Stereocilia Bundle Imaging med upplösning i nanoskala i levande däggdjurs auditiva hårceller

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), en beröringsfri skanningssondteknik som möjliggör nanoskala av avbildning av stereocilia-buntar i levande hörselhårceller.

Abstract

Innerörat hårceller upptäcker ljudinducerade förskjutningar och omvandlar dessa stimuli till elektriska signaler i ett hårpaket som består av stereocilia som är ordnade i rader med ökande höjd. När stereocilia avböjs rycker de på små (~ 5 nm i diameter) extracellulära spetslänkar som förbinder stereocilia, som förmedlar krafter till de mekanosensitiva flyttningskanalerna. Även om mekanotransduktion har studerats i levande hårceller i årtionden, kan de funktionellt viktiga strukturella detaljerna i mekanotransduktionsmaskineriet vid spetsen av stereocilia (såsom tip link dynamics eller transduction-dependent stereocilia remodeling) fortfarande studeras endast i döda celler med elektronmikroskopi. Teoretiskt sett har skanningssondtekniker, såsom atomkraftmikroskopi, tillräckligt med upplösning för att visualisera ytan av stereocilia. Men oberoende av bildframställningsläge skadar även den minsta kontakten av atomkraftmikroskopisonden med stereocilia-bunten vanligtvis bunten. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för hopping sond jonledning mikroskopi (HPICM) imaging av levande gnagare auditiva hårceller. Denna beröringsfria skanningssondteknik möjliggör tidsfördröjning av ytan av levande celler med en komplex topografi, som hårceller, med en enda nanometerupplösning och utan att göra fysisk kontakt med provet. HPICM använder en elektrisk ström som passerar genom glasnanopipetten för att upptäcka cellytan i närheten av pipetten, medan ett 3D-positionerande piezoelektriskt system skannar ytan och genererar dess bild. Med HPICM kunde vi avbilda stereocilia buntar och länkarna sammankopplade stereocilia i levande auditiva hårceller i flera timmar utan märkbar skada. Vi förväntar oss att användningen av HPICM kommer att möjliggöra direkt utforskning av strukturella förändringar i stereocilia av levande hårceller för bättre förståelse av deras funktion.

Introduction

Trots det faktum att stereocilia buntar i hörselhårcellerna är tillräckligt stora för att visualiseras av optisk mikroskopi och avledas i levande celler i ett patch clamp experiment, de väsentliga strukturella komponenterna i återgivningsmaskineriet såsom spetslänkar kunde endast avbildas med elektronmikroskopi i döda celler. I däggdjurssalongens hörselhåriga hårceller är givaren placerad i de nedre ändarna av spetslänkarna, dvs. vid spetsarna på den kortare radstereocilia¹ och regleras lokalt genom signalering vid spetsarna av stereocilia^2,3. Ändå är etikettfri avbildning av ytstrukturerna på denna plats i levande hårceller inte möjlig på grund av de små storlekarna av stereocilia.

Däggdjurs cochlea har två typer av auditiva sensoriska celler: inre och yttre hårceller. I de inre hårcellerna är stereocilia längre och tjockare jämfört med dem i de yttre hårcellerna⁴. Den första och andra raden av stereocilia har en diameter på 300-500 nm i mus- eller råtta inre hårceller. På grund av ljusets diffraktion är den maximala upplösningen som kan uppnås med en etikettfri optisk mikroskopi cirka 200 nm. Därför är visualisering av enskilda stereocilier inom första och andra raden i det inre hårcellspaketet relativt enkelt med optisk mikroskopi. Däremot har kortare radstereocilier i de inre hårcellerna och all stereocilia i de yttre hårcellerna diametrar runt 100-200 nm och kan inte visualiseras med optisk mikroskopi⁵. Trots de senaste framstegen inom superupplösning imaging, denna grundläggande begränsning kvarstår i alla optiska etikett-fria imaging. Alla nuvarande kommersiellt tillgängliga superupplösningstekniker kräver någon form av fluorescerande molekyler⁶, vilket begränsar deras applikationer. Förutom begränsningar på grund av behovet av specifika fluorescerande märkta molekyler har exponering för intensiv ljusbestrålning visat sig inducera cellskador och kan påverka cellulära processer, vilket är en stor nackdel när man studerar levande celler⁷.

Vår nuvarande kunskap om de strukturella detaljerna i hårcellstereocilia buntar har erhållits mestadels med olika elektronmikroskopi (EM) tekniker, såsom scanning elektronmikroskopi (SEM), transmission elektronmikroskopi (TEM), frys-fraktur EM, och nyligen med 3D-tekniker såsom seriell sektionering med fokuserad jonstråle eller kryo-EM-tomografi^{8,9,10,11,12,13, 14,15,16}. Tyvärr kräver alla dessa EM-tekniker kemisk eller kryofixering av provet. Beroende på fenomenens tidsskala gör detta krav en studie av de dynamiska processerna vid spetsarna av stereocilia antingen omöjligt eller mycket arbetsintensivt.

Begränsade ansträngningar har gjorts för att avbilda hår buntar av levande hårceller med atomkraftmikroskopi (AFM)^17,18. Eftersom AFM arbetar i fysiologiska lösningar kan det i teorin visualisera dynamiska förändringar i stereociliabuntarna av levande hårceller över tid. Problemet ligger i principerna för högupplöst AFM, vilket innebär viss fysisk kontakt mellan AFM-sonden och provet, även i det minst skadliga “tappning” -läget¹⁹. När AFM-sonden stöter på ett stereocilium kraschar den vanligtvis mot den och skadar hårbuntens struktur. Som ett resultat är denna teknik inte lämplig för att visualisera levande, eller ens fasta, hårceller buntar^17,18. Problemet kan delvis lindras genom att använda en stor kulformad AFM-sond som endast inför hydrodynamiska krafter på^{provytan 20}. Även om en sådan sond är idealisk för att testa prov²¹mekaniska egenskaper, ger den dock endast en submikrometerupplösning vid avbildning av corti^22-organet och gäller fortfarande för provet en kraft som kan vara betydande för de mycket känsliga stereociliabuntarna.

Scanning jonledningsmikroskopi (SICM) är en version av scanning sondmikroskopi som använder en glaspipett sond fylld med en ledande lösning²³. SICM detekterar ytan när pipetten närmar sig cellen och den elektriska strömmen genom pipetten minskar. Eftersom detta händer långt innan du rör vid cellen är SICM idealisk för beröringsfri avbildning av levande celler i fysiologisk lösning²⁴. Den bästa upplösningen av SICM är i ordningen av enstaka nanometer, vilket gör det möjligt att lösa enskilda proteinkomplex vid plasmamembranet i en levande cell²⁵. Men i likhet med andra skanningssondtekniker kan SICM endast avbilda relativt plana ytor. Vi övervann denna begränsning genom att uppfinna hoppningssondjonledningsmikroskop (HPICM)²⁶, där nanopipetten närmar sig provet vid varje bildpunkt (figur 1A). Med hjälp av HPICM kunde vi avbilda stereocilia-buntar i levande hörselhårceller med nanoupplösning²⁷.

En annan grundläggande fördel med denna teknik är att HPICM inte bara är ett bildverktyg. I motsats till andra skanningssondtekniker är HPICM/ SICM-sonden en elektrod som ofta används i cellfysiologi för elektriska inspelningar och lokal leverans av olika stimuli. Jonkanalaktivitet stör vanligtvis inte HPICM-avbildning, eftersom den totala strömmen genom HPICM-sonden är flera storleksordningar större än den extracellulära strömmen som genereras av de största jonkanalerna²⁵. HPICM tillåter dock exakt positionering av nanopipetten över en struktur av intresse och efterföljande enkanalig patchklämmainspelning från denna struktur²⁸. Så här fick vi de första preliminära inspelningarna av enkanalsaktivitet vid spetsarna på den yttre hårcellen stereocilia²⁹. Det är värt att nämna att även en stor ström genom nanopipetten inte kan producera betydande förändringar av potentialen över plasmamembranet på grund av enorm elektrisk shunt av det extracellulära mediet. Enskilda jonkanaler kan dock aktiveras mekaniskt genom vätskeflöde genom nanopipetten³⁰ eller kemiskt genom lokal applicering av en agonist³¹.

I HPICM genereras bilden när en nanopipette sekventiellt närmar sig provet vid en punkt, drar sig tillbaka och sedan rör sig i lateral riktning för att upprepa tillvägagångssättet (figur 1A). En patchklämmaförstärkare applicerar konstant spänning på en AgCl-tråd i pipetten(figur 1B) för att generera en ström på ~1 nA i badlösningen. Värdet på denna ström när pipetten är borta från cellens yta bestäms som en referensström (I_ref, figur 1C). Pipetten flyttas sedan i Z-axeln för att närma sig provet tills strömmen minskas med en mängd som fördefinierats av användaren (börvärde), vanligtvis 0,2%-1% av I_ref (bild 1C, toppspårning). Systemet sparar sedan Z-värde just nu som provets höjd, tillsammans med X- och Y-koordinater för denna bildpunkt. Därefter dras pipetten bort från ytan (bild 1C, bottenspår) med en hastighet som definieras av användaren, vanligtvis 700-900 nm/ms. Efter återkallelse flyttas pipetten (eller i vårt fall provet – se figur 1B) i sidled till nästa bildpunkt, ett nytt referensströmvärde erhålls och pipetten närmar sig återigen provet och upprepar processen. Pipettens X-Y-rörelse föredras i en upprätt mikroskopinställning som vanligtvis används för inspelningar av hårcellens mekanotransduktionsströmmar. I den här inställningen närmar sig HPICM-sonden hårcellsbuntarna inte uppifrån utan i en vinkel³². Den bästa upplösningen av HPICM-avbildning uppnås dock i en inverterad mikroskopinställning (figur 1A, B), där provets rörelse i X-Y-riktningar kopplas bort från nanopipettens Z-rörelse, vilket eliminerar potentiella mekaniska artefakter.

Med hjälp av HPICM fick vi topografiska bilder av mus och råtta inre och yttre hårcell stereocilia buntar, och även visualiserade länkarna mellan stereocilia som är ca 5 nm i diameter^26,27. Framgången för hårcell bunt imaging med denna teknik beror på flera faktorer. För det första bör nanopipetströmmens brus (varians) vara så litet som möjligt för att möjliggöra lägsta möjliga börvärde för HPICM-avbildning. Ett lågt börvärde gör det möjligt för HPICM-sonden att “känna” stereociliaytan på ett större avstånd och i vilken vinkel som helst mot sondens tillvägagångssätt och förbättrar överraskande X-Y-upplösningen av HPICM-avbildning (se Diskussion). För det andra bör vibrationerna och drivorna i systemet minskas till mindre än 10 nm, eftersom de bidrar direkt till bildföremålen. Slutligen, även om HPICM-sonden och provstadiet flyttas i Z- och X-Y-axlar av de kalibrerade återkopplingskontrollerade piezo-ställdonen som har en noggrannhet på en enda nanometer eller bättre, bestämmer nanopipettspetsens diameter spridningen av strömmen (avkänningsvolymen) och därmed upplösningen (figur 1A). Därför, innan du avbildar levande hårceller, är det viktigt att dra lämpliga pipetter, nå önskad upplösning med kalibreringsprover och uppnå lågt brus i inspelningssystemet.

Under minst ett par decennier har SICM-tekniken inte varit kommersiellt tillgänglig och den har utvecklats av endast få laboratorier i världen med det ledande labbet av Prof. Korchev i Imperial College (UK). Nyligen blev flera SICM-system kommersiellt tillgängliga (se Materialförteckningen), som alla är baserade på de ursprungliga HPICM-principerna. Att avbilda stereociliabuntar i hårcellerna kräver dock flera anpassade modifieringar som är tekniskt utmanande (eller till och med omöjliga) i de slutna “ready-to-go”-systemen. Därför behövs viss komponentintegration. Eftersom HPICM-installationen representerar en patchklämma med strängare vibrations- och driftkrav och en piezodriven rörelse av HPICM-sonden och provet (figur 1D), är denna integration relativt enkel för alla forskare, som är skickliga på patchklämmor. Men en forskare utan ordentlig bakgrund skulle definitivt behöva lite utbildning i elektrofysiologi först. Trots återstående utmaningar som att öka hastigheten på avbildning (se Diskussion) har vi kunnat avbilda stereocilia-buntar i levande hårceller med upplösning i nanoskala utan att skada dem.

Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll för att utföra framgångsrika HPICM imaging av levande auditiva hår cell buntar i unga postnatala råtta eller mus cochlear explants med hjälp av vårt anpassade system. De integrerade komponenterna listas i tabellen över material. I dokumentet beskrivs också vanliga problem som kan uppstå och hur du felsöker dem.

Protocol

Studien utfördes i enlighet med rekommendationerna i guiden för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Kentucky (protokoll 00903M2005). 1. Tillverkning och testning av nanopipetter Skapa ett program i mikropipettens puller för att erhålla pipetter med ett motstånd mellan 200 och 400 MΩ, vilket motsvarar innerspetsdiametrar p…

Representative Results

Protokollet som presenteras i detta dokument kan användas för att visualisera alla levande celler med komplex topografi. Efter dessa steg får vi rutinmässigt bilder av levande råtta auditiva hårcellsbuntar(Figur 6B, D). Trots att vi har lägre X-Y-upplösning jämfört med SEM-bilder kan våra HPICM-bilder framgångsrikt lösa de olika raderna av stereocilia, formen på stereociliaspetsarna och till och med de små länkarna (~ 5 nm i diameter) som förbinder intilligg…

Discussion

För att få framgångsrika HPICM-bilder måste användarna upprätta ett system med lågt brus och låg vibration och tillverka lämpliga pipetter. Vi rekommenderar starkt användning av AFM-kalibreringsstandarder för att testa systemets stabilitet innan du försöker utföra någon live cellavbildning. När systemets upplösning har testats kan användare överväga att avbilda fast organ av Corti-prover för att bekanta sig med bildinställningarna innan de försöker någon live-cellavbildning.

<p class="jove_co…

Materials

Analog oscilloscope	B&K Precision	2160C	Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards	TED PELLA Inc	HS-100MG; HS-20MG	These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator	AMETEK/TMC	Everstill K-400	Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer	National Instruments Corporation	PCI-6221	Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement	Standford Research Systems	SIM900, SIM960, SIM980	Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage	AMETEK/TMC	Type II	Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier	Brownlee Precision	Model 440	Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller	Sutter Instrument	P-2000/G	Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Extracellular (bath) solution
Micromanipulator	Scientifica	PatchStar	Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope	Nikon	Eclipse TS100	Inverted optical microscope
Patch amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B	The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509.C2A	Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis)	Piezosystem jena	ENT 400 & 800	Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips	TED PELLA Inc	26028	Used in the fabrication of the chambers for the tissue
SICM controller & software*	Ionscope, UK (ionscope.com)	N/A	Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue	The Dow Chemical Company	734	Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod	A-M Systems	717500	Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner	Piezosystem jena	RA 12/24 SG	Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM,
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.