Generatie van zelfgeassembleerde vasculariseerde menselijke huidequivalenten

Summary

Het doel van dit protocol is om de generatie- en volumetrische analyse van gevasculariseerde menselijke huidequivalenten te beschrijven met behulp van toegankelijke en eenvoudige technieken voor langetermijncultuur. Voor zover mogelijk wordt de reden voor stappen beschreven om onderzoekers in staat te stellen zich aan te passen op basis van hun onderzoeksbehoeften.

Abstract

Menselijke huidequivalenten (HSE's) zijn weefselgeënsingen die epidermale en huidcomponenten van de menselijke huid modelleren. Deze modellen zijn gebruikt om huidontwikkeling, wondgenezing en enttechnieken te bestuderen. Veel HSE's missen nog steeds vasculatuur en worden bovendien geanalyseerd door middel van histologische sectionering na de cultuur, waardoor de volumetrische beoordeling van de structuur wordt beperkt. Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd met toegankelijke materialen om gevasculariseerde menselijke huidequivalenten (VHSE) te genereren; verder beschreven zijn volumetrische beeldvormings- en kwantificeringstechnieken van deze constructies. Kortom, VHSE's zijn opgebouwd in 12 putcultuur inserts waarin huid- en epidermale cellen worden gezaaid in rat tail collageen type I gel. Het huidcompartiment bestaat uit fibroblast- en endotheelcellen die door collageengel worden verspreid. Het epidermale compartiment bestaat uit keratinocyten (huidepitheelcellen) die zich onderscheiden op de lucht-vloeistofinterface. Belangrijk is dat deze methoden kunnen worden aangepast op basis van de behoeften van de onderzoeker, met resultaten die VHSE-generatie aantonen met twee verschillende fibroblastceltypen: menselijke huidfibroblasten (hDF) en menselijke longfibrose (IMR90s). VHSE's werden ontwikkeld, afgebeeld door confocale microscopie en volumematig geanalyseerd met behulp van computationele software op tijdspunten van 4 en 8 weken. Er wordt een geoptimaliseerd proces beschreven om VHSE's voor volumetrisch onderzoek te repareren, te beitsen, te repareren en te wissen. Deze uitgebreide model-, beeldvormings- en analysetechnieken zijn gemakkelijk aan te passen aan de specifieke onderzoeksbehoeften van individuele laboratoria met of zonder eerdere HSE-ervaring.

Introduction

De menselijke huid vervult vele essentiële biologische functies, waaronder het fungeren als een immuun / mechanische barrière, het reguleren van de lichaamstemperatuur, het deelnemen aan waterretentie en zintuiglijke rollen^1,2,3,4. Anatomisch gezien is de huid het grootste orgaan in het menselijk lichaam en bestaat uit drie hoofdlagen (epidermis, dermis en hypodermis) en bezit een complex systeem van stromale, vasculaire, glandulaire en immuun / zenuwstelselcomponenten naast epidermale cellen. De epidermis zelf bestaat uit vier lagen cellen die continu worden vernieuwd om de barrièrefunctie en andere structuren van de inheemse huid (d.w.z. zweet- en talgklieren, nagels) te behouden³. Huidfysiologie is belangrijk in immuunfunctie, wondgenezing, kankerbiologie en andere gebieden, waardoor onderzoekers een breed scala aan modellen gebruiken, van in vitro monoculturen tot in vivo diermodellen. Diermodellen bieden de mogelijkheid om de volledige complexiteit van huidfysiologie te bestuderen, maar veelgebruikte diermodellen zoals muizen hebben significante fysiologische verschillen in vergelijking met mensen⁵. Deze beperkingen, en de hogere kosten van diermodellen, hebben ertoe geleid dat veel onderzoekers zich hebben gericht op het ontwikkelen van in vitro modellen die de fysiologie van de menselijke huid beter weerspiegelen^1,6. Hiervan is een van de eenvoudigere modeltypen het menselijke epidermale equivalent (HEE; ook wel halfdikte huidmodellen genoemd) die bestaan uit alleen epidermale keratinocyten op een acellulaire huidmatrix, maar epidermale differentiatie en stratificatie in vivo vastleggen. Voortbouwend hierop worden modellen die huid- en epidermale componenten (keratinocyten en fibroblasten) bevatten, vaak aangeduid als menselijke huidequivalenten (HSE), huidmodellen van volledige dikte of organotypische huidconstructies (OSC). Kortom, deze modellen worden gegenereerd door dermale cellen in gelmatrices in tekapselen en er epidermale cellen bovenop te zaaien. Epidermale differentiatie en stratificatie kunnen vervolgens worden bereikt via gespecialiseerde media en luchtblootstelling⁷. Huidequivalenten zijn meestal gegenereerd door middel van zelfassemblagetechnieken met behulp van huidgels gemaakt van collageen type I (van rattenstaart of runderhuidoorsprong)^1,8, maar vergelijkbare modellen hebben anderematrixcomponenten opgenomen zoals fibrine⁹,¹⁰, fibroblast afgeleid 11^,12, cadaveric de-epidermized membranen 13 ,^14,15 ,¹⁶, commercieel verkrijgde gels en andere 1^,1 ,¹. Momenteel zijn er huidequivalenten in de handel verkrijgbaar (zoals eerder beoordeeld^1,2). Deze zijn echter voornamelijk ontwikkeld voor therapeutische doeleinden en kunnen niet gemakkelijk worden aangepast aan specifieke onderzoeksvragen.

HSE's zijn toegepast in studies naar wondgenezing, enting, toxicologie en huidziekte/ontwikkeling^{11,12,13,16,8,20,21,22,23}. Hoewel 3D-cultuur functies van menselijk weefsel uitgebreider modelleert in vergelijking met 2D-culturen²⁴, maakt de opname van diverse celtypen die de in vivo populatie nauwkeuriger weerspiegelen , studies van cel-celcoördinatie in complexe weefsels^24,25,26mogelijk . De meeste HSE's omvatten alleen huidfibroblasten en epidermale keratinocyten²⁷, hoewel de in vivo huidomgeving veel andere celtypen omvat. Recente studies zijn begonnen met het opnemen van meer celpopulaties; deze omvatten endotheelcellen in vasculatuur^{10,28, 29,30,31,}32,^{33, 34,}adipocyten in sub-cutaan weefsel^35,36,zenuwcomponenten 19 ,²¹, stamcellen^27,37, 38 , immuuncellen¹⁰,³⁹,⁴⁰, 41 ,42 , en andere ziektes . Bijzonder belangrijk onder deze is vasculatuur; hoewel sommige HSE's vasculaire cellen bevatten, missen ze over het algemeen nog steeds uitgebreide capillaire elementen met connectiviteit over de hele dermis^10,29 , uitgebreide in vitro stabiliteit²⁸en de juiste vaatdichtheid. Verder worden HSE-modellen meestal beoordeeld door middel van histologische sectionering na de cultuur, waardoor de analyse van de driedimensionale structuur van HSE's wordt beperkt. Driedimensionale analyse maakt volumetrische beoordeling van vasculaire dichtheid^{48,49 mogelijk,}evenals regionale variatie van epidermale dikte en differentiatie.

Hoewel HSE's een van de meest voorkomende organotypische modellen zijn, zijn er veel technische uitdagingen bij het genereren van deze constructies, waaronder identificatie van geschikte extracellulaire matrix- en celdichtheden, mediarecepten, juiste luchtvloeistofinterfaceprocedures en postcultuuranalyse. Hoewel HEE- en HSE-modellen protocollen hebben gepubliceerd, bestaat er geen gedetailleerd protocol met huid vasculatuur en volumetrische beeldvorming in plaats van histologische analyse. Dit werk presenteert een toegankelijk protocol voor de cultuur van gevasculariseerde menselijke huidequivalenten (VHSE) uit voornamelijk commerciële cellijnen. Dit protocol is geschreven om gemakkelijk aan te passen, waardoor het eenvoudig kan worden aangepast aan verschillende celtypen en onderzoeksbehoeften. In het belang van toegankelijkheid, beschikbaarheid en kosten werd het gebruik van eenvoudige producten en generatietechnieken voorrang gegeven boven het gebruik van commercieel beschikbare producten. Verder worden eenvoudige volumetrische beeldvormings- en kwantificeringsmethoden beschreven die het mogelijk maken de driedimensionale structuur van de VHSE te beoordelen. Door deze procedure te vertalen naar een robuust en toegankelijk protocol kunnen niet-gespecialiseerde onderzoekers deze belangrijke modellen toepassen in gepersonaliseerde geneeskunde, vasculaire weefseltechnologie, entontwikkeling en geneesmiddelenevaluatie.

Protocol

1. Voorbereiding op 3D-cultuur

1. Bereid de collageenvoorraad van de rattenstaart voor op 8 mg/ml, met behulp van de vastgestelde protocollen^50,51,52. Als alternatief kan rattenstaartcollageen in de juiste concentraties bij leveranciers worden gekocht (zie materialenlijst).
   OPMERKING: Collageen kan worden bereid of gekocht in verschillende concentraties in het bereik van 3-10 mg/ml, of hoger^50,51,52. De berekeningen in het protocol gaan uit van een concentratie van 8 mg/ml, maar kunnen worden aangepast op basis van de behoeften van de onderzoeker.
2. Breid cellijnen uit: Endotheel- en fibroblastcellen moeten klaar zijn om te zaaien aan het begin van de 3D-collageendermaalcomponentgeneratie (stap 2). Keratinocyten moeten klaar zijn op dag 7 van de 3D-cultuur. Een volledige VHSE-constructie vereist 7,5 x 10⁵ endotheelcellen; 7,5 x 10⁴ fibroblasten; en 1,7 x 10⁵ keratinocyten voor de opwekking (tabel 1).
   OPMERKING: Deze dichtheden zijn geschikt voor 12-put grootte doorlatende weefselkweek inserts of gelijkwaardig. Celdichtheid en -formaat kunnen omhoog of omlaag worden geschaald op basis van de behoeften van de onderzoeker. Ter verduidelijking, deze hoeveelheid endotheel- en fibroblastcellen zaait 1-3 huidcomponenten, terwijl elke epidermale component 1,7 x 10⁵ keratinocyten vereist.
3. Voer alle celcentrifugatie in dit protocol gedurende 5 minuten uit bij 300 x g, maar dit kan worden verminderd voor fragielere celtypen.

2. Generatie van 3D collageen huidcomponent

OPMERKING: Stap 2 is een tijdgevoelige procedure en moet in één instelling worden voltooid. Het wordt aanbevolen om een kwaliteitscontrole van de collageenvoorraad te voltooien om een goede gelatie en homogeniteit te garanderen voordat u begint met het zaaien van huidcomponenten, zie probleemoplossing in discussie.

1. Acellulaire collageenlaagvoorbereiding en zaaien
   1. Bereid twee microcentrifugebuizen met een dop van 1,7 ml, één voor de acellulaire ondersteuning en één voor de cellulaire dermis. De in deze stap gegeven hoeveelheden bereiden 1 ml collageen van 3 mg/ml (streefcollageenconcentratie) voor, voldoende voor (3) VHSE's van 12-putgrootte. Vergelijkingen worden weergegeven als aanpassing nodig is. Zowel volume als dichtheid kunnen worden geschaald op basis van de behoeften van de onderzoeker (gemeenschappelijke referentienummers zijn opgenomen in tabel 2).
   2. Voeg aan elke buis 100 μL kweekkwaliteit 10x Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe (één buis levert 3 VHSE's op) en voeg 8,6 μL 1 N NaOH toe. Plaats afgedekte buizen op nat ijs om minstens 10 minuten te koelen.
      C_s = Collageen voorraad concentratie
      V_f = Eindvolume collageen nodig
      C_t = Doelcollageenconcentratie
      V_s = Volume voorraadcollageen noodzakelijk voor de gewenste hoeveelheid (V_f)
      V_pbs = Volume van 10X PBS nodig voor doelcollageenconcentratie (C_t)
      V_NaOH = Volume van 1N NaOH nodig voor C_{t
      V-media} = Volume van media, oproepophanging of ddH2O nodig voor C_t
      
      
      
      
   3. Bereid 1000 en 250 μL pipetten met positieve verplaatsing voor gebruik en zet apart. Omdat latere stappen tijdgevoelig zijn, is het handig om pipetpunten te laden en volumes in te stellen (respectievelijk 375 μL en 125 μL). Stel bovendien een normale pipet van 1000 μL in voor 516 μL.
      OPMERKING: Pipetten met positieve verplaatsing kunnen indien nodig worden vervangen door normale pipetten, maar vanwege de hoge viscositeit van collageen en de tijd/ temperatuurgevoeligheid van deze procedure, worden pipetten met positieve verplaatsing aanbevolen om consistente zaairesultaten te produceren. Als u normale pipetten gebruikt, gebruik dan langzame bewegingen.
   4. Bereid kweekinzetplaten goed voor: Gebruik steriele tangen om drie kweekinzetstukken van 12 putformaat in een steriele 12-put weefselkweekplaat te plaatsen, plaats in de middelste kolommen.
   5. Zet koude media die geschikt zijn voor fibroblast- en endotheelceltypen.
   6. Plaats na het afkoelen van de afgedekte buizen één buis (voor de acellulaire ondersteuning) op een rek met de inhoud zichtbaar. Laat de andere buis (voor de cellulaire dermis) op ijs staan.
   7. Verwijder 8 mg/ml collageenbouillon uit de koeling en plaats deze op nat ijs.
      OPMERKING: Gebruik geen vriesijs of -20 °C tafelkoelers, omdat dit het collageen bevriest.
   8. Voeg aan de koud afgedekte buis 516 μL media toe en voeg onmiddellijk 375 μL koud collageen toe met behulp van de pipet met een positieve verplaatsing van 1000 μL. Doseer collageen in de oplossing (niet aan de zijkant van de buis). Verwijder onmiddellijk de lege pipettip en schakel over op de voorbereide 250 μL positieve verplaatsingspipet om te mengen.
      1. Meng snel maar voorzichtig om bellenvorming te voorkomen, verwijder indien mogelijk geen punt uit de oplossing. Meng tot de oplossing van homogene kleur is, wat meestal ongeveer 5 pipetcycli of 10 s duurt (als u media met fenolrood gebruikt, wordt de kleur lichter en uniform). Zorg er bij het mengen voor dat u uit verschillende posities van de buis (onder en boven) tekent voor gelijkmatig mengen.
         OPMERKING: Dit kan worden uitgevoerd met 516 μL water van celkweekkwaliteit of andere vloeistof van celkweekkwaliteit, maar fenolrood van de meeste media is een goede indicator van het mengen. Gebruik fibroblast- of endotheelmedia die werden gebruikt voor 2D-uitbreidingen.
   9. Verspreid onmiddellijk 125 μL acellulair collageen op het membraan van elk van de drie 12-put kweekinzetstukken. Om een uniforme dekking van de acellulaire collageengel te garanderen, schommelt u de schaal; als dat geen uniforme membraandekking creëert, gebruik dan de pipettip om het membraan in wezen te schilderen door collageen voorzichtig rond te verspreiden; vermijd het uitoefenen van druk op het membraan. Gelatie begint bijna onmiddellijk; voer deze stap snel uit om een gelijkmatige dekking te garanderen.
      OPMERKING: Er zal overtollig acellulair collageen zijn. Het volume kan worden verminderd, maar het bereiden van minder dan 1 ml collageensuspensie kan leiden tot problemen bij het mengen van de oplossing en onvoldoende gelatie.
   10. Verplaats de 12-put plaat onmiddellijk naar een incubator van 37 °C celkweek om deze minstens 20 minuten te laten geleren (acellulair collageen kan indien nodig langer geleren; ga tijdens deze gelatietijd verder met stap 2.2). Verwijder de collageensuspensie uit ijs en plaats deze terug in de koeling (collageen is het meest stabiel bij 4 °C).
2. Celsuspensie & zaaipreparaat
   OPMERKING: Voor de cultuurtijdlijn van dit protocol komt dit overeen met Dag 1 (SD1)
   1. Probeer tijdens het geleren van de acellulaire collageenondersteuning de endotheel- en fibroblastcellijnen te trypsiniseren en te tellen.
   2. Schors 7,5 x 10⁵ endotheelcellen en 7,5 x 10⁴ fibroblasten in 258 μL van hun respectieve media en combineer celsuspensusingen om een aliquot van 516 μL te creëren. Houd de celsuspensingen op nat ijs tot gebruik.
   3. Bereid 1000 en 250 μL pipetten met positieve verplaatsing voor gebruik en zet apart. Omdat latere stappen tijdgevoelig zijn, is het handig om pipettips te laden en volumes in te stellen (respectievelijk 375 μL en 250 μL). Stel bovendien een normale pipet van 1000 μL in voor 516 μL.
3. Cel beladen collageen zaaien van dermale compartiment
   1. Verwijder na de gelatieperiode de 12 putplaat van acellulair collageen uit de incubator.
      OPMERKING: Als dit collageen na 30 minuten niet gelled is, ga dan niet verder met de procedure, omdat er waarschijnlijk een fout was tijdens het zaaien of de collageenvoorraad een probleem kan hebben (zie probleemoplossing in discussie).
   2. Verwijder de 1,7 ml afgedekte buis van nat ijs (bevat 10x PBS en NaOH). Plaats de buis in een rek zodat de inhoud zichtbaar is. Maak alle doppen los/open ze (celsuspensie, koud afgedekte buis).
   3. Verwijder het stamcollageen (8 mg/ml) uit de koeling van 4 °C en leg het op nat ijs. Laat de dop open.
   4. Voeg de 516 μL gekoelde celsuspensie toe aan de koud afgedekte buis. Gebruik de pipet met een positieve verplaatsing van 1000 μL om onmiddellijk 375 μL koude collageenoplossing rechtstreeks in de oplossing van de afgedekte buis te pipeteren.
   5. Verwijder al het collageen van pipet in de buis en gooi de positieve verplaatsing pipettip weg. Schakel onmiddellijk over op de pipet met een positieve verplaatsing van 250 μL en meng de collageenoplossing.
   6. Meng de collageenoplossing zoals eerder voltooid (snel maar voorzichtig om bellenvorming te voorkomen), verwijder indien mogelijk geen punt uit gel. Meng tot de oplossing homogeen is (ongeveer 5 pipetcycli of 10 s). Zorg er bij het mengen voor dat u vanuit verschillende posities van de buis (onder en boven) tekent voor gelijkmatig mengen.
   7. Eenmaal gemengd, breng onmiddellijk 250 μL cellulaire collageenoplossing over op de acellulaire collageensteunen in elk van de drie 12-put kweekinzetstukken. Om een uniforme dekking van de acellulaire collageenondersteuning te garanderen, schommelt u de schotel en/of gebruikt u de pipet met positieve verplaatsing om het vers gezaaide cellulaire collageen voorzichtig te verplaatsen zonder de acellulaire laag te verstoren.
   8. Verplaats de 12-put plaat onmiddellijk naar 37 °C celkweek incubator om deze minstens 30 minuten te laten geleren. Plaats collageen na gebruik terug in de koeling van 4 °C.
   9. Kantel na de geltijd van 30 minuten de plaat voorzichtig om de gelatie te beoordelen. Zorg ervoor dat het collageen gestold is.
   10. Voeg respectievelijk 500 μL en 1000 μL mengmedia (half endotheel- en half fibroblastonderhoudsmedia) toe aan de bovenkamer en de onderste kamer van de insert (eerst boven, dan onder om te voorkomen dat hydrostatische druk collageen omhoog duwt). Voeg langzaam media toe aan de zijkant van de put, niet direct aan collageengel, om verstoring van het collageen te minimaliseren.
       1. Zorg ervoor dat de collageengel onder water staat, voeg indien nodig meer media toe. Plaats de putplaat in de celincubator voor nachtelijke incubatie. In dit stadium bevatten media 10% FBS; de normale onderhoudsmedia voor elke celregel (tijdlijn en schema in figuur 1, A).
          OPMERKING: Media in de hele VHSE-cultuur kunnen worden aangepast voor aangepaste celtypen; enige optimalisatie kan nodig zijn.
4. Submersion Day 2 (SD2) mediaverandering
   1. Verander 10% FBS-media in VHSE-putten in 5% FBS half fibroblast, half endotheelmedia aangevuld met 100 μg/ml L-ascorbinezuur. Voeg 500 μL toe aan de bovenste kamer van de kweekinzet aan de zijkant van de put (nogmaals, voeg voorzichtig toe aan de zijwand om verstoring van het collageen te minimaliseren) en voeg 1000 μL toe aan de onderste kamer.
   2. Vernieuw media om de 2 dagen (SD4 en SD6) tot Dag van de Onderdompeling 7 (SD7).
   3. Gebruik een handmatige pipet om media uit de putten te verwijderen. Het gebruik van een aspirator is mogelijk, maar kan leiden tot schade of vernietiging van de constructie.
      OPMERKING: L-ascorbinezuur moet elke 2-3 dagen vers worden gemaakt (het oxideert in oplossing om waterstofperoxide te produceren, waardoor oxidatieve stress en uiteindelijk cellulaire schade worden veroorzaakt⁵³). Media moeten dus elke 2-3 dagen worden vervangen van SD2 tot het einde van de VHSE-cultuur, omdat L-ascorbinezuur aanwezig is. Het is het gemakkelijkst om een voorraad media te maken en elke voedingsdag een vers bereide hoeveelheid L-ascorbinezuur aan een media aliquot toe te voegen. Gebruik water of media van kweekkwaliteit als oplosmiddel en bereid vers L-ascorbinezuur bij 100 mg/ml. L-ascorbinezuur stimuleert de collageensynthese door fibroblasten in een passend tempo en bevordert de collageenstabiliteit^54,55,56; het vermindert ook de endotheeldoorlaatbaarheid en handhaaft de integriteit van de vaatwand^56,57 en draagt bovendien bij tot de vorming van epidermale barrière^6,58.

3. Zaaien van epidermale component en stratificatie inductie

1. Submersie dag 7 (SD7): zaadkeratinocyten
   OPMERKING: Zaadkeratinocyten om de epidermis op SD7 vast te stellen. Dit tijdspunt kan worden verschoven op basis van de behoeften van de onderzoeker. De duur van de submersiecultuur zonder keratinocyten mag niet langer zijn dan 9 dagen, omdat een langere onderdompeling vaak leidt tot verhoogde dermale contractie. Als contractie optreedt vóór SD7, wordt aanbevolen om de onderdompelingsperiode te verkorten tot 5 dagen en zaadepidermis op SD5. Optimaliseer de onderdompelingsperiode zoals vereist voor specifieke experimenten (zie probleemoplossing in discussie).
   1. Kweekkeratinocyten (N/TERT-1^20,59 of andere geschikte cellen) tot hun samenvloeiingsgrens vóór trypsinisatie en zaaien op VHSE's. Voor N/TERT-1-cellen mag de samenvloeiing niet significant meer dan 30% bedragen om niet-gewenste differentiatie van keratinocyten in 2D-cultuur te voorkomen⁵⁹. Voor andere geschikte cellijnen, zoals primaire menselijke epidermale keratinocyten, wordt over het algemeen een samenvloeiingsgrens van 75-80% gebruikt⁶⁰.
   2. Tel en schorst na trypsinisatie 510.000 cellen in 600 μL Human Skin Equivalent (HSE) Differentiatiemedia aangevuld met 5% FBS (Tabel 1).
      OPMERKING: 510.000 cellen in 600 μL maakt 170.000 cellen/construct mogelijk bij het zaaien van 200 μL per constructie (3 VHSE's).
   3. Gebruik een handmatige pipet en verzamel en gooi media weg die zich momenteel in de onderste en bovenste kamer bevindt voor elke constructieput. Zorg ervoor dat u zoveel mogelijk media verzamelt. Verzamel media die direct onder het doorlatende membraan kunnen worden geplakt door de pipetpunt voorzichtig onder het kweekinzetmembraan te plaatsen en het inzetstuk tijdelijk uit zijn plaats te slaan. Media kunnen vastgelopen zijn door oppervlaktespanning. Zorg ervoor dat de inzetstukken plat in hun putten zitten voordat u verder gaat. Het gebruik van een aspirator is mogelijk, maar kan leiden tot schade of vernietiging van de constructie.
   4. Voeg 1 ml HSE-media aangevuld met 5% FBS toe aan de onderste kamer van elke put. Voeg vervolgens 200 μL celsuspensie toe aan de bovenste kamer van elke put. Zaad direct op het huidconstructieoppervlak. Laat keratinocyten 2 uur in de incubator bezinken.
   5. Twee uur na het zaaien van de keratinocyten, voeg voorzichtig 300 μL HSE-media aangevuld met 5% FBS toe aan de bovenste kamer van elke constructieput; pipetteer langzaam media op de zijkant van de cultuurinzet. Laad media zeer voorzichtig in de bovenste kamer om vaste keratinocyten die mogelijk nog niet stevig aan de onderliggende collageengel hebben vastgekleefd, niet te verstoren.
   6. Plaats de constructie na het laden van de media terug in de incubator.
2. Onderdompelingsdag 8/9 (SD8 of SD9)
   1. Maak HSE-media aangevuld met 1% FBS en 100 μg/ml L-ascorbinezuur.
   2. Verwijder media uit zowel de bovenste als de onderste kamers met een handmatige pipettor.
   3. Voeg eerst 500 μL media toe aan de bovenste kamer en vervolgens 1 ml in de onderste kamer. (Deze stap kan worden uitgevoerd op SD8 of SD9)
3. Duikdag 9/10 (SD9 of SD10, dit moet de dag na stap 3.2 zijn)
   1. Maak serumvrije HSE differentiatiemedia met 100 μg/ml L-ascorbinezuur.
   2. Verwijder media uit zowel de bovenste als de onderste kamers met een handmatige pipettor.
   3. Laad 500 μL in de bovenkamer en 1 ml in de onderste kamer.
4. Air-Liquid Interface Dag 1 (ALI1)
   OPMERKING: ALI wordt de dag na stap 3.3 uitgevoerd.
   1. Til elke constructie op naar de lucht-vloeistof interface (ALI) door mediaafval alleen uit de bovenkamer te verwijderen. Gebruik een handmatige pipet om zo dicht mogelijk bij de epidermale laag te komen zonder deze aan te raken of te beschadigen.
   2. Kantel de plaat iets onder verschillende hoeken om de media te verzamelen. Verwijder in deze stap zoveel mogelijk media. Voeg ongeveer 2 ml steriel water toe aan de omringende putten in de plaat om een consistente luchtvochtigheid te behouden; houd de putten gevuld met water gedurende de hele cultuur.
   3. Controleer de plaat een paar uur later om er zeker van te zijn dat de keratinocyten zich nog steeds op de lucht-vloeistof interface bevinden. Als er media in de bovenkamer zijn, verwijder deze dan. Houd bij hoeveel media voor elke VHSE goed worden verwijderd (Het beginvolume van de bovenste en onderste kamers (1500 μL) - verwijderde media = een goed startpunt voor ALI-voeding).
      OPMERKING: VHSE's vereisen niet noodzakelijkerwijs hetzelfde medianiveau voor luchtlift; meestal als de VHSE's samengezaaid zijn, hebben ze ongeveer hetzelfde niveau van media nodig voor luchtlift, maar dit is niet altijd het geval. Pas de volumes zo nodig aan om ALI te behouden, maar zorg ervoor dat de medianiveaus niet zo laag zijn dat de VHSE's uitdrogen. Het is veiliger om voorzichtig te zijn en dagelijks kleine mediahoeveelheden te verwijderen totdat een balans tussen luchtlift en hydratatie is bereikt.
5. ALI Dag 2 (ALI2)
   1. Gebruik vanaf nu alleen serumvrije HSE-media aangevuld met 100 μg/ml L-ascorbinezuur. Verander media op ALI Dag 2 (ALI2). Als er media in de bovenste kamer zijn, verwijdert u deze en voegt u deze toe aan de hoeveelheid verwijderde media die eerder zijn opgenomen. Bereken het benodigde mediavolume met behulp van de vergelijking in de vorige stap. Bijvoorbeeld: Als 200 μL media uit de bovenste kamer is verwijderd, voeg dan 1300 μL toe om ALI vast te stellen (als 1500 μL - 200 μL = 1300 μL)
   2. Gebruik het berekende volume om in de onderste kamer van elke put te laden en plaats de plaat vervolgens terug in de celincubator. Houd het gebruikte volume per dag bij. Bij gebruik van de aanbevolen collageenhoeveelheden in 12-well kweekinzetstukken, daalt het gebruikelijke bereik van ALI-waarden tussen 750 μL en 1300 μL. Meestal neemt het volume af tijdens de kweekrijping en wordt consistent rond week 2/3 van ALI. Afhankelijk van de cultuurspecificaties kan dit aantal veranderen en moet het worden geoptimaliseerd (zoals beschreven in 3.4.2 - 4.1).

4. Routineonderhoud van vasculaire menselijke huidequivalent

1. Van ALI Dag 3 (ALI3) tot kweek eindpunt: Vernieuw de media van de onderste kamer om de 2-3 dagen met serumvrije HSE media met 100 μg/ml L-ascorbinezuur. Ga door met het aanpassen en volgen van het medianiveau dat nodig is in de onderste kamer voor ALI zoals beschreven in stap 3.5.2.
2. Aangezien het epidermale oppervlak in contact moet blijven met de lucht, controleert en past u het medianiveau dagelijks aan totdat consistente ALI-niveaus zijn vastgesteld. De epidermale laag moet er gehydrateerd uitzien, niet droog, maar er mogen geen media bovenop de constructie worden gepoold. Culturen met 8 weken ALI hebben de meest consistente morfologie en expressie gegeven; afhankelijk van de toepassing kunnen culturen van 4 tot 12 weken echter geschikt zijn. De kweekduur voor verschillende cel- en kweekomstandigheden moet mogelijk worden geoptimaliseerd.
   OPMERKING: Het veranderen van media maandag, woensdag, vrijdag is een goede oefening. De VHSE's zijn gezond in het weekend, maar de media moeten vroeg op maandag en laat op vrijdag worden veranderd. Na het volledig voltooien van stap 1-4 is het genereren van een VHSE voltooid. Stap 5-end van het protocol zijn optionele verwerkings- en beeldvormingstechnieken die zijn geoptimaliseerd voor dit type 3D-constructie.

5. Fixatie en permeabilisatie van 3D-constructies

OPMERKING: Stap 5 is geoptimaliseerd voor beeldvormingstechnieken die specifiek zijn voor deze 3D-constructie en die worden beschreven in de rest van het protocol. De volgende stappen zijn niet nodig voor het genereren van een VHSE.

1. Fixatie/permeabilisatie
   1. Verwijder voorzichtig alle media uit de bovenste en onderste kamers van elke put op het eindpunt van de cultuurperiode.
      OPMERKING: De epidermale laag is mogelijk kwetsbaar, ga voorzichtig te werk en roer de epidermis niet met agressieve pipetten.
   2. Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS (pH 6.9) toe aan de wand van de bovenste kamer (niet direct op de constructie) en vervolgens aan de onderste kamer, om elke constructie vooraf te bevestigen. Voeg 1 ml per kamer toe en stel 5 minuten bloot bij kamertemperatuur.
      LET OP: PFA is gevaarlijk en moet met zorg en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) worden gebruikt, inclusief oogbescherming.
   3. Verwijder 4% PFA-oplossing na 5 minuten en voeg de 0,5% Triton X 100 in 4% PFA-oplossing toe aan de bovenste en onderste kamers zoals beschreven in de vorige stap. Stel 1 uur bloot bij kamertemperatuur; VHSE-constructie vereist vanaf nu geen steriele omgeving meer.
   4. Verwijder na 1 uur de permeabilisatie-/fixatieoplossing voorzichtig uit beide kamers en was het monster 3 keer met 1x PBS.
   5. Bewaar monsters in PBS in de koelkast van 4 °C of onmiddellijk beitsen. Om de monsters op te slaan, wikkelt u de schaal in een plasticfolie en vervolgens folie om verdamping en blootstelling aan licht te minimaliseren
      OPMERKING: Pauzepunt - Na fixatie en permeabilisatie kan deze procedure worden onderbroken omdat de monsters enkele weken stabiel zijn als ze zijn voorbereid zoals beschreven in stap 5.1.5. Als alternatief kan de kleuring (zoals beschreven in stap 6) onmiddellijk na stap 5 worden voltooid.

6. Immunofluorescente kleuring van 3D-constructies

1. Voorbereiding van de constructie
   OPMERKING: VHSE's vlekken goed wanneer gescheiden van poreus membraan van de kweekinzet; scheiding van het membraan is ook nodig voor niet-belemmerde beeldvorming en maakt verminderde volumes voor kleuring mogelijk.
   1. Om de constructie voor immunofluorescente kleuring voor te bereiden, draait u een inzetstuk ondersteboven en plaatst u het over de put op de putplaat (als de VHSE valt, valt deze met PBS in de put) (Aanvullende figuur 1A).
   2. Stabiliseer het inzetstuk met één hand over de put terwijl u een fijne tip forceps en/of een precisiemes gebruikt om ongeveer de helft van de omtrek van het wisselplaatmembraan te snijden. Snijd met een zachte hand zo dicht mogelijk bij de kunststof behuizing om beschadiging van de VHSE-constructie te voorkomen.
   3. Pak met behulp van de fijne tip forceps de rand van de gesneden membraanklep en pel het poreuze membraan voorzichtig van het inzetstuk en de VHSE-constructie. Doe dit heel voorzichtig en langzaam om schade aan de VHSE constructie te voorkomen. Als de VHSE-constructie gemakkelijk scheidt, moet deze in de put eronder vallen, als deze aan de zijkant van de kamer vast komt te zitten, gebruik dan de fijne tipdarm of een kleine scoopula om hem naar de put te verplaatsen. Houd rekening met de epidermale laag, omdat deze meestal fragiel is (Aanvullende figuur 1A).
      OPMERKING: Soms komt het membraan er niet gemakkelijk af of komt het in stukken los, als dit gebeurt, gebruik dan het gereedschap om het membraan en de VHSE-constructie voorzichtig uit elkaar te trekken. Zorg ervoor dat de VHSE's tijdens dit proces niet uitdrogen door indien nodig PBS in te dompelen.
   4. Zodra de VHSE zich in de put bevindt, gooit u de resterende stukken van het wisselplaatmembraan weg en houdt u de kweekinzetbehuizing in elke put om de VHSE's tijdens het kleuren in een ondergedompelde positie te houden.
2. Kleuring
   OPMERKING: Kleuring en de bijbehorende hantering/manipulatie en wasbeurten moeten zo voorzichtig mogelijk worden uitgevoerd, omdat VHSE's kwetsbaar kunnen zijn. Als delen van de epidermis opstijgen, kunnen de stukken afzonderlijk worden gekleurd; bovenste lagen van de opperhuid zijn fragiel en gaan door natuurlijke desquamatie⁴, maar voor analyse is het belangrijk om de integriteit zoveel mogelijk te behouden.
   1. Bereid de gekozen primaire antilichaamvlekken voor in 700 μL blokkeerbuffer per constructieput (meestal kunnen alle primaire antilichamen zich in dezelfde kleuroplossing bevindt, maar dit moet worden bevestigd voor nieuwe antilichamen). 700 μL werkt voor een grootte van 12 putten, maar kan worden aangepast voor andere kweekformaten. Aanbevolen concentraties van primaire en secundaire antilichamen met blokkerend bufferrecept zijn opgenomen in tabel 3 (optimalisatie kan nodig zijn).
   2. Verwijder pbs uit de put met behulp van een handmatige pipet, wees voorzichtig om pipet uit de buurt van VHSEs (als VHSE's zweven, vacuüm aspiratie wordt niet aanbevolen).
   3. Voeg de primaire vlekoplossing toe aan elke put en plaats de kweekinzetbehuizing in de put om de VHSE ondergedompeld te houden in vloeistof(aanvullende figuur 1B). Wikkel de putplaat in met plasticfolie. Folie en vlek gedurende 48 uur in 4 °C koeling zonder roeren of schommelen (schommelen kan de VHSE-constructie beschadigen).
   4. Bereid na 48 uur secundaire antilichamen en chemische vlekken voor in 700 μL blokkeerbuffer (per put).
   5. Verwijder de kweekinzetbehuizing en de primaire vlekoplossing en was met 1x PBS, 3x gedurende 5 minuten voordat u de secundaire vlekoplossing toevoegt. Plaats de kweekinzetbehuizing terug in de put om de VHSE-constructie onder water te houden (Aanvullende figuur 1B). Bloot gedurende 48 uur in de koeling van 4 °C zonder te roeren of te schommelen.
   6. Verwijder na 48 uur blootstelling de vlekoplossing met een handmatige pipettor en was voorzichtig 3x met PBS; pipetvloeistof niet rechtstreeks op de VHSE's, omdat deze kwetsbaar kunnen zijn. Rehydrateer met overtollige PBS en plaats de kweekinzetbehuizing terug in de put om de VHSE ondergedompeld en gehydrateerd te houden tijdens opslag (bewaar door in plasticfolie en folie te wikkelen om verdamping en blootstelling aan licht te minimaliseren)
3. Clearing (optioneel & terminal)
   OPMERKING: Wissen is optioneel voor beeldvorming. Indien voltooid, moet het worden gedaan na het kleuren / weergeven van het monster volledig, omdat clearing verdere vlekken voorkomt, de fluorofoorprestaties kan veranderen en de VHSE-structuur kan beschadigen. Meerdere weefsel clearing methoden bestaan^49,61,62 en kunnen worden geoptimaliseerd voor specifieke projecten. Methylsalicylaat clearing, hieronder beschreven, is zowel eenvoudig als effectief voor VHSE. De volgende ontruimingstechniek moet worden uitgevoerd in glazen containers en pipetpunten moeten glas of polypropyleen zijn (polystyreen lost op in contact met methylsalicylaat). Voltooi alle ontruimingsprocedure in een goed geventileerde ruimte of zuurkast.
   1. Voeg 100% methanol toe aan een kleine ondiepe glazen container (glazen Petrischalen werken goed). Gebruik de kleinst mogelijke container die bij de constructie past (om reagensafval te minimaliseren).
   2. Verwijder de constructie van de putplaat met behulp van een tang/scoopula(aanvullende figuur 1C)en plaats deze in de methanol gevulde container. Voeg meer methanol toe als de constructie niet onder water staat.
   3. Dehydrateer de VHSE-constructie in methanol gedurende 3 x 10 minuten onderdompeling; vervang methanol volledig na elke onderdompeling en verwijder onmiddellijk methanol na het laatste bad. In de loop van deze procedure kan de constructie ondoorzichtiger worden en iets krimpen.
      OPMERKING: Deze duur en herhalingen zijn geoptimaliseerd, maar methanol en de volgende methylsalicylaatprocedures moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van het specifieke kweekformaat en de vlekken.
   4. Voeg onmiddellijk na het verwijderen van methanol methylsalicylaat toe en dompel de VHSE onder in 5 x 5 minuten onderdompeling. Vervang het reagens volledig na elke onderdompeling en laat de VHSE in de 5e dompeloplossing voor opslag. In de loop van deze procedure wordt de constructie transparant.
   5. Afbeelding van de constructie of opslag bij 4 °C. Voltooi na het opruimen alle beeldvorming zo snel mogelijk, omdat de fluoroforen binnen enkele dagen kunnen afbreken in methylsalicylaat. Clearing zorgt ervoor dat de constructies broos worden en de uitgebreide opslag, hoewel niet aanbevolen, heeft een regelmatige controle nodig om ervoor te zorgen dat er voldoende methylsalicylaat is.

7. Confocale beeldvorming van 3D-constructies

OPMERKING: Beeldvorming door weefselkweekplastic levert niet dezelfde beeldkwaliteit op als beeldvorming door afdekglas, deze methode beschrijft de fabricage van een aangepaste glasbodemput om uitdroging tijdens confocale beeldvorming te voorkomen. Meestal is dit voldoende voor ten minste 3 uur beeldvorming.

1. Twee dagen voor beeldvorming: bereid polydimethylsiloxaan (PDMS)
   1. Bereid PDMS^48,63,64 voor bij een voorgestelde concentratie van [9:1], basis: crosslinker. Bereid 30 g PDMS-totaal voor: 27 g basiscomponent en 3 g crosslinker. Plaats elk schoon mengvat op een weegbalans en tarra de weegschaal. Voeg de basis (27 g) toe en voeg vervolgens de crosslinker (3 g) toe om een totaal van 30 g te bereiken. Voeg altijd de basis toe voordat u crosslinkert.
   2. Roer de oplossing minstens 4 minuten krachtig; dit zal kleine bubbels creëren. Giet het PDMS na voldoende mengen in een petrischaal van 100 mm of een vergelijkbare hittebestendige container met platte bodem.
   3. Ontgass het PDMS in een vacuümkamer totdat alle bellen van het mengen verdwijnen en PDMS helder is. Laat het vacuüm langzaam los en verwijder het PDMS (langzaam). Zet de schaal in een oven om 's nachts uit te harden (50-60 °C); zorg ervoor dat de schotel plat zit om PDMS gelijkmatig te laten uitharden.
      OPMERKING: Na het uitharden moet PDMS helder zijn en moet het oppervlak glad en niet plakkerig zijn (kleverigheid kan wijzen op onvoldoende mengen).
2. Een dag voor beeldvorming: PDMS goed voorbereid
   1. Pons of knip met een handprecisiemes een cirkelvormige put uit de PDMS-plaat die in 7.1 is voorbereid. De put moet ongeveer even groot zijn als de VHSE-constructie. Snijd een vierkante patch rond de cirkelvormige put om een enkele PDMS-put te maken. De bereide PDMS-hoeveelheid van 30 g moet ten minste vier aangepaste putten opleveren.
      OPMERKING: De PDMS-put moet dicht bij de grootte van de VHSE-constructie liggen. Het moet de beweging van het monster beperken tijdens de beeldvorming. Meerdere putten kunnen in één keer worden gefabriceerd en voor onbepaalde tijd in een schone container worden opgeslagen.
   2. Voeg met behulp van een glazen afdeklip van een vergelijkbare grootte als de PDMS-put cyanoacrylaatlijm (bijv. superlijm) toe aan het onderste oppervlak van het PDMS (het gladde oppervlak dat in contact was met de Petrischaal) en smeer gelijkmatig in met een wegwerppipetpunt. Centreer en druk het PDMS goed op het glas terwijl u een helder glasvenster binnen de geperforeerde cirkel laat (zorg ervoor dat de lijm niet over het kijkvenster wordt gesmeerd).
      OPMERKING: Indien beschikbaar is plasmabinding van het PDMS op de afdeklip een alternatief^65,66,67.
   3. Laat de lijm enkele uren of 's nachts drogen voordat u ze gebruikt. Deze zijn herbruikbaar totdat ze breken door normale slijtage.
      OPMERKING: Het wordt niet aanbevolen om de monsters in de gelijmde PDMS te beitsen die goed worden gebruikt voor beeldvorming. Deze putten houden vloeistof enkele uren vast, maar kunnen lekken tijdens langere vlekken.
3. VHSE beeldvorming
   OPMERKING: Als de beeldvorming onduidelijk is, gebruik PBS dan als beeldvormingsoplossing. Als beeldvorming met gewiste monsters, gebruik dan methylsalicylaat (of de gekozen clearingoplossing) als beeldvormingsoplossing.
   1. Voeg een paar druppels beeldvormingsoplossing toe aan de PDMS-put en controleer op lekken (als er een lek is, repareer het dan met een punt / uitstrijkje van cyanoacrylaat superlijm of gebruik een andere put).
   2. Houd de imaging-oplossing goed in het PDMS bij het toevoegen van de VHSE. Verwijder met behulp van scoopula of fijne tip forceps(Supplemental Figure 1C),de constructie van de 12-putplaat en plaats deze in de PDMS-put op de glazen afdeklip. Plaats constructie met de oriëntatie van belang naar het doel gericht. Als u bijvoorbeeld de opperhuid wilt in beeld zien met een omgekeerde microscoop, moet u ervoor zorgen dat de epidermis naar beneden is gericht, naar het glas.
      1. Als alternatief, voor een rechtopstaande microscoop, kijk je naar de epidermis omhoog. De onderstaande beeldvormingsprocedures worden beschreven voor een omgekeerde microscoop, maar kunnen gemakkelijk worden aangepast voor een rechtopstaande microscoop.
         OPMERKING: Wees voorzichtig bij het manipuleren van de VHSE om schade te voorkomen. Breng over de putplaat voor het geval de VHSE valt. Een gebogen, platte tip scoopula is de gemakkelijkste manier om de constructie over te brengen (Aanvullende figuur 1C).
   3. Zorg ervoor dat het monster plat in de put zit en dat er geen delen van de opperhuid of dermis onder het monster worden gevouwen. Als het vouwen plaatsvindt, manipuleer het monster voorzichtig met een tang of een scoopula; het tijdelijk toevoegen van extra beeldvormingsoplossing om de VHSE te laten zweven, kan helpen om het recht te zetten. Het vouwen of rimpelen van het monster kan worden gezien met het oog of met behulp van de microscoop.
   4. Vul de put met beeldvormingsoplossing, met net genoeg vloeistof om het monster gehydrateerd te houden; te veel vloeistof zal het monster laten zweven, wat resulteert in beweging tijdens de beeldvorming. De constructie moet op het glazen kijkvenster zitten; test op beweging door de PDMS goed te kantelen. Als er beweging is, verwijder dan wat vloeistof; voeg vloeistofdruppels toe en verwijder deze totdat de beweging stopt.
   5. Plaats een glazen schuif over de put om verdamping tijdens beeldvorming te minimaliseren (Aanvullende figuur 1D). Voor langere beeldvormingssessies controleert u het monster regelmatig om de juiste vloeistofniveaus te garanderen. Indien toegankelijk, kan een bevochtigde kamer tijdens beeldvorming worden gebruikt (hoewel dit meestal niet nodig is).
   6. Plaats het monster op het microscoopstadium en beeld door het venster van de glasdekkingslip(Supplemental Cijfer 1D). Deze techniek maakt ten minste 3 uur continue confocale beeldvorming mogelijk, maar de hydratatie van het monster moet regelmatig worden gecontroleerd, waarbij indien nodig een beeldvormingsoplossing wordt toegevoegd.
      OPMERKING: Als het monster wordt gewist, zal methylsalicylaat de lijm na verloop van tijd afbreken. De lijm die het PDMS verlijmt, kan opnieuw worden aangebracht tussen beeldvormende uitvoeringen; of het monster kan periodiek naar nieuwe putten worden overgebracht. In putten met plasmabinding zal dit geen probleem zijn.
   7. Drijf het monster na beeldvorming zoveel mogelijk met beeldvormingsvloeistof in de put. Gebruik een scoopula of fijne tip forceps om het monster goed over te brengen in de opslag. Voer de overdracht uit over een putplaat voor het geval het monster valt.
   8. Elke PDMS put- en topglasafdekkingslip kan opnieuw worden gebruikt totdat ze breken. Reinig het onderste glas voor het in beeld brengen, zowel binnen als buiten de put. Controleer voor hergebruik altijd op lekkages en repareer indien nodig met lijm.
   9. Bewaar monsters zoals beschreven in stap 6.3.6 en voeg pbs om de paar maanden toe om te onderhouden; als de monsters worden gewist, bewaar deze dan in glas met methylsalicylaat en controleer de niveaus regelmatig. Gewiste monsters kunnen snel (binnen enkele dagen) afbreken en moeten zo snel mogelijk in beeld worden gebracht.

Representative Results

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het genereren van in vitro gevasculariseerde menselijke huidequivalenten (VHSE) met behulp van telomerase reverse transcriptase (TERT) vereeuwigde keratinocyten (N/TERT-1^20,59),volwassen menselijke huidfibroblasten (hDF) en menselijke microvasculaire endotheelcellen (HMEC-1) (Figuur 1). Bovendien wordt het aanpasbare karakter van dit protocol benadrukt door ook VHSE-generatie en stabiliteit aan te tonen bij het gebruik van algemeen beschikbare longfibblasten (IMR90) in plaats van hDF. Het genereren van de VHSE wordt voltooid in stap 1-4, terwijl stap 5-7 optionele eindpuntverwerkings- en beeldvormingstechnieken zijn die zijn geoptimaliseerd voor deze VHSE's. Het is belangrijk op te merken dat de VHSE's kunnen worden verwerkt op basis van specifieke onderzoeksvragen en dat stappen 5-7 niet nodig zijn om de constructie te genereren. Volumetrische beeldvorming, analyse en 3D-renderings werden voltooid om een volumetrische analysemethode aan te tonen. Deze volumetrische constructievoorbereidings- en beeldvormingsprotocollen behouden de VHSE-structuur op zowel microscopisch als macroscopisch niveau, waardoor een uitgebreide 3D-analyse mogelijk is.

Karakterisering van de epidermis en dermis vertoont geschikte immunofluorescente markers voor de menselijke huid in de VHSE-constructies (Figuur 2, 3). Cytokeratine 10 (CK10) is een vroege differentiatie keratinocytmarker die gewoonlijk alle suprabasale lagen in huidequivalenten^18,30,68 markeert ( Figuur2). Involucrine en filaggrin zijn late differentiatiemarkers in keratinocyten en markeren de bovenste suprabasale lagen in huidequivalenten^12,30,68,69 ( figuur2). Een verrode fluorescerende kernkleurstof (zie materialenlijst) werd gebruikt om kernen in zowel de epidermis als de dermis te markeren, waarbij Col IV de vasculatuur van de dermis markeert (figuur 2, figuur 3, figuur 4). Epidermale keldermembraancomponenten (BM) worden niet altijd goed uitgedrukt in HSE-culturen^15,16; en Col IV-kleuring van de BM wordt niet consistent waargenomen met behulp van dit protocol. Onderzoeksgerichte BM-componenten en -structuur zouden baat hebben bij extra optimalisatie van media, cellen en beeldvorming¹⁴.

Hoewel confocale beeldvorming door het grootste deel van de VHSE-culturen vaak beelden met een hoge resolutie oplevert die voldoende zijn voor computationele analyse van de dermis en epidermis, maakt de beschreven clearingmethode diepere weefselbeeldvorming mogelijk. Clearing verbetert de confocale laserpenetratiediepte en effectieve beeldvorming in VHSE's kan worden bereikt tot meer dan 1 mm voor gewiste monsters (vergeleken met ~ 250 μm voor onduidelijk). De beschreven clearingtechniek (methanoldehydratie en methylsalicylaat) komt voldoende overeen met de brekingsindex in VHSE-monsterweefsel⁶¹. Het wissen van de VHSE maakte het mogelijk om de hele constructie zonder manipulatie eenvoudig weer te geven (bijv. de constructie te heroriënteren om de dermis en epidermis afzonderlijk weer te geven), (figuur 3).

Volumetrische beelden maken het mogelijk om 3D-rendering te genereren om vasculatuur in elke constructie in kaart te brengen (figuur 4). Kortom, confocale beeldsets werden genomen in dermale tot epidermale oriëntatie van verschillende subvolumes van VHSE's om Collagen IV-vlek (markeringsvatwanden) en kernen (gemarkeerd door een verrode fluorescerende nucleaire kleurstof) te detecteren. Afbeeldingsstacks worden geladen in computationele software (zie materialenlijst) en een aangepast algoritme (gebaseerd op deze bronnen ^{48,70,71,72,73,74,75}) wordt gebruikt voor 3D-rendering en kwantificering zoals eerder beschreven⁴⁸. Dit algoritme segmenteert automatisch de vasculaire component op basis van de Col IV-vlek. De volumetrische segmentatie wordt doorgegeven aan een skeletonisatiealgoritme op basis van snel marcheren^75,76,77. Skeletonisatie vindt het definitieve centrum van elk col IV gemarkeerd vat en de resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de diameter van het vat en de vasculaire fractie te berekenen (figuur 4). Widefield fluorescentie is een toegankelijke optie als laserscanmicroscopie niet beschikbaar is; het vasculaire netwerk en de epidermis kunnen worden afgebeeld met breedveld fluorescerende microscopie (Aanvullende figuur 2). Driedimensionale kwantificering is mogelijk met behulp van widefield imaging van VHSE's in plaats van laserscanmicroscopie, hoewel het mogelijk meer filtering en deconvolutie van beelden vereist als gevolg van buiten het vlak licht.

Figuur 1: Schematische tijdlijn van gevasculariseerde menselijke huidequivalentgeneratie. A) Toont progressie van het VHSE-model van 1) het zaaien van de huidcomponent, 2) keratinocyt zaaien op de huidcomponent, 3) epitheliale stratificatie via luchtvloeistofinterface en kweekonderhoud. Postcultuurverwerking en volumetrische beeldvorming kunnen worden uitgevoerd op het cultuureindpunt. B) Camerabeelden van hDF VHSE macrostructuur in de cultuurinzetstukken op hun cultuureindpunt, 8 weken. Verschillende niveaus van contractie zijn normaal voor VHSE's; contractie kan worden verminderd zoals het protocol beschrijft. (1 & 2) Minder gecontracteerde monsters. (3 & 4) Meer gecontracteerde monsters leveren nog steeds de juiste huidelementen op. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Epidermale karakterisering via immunofluorescente markers. Alle foto's zijn gemaakt van VHSE's op 8wk cultuurtijdpunt via confocale microscopie. Overeenkomstige kleuringsmethoden worden beschreven in protocolstap 6. De juiste epitheliale markers zijn aanwezig in zowel hDF VHSE's (linkerkolom) als IMR90 VHSE's (rechterkolom). Involucrine en Filaggrin zijn late differentiatiemarkers van keratinocyten en tonen aan dat de epidermis volledig gestratificeerd is in beide VHSE-typen. Cytokeratine 10 is een vroege differentiatiemarker die suprabasale lagen in de VHSE's identificeert. Kernen worden weergegeven in orthogonale aanzichten in geel. En face en orthogonale max projectiebeelden werden gerenderd via computationele software; Afbeeldingen worden individueel geschaald met achtergrondaftrekking en mediaanfiltering voor duidelijkheid. Schaalstaven zijn 100 μm. (Primaire en secundaire antilichamen met intern blokkeerbufferrecept zijn opgenomen in tabel 3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Vergelijking van onduidelijke versus vrijgesproken VHSE. Deze VHSE werd gegenereerd met IMR90's en beelden werden genomen op 4wk cultuurtijdpunt via confocale microscopie. Collageen IV wordt weergegeven in cyaan; Kernen worden getoond in magenta; magenta in de gewiste 3D-rendering staat voor consolidatie van kernen in de epidermale laag van de VHSE. Het onduidelijke VHSE-beeld is een voorbeeld van laserdemping in dikkere VHSE-constructies, door clearing (methanol en methylsalicylaat) kan de hele constructie worden afgebeeld met weinig/geen laserdemping vanaf de dermale kant van de constructie. Beeldinstellingen zoals laserlijn, gain en pinhole werden verlaagd voor gewiste VHSE om oververzadiging te verminderen. Clearing en imaging zijn voltooid zoals beschreven in stap 6 & 7 in het protocol. Orthogonale maximale projectiebeelden en 3D-rendering werden voltooid met computationele software, 3D-rendering werd gegenereerd uit gewiste constructafbeeldingen. Afbeeldingen worden individueel geschaald met achtergrondaftrekking en mediaanfiltering voor duidelijkheid. Schaalbalken zijn 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Driedimensionale analyse van vasculatuur binnen VHSE's. Volumetrische beelden gemaakt via confocale microscopie maken vasculaire parameterkwantificering op de cultuureindpunten mogelijk door middel van computationele beeldanalyse. Van VHSE subvolumes markeert detectie van Collagen IV-vlek (cyaan) endotheelwanden van vasculatuur en maakt segmentatie van vasculaire op basis van collageen IV-locatie mogelijk; segmentatiegegevens worden vervolgens geskeletiseerd en het midden van elk vat wordt gevonden (magenta). Voorbeelden van 3D-skeletonisatie worden getoond gedurende 4 weken en 8 weken IMR90 VHSE-monsters, niet gewist. De resulterende gegevens van een IMR90 VHSE-experimentset werden gebruikt om de vaatdiameters en de vasculaire fracties te berekenen voor vier subvolumes (elk 250 μm in de z-richting) binnen elke constructie, de gegevens werden gemiddeld per VHSE en verder gemiddeld per kweektijdpunt. Deze gegevens tonen de vasculaire netwerkhomeostase over 4 en 8 weken kweekduur met diameters die relevant zijn voor de in vivo menselijke huid⁷⁸, en de vasculaire fractie binnen dezelfde volgorde als in vivo menselijke huid⁷⁹ (vasculaire fractie in collageenconstructies is aangetoond aanpasbaar⁴⁸ en kan verder worden geoptimaliseerd voor verhoogde waarden). Gegevens worden weergegeven als middelen ± standaardfout gemiddeld (S.E.M); n = 3 voor elk tijdspunt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

media	Onderdelen
Menselijke Dermale Fibroblast cellijn (hDF)	DMEM HG
	5% Foetaal Runderserum (FBS)
	1% Penicilline/Streptomycine (P/S)
IMR90 Fibroblast cellijn	DMEM/HAM'S F12 50:50 uur
	10% FBS
	1% P/S
HMEC-1 Endotheelcellijn	MCDB131 Basismedium
	10% FBS
	1% P/S
	L-Glutamine [10 mM]
	Epidermale groeifactor (EFG) [10 ng/ml]
	Hydrocortison [10 μg/ml]
N/TERT-1 Keratinocyt cellijn	K-SFM mediabasis
	1% P/S
	Bovine Hypofyse Extract (BPE) [25 μg/ml], uit K-SFM supplement kit
	Epidermale groeifactor (EFG) [0,2 ng/ml], uit K-SFM supplement kit
	CaCl2 [0,3 mM]
Menselijke huidequivalent (HSE) differentiatie	3:1 DMEM: Ham's F12
	1% P/S
	0,5 μM Hydrocortison
	0,5 μM Isoproterenol
	0,5 μg/ml insuline

Tabel 1: Mediarecepten. Mediarecepten voor 2D-cultuur van de menselijke huidfibroblasten, IMR90 fibroblasten, HMEC-1 en N/TERT-1 keratinocyten worden gegeven. Deze recepten werden gebruikt om cellijnen uit te breiden voordat VHSE's werden gegenereerd. Human skin equivalent (HSE) differentiatiemedia worden gebruikt om VHSE's te genereren; een basisrecept wordt gegeven, tijdens porties onderdompelingscultuur en stratificatie-inductie, moeten taps toelopende hoeveelheden FBS worden toegevoegd zoals beschreven in protocolstap 3. HSE recept op basis van deze bronnen^11,80.

Collageenvoorraadconcentratie (Cs) :	8	mg/ml
Gewenst volume (Vf):	1	Ml
Normaliseren van NaOH-aanpassing*:	1	X
* Elke partij collageen moet worden getest om de hoeveelheid NaOH te bepalen die nodig is om pH 7 - 7,4 in te stellen
		Gewenste collageenconcentratie (mg/ml)
	2	3	4	5
10X PBS (Vpbs)	0.1	0.1	0.1	0.1
Collageenbouillon (Vs)	0.25	0.375	0.5	0.625
1N NaOH (VNaOH)	0.00575	0.008625	0.0115	0.014375
Media (Vmedia)	0.64425	0.516375	0.3885	0.260625

Tabel 2: Referentietabel collageenberekening. Referentietabel geeft algemeen gewenste collageenconcentraties berekend uitgaande van een collageenvoorraadconcentratie van 8 mg/ml en een gewenst eindvolume van 1 ml; alle waarden zijn in ml. De vergelijkingen die worden gebruikt om deze bedragen te berekenen, worden gegeven in protocolstap 2.2. Het is belangrijk om de pH voor elke collageenvoorraad te controleren; indien nodig moeten NaOH-hoeveelheden worden toegevoegd om een pH van 7 - 7,4 te bereiken (na PBS, NaOH, collageenbouillon, media worden toegevoegd). Het protocol is geoptimaliseerd voor VHSE's met een collageenconcentratie van 3 mg/ml; veranderingen in de collageenconcentratie kunnen nodig zijn voor verschillende cellijnen/gewenste eindresultaten⁴⁸.

Primair antilichaam	bron	concentratie	gebruiken
Filaggrin (AKH1) muis monoklonale IgG	Santa Cruz; sc-66192 (200 μg/ml)	[1:250]	Late differentiatiemarker15
Involucrine konijn polyklonale IgG	Proteintech; 55328-1-AP (30 μg/150 μL)	[1:250]	Late terminale differentiatiemarker15
Cytokeratine 10 (DE-K10) muis IgG, supernatans	Santa Cruz; Sc-52318	[1:350]	Suprabasale epidermale marker14,36,59
Collageen IV konijn polyklonaal	Proteintech; 55131-1-AP	[1:500]	Endotheel vasculaire wand67
DRAQ 7	Celsignalering; 7406 (0,3 mM)	[1:250]	Nucleaire marker
Secundair antilichaam	bron	concentratie	gebruiken
Goat Anti-Rabbit IgG DyLight™ 488 Geconjugeerd	Invitrogen; 35552 (1 mg/ml)	[1:500]	Collageen IV secundair
Anti-Rabbit IgG (H&L) (GOAT) Antilichaam, DyLight™ 549 Geconjugeerd	Rockland Immunochemicaliën; 611-142-002	[1:500]	Involucrine secundair
Geit Anti-Muis IgG (H&L), DyLight™ 488	Thermo Wetenschappelijk; 35502 (1 mg/ml)	[1:500]	Filaggrin of Cytokeratine 10 secundair
BLOKKERENDE BUFFER (500 ml)
Reagens	aantal
ddH2O	450 ml
10 x PBS	50 ml
Runderserum Albumine (BSA)	5 g
Tween 20	0,5 ml
Koud water Vis Gelatine	1 g
Natrium Azide (10% Natrium Azide in diH2O)	5 ml (eindconcentratie van 0,1 % )

Tabel 3: Primaire en secundaire antilichamen met blokkerend bufferrecept. De vermelde antilichamen en chemische vlekken werden gebruikt voor kleuring in figuur 2, figuur 3, figuur 4. De kleuring is voltooid zoals gegeven in protocol stap 6 met behulp van het hier vermelde blokkeringsbufferrecept. Sommige optimalisaties van de kleuringsconcentraties en de duur kunnen nodig zijn, afhankelijk van de gekozen kweektechnieken en de cellijnen.

Aanvullende tabel 1: Lijst met afkortingen. Afkortingenlijst inbegrepen voor het gemak van de lezer. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend figuur 1: Technische VHSE-technische hulp voor hantering. Het hanteren van VHSE's is een uitdaging, vooral tijdens fixatie, verwerking en kleuring. A-D komt overeen met de instructies in stap 5-7. A toont de technische behandeling van het verwijderen van het poreuze membraan uit een kweekinzetstuk om een goede kleuring te garanderen. B laat zien hoe u elke VHSE onder water houdt tijdens het kleuren en opslaan. C toont de veiligste en gemakkelijkste manier om constructies naar PDMS-beeldputten te verplaatsen. D toont een VHSE die in een PDMS-beeldvormingsput zit: PDMS-put wordt aan de onderkant aan een glazen dia gelijmd, waardoor een venster voor beeldvorming ontstaat, een glazen schuif bovenop wordt geplaatst om de vochtigheid te behouden door lange beeldvormingsruns. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend figuur 2: Standaard widefield fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om VHSE's te beoordelen. Widefield imaging kan worden gebruikt voor volumetrische beeldvorming voor routinematige beoordeling wanneer laserscanmicroscopie niet beschikbaar is. Als voorbeeld worden beeldvorming van VHSE's van zowel de apicale als basolaterale aspecten weergegeven als en face en orthogonale (Ortho.) maximale projecties. (Boven) De epidermis werd afgebeeld met involucrine en kernen als markers. (Onder) Huid vasculatuur werd afgebeeld met behulp van collageen IV als een marker. Afbeeldingen worden voor de duidelijkheid afgetrokken van de achtergrond. Out-of-plane licht leidt tot de "streaking" of "flare" artefacten duidelijk in de orthogonale weergaven. Widefield imaging kan worden gebruikt voor kwantificering, maar vereist mogelijk meer beeldverwerking. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit protocol heeft een eenvoudige en herhaalbare methode aangetoond voor het genereren van VHSE's en hun driedimensionale analyse. Belangrijk is dat deze methode afhankelijk is van weinig gespecialiseerde technieken of apparatuurstukken, waardoor deze toegankelijk is voor een reeks laboratoria. Verder kunnen celtypen worden vervangen door beperkte wijzigingen in het protocol, waardoor onderzoekers dit protocol kunnen aanpassen aan hun specifieke behoeften.

Een goede collageengelatie is een uitdagende stap in het vaststellen van huidcultuur. Vooral bij het gebruik van ruwe preparaten zonder zuivering kunnen sporenverontreinigingen het gelatieproces beïnvloeden. Om consistentie te helpen garanderen, moeten groepen experimenten worden uitgevoerd met dezelfde collageenvoorraad die zal worden gebruikt voor VHSE-generatie. Verder zou de gelatie idealiter moeten optreden bij een pH van 7-7,4 en sporenverontreinigingen kunnen de pH verschuiven. Voordat een collageenvoorraad wordt gebruikt, moet een oefenacellulaire gel in de gewenste concentratie worden gemaakt en moet de pH worden gemeten voorafgaand aan gelatie. Het voltooien van deze collageenkwaliteitscontrole voordat u begint met het zaaien van huidcomponenten, zal de problemen met de juiste gelatie en collageenhomogeniteit identificeren voordat een volledig experiment wordt opgezet. In plaats van acellulair collageen rechtstreeks op een kweekinzet te zaaien, zaait u wat collageen op een pH-strip die de hele pH-schaal evalueert en controleert u een pH van 7-7,4. Gelatie kan worden geëvalueerd door een druppel van de collageengeloplossing op een afdeklip of plastic putplaat voor weefselkweek aan te brengen (een putplaat wordt aanbevolen om de beperkte zijden van een kweekinzet te simuleren). Na gelatietijd moet het collageen stevig zijn, d.w.z. het mag niet stromen wanneer de plaat wordt gekanteld. Onder fasecontrastmicroscopie moet het collageen er homogeen en helder uitzien. Incidentele bubbels van collageen zaaien zijn normaal, maar grote amorfe klodders ondoorzichtig collageen in de heldere gel duidt op een probleem- waarschijnlijk als gevolg van onvoldoende mengen, verkeerde pH en / of het niet gekoeld houden van het collageen tijdens het mengen.

De celzaden en media kunnen worden aangepast. In het bovenstaande protocol zijn de ingekapselde celhoeveelheden geoptimaliseerd voor een insert van 12 putjes bij 7,5 x^{10 4} fibroblasten en 7,5 x^{10 5} endotheelcellen per ml collageen met 1,7 x 10⁵ keratinocyten die bovenop de huidconstructie zijn gezaaid. Celdichtheden zijn geoptimaliseerd voor dit VHSE-protocol op basis van de voorstudies en het eerdere onderzoek naar 3D vasculaire netwerkgeneratie in verschillende collageenconcentraties⁴⁸ en HSE-generatie^22,80,81. In vergelijkbare systemen zijn de gepubliceerde endotheelceldichtheden 1,0 x 10⁶ cellen/ml collageen⁴⁸; de fibroblastconcentraties variëren vaak van 0,4 x 10⁵ cellen/ml collageen^22,28,82 tot 1 x 10⁵ cellen/ml collageen^{8,58,83,84,85}; en de keratinocytconcentraties variëren van 0,5 x 10⁵ [cellen/cm²]⁸⁰ tot 1 x 10⁵ [cellen/cm²]⁸. Celdichtheden kunnen worden geoptimaliseerd voor specifieke cellen en onderzoeksvragen. Driedimensionale culturen met contractiele cellen, zoals fibroblasten, kunnen samentrekken, wat leidt tot vermindering van de levensvatbaarheid en cultuurverlies^86,87. Voorbereidende experimenten moeten worden voltooid om de samentrekking van het huidcompartiment te testen (die kan optreden bij meer huidcellen, meer contractiele huidcellen, langere submersieculturen of zachtere matrices) en om epidermale oppervlaktedekking te testen. Bovendien kunnen het aantal dagen in de onderdompeling en de snelheid van taps toelopen van het serumgehalte ook worden aangepast als overmatige huidcontractie optreedt of een andere mate van keratinocytdekking vereist is. Bijvoorbeeld, als contractie wordt opgemerkt tijdens de periode van dermale onderdompeling of terwijl keratinocyten een oppervlaktemonolaag vaststellen, sneller door het serum taperingsproces bewegen en VHSE's verhogen naar ALI kan helpen bij het voorkomen van extra contractie. Evenzo, als keratinocytdekking niet ideaal is, kan het veranderen van het aantal dagen dat de VHSE zonder serum wordt ondergedompeld, helpen de epidermale monolaagdekking te verhogen en de contractie te verminderen omdat serum wordt weggelaten. Veranderingen in celdichtheden of andere suggesties hierboven moeten worden geoptimaliseerd voor de specifieke culturen en onderzoeksdoelen.

Om een goede stratificatie van de epidermis tijdens de air liquid interface (ALI) periode vast te stellen, is het van cruciaal belang om regelmatig de vloeistofniveaus in elke put te controleren en te handhaven, zodat ALI en de juiste hydratatie van elke constructie gedurende de hele kweeklengte worden bewaard. Medianiveaus moeten dagelijks worden gecontroleerd en bijgehouden totdat consistente ALI-niveaus zijn vastgesteld. De epidermale laag moet er gehydrateerd uitzien, niet droog, maar er mogen geen poelen met media op de constructie zijn. Tijdens ALI ontwikkelt de constructie een ondoorzichtige wit/gele kleur die normaal is. De epidermale laag zal zich waarschijnlijk ongelijk ontwikkelen. Gewoonlijk worden de VHSE's gekanteld als gevolg van het zaaien van collageen of dermale contractie. Het is ook normaal om een hoger epidermaal gedeelte in het midden van de constructie te observeren in kleinere constructies (24 putgrootte) en een nokvorming rond de omtrek van de VHSE in 12 putgrootte. Samentrekking van de constructies¹³ kan deze topografische formaties veranderen en/of helemaal niet worden waargenomen.

Kleuring en beeldvorming van VHSE's introduceert mechanische manipulatie bij de VHSE's. Het is erg belangrijk om manipulatie van elke cultuur te plannen en te beperken. Wanneer manipulatie nodig is, moet u voorzichtige bewegingen aanhouden bij het verwijderen van VHSE's uit de wisselplaatmembranen, bij het toevoegen van kleurings- of wasoplossingen aan het constructieoppervlak en bij het verwijderen en vervangen van VHSE's in hun opslag-/beeldvormingsputten tijdens de voorbereiding van de beeldvorming. In het bijzonder kunnen de apicale lagen van de epidermale component kwetsbaar zijn en het risico lopen de basale epidermale lagen af te schuinen. Apicale lagen van de epidermis zijn fragiel en gaan door desquamatie, zelfs in inheems weefsel^4,maar voor een nauwkeurige analyse van de epidermale structuur is het belangrijk om schade of verlies te minimaliseren. Als epidermale lagen de constructie opheffen, kunnen ze afzonderlijk worden afgebeeld. De basale lagen van de opperhuid zijn hoogstwaarschijnlijk nog steeds aan de dermis gehecht, terwijl delen van de apicale lagen kunnen losraken. Voor visualisatie van de epidermis is een nucleaire vlek nuttig om dit te observeren, omdat dichte kernen een kenmerk zijn van lagere en middenlagen van de epidermis.

Confocale beeldvorming van de VHSE postfixatie is besproken in het protocol, maar het is ook mogelijk om de VHSE's in de hele cultuur in beeld te brengen via rechtopstaande optische coherentietomografie (OCT)^{88,89,90,91,92,93}. VHSE zijn stabiel genoeg om beeldvorming te weerstaan zonder incubatie of bevochtiging gedurende ten minste twee uur zonder merkbare effecten. Omdat OCT labelvrij en niet-invasief is, is het mogelijk om de epidermale dikte tijdens de rijping te volgen. Andere niet-invasieve beeldvormingsmodaliteiten kunnen waarschijnlijk ook worden gebruikt.

Volumetrische beeldvorming van de gecombineerde huid- en epidermale structuren kan een uitdaging zijn vanwege laserdemping dieper in de VHSE. Dit kan worden verzacht door de constructie in twee richtingen in beeld te brengen, van de epidermale kant (figuur 1) en van de huidzijde (figuur 2), waardoor een goede resolutie van de huidstructuren en de epidermis mogelijk is. Bovendien kan het monster worden gewist, waardoor volumetrische beelden van de hele structuur met minimale demping mogelijk zijn. Verschillende clearingmethoden werden geprobeerd, maar de beschreven methanol/methylsalicylaatmethode leverde de beste resultaten op. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het optimaliseren van andere clearingmethoden zijn gericht op deze beoordelingen^49,61,62. Bij het wissen wordt voorgesteld om het monster volledig in beeld te brengen voordat het wordt gewist, omdat de methode de fluoroforen en/of de structuur kan beschadigen. Verder moet de beeldvorming zo snel mogelijk na het wissen worden voltooid, omdat de fluorescentie binnen enkele dagen kan vervagen.

Voor eenvoud en toegankelijkheid maakte dit protocol gebruik van de eenvoudigste mediamixen uit eerdere literatuur^11,80. Hoewel het gebruik van eenvoudige mediamixen veel voordelen heeft, worden ook de beperkingen van deze keuze erkend. Andere groepen hebben de effecten van specifieke mediacomponenten op de epidermale en huidgezondheid bestudeerd en ontdekten dat andere mediaadditieven⁹⁴, zoals externe vrije vetzuren/lipiden, het stratum corneum van de opperhuid verbeteren en de huidbarrièrefunctie verbeteren. Hoewel onze immunofluorescente markers een geschikte differentiatie en stratificatie in de epidermis vertonen, kan, afhankelijk van de uitgevoerde studies, aanvullende mediaoptimalisatie nodig zijn. Verder werd geen uitgebreide analyse van de epidermale BM uitgevoerd bij de evaluatie van de hier gepresenteerde VHSE's. De integriteit van de BM is een belangrijke indicatie van huidequivalenten; verschillende groepen hebben onderzoek gedaan naar de kweekduur en het effect ervan op BM-markeringen^95, alsmede analyse van fibroblastaanwezigheid en toegevoegde groeifactoreffecten op BM-expressie¹⁴. Het is belangrijk op te merken dat de analyse van de BM-component moet worden geëvalueerd en geoptimaliseerd bij het gebruik van dit protocol.

In dit protocol wordt een procedure beschreven voor VHSE-generatie, die resultaten na 8 weken bij ALI aantoont. VHSE-culturen zijn gekweekt tot 12 weken bij ALI zonder merkbare verandering of verlies van levensvatbaarheid, en het is mogelijk dat ze langer levensvatbaar zijn. Belangrijk is dat dit protocol gemakkelijk kan worden aangepast aan algemeen beschikbare celtypen, zoals blijkt uit de vervanging van huidfibroblasten door IMR90 longfibrose. Afhankelijk van de behoefte van de onderzoeker en de beschikbare bronnen, kunnen de celtypen en mediamengsels op de cultuur worden aangepast, hoewel meer verschillende celtypen mediaoptimalisatie vereisen. Samengevat zijn deze procedures bedoeld om duidelijkheid te verschaffen over de cultuur van VHSE's voor de studie van huidbiologie en -ziekte. Om de toegankelijkheid te maximaliseren, werd het protocol ontwikkeld met behulp van gemeenschappelijke apparatuur, cellijnen en reagentia als een minimale effectieve aanpak die verder kan worden aangepast aan de specifieke behoeften van onderzoeken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N NaOH	Fisher Chemical	S318-100	(Dilute from Lab stock)
4% Paraformaldehyde	ACROS Organics	#41678-5000, Lot # B0143461	Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9
Autoclaved forceps	Fine Science Tools	#11295-00	Dumont #5 forceps
CaCl2	Fisher bioreagents	Cat # BP510-250, Lot # 190231	Rnase, Dnase, Protease-Free
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1)	ATCC	CRL-3243	SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult	ATCC	PCS-201-012	Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90)	ATCC	CCL-186	Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1			Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.
Centrifuge	Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R		(standard lab equipment)
Computational Software	MATLAB	MATLAB 2020a	MathWorks, Natick, MA.
Confocal Microscope	Leica TCS SPEII confocal		Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.
Cover Glass (22 x 22)	Fisher Scientific	12-545F	0.13-0.17 mm No.1 Thickness
Cyanoacrylate super glue or silicone grease	Glue Masters	#THI0102	Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred
DMEM media base	Corning; Mediatech, Inc	REF # 10-013-CM; Lot # 26119007	DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
DMEM/F-12 50/50	Corning; Mediatech, Inc	REF # 10-090-CV; Lot # 21119006	DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethanol	Decon Labs	#V1101	(standard lab reagent)
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	Cat # FB12999102, Lot # AE29451050	Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered
Fine tip forceps	Fine Science Tools	#11295-00	Dumont #5 forceps
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218	Made up in 0.1% BSA in PBS
Hydrocortisone	Alpha Easar	Lot # 5002F2A	made up in DMSO
Insulin (human)	Peprotech	Lot # 9352621
Inverted Light/Phase Contrast Microscope	VWR	76317-470	(standard lab equipment)
Isoproterenol	Alfa Aesar	#AAJ6178806	DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%
Keratinocyte-SFM (1x) media base	Gibco; Life Technologies Corporation	REF #: 10724-011; Lot # 2085518	Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium
L-Ascorbic Acid	Fisher Chemical	Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7	Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt
L-glutamine (solid)	Fisher Bioreagents	CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9	L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder
MCDB 131 media base	Gen Depot	CM034-050, Lot # 03062021	MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered
Metal punches	Sona Enterprises (SE)	791LP, 12PC	Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2".
Methanol	Fisher Chemical	CAS # 67-56-1	(optional). For clearing dehydration step.
Methyl Salicylate	Fisher Chemical	O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8	(optional). For clearing.
Microtubes, 1.7 mL	Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics	Cat # 24-282; Lot # 19467	1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free
PBS, 10x Culture grade or autoclaved	APEX Bioresearch Products	Cat # 20-134, Lot # 202237	PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium	Genesee Scientific Corporation	Ref # 25-508; Lot # 07171015
PBS, 1x non-Culture grade	APEX Bioresearch Products	Cat # 20-134, Lot # 202237	PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water.
Penicillin/Streptomycin	Gibco; Life Technologies Corporation	Ref # 15140-122, Lot # 2199839	Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)
Petri Dish, glass, small	Corning	PYREX 316060	(optional). To be used as a clearing container
Petri Dishes, 100 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Use for making up PDMS.
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	GMID 02065622, Batch # H04719H035	Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)
	Dow Corning	GMID 02065622, Batch # H047JC4003	DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL)	Gilson	1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L	M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL)	Gilson	1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S	Sterilized capillaries and pistons
Round tipped scoopula			(optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging
Supplements for Keratinocyte-SFM media	Gibco; Life Technologies Corporation	Ref # 37000-015, Lot # 2154180	Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size	Corning; Costar	REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057	Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates,
Tissue Culture Plates, 12 well size	Greiner Bio-one; CellStar	Cat # 665 180; Lot # E18103QT	12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area	Genesee Scientific Corporation	Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B	Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene
Triton x 100	Ricca Chemical Company	Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34	Wetting agent
Trypsin 0.25%	Corning; Mediatech, Inc	Ref # 25-053-CI	0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate
Type 1 Collagen isolated from Rat tail	Pel-Freez Biologicals	56054-1	Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)
Vaccum chamber, benchtop	Bel-Art	F42010-0000	(standard lab equipment)
Handheld Precision knife	X-Acto	X3311	(X-Acto knife optional if purchased steel punches)