Stereozilien-Bündelbildgebung mit nanoskaliger Auflösung in lebenden Säugetier-Hörhaarzellen

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für die Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM) vor, eine berührungslose Scanning-Sondentechnik, die die nanoskalige Abbildung von Stereozilienbündeln in lebenden auditiven Haarzellen ermöglicht.

Abstract

Innenohr-Haarzellen detektieren schallinduzierte Verschiebungen und wandeln diese Reize in elektrische Signale in einem Haarbündel um, das aus Stereozilien besteht, die in reihen zunehmender Höhe angeordnet sind. Wenn Stereozilien abgelenkt werden, ziehen sie an winzigen (~ 5 nm Durchmesser) extrazellulären Spitzenverbindungen, die Stereozilien miteinander verbinden, die Kräfte zu den mechanosensitiven Transduktionskanälen transportieren. Obwohl die Mechanotransduktion in lebenden Haarzellen seit Jahrzehnten untersucht wird, können die funktionell wichtigen ultrastrukturellen Details der Mechanotransduktionsmaschinerie an den Spitzen der Stereozilien (wie z.B. Tip-Link-Dynamik oder transduktionsabhängiges Stereozilien-Remodeling) immer noch nur in toten Zellen mit Elektronenmikroskopie untersucht werden. Theoretisch haben Rastersondentechniken wie die Rasterkraftmikroskopie eine ausreichende Auflösung, um die Oberfläche von Stereozilien sichtbar zu machen. Unabhängig vom Bildgebungsmodus beschädigt jedoch selbst der geringste Kontakt der rasterkraftmikroskopischen Sonde mit dem Stereozilienbündel in der Regel das Bündel. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Hopping-Probe-Ionenleitfähigkeitsmikroskopie (HPICM) Bildgebung von lebenden auditiven Nagetierhaarzellen. Diese berührungslose Scanning-Sondentechnik ermöglicht die Zeitraffer-Bildgebung der Oberfläche lebender Zellen mit einer komplexen Topographie, wie Haarzellen, mit einer Auflösung von nur einem Nanometer und ohne physischen Kontakt mit der Probe. Das HPICM verwendet einen elektrischen Strom, der durch die Glasnanopipette fließt, um die Zelloberfläche in unmittelbarer Nähe zur Pipette zu erfassen, während ein piezoelektrisches 3D-Positionierungssystem die Oberfläche abtastet und ihr Bild erzeugt. Mit HPICM waren wir in der Lage, Stereozilienbündel und die Verbindungen, die Stereozilien in lebenden auditiven Haarzellen miteinander verbinden, mehrere Stunden lang ohne merkliche Schäden abzubilden. Wir gehen davon aus, dass der Einsatz von HPICM eine direkte Erforschung ultrastruktureller Veränderungen in den Stereozilien lebender Haarzellen ermöglichen wird, um deren Funktion besser zu verstehen.

Introduction

Trotz der Tatsache, dass Stereozilienbündel in den auditiven Haarzellen groß genug sind, um durch optische Mikroskopie sichtbar gemacht und in einem Patch-Clamp-Experiment in lebenden Zellen abgelenkt zu werden, konnten die wesentlichen strukturellen Komponenten der Transduktionsmaschinerie wie Spitzenverbindungen nur mit der Elektronenmikroskopie in toten Zellen abgebildet werden. In den Säugetier-Hörhaarzellen befindet sich die Transduktionsmaschinerie an den unteren Enden der Spitzenverbindungen, d.h. an den Spitzen der kürzeren Reihe Stereozilien¹ und wird lokal durch die Signalübertragung an den Spitzen der Stereozilien^2,3reguliert. Eine markierungsfreie Abbildung der Oberflächenstrukturen an dieser Stelle in lebenden Haarzellen ist jedoch aufgrund der geringen Größe von Stereozilien nicht möglich.

Die Cochlea von Säugetieren hat zwei Arten von auditiven Sinneszellen: innere und äußere Haarzellen. In den inneren Haarzellen sind Stereozilien länger und dicker als in den äußeren Haarzellen⁴. Die erste und zweite Reihe von Stereozilien haben einen Durchmesser von 300-500 nm in inneren Haarzellen von Mäusen oder Ratten. Durch die Beugung des Lichts beträgt die maximale Auflösung, die mit einer markierungsfreien optischen Mikroskopie erreicht werden kann, etwa 200 nm. Daher ist die Visualisierung einzelner Stereozilien in der ersten und zweiten Reihe des inneren Haarzellbündels mit der optischen Mikroskopie relativ einfach. Im Gegensatz dazu haben kürzere Stereozilien in den inneren Haarzellen und alle Stereozilien der äußeren Haarzellen Durchmesser um 100-200 nm und können mit optischer Mikroskopie nicht sichtbar gemacht werden⁵. Trotz der jüngsten Fortschritte bei der hochauflösenden Bildgebung besteht diese grundlegende Einschränkung bei jeder optischen, markierungsfreien Bildgebung fort. Alle derzeit kommerziell erhältlichen Superauflösungstechniken erfordern eine Art fluoreszierende Moleküle⁶, was ihre Anwendungen einschränkt. Zusätzlich zu den Einschränkungen aufgrund des Bedarfs an spezifischen fluoreszenzmarkierten Molekülen hat sich gezeigt, dass die Exposition gegenüber intensiver Lichtbestrahlung zelluläre Schäden induziert und zelluläre Prozesse beeinflussen könnte, was bei der Untersuchung lebender Zellen ein großer Nachteil ist⁷.

Unser aktuelles Wissen über die ultrastrukturellen Details von Haarzell-Stereozilienbündeln wurde hauptsächlich mit verschiedenen Elektronenmikroskopietechniken (EM) wie Rasterelektronenmikroskopie (REM), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Gefrierbruch-EM und kürzlich mit 3D-Techniken wie seriellem Schnitt mit fokussiertem Ionenstrahl oder Kryo-EM-Tomographie^8,9^{,10,11,12,13, 14,15,16}. Leider erfordern alle diese EM-Techniken eine chemische oder Kryofixierung der Probe. Abhängig von der Zeitskala der Phänomene macht diese Anforderung eine Untersuchung der dynamischen Prozesse an den Spitzen der Stereozilien entweder unmöglich oder sehr arbeitsintensiv.

Es wurden begrenzte Anstrengungen unternommen, um Haarbündel lebender Haarzellen mit Rasterkraftmikroskopie (AFM)^{abzubilden 17,18}. Da AFM in physiologischen Lösungen arbeitet, könnte es theoretisch dynamische Veränderungen in den Stereozilienbündeln lebender Haarzellen im Laufe der Zeit visualisieren. Das Problem liegt in den Prinzipien des hochauflösenden AFM, das einen gewissen physikalischen Kontakt zwischen der AFM-Sonde und der Probe impliziert, selbst im am wenigsten schädlichen “Tapping” -Modus¹⁹. Wenn die AFM-Sonde auf ein Stereocilium trifft, prallt sie normalerweise dagegen und beschädigt die Struktur des Haarbündels. Infolgedessen ist diese Technik nicht geeignet, um lebende oder sogar feste Haarzellenbündel^{17,18 zu visualisieren.} Das Problem kann teilweise durch die Verwendung einer großen kugelförmigen AFM-Sonde gelindert werden, die nur hydrodynamische Kräfte auf die Oberfläche der Probe ausübt²⁰. Obwohl eine solche Sonde ideal geeignet ist, um die mechanischen Eigenschaften der Probe²¹zu testen, liefert sie bei der Abbildung des Corti^22-Organs nur eine Auflösung im Submikrometerbereich und übt dennoch eine Kraft auf die Probe aus, die für die hochempfindlichen Stereozilienbündel erheblich sein kann.

Die Rasterionenleitwertmikroskopie (SICM) ist eine Version der Rastersondenmikroskopie, bei der eine Glaspipettensonde verwendet wird, die mit einer leitfähigen Lösung gefüllt ist²³. SICM erkennt die Oberfläche, wenn sich die Pipette der Zelle nähert und der elektrische Strom durch die Pipette abnimmt. Da dies lange vor dem Berühren der Zelle geschieht, eignet sich das SICM ideal für die berührungslose Bildgebung lebender Zellen in physiologischer Lösung²⁴. Die beste Auflösung von SICM liegt in der Größenordnung von einzelnen Nanometern, was die Auflösung einzelner Proteinkomplexe an der Plasmamembran einer lebenden Zelle^{ermöglicht 25}. Ähnlich wie andere Rastersondentechniken ist SICM jedoch in der Lage, nur relativ flache Oberflächen abzubilden. Wir haben diese Einschränkung überwunden, indem wir das Hopping-Probe-Ionenleitfähigkeitsmikroskop (HPICM)²⁶erfunden haben, bei dem sich die Nanopipette an jedem Bildgebungspunkt der Probe nähert (Abbildung 1A). Mit HPICM konnten wir Stereozilienbündel in lebenden auditiven Haarzellen mit nanoskaliger Auflösung^{27 abbilden.}

Ein weiterer grundlegender Vorteil dieser Technik ist, dass HPICM nicht nur ein bildgebendes Werkzeug ist. Im Gegensatz zu anderen Rastersondentechniken ist die HPICM/SICM-Sonde eine Elektrode, die in der Zellphysiologie für elektrische Aufzeichnungen und die lokale Abgabe verschiedener Reize weit verbreitet ist. Die Ionenkanalaktivität stört die HPICM-Bildgebung normalerweise nicht, da der Gesamtstrom durch die HPICM-Sonde um mehrere Größenordnungen größer ist als der extrazelluläre Strom, der von den größten Ionenkanälen erzeugt wird²⁵. HPICM ermöglicht jedoch die präzise Positionierung der Nanopipette über einer interessierenden Struktur und die anschließende einkanalige Patch-Clamp-Aufzeichnung von dieser Struktur²⁸. So erhielten wir die ersten Voraufnahmen der Einkanalaktivität an den Spitzen der äußeren Haarzelle Stereozilien²⁹. Es ist erwähnenswert, dass selbst ein großer Strom durch die Nanopipette aufgrund des enormen elektrischen Shunts des extrazellulären Mediums keine signifikanten Änderungen des Potentials über die Plasmamembran erzeugen kann. Einzelne Ionenkanäle können jedoch mechanisch durch Flüssigkeitsfluss durch die Nanopipette³⁰ oder chemisch durch lokale Anwendung eines Agonisten³¹aktiviert werden.

In HPICM wird das Bild erzeugt, wenn sich eine Nanopipette an einem Punkt sequentiell der Probe nähert, sich zurückzieht und sich dann in lateraler Richtung bewegt, um die Annäherung zu wiederholen (Abbildung 1A). Ein Patch-Clamp-Verstärker legt ständig Spannung an einen AgCl-Draht in der Pipette an (Abbildung 1B), um einen Strom von ~ 1 nA in der Badlösung zu erzeugen. Der Wert dieses Stroms, wenn die Pipette von der Oberfläche der Zelle entfernt ist, wird als Referenzstrom bestimmt (I_ref, Abbildung 1C). Dann bewegt sich die Pipette in der Z-Achse, um sich der Probe zu nähern, bis der Strom um einen vom Benutzer vordefinierten Betrag (Sollwert) reduziert wird, normalerweise 0,2% -1% der _I-Referenz (Abbildung 1C,obere Spur). Das System speichert dann in diesem Moment den Z-Wert als Höhe der Probe zusammen mit X- und Y-Koordinaten dieses Abbildungspunkts. Dann wird die Pipette von der Oberfläche weggezogen(Abbildung 1C,untere Spur) mit einer vom Benutzer definierten Geschwindigkeit, normalerweise 700-900 nm/ms. Nach dem Zurückziehen wird die Pipette (oder in unserem Fall die Probe – siehe Abbildung 1B) seitlich zum nächsten Bildgebungspunkt bewegt, ein neuer Referenzstromwert wird erhalten, und die Pipette nähert sich erneut der Probe und wiederholt den Vorgang. Die X-Y-Bewegung der Pipette wird in einem aufrechten Mikroskopaufbau bevorzugt, der typischerweise für Aufzeichnungen der Mechanotransduktionsströme der Haarzellen verwendet wird. In dieser Einstellung nähert sich die HPICM-Sonde den Haarzellbündeln nicht von oben, sondern in einem Winkel^{von 32}. Die beste Auflösung der HPICM-Bildgebung wird jedoch in einem inversen Mikroskopaufbau (Abbildung 1A,B) erreicht, bei dem die Bewegung der Probe in X-Y-Richtung von der Z-Bewegung der Nanopipette entkoppelt wird, wodurch potenzielle mechanische Artefakte eliminiert werden.

Mit HPICM erhielten wir topographische Bilder von inneren und äußeren Haarzellen-Stereozilienbündeln von Maus und Ratte und visualisierten sogar die Verbindungen zwischen den Stereozilien mit einem Durchmesser von etwa 5 nm^26,27. Der Erfolg der Haarzellbündelbildgebung mit dieser Technik hängt von mehreren Faktoren ab. Erstens sollte das Rauschen (Varianz) des Nanopipettenstroms so gering wie möglich sein, um einen möglichst niedrigen Sollwert für die HPICM-Bildgebung zu ermöglichen. Ein niedriger Sollwert ermöglicht es der HPICM-Sonde, die Stereozillenoberfläche in einem größeren Abstand und in jedem Winkel zum Sondenansatz zu “erfassen” und überraschenderweise die X-Y-Auflösung der HPICM-Bildgebung zu verbessern (siehe Diskussion). Zweitens sollten die Vibrationen und Drifts im System auf weniger als 10 nm reduziert werden, da sie direkt zu den bildgebenden Artefakten beitragen. Obwohl die HPICM-Sonde und der Probentisch in der Z- und X-Y-Achse von den kalibrierten rückkopplungsgesteuerten Piezoaktuatoren bewegt werden, die eine Genauigkeit von einem Nanometer oder besser haben, bestimmt der Durchmesser der Nanopipettenspitze die Ausbreitung des Stroms (Erfassungsvolumen) und damit die Auflösung (Abbildung 1A). Daher ist es vor der Bildgebung lebender Haarzellen wichtig, die entsprechenden Pipetten zu ziehen, die gewünschte Auflösung mit Kalibrierproben zu erreichen und ein geringes Rauschen im Aufnahmesystem zu erreichen.

Seit mindestens ein paar Jahrzehnten ist die SICM-Technik nicht mehr kommerziell verfügbar und wurde nur von wenigen Labors auf der Welt mit dem führenden Labor von Prof. Korchev am Imperial College (UK) entwickelt. In jüngster Zeit sind mehrere SICM-Systeme kommerziell verfügbar geworden (siehe Materialtabelle),die alle auf den ursprünglichen HPICM-Prinzipien basieren. Die Abbildung von Stereozilienbündeln in den Haarzellen erfordert jedoch mehrere kundenspezifische Modifikationen, die in den geschlossenen “ready-to-go”-Systemen technisch anspruchsvoll (oder sogar unmöglich) sind. Daher ist eine gewisse Komponentenintegration erforderlich. Da der HPICM-Aufbau ein Patch-Clamp-Rig mit strengeren Vibrations- und Driftanforderungen und einer piezogetriebenen Bewegung der HPICM-Sonde und der Probe darstellt (Abbildung 1D), ist diese Integration für jeden Forscher, der sich mit Patch-Clamping auskennt, relativ einfach. Ein Wissenschaftler ohne richtigen Hintergrund würde jedoch definitiv zuerst eine Ausbildung in Elektrophysiologie benötigen. Trotz verbleibender Herausforderungen wie der Erhöhung der Bildgebungsgeschwindigkeit (siehe Diskussion)konnten wir Stereozilienbündel in lebenden Haarzellen mit nanoskaliger Auflösung abbilden, ohne sie zu beschädigen.

Dieses Papier stellt ein detailliertes Protokoll vor, um eine erfolgreiche HPICM-Bildgebung der lebenden auditiven Haarzellbündel in jungen postnatalen Ratten- oder Maus-Cochlea-Explantaten mit unserem benutzerdefinierten System durchzuführen. Die integrierten Komponenten sind in der Materialtabelle aufgeführt. In diesem Dokument werden auch häufige Probleme beschrieben, die auftreten können, und wie Sie diese beheben können.

Protocol

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Kentucky genehmigt (Protokoll 00903M2005). 1. Herstellung und Prüfung der Nanopipetten Erstellen Sie im Mikropipettenzieher ein Programm, um Pipetten mit einem Widerstand zwischen 200 und 400 MΩ z…

Representative Results

Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll kann verwendet werden, um lebende Zellen mit komplexer Topographie zu visualisieren. Nach diesen Schritten erhalten wir routinemäßig Bilder von lebenden auditiven Haarzellbündeln der Ratte (Abbildung 6B, D). Trotz der im Vergleich zu REM-Bildern niedrigeren X-Y-Auflösung können unsere HPICM-Bilder die verschiedenen Reihen von Stereozilien, die Form der Stereozilienspitzen und sogar die kleinen Glieder (~ 5 nm Durchmesser), di…

Discussion

Um erfolgreiche HPICM-Bilder zu erhalten, müssen Benutzer ein rausch- und vibrationsarmes System einrichten und geeignete Pipetten herstellen. Wir empfehlen dringend die Verwendung von AFM-Kalibrierstandards, um die Stabilität des Systems zu testen, bevor Sie versuchen, eine Lebendzellbildgebung durchzuführen. Sobald die Auflösung des Systems getestet wurde, können Benutzer die Bildgebung eines festen Organs von Corti-Proben in Betracht ziehen, um sich mit den Bildgebungseinstellungen vertraut zu machen, bevor sie e…

Materials

Analog oscilloscope	B&K Precision	2160C	Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards	TED PELLA Inc	HS-100MG; HS-20MG	These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator	AMETEK/TMC	Everstill K-400	Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer	National Instruments Corporation	PCI-6221	Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement	Standford Research Systems	SIM900, SIM960, SIM980	Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage	AMETEK/TMC	Type II	Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier	Brownlee Precision	Model 440	Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller	Sutter Instrument	P-2000/G	Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Extracellular (bath) solution
Micromanipulator	Scientifica	PatchStar	Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope	Nikon	Eclipse TS100	Inverted optical microscope
Patch amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B	The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509.C2A	Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis)	Piezosystem jena	ENT 400 & 800	Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips	TED PELLA Inc	26028	Used in the fabrication of the chambers for the tissue
SICM controller & software*	Ionscope, UK (ionscope.com)	N/A	Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue	The Dow Chemical Company	734	Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod	A-M Systems	717500	Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner	Piezosystem jena	RA 12/24 SG	Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM,
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.