इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य दीर्घकालिक संस्कृति के लिए सुलभ और सरल तकनीकों का उपयोग करके संवहनी मानव त्वचा समकक्ष की पीढ़ी और मात्रात्मक विश्लेषण का वर्णन करना है। संभव हद तक, कदम के लिए तर्क शोधकर्ताओं को अपने अनुसंधान की जरूरत के आधार पर अनुकूलित करने की क्षमता की अनुमति के लिए वर्णित है ।
मानव त्वचा समकक्ष (एचईएस) ऊतक इंजीनियर निर्माण हैं जो मानव त्वचा के मॉडल एपिडर्मल और डर्मल घटक हैं। इन मॉडलों का उपयोग त्वचा के विकास, घाव भरने और ग्राफ्टिंग तकनीकों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। कई HSEs के लिए vasculature कमी जारी है और इसके अतिरिक्त पोस्ट संस्कृति हिस्टोलॉजिकल अनुभाग जो संरचना के वॉल्यूमेट्रिक मूल्यांकन सीमा के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं । यहां प्रस्तुत एक सीधा प्रोटोकॉल है जो संवहनी मानव त्वचा समकक्ष (वीएचएसई) उत्पन्न करने के लिए सुलभ सामग्रियों का उपयोग करता है; इसके अलावा वर्णित इन निर्माणों की वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन तकनीक हैं। संक्षेप में, वीएचएसई का निर्माण 12 अच्छी तरह से संस्कृति आवेषण में किया जाता है जिसमें डर्मल और एपिडर्मल कोशिकाओं को चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार I जेल में वरीयता दी जाती है। डर्मल डिब्बे फाइब्रोब्लास्ट से बना है और एंडोथेलियल कोशिकाओं को कोलेजन जेल भर में फैलाया जाता है। एपिडर्मल डिब्बा केराटिनोसाइट्स (त्वचा एपिथेलियल कोशिकाओं) से बना है जो हवा-तरल इंटरफेस में अंतर करता है। महत्वपूर्ण बात, इन तरीकों शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर अनुकूलन कर रहे हैं, दो अलग फाइब्रोब्लास्ट सेल प्रकार के साथ VHSE पीढ़ी का प्रदर्शन परिणाम के साथ: मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट (hDF) और मानव फेफड़ों फाइब्रोब्लास्ट (IMR90s) । वीएचएसई को विकसित किया गया था, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से चित्रित किया गया था, और 4-और 8-सप्ताह के टाइमपॉइंट पर कंप्यूटेशनल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वॉल्यूमेट्रिकली रूप से विश्लेषण किया गया था। वॉल्यूमेट्रिक परीक्षा के लिए ठीक करने, दाग, छवि और स्पष्ट वीएचएसई के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। यह व्यापक मॉडल, इमेजिंग और विश्लेषण तकनीक पूर्व एचएसई अनुभव के साथ या बिना व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं की विशिष्ट अनुसंधान आवश्यकताओं के लिए आसानी से अनुकूलित हैं।
मानव त्वचा प्रतिरक्षा/यांत्रिक बाधा के रूप में कार्य करने, शरीर के तापमान को विनियमित करने, जल प्रतिधारण और संवेदी भूमिकाओं में भाग लेने सहित कई आवश्यक जैविक कार्य करती है1,2,3,4। शारीरिक रूप से, त्वचा मानव शरीर में सबसे बड़ा अंग है और तीन मुख्य परतों (एपिडर्मिस, डर्मिस, और हाइपोडर्मिस) से बना है और एपिडर्मल कोशिकाओं के अलावा स्ट्रोमल, संवहनी, ग्रंथि और प्रतिरक्षा/तंत्रिका तंत्र घटकों की एक जटिल प्रणाली है। एपिडर्मिस स्वयं कोशिकाओं की चार परतों से बना है जो बाधा समारोह और देशी त्वचा की अन्य संरचनाओं (यानी पसीने और स्नेहक ग्रंथियों, नाखून)3को बनाए रखने के लिए लगातार नवीनीकृत होते हैं। त्वचा शरीर विज्ञान प्रतिरक्षा समारोह, घाव भरने, कैंसर जीव विज्ञान, और अन्य क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है, अग्रणी शोधकर्ताओं ने मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करने के लिए, इन विट्रो मोनोकल्चर से वीवो पशु मॉडल में। पशु मॉडल त्वचा शरीर विज्ञान की पूरी जटिलता का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करते हैं, हालांकि, आमतौर पर चूहों जैसे पशु मॉडलों में मनुष्यों की तुलना में महत्वपूर्ण शारीरिक अंतर होते हैं5। इन सीमाओं, और पशु मॉडलों की बढ़ी हुई लागत ने कई शोधकर्ताओं को विट्रो मॉडल विकसित करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए नेतृत्व किया है जो मानव त्वचा1,6के शरीर विज्ञान को अधिक बारीकी से प्रतिबिंबित करते हैं। इनमें से एक सरल मॉडल प्रकार मानव एपिडर्मल समकक्ष (एचईई; जिसे आधी मोटाई वाले त्वचा मॉडल भी कहा जाता है) है जो एक कोलेकुलर डर्मल मैट्रिक्स पर केवल एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स से बना होता है, लेकिन वीवो में देखे गए एपिडरमल विभेदन और स्तरीकरण पर कब्जा करता है। इस पर निर्माण, डर्मल और एपिडर्मल घटकों (केराटिनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट) वाले मॉडलों को अक्सर मानव त्वचा समकक्ष (एचएसई), पूर्ण मोटाई त्वचा मॉडल, या ऑर्गेनोटिपिक त्वचा निर्माण (ऊएससी) के रूप में जाना जाता है। संक्षेप में, ये मॉडल जेल मैट्रिस के भीतर डर्मल कोशिकाओं को एनकैप्सुलेट करके उत्पन्न होते हैं और शीर्ष पर एपिडर्मल कोशिकाओं को सीडिंग करते हैं। एपिडर्मल विभेदन और स्तरीकरण तो विशेष मीडिया और हवा जोखिम7के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । त्वचा के समकक्ष अक्सर कोलेजन प्रकार से बने डर्मल जैल (चूहे की पूंछ या गोजातीय त्वचा मूल के)1, 8से बने डर्मल जैल का उपयोग करके स्वयं-असेंबली तकनीकों के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, लेकिन इसीतरहके मॉडलों ने फाइब्रिन9,10,फाइब्रोबला जैसे अन्य मैट्रिक्स घटकों को शामिल किया है11,12, कैडेवद डी-एपिडर्मिज झिल्ली13, 14,15,16,व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जैल और अन्य 1 ,12,13,17,18,19. वर्तमान में, व्यावसायिक रूप से त्वचा समकक्ष उपलब्ध हैं (जैसा कि पहले1,2की समीक्षा की गई थी)। हालांकि, ये मुख्य रूप से चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए विकसित किए गए हैं और विशिष्ट शोध प्रश्नों के लिए आसानी से अनुकूलित नहीं किए जा सकते हैं।
एचईएस को घाव भरने, ग्राफ्टिंग, विष विज्ञान और त्वचा रोग/विकास11, 12, 13, 16,8,20,22,23केअध्ययनोंमें लागू किया गया है। यद्यपि 3 डी संस्कृति 2डी संस्कृतियों की तुलना में मानव ऊतक के कार्यों को अधिक व्यापक रूप से मॉडल करती है, 24 , 25,26 ,26जटिल ऊतकों में विविध कोशिका प्रकारों को शामिल करना जो अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित होते हैं । अधिकांश एचएसई में केवल डर्मल फाइब्रोब्लास्ट और एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स27शामिल हैं, हालांकि वीवो त्वचा वातावरण में कई अन्य सेल प्रकार शामिल हैं। हाल के अध्ययनों में अधिक सेल आबादी शामिल है; इनमें वेक्यूलेचर 10,28, 29,30, 31,32,33,34,उप-कटनी ऊतकों में एडिपोसाइट्स35,36,तंत्रिकाघटक19,21, स्टेम सेल27,37,38, प्रतिरक्षा कोशिकाएं10,39,40 , 41,42और अन्य रोग/ कैंसर विशिष्ट मॉडल16,40,43,44,45,46,47. इनमें से विशेष रूप से महत्वपूर्ण वास्कुलेचर है; जबकि कुछ एचएसई में संवहनी कोशिकाएं शामिल हैं, कुल मिलाकर उनके पास अभी भी पूरे डर्मिस10,29 मेंकनेक्टिविटी के साथ व्यापक केशिका तत्वों की कमी है, जो विट्रोस्थिरता 28में विस्तारित है, और उचित पोत घनत्व है। इसके अलावा, एचएसई मॉडल आमतौर पर पोस्ट-कल्चर हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग के माध्यम से मूल्यांकन किए जाते हैं जो एचईएस की त्रि-आयामी संरचना के विश्लेषण को सीमित करता है। त्रिआयामी विश्लेषण संवहनी घनत्व48, 49के वॉल्यूमेट्रिक मूल्यांकन के साथ-साथ एपिडर्मलमोटाई और भेदभाव के क्षेत्रीय भिन्नता के लिए अनुमति देता है।
हालांकि एचएसईएस सबसे आम ऑर्गेनोटिपिक मॉडल में से एक हैं, लेकिन इन निर्माणों को उत्पन्न करने में कई तकनीकी चुनौतियां हैं जिनमें उचित एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स और सेल घनत्व, मीडिया व्यंजनों, उचित एयर लिक्विड इंटरफेस प्रक्रियाओं और संस्कृति के बाद विश्लेषण की पहचान शामिल है। इसके अलावा, जबकि एचईई और एचएसई मॉडल ने प्रोटोकॉल प्रकाशित किए हैं, एक विस्तृत प्रोटोकॉल जिसमें हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के बजाय डर्मल वैक्यूलेचर और वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग शामिल है। यह काम मुख्य रूप से वाणिज्यिक सेल लाइनों से संवहनी मानव त्वचा समकक्ष (वीएचएसई) की संस्कृति के लिए एक सुलभ प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से अनुकूलन योग्य होने के लिए लिखा गया है, जो विभिन्न सेल प्रकारों और अनुसंधान आवश्यकताओं के लिए सीधे-आगे अनुकूलन की अनुमति देता है। पहुंच, उपलब्धता और लागत के हित में, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध उत्पादों के उपयोग पर सरल उत्पादों और उत्पादन तकनीकों के उपयोग को प्राथमिकता दी गई थी। इसके अलावा, सीधी वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन विधियों का वर्णन किया जाता है जो वीएचएसई की त्रि-आयामी संरचना के आकलन के लिए अनुमति देते हैं। इस प्रक्रिया को एक मजबूत और सुलभ प्रोटोकॉल में अनुवाद करना गैर-विशेषज्ञ शोधकर्ताओं को व्यक्तिगत चिकित्सा, संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग, भ्रष्टाचार विकास और दवा मूल्यांकन में इन महत्वपूर्ण मॉडलों को लागू करने में सक्षम बनाता है।
इस प्रोटोकॉल ने वीएचएसई की पीढ़ी और उनके त्रि-आयामी विश्लेषण के लिए एक सरल और दोहराने योग्य विधि का प्रदर्शन किया है। महत्वपूर्ण बात, यह विधि कुछ विशेष तकनीकों या उपकरणों के टुकड़ों पर निर्भर करती है, जिससे यह प्रयोगशालाओं की एक श्रृंखला के लिए सुलभ हो जाती है। इसके अलावा, सेल प्रकार प्रोटोकॉल में सीमित परिवर्तन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, शोधकर्ताओं को अपनी विशिष्ट जरूरतों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने की अनुमति ।
उचित कोलेजन जेलेशन त्वचा संस्कृति की स्थापना में एक चुनौतीपूर्ण कदम है। विशेष रूप से जब शुद्धि के बिना कच्चे तेल की तैयारी का उपयोग करते हैं, तो संदूषकों का पता लगाने से जेलेशन प्रक्रिया प्रभावित हो सकती है। स्थिरता सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए, प्रयोगों के समूहों को उसी कोलेजन स्टॉक के साथ किया जाना चाहिए जिसका उपयोग वीएचएसई पीढ़ी के लिए किया जाएगा। इसके अलावा, जेलेशन आदर्श रूप से 7-7.4 के पीएच पर होना चाहिए, और संदूषकों का पता लगाने से पीएच बदल सकता है। किसी भी कोलेजन स्टॉक का उपयोग करने से पहले, वांछित एकाग्रता पर एक अभ्यास एसेलुलर जेल बनाया जाना चाहिए और पीएच को जेलेशन से पहले मापा जाना चाहिए। शुरू करने से पहले इस कोलेजन गुणवत्ता की जांच को पूरा करने से एक पूर्ण प्रयोग स्थापित करने से पहले उचित जेलेशन और कोलेजन एकरूपता के साथ समस्याओं की पहचान होगी। एक संस्कृति डालने पर सीधे एसेलुलर कोलेजन बोने के बजाय, एक पीएच पट्टी पर कुछ कोलेजन बीज जो पूरे पीएच पैमाने का मूल्यांकन करता है और 7-7.4 के पीएच को सत्यापित करता है। जेलेशन का मूल्यांकन कोलेजन जेल समाधान की एक बूंद को कवरस्लिप या ऊतक संस्कृति प्लास्टिक वेल प्लेट पर लागू करके किया जा सकता है (संस्कृति डालने के सीमित पक्षों को अनुकरण करने के लिए एक अच्छी तरह से प्लेट की सिफारिश की जाती है)। जेलेशन टाइम के बाद कोलेजन सॉलिड होना चाहिए यानी प्लेट झुका होने पर उसे प्रवाहित नहीं करना चाहिए। चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत, कोलेजन सजातीय और स्पष्ट दिखना चाहिए। कोलेजन सीडिंग से सामयिक बुलबुले सामान्य होते हैं लेकिन स्पष्ट जेल के भीतर अपारदर्शी कोलेजन के बड़े असंगत ब्लॉब्स अपर्याप्त मिश्रण, गलत पीएच, और/या मिश्रण के दौरान कोलेजन को ठंडा रखने में विफलता के कारण समस्या की संभावना को इंगित करता है ।
सेल सीडिंग मात्रा और मीडिया को समायोजित किया जा सकता है। ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में, एनकैप्सुलेटेड सेल मात्रा को 7.5 x 104 फाइब्रोब्लास्ट और 7.5 x 105 एंडोथेलियल कोशिकाओं प्रति एमएल कोलेजन के 1.7 x 10 5 केराटिनोसाइट्स के साथ 1.7 x 105 केराटिनोसाइट्स के लिए अनुकूलित किया गया है। प्रारंभिक अध्ययनों और पिछले शोध के आधार पर इस वीएचएसई प्रोटोकॉल के लिए सेल घनत्व को अनुकूलित किया गया है , जिसमें विभिन्न कोलेजन सांद्रता 48 और एचएसई पीढ़ी22,80 ,81में 3डी वैस्कुलर नेटवर्क उत्पादन की जांच की गई थी । इसी तरह की प्रणालियों में, प्रकाशित एंडोथेलियल सेल घनत्व 1.0 x106 कोशिकाओं/ फाइब्रोब्लास्टसांद्रता अक्सर कोलेजन22, 28,82से1 x10 5 कोशिकाओं/एमएल की 0.4 x 105 कोशिकाओं/एमएल से लेकर कोलेजन8,58,83,84, 85,85से होती है । और केराटिनोसाइट सांद्रता 0.5 x 105 [कोशिकाओं/सेमी2]80 से 1 x 105 [कोशिकाओं/सेमी2]8से लेकर । सेल घनत्व विशिष्ट कोशिकाओं और अनुसंधान प्रश्न के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फाइब्रोब्लास्ट जैसी अनुबंध कोशिकाओं के साथ त्रि-आयामी संस्कृतियां, व्यवहार्यता में कमी और संस्कृति हानि86,87के लिए अग्रणी अनुबंध कर सकती हैं। डर्मल डिब्बे के संकुचन का परीक्षण करने के लिए प्रारंभिक प्रयोग पूरे किए जाने चाहिए (जो अधिक डर्मल कोशिकाओं, अधिक अनुबंधित डर्मल कोशिकाओं, लंबे समय तक पनडुब्बी संस्कृतियों, या नरम मैट्रिस के साथ हो सकता है) और एपिडर्मल सतह कवरेज का परीक्षण करने के लिए। इसके अतिरिक्त, पनडुब्बी में दिनों की संख्या और सीरम सामग्री को पतला करने की दर को भी अनुकूलित किया जा सकता है यदि अत्यधिक डर्मल संकुचन हो रहा है या केराटिनोसाइट कवरेज की एक अलग दर की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, यदि संकुचन डर्मल पनडुब्बी की अवधि के दौरान देखा जाता है या जबकि keratinocytes एक सतह मोनोलेयर की स्थापना कर रहे हैं, सीरम टेपरिंग प्रक्रिया के माध्यम से और अधिक तेजी से आगे बढ़ रहे हैं और अली के लिए VHSEs स्थापना अतिरिक्त संकुचन को रोकने में सहायता कर सकते हैं । इसी तरह, यदि केराटिनोसिट कवरेज आदर्श नहीं है, तो सीरम के बिना वीएचएसई जलमग्न होने वाले दिनों की संख्या को बदलने से एपिडर्मल मोनोलेयर कवरेज बढ़ाने और संकुचन को कम करने में मदद मिल सकती है क्योंकि सीरम को छोड़ दिया जाता है। सेल घनत्व या ऊपर दिए गए अन्य सुझावों में परिवर्तन विशिष्ट संस्कृतियों और अनुसंधान लक्ष्यों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
एयर लिक्विड इंटरफेस (अली) अवधि के दौरान एपिडर्मिस का उचित स्तरीकरण स्थापित करने के लिए, प्रत्येक कुएं में तरल पदार्थ के स्तर की नियमित रूप से जांच करना और बनाए रखना महत्वपूर्ण है ताकि प्रत्येक निर्माण के अली और उपयुक्त जलयोजन को संस्कृति की लंबाई में रखा जा सके। मीडिया के स्तर की जांच की जानी चाहिए और दैनिक ट्रैक जब तक लगातार अली स्तर की स्थापना कर रहे हैं । एपिडर्मल लेयर हाइड्रेटेड दिखना चाहिए, सूखा नहीं, लेकिन निर्माण पर मीडिया के पूल नहीं होने चाहिए। अली के दौरान, निर्माण एक अपारदर्शी सफेद/पीला रंग विकसित करेगा जो सामान्य है । एपिडर्मल परत की संभावना असमान रूप से विकसित होगी। आमतौर पर, वीएचएसई कोलेजन सीडिंग या डर्मल संकुचन के कारण झुकाया जाता है। छोटे निर्माण (24 अच्छी आकार) में निर्माण के बीच में एक उच्च एपिडर्मल भाग और 12 अच्छी आकार में वीएचएसई की परिधि के चारों ओर एक रिज गठन का निरीक्षण करना भी सामान्य है। 13 के निर्माण ों का संकुचन इन स्थलाकृतिक संरचनाओं को बदल सकता है, और/या बिल्कुल नहीं देखा जा सकता है ।
वीएचएसई की स्टेनिंग और इमेजिंग वीएचएसई में यांत्रिक हेरफेर का परिचय देती है। प्रत्येक संस्कृति के हेरफेर की योजना बनाना और उसे सीमित करना बहुत महत्वपूर्ण है । जब हेरफेर आवश्यक हो, तो डालने की झिल्ली से वीएचएसई को हटाते समय कोमल आंदोलनों को बनाए रखें, जब निर्माण सतह पर धुंधला या धोने के समाधान जोड़ते हैं, और इमेजिंग तैयारी के दौरान वीएचएसई को उनके भंडारण/इमेजिंग कुओं में हटाते और बदलते समय। विशेष रूप से, एपिडर्मल घटक की एपिकल परतें नाजुक हो सकती हैं और बेसल एपिडर्मल परतों को बंद करने का खतरा है। एपिडर्मिस की एपिकल परतें नाजुक होती हैं और देशी ऊतक4में भी डिस्क्वमेशन से गुजरती हैं, लेकिन एपिडर्मल संरचना के सटीक विश्लेषण के लिए नुकसान या नुकसान को कम करना महत्वपूर्ण है। यदि एपिडर्मल परतें निर्माण को हटा देती हैं, तो उन्हें अलग से चित्रित किया जा सकता है। एपिडर्मिस की बेसल परतें अभी भी डर्मिस से जुड़ी होती हैं जबकि एपिकल परतों के कुछ हिस्से अलग हो सकते हैं। एपिडर्मिस के दृश्य के लिए, एक परमाणु दाग इसे देखने में सहायक है क्योंकि घने नाभिक एपिडर्मिस की निचली और मध्य परतों की एक विशेषता है।
प्रोटोकॉल में वीएचएसई पोस्ट-फिक्सेशन के कॉन्फोकल इमेजिंग पर चर्चा की गई है, लेकिन ईमानदार आधारित ऑप्टिकल जुटनाटोमोग्राफी (OCT)88, 89,90,91,92,93के माध्यम से संस्कृति में वीएचएसई की छवि बनाना भी संभव है। वीएचएसई बिना ध्यान देने योग्य प्रभावों के कम से कम दो घंटे तक इनक्यूबेशन या आर्द्रीकरण के बिना इमेजिंग का सामना करने के लिए पर्याप्त स्थिर हैं। चूंकि अक्टूबर लेबल मुक्त और गैर-निवास है, परिपक्वता के दौरान एपिडर्मल मोटाई को ट्रैक करना संभव है। अन्य नॉनइनवेसिव इमेजिंग तौर-तरीकों को भी नियोजित किया जा सकता है।
संयुक्त डर्मल और एपिडर्मल संरचनाओं की वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग वीएचएसई में लेजर क्षीणता के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इसे दो झुकाव में निर्माण इमेजिंग द्वारा कम किया जा सकता है, एपिडर्मल साइड(चित्रा 1)से और डर्मल साइड(चित्रा 2)से, डर्मल संवहनी संरचनाओं और एपिडर्मिस के अच्छे समाधान की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, नमूने को मंजूरी दी जा सकती है, जिससे न्यूनतम क्षीणता के साथ पूरी संरचना की वॉल्यूमेट्रिक छवियों की अनुमति दी जा सकती है। कई समाशोधन विधियों का प्रयास किया गया, हालांकि, मेथनॉल/मिथाइल सैलिसिलेट विधि का वर्णन सबसे अच्छा परिणाम मिला । अन्य समाशोधन पद्धतियों को अनुकूलित करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं को इन समीक्षाओं की दिशा में निर्देशित किया जाता है49,61,62. यदि समाशोधन, यह पूरी तरह से समाशोधन से पहले नमूना छवि का सुझाव दिया है, के रूप में विधि फ्लोरोफोरस और/या संरचना को नुकसान पहुंचा सकता है । इसके अलावा, इमेजिंग समाशोधन के बाद जितनी जल्दी हो सके पूरा किया जाना चाहिए, के रूप में फ्लोरेसेंस दिनों के भीतर फीका हो सकता है ।
सादगी और पहुंच के लिए, इस प्रोटोकॉल ने पिछले साहित्य11,80में पाए गए सबसे सरल मीडिया मिश्रणों का उपयोग किया। हालांकि सरल मीडिया मिश्रणों का उपयोग करने के कई फायदे हैं, लेकिन इस विकल्प की सीमाएं भी पहचानी जाती हैं। अन्य समूहों ने एपिडर्मल और डर्मल स्वास्थ्य पर विशिष्ट मीडिया घटकों के प्रभावों का अध्ययन किया है और पाया है कि अन्य मीडिया एडिटिव्स94,जैसे बाहरी मुक्त फैटी एसिड/लिपिड, एपिडर्मिस के स्ट्रेटम कॉर्नियम को बढ़ाते हैं और त्वचा बाधा कार्य में सुधार करते हैं। यद्यपि हमारे इम्यूनोफ्लोर्सेंट मार्कर एपिडर्मिस में उचित भेदभाव और स्तरीकरण दिखाते हैं, जो किए जा रहे अध्ययनों के आधार पर, अतिरिक्त मीडिया अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत वीएचएसई का मूल्यांकन करते समय एपिडर्मल बीएम का व्यापक विश्लेषण नहीं किया गया था। बीएम की अखंडता त्वचा समकक्ष का एक महत्वपूर्ण संकेत है; विभिन्न समूहों ने संस्कृति अवधि और बीएम चिह्नों पर इसके प्रभाव पर शोध किया है95 के साथ-साथ फाइब्रोब्लास्ट उपस्थिति का विश्लेषण और बीएम अभिव्यक्ति14पर विकास कारक प्रभाव जोड़ा . यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय बीएम घटक के विश्लेषण का मूल्यांकन और अनुकूलन किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल में वीएचएसई पीढ़ी के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है, जो अली में 8 सप्ताह के बाद परिणामों का प्रदर्शन करता है। VHSE संस्कृतियों को ध्यान देने योग्य परिवर्तन या व्यवहार्यता की हानि के बिना अली में 12 सप्ताह तक सुसंस्कृत किया गया है, और यह संभव है कि वे अब व्यवहार्य हो सकता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रोटोकॉल आमतौर पर उपलब्ध सेल प्रकारों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है, जैसा कि आईएमआर 90 फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट के साथ डर्मल फाइब्रोब्लास्ट के प्रतिस्थापन द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। शोधकर्ता की जरूरत और उपलब्ध संसाधनों के आधार पर, संस्कृति पर सेल प्रकार और मीडिया मिश्रणों को समायोजित किया जा सकता है, हालांकि अधिक भिन्न सेल प्रकारों को मीडिया अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। संक्षेप में, इन प्रक्रियाओं को त्वचा जीव विज्ञान और रोग के अध्ययन के लिए VHSEs की संस्कृति पर स्पष्टता प्रदान करने के लिए होती हैं । पहुंच को अधिकतम करने के लिए, प्रोटोकॉल को आम उपकरणों, सेल लाइनों और पुनर्प्रांतों का उपयोग करके एक न्यूनतम प्रभावी दृष्टिकोण के रूप में इस सरल और मजबूत विकसित किया गया था जिसे अनुसंधान अध्ययनों की विशिष्ट जरूरतों के लिए आगे अनुकूलित किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने एन/टीईआरटी सेल लाइनों के उदार उपहार के लिए डॉ जिम रिनवाल्ड५९ और डॉ एलेन एच वान डेन बोगार्ड20 का शुक्रिया अदा किया । इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (19IPLOI34760636) द्वारा समर्थित किया गया था।
1 N NaOH | Fisher Chemical | S318-100 | (Dilute from Lab stock) |
4% Paraformaldehyde | ACROS Organics | #41678-5000, Lot # B0143461 | Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9 |
Autoclaved forceps | Fine Science Tools | #11295-00 | Dumont #5 forceps |
CaCl2 | Fisher bioreagents | Cat # BP510-250, Lot # 190231 | Rnase, Dnase, Protease-Free |
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1) | ATCC | CRL-3243 | SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used. |
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult | ATCC | PCS-201-012 | Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used. |
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90) | ATCC | CCL-186 | Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used. |
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1 | Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines. | ||
Centrifuge | Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R | (standard lab equipment) | |
Computational Software | MATLAB | MATLAB 2020a | MathWorks, Natick, MA. |
Confocal Microscope | Leica TCS SPEII confocal | Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy. | |
Cover Glass (22 x 22) | Fisher Scientific | 12-545F | 0.13-0.17 mm No.1 Thickness |
Cyanoacrylate super glue or silicone grease | Glue Masters | #THI0102 | Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred |
DMEM media base | Corning; Mediatech, Inc | REF # 10-013-CM; Lot # 26119007 | DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
DMEM/F-12 50/50 | Corning; Mediatech, Inc | REF # 10-090-CV; Lot # 21119006 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
Ethanol | Decon Labs | #V1101 | (standard lab reagent) |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | Cat # FB12999102, Lot # AE29451050 | Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered |
Fine tip forceps | Fine Science Tools | #11295-00 | Dumont #5 forceps |
Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218 | Made up in 0.1% BSA in PBS |
Hydrocortisone | Alpha Easar | Lot # 5002F2A | made up in DMSO |
Insulin (human) | Peprotech | Lot # 9352621 | |
Inverted Light/Phase Contrast Microscope | VWR | 76317-470 | (standard lab equipment) |
Isoproterenol | Alfa Aesar | #AAJ6178806 | DL-Isoproterenol hydrochloride, 98% |
Keratinocyte-SFM (1x) media base | Gibco; Life Technologies Corporation | REF #: 10724-011; Lot # 2085518 | Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium |
L-Ascorbic Acid | Fisher Chemical | Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7 | Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt |
L-glutamine (solid) | Fisher Bioreagents | CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9 | L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder |
MCDB 131 media base | Gen Depot | CM034-050, Lot # 03062021 | MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered |
Metal punches | Sona Enterprises (SE) | 791LP, 12PC | Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2". |
Methanol | Fisher Chemical | CAS # 67-56-1 | (optional). For clearing dehydration step. |
Methyl Salicylate | Fisher Chemical | O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8 | (optional). For clearing. |
Microtubes, 1.7 mL | Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics | Cat # 24-282; Lot # 19467 | 1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free |
PBS, 10x Culture grade or autoclaved | APEX Bioresearch Products | Cat # 20-134, Lot # 202237 | PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. |
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium | Genesee Scientific Corporation | Ref # 25-508; Lot # 07171015 | |
PBS, 1x non-Culture grade | APEX Bioresearch Products | Cat # 20-134, Lot # 202237 | PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | Ref # 15140-122, Lot # 2199839 | Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin) |
Petri Dish, glass, small | Corning | PYREX 316060 | (optional). To be used as a clearing container |
Petri Dishes, 100 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | Use for making up PDMS. |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | GMID 02065622, Batch # H04719H035 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI) |
Dow Corning | GMID 02065622, Batch # H047JC4003 | DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent | |
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components. | |||
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL) | Gilson | 1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L | M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL |
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL) | Gilson | 1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S | Sterilized capillaries and pistons |
Round tipped scoopula | (optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging | ||
Supplements for Keratinocyte-SFM media | Gibco; Life Technologies Corporation | Ref # 37000-015, Lot # 2154180 | Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014) |
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size | Corning; Costar | REF # 3462 – Clear; Lot # 14919057 | Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates, |
Tissue Culture Plates, 12 well size | Greiner Bio-one; CellStar | Cat # 665 180; Lot # E18103QT | 12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic |
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area | Genesee Scientific Corporation | Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B | Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene |
Triton x 100 | Ricca Chemical Company | Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34 | Wetting agent |
Trypsin 0.25% | Corning; Mediatech, Inc | Ref # 25-053-CI | 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate |
Type 1 Collagen isolated from Rat tail | Pel-Freez Biologicals | 56054-1 | Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249) |
Vaccum chamber, benchtop | Bel-Art | F42010-0000 | (standard lab equipment) |
Handheld Precision knife | X-Acto | X3311 | (X-Acto knife optional if purchased steel punches) |