |
| SICM controller & software* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd |
| Silicone elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue |
| Silicon glue | The Dow Chemical Company | 734 | Used to glue the different parts of the chamber for the tissue |
| Tungsten rod | A-M Systems | 717500 | Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue |
| XY piezo nanopositioner | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY translation stage with capacitive sensors |
| Z piezo nanopositioner | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring piezoactuator with a strain gage sensor |
| *Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems: NX12-Bio and NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original | |||
| HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically | |||
| challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one | |||
| modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. |
References
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
- Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
- Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W.
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
- Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
- Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
- Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
- Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
- Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
- Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).
- Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
- Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
- Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
- Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
- Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
- Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
- Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).
- Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
- Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B.
- Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
- Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
- Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
- Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
- Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
- Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
- Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
- Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
- Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
- Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).
