Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Coloration, visualisation et analyse en monture entière des papilles gustatives fongiformes, circonvallates et palatines

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62126
Automatic Translation
1, 1
1Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

Summary

Cet article décrit des méthodes de préparation des tissus, de coloration et d’analyse des papilles gustatives fongiformes, circonvallates et palatines entières qui produisent systématiquement des papilles gustatives entières et intactes (y compris les fibres nerveuses qui les innervent) et maintiennent les relations entre les structures des papilles gustatives et de la papille environnante.

Abstract

Les papilles gustatives sont des collections de cellules transductrices du goût spécialisées dans la détection de sous-ensembles de stimuli chimiques dans la cavité buccale. Ces cellules transductrices communiquent avec les fibres nerveuses qui transportent cette information vers le cerveau. Parce que les cellules transductrices du goût meurent continuellement et sont remplacées tout au long de l’âge adulte, l’environnement des papilles gustatives est à la fois complexe et dynamique, nécessitant des analyses détaillées de ses types de cellules, de leur emplacement et de toute relation physique entre elles. Les analyses détaillées ont été limitées par l’hétérogénéité et la densité du tissu de la langue qui ont considérablement réduit la perméabilité des anticorps. Ces obstacles nécessitent des protocoles de sectionnement qui entraînent la division des papilles gustatives entre les sections afin que les mesures ne soient qu’approximatives et que les relations cellulaires soient perdues. Pour surmonter ces défis, les méthodes décrites ici impliquent la collecte, l’imagerie et l’analyse de papilles gustatives entières et de tonnelles terminales individuelles de trois régions gustatives: papilles fongiformes, papilles circumvallates et palais. La collecte de papilles gustatives entières réduit les biais et la variabilité technique et peut être utilisée pour indiquer des chiffres absolus pour des caractéristiques telles que le volume des papilles gustatives, l’innervation totale des papilles gustatives, le nombre de cellules transductrices et la morphologie des tonnelles terminales individuelles. Pour démontrer les avantages de cette méthode, cet article fournit des comparaisons des volumes de papilles gustatives et d’innervation entre les papilles gustatives fongiformes et circumvallates à l’aide d’un marqueur général des papilles gustatives et d’une étiquette pour toutes les fibres gustatives. Un flux de travail pour l’utilisation du marquage génétique des neurones du goût à cellules clairsemées (avec des sous-ensembles marqués de cellules transductrices du goût) est également fourni. Ce flux de travail analyse les structures des tonnelles individuelles goût-nerf, les numéros de type de cellule et les relations physiques entre les cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Ensemble, ces flux de travail offrent une nouvelle approche pour la préparation des tissus et l’analyse des papilles gustatives entières et de la morphologie complète de leurs tonnelles innervantes.

Introduction

Les papilles gustatives sont des collections de 50 à 100 cellules épithéliales spécialisées qui se lient à des sous-ensembles de stimuli chimiques et gustatifs présents dans la cavité buccale. On pense généralement que les cellules transductrices de goût existent en tant que types1,2,3,4,5,6,7,8,9,initialement sur la base de critères de microscopie électronique qui ont ensuite été corrélés avec des marqueurs moléculaires. Les cellules de type II expriment la phospholipase C-beta 2 (PLCβ2)2 et le canal cationique potentiel récepteur transitoire, sous-famille M membre 51 et comprennent les cellules qui transduisent le sucré, l’amer etl’umami1,10. Les cellules de type III expriment l’anhydrase carbonique 4 (Car4)11 et la protéine associée synaptomomique 258 et désignent les cellules qui répondent principalement au goût aigre11. Les cellules qui transduisent la salinité n’ont pas été aussi clairement délimitées12,13,14, mais pourraient potentiellement inclure les cellules de type I, de type II et de type III15,16,17,18,19. L’environnement des papilles gustatives est complexe et dynamique, étant donné que les cellules transductrices de goût se retournent continuellement tout au long de l’âge adulte et sont remplacées par des progéniteurs basaux3,20,21. Ces cellules transductrices du goût se connectent aux fibres nerveuses pseudo-unipolaires des ganglions géniculés et pétrosaux, qui transmettent des informations gustatives au tronc cérébral. Ces neurones ont principalement été classés en fonction du type d’informations gustatives qu’ils portent22,23 parce que les informations sur leur morphologie ont été insaisissables jusqu’à récemment24. Les cellules de type II communiquent avec les fibres nerveuses via les canaux ioniques 25 de la protéine modulatrice de l’homéostasiecalcique 1,tandis que les cellules de type III communiquent via les synapses classiques8,26. La caractérisation plus poussée des cellules des papilles gustatives, y compris les lignées de type cellulaire transductrices, les facteurs qui influencent leur différenciation et les structures des tonnelles de connexion, sont tous des domaines d’investigation actifs.

Les études sur les papilles gustatives ont été entravées par plusieurs défis techniques. Les tissus hétérogènes et denses qui composent la langue réduisent considérablement la perméabilité des anticorps pour l’immunohistochimie27,28,29. Ces obstacles ont nécessité des protocoles de sectionnement qui entraînent la division des papilles gustatives entre les sections afin que les mesures soient soit approximatives en fonction de sections représentatives, soit additionnées entre les sections. Auparavant, des sections minces représentatives ont été utilisées pour approximer à la fois les valeurs de volume et le nombre de cellules de transduction30. Une section série plus épaisse permet l’imagerie de toutes les sections de papilles gustatives et la somme des mesures de chaque section31. Couper de telles sections épaisses et ne sélectionner que des papilles gustatives entières biaise l’échantillonnage vers des papilles gustatives plus petites32,33,34. Les estimations de l’innervation nerveuse à partir de papilles gustatives sectionnées ont été basées sur des analyses de nombres de pixels13,35, si quantifiés au tout36,37,38. Ces mesures ignorent complètement la structure et le nombre de tonnelles nerveuses individuelles, car les tonnelles sont divisées (et généralement mal étiquetées). Enfin, bien que le pelage de l’épithélium permette de colorer des papilles gustatives entières39,40, il élimine également les fibres nerveuses des papilles gustatives et pourrait perturber les relations normales entre les cellules. Par conséquent, les recherches sur les relations structurelles au sein des papilles gustatives ont été limitées en raison de cette perturbation causée par les approches de coloration.

La collection de structures entières élimine le besoin de sections représentatives et permet de déterminer des mesures en valeur absolue des volumes, du nombre de cellules et des morphologies de structure41. Cette approche augmente également la précision, limite les biais et réduit la variabilité technique. Ce dernier élément est important car les papilles gustatives présentent une variabilité biologique considérable à la fois dans les régions34,42 et entre les régions43,44,et les analyses des papilles gustatives entières permettent de comparer le nombre absolu de cellules entre les conditions témoins et expérimentales. De plus, la capacité de recueillir des papilles gustatives intactes permet d’analyser les relations physiques entre les différentes cellules transductrices et leurs fibres nerveuses associées. Parce que les cellules transductrices de goût peuvent communiquer entre elles45 et communiquer avec les fibres nerveuses46, ces relations sont importantes pour le fonctionnement normal. Ainsi, les conditions de perte de fonction peuvent ne pas être dues à une perte de cellules, mais plutôt à des changements dans les relations cellulaires. Voici une méthode de collecte des papilles gustatives entières afin d’obtenir les avantages des mesures absolues pour affiner les analyses de volume pour les papilles gustatives et leurs innervations, le nombre et les formes des cellules gustatives, et pour faciliter les analyses des relations entre les cellules transductrices et les morphologies nerf-arbre. Deux flux de travail sont également présentés en aval de cette nouvelle méthode de préparation des tissus à montage entier : 1) pour analyser le volume des papilles gustatives et l’innervation totale et 2) pour l’étiquetage génétique des neurones du goût à cellules clairsemées (avec des sous-ensembles de cellules transductrices du goût marquées) et les analyses ultérieures de la morphologie de la tonnelle goût-nerf, du nombre de types de cellules gustatives et de leurs formes, et l’utilisation d’un logiciel d’analyse d’images pour analyser les relations physiques entre les cellules transductrices et celles entre la transduction les cellules et leurs tonnelles nerveuses. Ensemble, ces flux de travail offrent une nouvelle approche de la préparation des tissus et de l’analyse des papilles gustatives entières et de la morphologie complète de leurs tonnelles innervantes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

REMARQUE: Tous les animaux ont été soignés conformément aux lignes directrices établies par la politique du service de santé publique des États-Unis sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et le Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris Phox2b-Cre (souche MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) ou des souris TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) ont été élevées avec des souris rapporteures tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 ont été élevés avec Phox2b-flpo48 et Ai65. Pour les injections de 5-éthyynyl-2′-désoxyuridine (EdU), l’EdU a été préparée et les doses calculées selon Perea-Martinez et al.49.

1. Préparation des matériaux

  1. Préparation de solutions
    1. Dissoudre 5,244 g de phosphate de sodium monobasique et 23,004 g de phosphate de sodium dibasique dans de l’eau double distillée (ddH2O) sur une plaque à mélanger. Ajuster le pH à 7,4 et porter le volume total pour obtenir 1 L de tampon phosphate de sodium (PB) de 0,2 M.
    2. Dissoudre le paraformaldéhyde dans ddH2O dans une hotte en chauffant en remuant sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que la solution atteigne 90 °C. Ajouter 4 M de solution de NaOH goutte à goutte pour éliminer le paraformaldéhyde et filtrer la solution à l’aide d’une fiole d’Erlenmeyer sous vide et d’un filtre en céramique avec du papier filtre. Ajouter un volume égal de 0,2 M PB et ajuster le pH à 7,4 pour obtenir 4 % de PFA dans 0,1 M PB.

2. Préparation des tissus

  1. Prélèvement de tissus
    1. Sacrifier des souris en utilisant un surdosage anesthésique avec une solution de travail contenant 10 mL de solution saline stérile et 0,25 mL d’une solution mère contenant 5 g de 2,2,2-tribromoéthanol et 5 mL d’alcool tert-amylique. Perfuser transcardiquement avec 4% PFA dans 0,1 M PB; enlever les langues et le palais.
    2. Isoler les papilles gustatives circumvallates à l’aide d’une coupe coronale séparant la langue postérieure, derrière l’éminence intermolaire; couper les papilles gustatives avec une lame de rasoir; puis coupez la langue antérieure en deux à la ligne médiane. Post-fixer pendant la nuit à 4 °C avec 4 % de PFA dans 0,1 M PB.
    3. Cryoprotégez le tissu dans 30% de saccharose pendant la nuit à 4 °C.
      REMARQUE: Le tissu peut être congelé dans un composé à température de coupe optimale (OCT) à l’aide de 2-méthylbutane réfrigéré dans un bécher sur de la glace carbonique et stocké à -80 ° C si la procédure doit être suspendue ici.
  2. Papilles gustatives fongiformes
    1. Refroidir le 2-méthylbutane dans un bécher sur de la glace carbonique en préparation de l’étape 2.2.8.
    2. Décongeler et rincer la langue à 0,1 M PB. Placez la moitié de la langue antérieure contenant les papilles fongiformes sur une lame de verre sous un microscope à dissection.
    3. Utilisez des pinces émoussées et des ciseaux à dissection pour enlever le muscle. Utilisez des pinces émoussées pour maintenir le tissu ouvert lorsque l’épithélium lingual est incurvé et assurez-vous d’une orientation plate en gardant les lames des ciseaux à dissection grossière parallèles à l’épithélium.
    4. Jetez l’épithélium ventral non kératinisé de la langue car il ne contient pas de papilles gustatives.
    5. Utilisez des ciseaux à dissection fine pour une dissection plus proche de la face inférieure de l’épithélium kératinisé.
      REMARQUE: Il est important de disséquer près de l’épithélium afin que le muscle restant soit d’épaisseur uniforme et que la surface soit lisse pour assurer une pénétration uniforme des anticorps. La conséquence de l’épaisseur non uniforme du muscle restant sera une section inégale sur le cryostat, avec une exposition de l’épithélium dans les zones moins musclées et une couche musculaire plus épaisse pour d’autres zones, ce qui entrave la pénétration des anticorps.
    6. Utilisez la pince à extrémité émoussée pour déposer un morceau d’épithélium dans un moule tissulaire (côté musculaire vers le bas) et assurez-vous qu’il repose à plat. Une fois que le tissu est plat, ajoutez une goutte d’OCT au tissu.
      REMARQUE: Étant donné que le bout de la langue est incurvé, il peut être nécessaire de faire une coupure dans l’épithélium où il est courbé afin que le tissu puisse être fait à plat.
    7. Placez le moule en tissu sur une base métallique (préalablement refroidie dans de la glace carbonique) sous la lunette de dissection. Continuez à tapoter légèrement le tissu avec les pinces jusqu’à ce que l’OCT ait gelé pour vous assurer que le tissu gèle aussi plat que possible.
    8. Une fois que l’OCT a gelé, ajoutez rapidement de l’OCT supplémentaire et placez le moule dans un bécher de 2-méthylbutane (refroidi dans de la glace carbonique) jusqu’à ce qu’il soit congelé.
    9. Sectionnement cryostat
      REMARQUE: Le cryostat est utilisé pour l’élimination fine du tissu sous-cutané restant, ce qui peut inhiber la pénétration des anticorps (Figure 1).
      1. Montez les moules OCT sur le cryostat et coupez des sections de 20 μm. Recueillez chaque section et visualisez-la au microscope optique pour évaluer sa proximité avec la base de l’épithélium(Figure 1E - H).
      2. Une fois le tissu rasé de la face inférieure de l’épithélium, décongelez l’épithélium et rincez-le deux fois dans 0,1 M PB sur un agitateur.
  3. Papilles gustatives circumvallates
    1. À l’aide d’une coupe coronale avec une lame de rasoir, séparez la papille circumvallate de la langue antérieure. Utilisez deux coupes parasagitales avec la même lame de rasoir pour enlever le tissu latéral à la papille sous une lunette de dissection. Placez la papille dans un moule tissulaire à l’aide d’une pince de sorte qu’un bord latéral de la papille circumvallate fasse face au fond de la moisissure tissulaire.
      REMARQUE: Le tissu peut être congelé dans l’OCT en utilisant du 2-méthylbutane réfrigéré dans un bécher sur de la glace sèche et stocké à -80 ° C si la procédure doit être suspendue ici.
    2. Coupez le tissu en sections flottantes de 90 μm sur le cryostat.
  4. Papilles gustatives en bouche
    1. Couper le palais dur avant la jonction du palais mou et du palais dur (Figure 2). Utilisez des ciseaux pour séparer le palais mou du tissu sous-jacent, en vous assurant que tous les fragments d’os restants sont coupés. Enlevez les muscles et le tissu conjonctif supplémentaires.
      REMARQUE: Une fois enlevé, tous les tissus qui restent seront constitués de glandes et de tissu conjonctif lâche, qui sont légèrement adhérés à la face inférieure du palais.
    2. Tenez le palais avec une pince à extrémité émoussée et retirez les glandes restantes et le tissu conjonctif lâche en les grattant doucement avec une lame de rasoir.
      REMARQUE: Le tissu peut être congelé dans l’OCT en utilisant du 2-méthylbutane réfrigéré dans un bécher sur de la glace sèche et stocké à -80 ° C si la procédure doit être suspendue ici.

3. Coloration immunohistochimique

  1. Lavez les mouchoirs avec 0,1 M PB, 3 x 15 min. Placer les tissus dans des tubes de 1 mL avec une solution bloquante (sérum d’âne à 3 %, tensioactif non ionique à 0,5 % (voir la table des matières),0,1 M PB) à 4 °C pendant la nuit.
  2. Retirer la solution bloquante et incuber le tissu dans un anticorps primaire (anti-PCLβ2 de lapin) dans une solution d’anticorps (0,1 M PB, tensioactif non ionique à 0,5 %) pendant 5 jours à 4 °C.
  3. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, et incuber dans un anticorps secondaire anti-lapin 488 (1:500) dans une solution d’anticorps pendant 2 jours à 4 °C.
  4. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, et bloquer avec 5% de sérum de lapin normal dans une solution d’anticorps.
  5. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min. Incuber avec un anticorps bloquant l’âne (20 μg/mL) dans une solution d’anticorps pendant 2 jours à 4 °C.
  6. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, puis incuber avec un anticorps primaire dsRed (lapin) conjugué à une étiquette fluorescente (selon les instructions du fabricant) dans une solution d’anticorps pendant 5 jours à 4 °C.
  7. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, puis incuber avec un anticorps primaire (chèvre anti-Car4 (1:500)) dans une solution d’anticorps pendant 5 jours à 4 °C.
  8. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage. Incuber avec un anticorps secondaire anti-chèvre 647 (1:500) dans une solution d’anticorps pendant 2 jours à 4 °C.
  9. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, et monter (côté épithélial vers le haut) dans un support de montage aqueux, et placer un couvercle sur la section de tissu.
    REMARQUE: Si vous utilisez des anticorps de différentes espèces, comme dans le cas de la kératine-8 et de la dsRed uniquement, ajouter tous les anticorps primaires à la solution d’anticorps à l’étape 3.2 et tous les anticorps secondaires à l’étape 3.3 avant de passer à l’étape 3.9.

4. Imagerie confocale et déconvolution

  1. Capturez des images confocales à l’aide d’un microscope confocal avec un objectif 60x (ouverture numérique = 1,40), 4 ms / pixel, zoom de 3, Kalman de 2 et taille de 1024 x 1024. Sélectionnez une taille de pas de 0,47 mm le long de l’axe z. Pour capturer l’innervation de la papille, utilisez un zoom de 2,5 si le champ de vision avec un zoom de 3 est trop étroit pour capturer toute l’innervation de la papille.
  2. Pour déconvoluer les images, notez que certains paramètres seront automatiquement importés avec l’image ; par conséquent, remplissez les détails restants pour la modalité, l’objectif, l’ouverture numérique, le milieu d’immersion, le milieu d’échantillonnage et les fluorophores capturés dans l’image. Ensuite, sélectionnez Déconvolution 3D.

5. Analyse d’images

  1. Papille gustative et volume d’innervation
    1. Importez des piles d’images déconvoluées dans un logiciel d’analyse d’images basé sur des pixels (voir la Table des matériaux)pour déterminer le volume des papilles gustatives et le volume d’innervation totale dans la papille gustative.
      1. Décochez Volume dans le menu principal Objet.
      2. Sélectionnez Ajouter de nouvelles surfaces dans le menu Objet. Sélectionnez Ignorer la création automatique, modifier manuellement, puis sélectionnez Contour.
      3. Cliquez sur Sélectionner et observez la flèche apparaissant sous la forme d’un + pour aider à tracer la bordure de la papille gustative. Déplacez la trancheuse et tracez le contour de la papille gustative dans chaque section optique. Une fois les contours terminés, cliquez sur Créer une surface.
      4. Observez l’objet de volume des papilles gustatives qui apparaît maintenant dans le menu principal Objet. Localisez le volume de la papille gustative sous Outils.
    2. Volume d’innervation dans la papille gustative
      1. Sélectionnez l’icône en forme de crayon sous l’objet papille gustative, puis sélectionnez Masquer tout.
      2. Dans le menu déroulant, sélectionnez le canal fluorescent qui correspond à l’étiquette de la fibre nerveuse. Cochez la case Créer un canal en double.
      3. Cochez la case Définir les voxels en dehors de la surface sur :, puis tapez 0 dans la zone.
      4. Observez le nouveau canal apparaissant dans la fenêtre Réglage de l’affichage, qui est un duplicata non modifié du canal fluorescent sélectionné dans la papille gustative.
      5. Dans le menu principal Objet, sélectionnez Créer une nouvelle surface. Décochez Ignorer la création automatique, modifier manuellement.
      6. Cliquez deux fois sur la flèche bleue pour passer à l’étape suivante.
      7. Cliquez sur Supprimer, puis cliquez sur la double flèche verte pour compléter la surface, qui représente le volume des fibres nerveuses présentes dans la papille gustative. Pour trouver la valeur du volume, sélectionnez Outils dans le menu Objet de fibre nerveuse, puis sélectionnez Volume dans le menu déroulant.
    3. Volume d’innervation à la papille
      1. Créez un volume de la papille gustative comme décrit à la section 5.1.
      2. Sélectionnez l’icône en forme de crayon sous l’objet papille, puis sélectionnez Masquer tout.
      3. Dans le menu déroulant, sélectionnez le canal fluorescent qui correspond à l’étiquette de la fibre nerveuse. Cochez la case Créer un canal en double.
      4. Cochez la case Définir les voxels à l’intérieur de la surface sur : et tapez 0 dans la zone. Cliquez sur OK.
      5. Générez une surface en cliquant sur Ajouter une nouvelle surface. Sélectionnez Segmenter uniquement une région d’intérêt.
      6. Cliquez sur la flèche bleueet augmentez la valeur Z afin que la région d’intérêt commence à la base de la papille gustative.
      7. Cliquez deux fois sur la flèche bleue pour passer à l’étape suivante.
      8. Cliquez sur Supprimer, puis cliquez sur la double flèche verte pour compléter la surface, qui représente le volume de l’innervation à la papille. Pour trouver la valeur du volume, sélectionnez Outils dans le menu Objet de fibre nerveuse, puis sélectionnez Volume dans le menu déroulant.
    4. Analyse des contacts de la tonnelle terminale
      1. Préparation de l’image
        1. Accédez au menu Edition et sélectionnez Recadrer 3D. Recadrez l’image de tous les côtés, en supprimant l’espace en dehors de la papille gustative.
          REMARQUE: Recadrez aussi près de la papille gustative sans supprimer aucune structure pertinente - tout excès d’image allongera le temps de traitement.
        2. Sélectionnez Modifier dans le menu principal, cliquez sur Modifier le typede données . Sélectionnez À : flottant 32 bits dans le menu déroulant.
        3. Sélectionnez Ajouter de nouvelles surfaces dans le menu Objet. Cliquez sur Ignorer la création automatique, modifiez manuellement, sélectionnez Contour, puis faites glisser la position de la tranche vers la droite pour trouver le nombre total de tranches optiques.
        4. Générez des voxels isométriques et assurez-vous qu’au lieu que les voxels soient des rectangles (0,0691 x 0,0691 x 0,474) comme XxYxZ, respectivement, les voxels sont de 0,0691 x 0,0691 x 0,0691 en divisant les rectangles en cubes avec des valeurs identiques pour l’intensité de fluorescence que le voxel rectangulaire d’origine. Sélectionnez Propriétés de l’image. Ensuite, divisez la valeur Z pour Voxel Size par la valeur X ou Y (= 0,474/0,0691) et multipliez cette valeur par le nombre de tranches (sections optiques) trouvées à l’étape précédente.
        5. Revenez à Modifier dans le menu principal, puis sélectionnez Rééchantillonner 3D.
        6. Remplacez la valeur Z (nombre de tranches) par la valeur nouvellement calculée.
      2. Création de surfaces automatiques basées sur la fluorescence
        1. Cliquez à nouveau sur Ajouter une nouvelle surface pour ajouter une nouvelle surface, désélectionnez Segment uniquement une région d’intérêt,puis cliquez sur Suivant.
        2. Dans le menu déroulant Canal source, sélectionnez le canal correspondant à l’un des types de cellules transductrices de goût. Désélectionnez Lisser et passez à l’étape suivante.
        3. Ne modifiez rien sur l’écran suivant qui montre la gamme d’intensités fluorescentes présentes dans l’image. Cliquez à nouveau sur la flèche bleue en bas pour passer à l’étape suivante.
        4. Cliquez sur Supprimer, puis cliquez sur la double flèche verte pour compléter la surface.
        5. Accédez au menu Objet sur la main gauche de l’écran où la surface de cellule terminée apparaîtra et sera appelée quelque chose de générique tel que Surface 2. Double-cliquez sur le nom de la surface pour la nommer en fonction de ce que l’étiquette représente.
          REMARQUE: Dans ce cas, la surface générée est basée sur la cellule marquée PLCß2.
        6. S’il y a des points au lieu d’une surface, sous le menu dans le coin inférieur gauche, cliquez sur Surface au lieu de Point central. Ensuite, cliquez sur OK lorsque vous y êtes invité.
        7. Répétez les étapes 5.3.2.1 à 5.3.2.5 pour les autres marqueurs cellulaires transducteurs de goût et le marqueur de fibres nerveuses.
        8. Enregistrez (exportez) la progression.
        9. Cliquez sur une cellule de type Surface dans le menu principal. Dans le menu de cet objet, cliquez sur Outils, puis sur Transformation de distance.
        10. Attendez qu’une fenêtre contextuelle intitulée XTDistanceTransformation apparaisse. Sélectionnez Objet de surface extérieure. Notez le nouveau canal qui apparaît dans le menu Réglage de l’affichage appelé Distance au nom de la surface.
        11. Sélectionnez la surface Fibre nerveuse dans le menu Objet. Cliquez sur l’icône en forme de crayon, puis sur Masquer tout.
        12. Dans le menu déroulant qui s’affiche, sélectionnez le nouveau nom de la couche Distance à la surface. Notez le nouveau canal qui apparaît dans la fenêtre Réglage de l’affichage appelée Distance masquée au nom de la surface.
        13. Créez un nouvel objet à l’aide du menu principal Objet. Désélectionnez Segmenter uniquement une région d’intérêt et cliquez sur la flèche bleue. Sélectionnez la distance masquée au canal PLCß2 et décochez Lisse.
        14. Sur l’écran suivant, vérifiez s’il y a des régions où les cellules transductrices de goût se trouvent à la plus petite distance des fibres nerveuses discernables par ce logiciel. Pour ce faire, fixez une limite de 0,01 à 0,11 μm pour vérifier la fluorescence des cellules réceptrices à proximité des fibres nerveuses.
        15. Tapez 0.01 dans la zone verte sur le côté gauche pour définir le seuil inférieur, appuyez sur Tab. Cliquez ensuite sur le bouton rouge et tapez 0.11 pour définir le seuil supérieur. Appuyez sur Tab, puis cliquez sur la flèche bleue en bas pour passer à l’étape suivante.
        16. Cliquez sur Supprimer, puis sur la double flèche verte pour terminer.
        17. Renommez cette surface dans la section 0.01-0.11 de PLCß2 dans le menu Objet. Sélectionnez Dans 0,01 - 0,11 de surface PLCß2 dans le menu Objet.
        18. Sélectionnez le crayon puis cliquez sur Masquer tout. Sélectionnez le canal rouge (fibre nerveuse) dans le menu déroulant et cliquez sur OK. Notez le nouveau canal qui apparaît dans la fenêtre de réglage de l’affichage appelée CHS2 masqué .
        19. Cliquez sur le nom de la chaîne; renommez le canal dans 0.01 - 0.11 de PLCß2.
          REMARQUE: Il s’agit d’un canal fluorescent qui représente un double du canal fluorescent rouge présent dans la surface créée.
        20. Cliquez sur blanc au milieu du sélecteur de couleur. Sélectionnez une couleur qui contraste avec les couleurs des structures.
        21. Exportez (c’est-à-dire enregistrez) le fichier à ce stade.
        22. Répétez les étapes 5.4.2.9 à 5.4.2.21 pour d’autres marqueurs cellulaires transducteurs de goût.
        23. Exportez (c’est-à-dire enregistrez) le fichier à ce stade.
          REMARQUE: Pour analyser la proximité d’un type de cellule étiqueté à un autre, remplacez simplement la surface de la fibre nerveuse à l’étape 5.4.2.11 (et les étapes suivantes) par l’objet d’intérêt et les composants équivalents qui se rapportent à chaque étape suivante.

6. Reconstruction de la tonnelle neuronale et quantification du nombre absolu de cellules

  1. Traçage et analyse des tonnelles terminales
    1. Ouvrez le fichier image déconvolu dans un logiciel d’analyse d’images vectorielles 3D (voir la table des matériaux),sélectionnez Trace,cliquez sur Neuron, puis cliquez sur Dendrite.
    2. Faites défiler jusqu’à la base de la papille gustative dans la pile d’images. Tracez chaque fibre jusqu’à la fin tout en faisant défiler la pile d’images.
    3. À l’extrémité de la branche, faites un clic droit sur la fin et sélectionnez Fin. Aux points de branche, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Bifurcating Node.
      REMARQUE: Cela permet de tracer une branche jusqu’à la fin, puis de revenir au point de bifurcation et de tracer l’autre branche avec le programme reconnaissant que ce traçage est toujours du même neurone.
    4. Enregistrez le fichier de données en tant que fichier . DAT, qui peut ensuite être ouvert pour analyse dans le logiciel d’analyse d’images vectorielles 3D.

7. Quantification du nombre de cellules

  1. Quantifier les cellules de papilles gustatives étiquetées dans n’importe quel logiciel d’analyse d’images tant que des marqueurs distincts pour la transduction des types de cellules ancrés à la position z peuvent être placés au niveau nucléaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La coloration de l’épithélium lingual avec des anticorps dirigés contre dsRed et la kératine-8 (un marqueur général des papilles gustatives) a marqué à la fois les papilles gustatives entières et toute l’innervation des papilles gustatives chez les souris Phox2b-Cre:tdTomato50,51 (Figure 3A). L’imagerie de ces papilles gustatives de leurs pores à leurs bases a donné les images de plan x-y de la plus haute résolution(Figure 3A,B). La fonction de contour du programme d’imagerie à base de pixels a été utilisée pour décrire la périphérie de la papille gustative dans chaque section (Figure 3B), puis générer une surface (Figure 3C) qui représentait le volume des papilles gustatives. Le masquage (ou la duplication) de la fluorescence associée à l’étiquette des papilles gustatives uniquement à l’intérieur de la surface a créé un nouveau canal qui ne contenait que cette fluorescence et a éliminé toute coloration de la papille obscurcissant la papille gustative(Figure 3D). La fluorescence des fibres nerveuses dans la papille gustative a été masquée (Figure 3E) et utilisée pour créer automatiquement une surface représentant le volume d’innervation à l’intérieur de celle-ci (Figure 3F). Une approche similaire a également été utilisée pour mesurer le volume des papilles gustatives et celui de son innervation associée dans les papilles gustatives circonvallates (Figure 3G). Les données de mesure représentatives n’ont révélé aucune corrélation entre les volumes papilles gustatives et les volumes d’innervation dans les régions de mesure fongiforme (p = 0,115) ou circonvallate (p = 0,090) (Figure 3H).

L’administration d’une faible dose de tamoxifène chez les souris TrkBCreER:tdTomato provoque une recombinaison génique et le marquage d’un petit nombre de neurones de sorte que les papilles gustatives sont innervées par zéro à quelques tonnelles terminales marquées (la partie neuronale dans la papille gustative). L’épithélium lingual a été coloré à l’aide d’un anticorps anti-dsRed pour les tonnelles terminales et d’anticorps anti-Car4 (acide) et anti-PLCβ2 (doux, amers et umami) pour les cellules transductrices du goût(Figure 4A). Un programme d’analyse d’images vectorielles a été utilisé pour tracer les tonnelles terminales étiquetées (Figure 4B). Les hauteurs orthogonales des tonnelles associées aux tracés bleus et verts étaient respectivement de 33,4 μm(figure 4C)et de 32,4 μm(figure 4D). Les mesures 3D de la coque convexe (c.-à-d. l’étendue de la tonnelle terminale dans la papille gustative) pour la tonnelle terminale bleue étaient de 644,0μm 3 et de 3647,0 μm3 pour la tonnelle verte. Le dendrogramme du tracé vert est représenté à la figure 4E avec des longueurs de branches mesurées en microns. La tonnelle verte avait sept extrémités de branches et une longueur totale de 183,4 μm. La quantification du nombre absolu de cellules PLCβ2+ et Car4+ a révélé que cette papille gustative comptait 17 cellules PLCβ2+ et deux cellules Car4+. L’utilisation d’un logiciel d’imagerie basé sur des pixels cellulaires pour déterminer la proximité la plus proche entre les fibres nerveuses et les cellules transductrices de goût a révélé que sur un total de 19 cellules transductrices de goût dans la papille gustative, la tonnelle terminale bleue (représentée en rouge dans la figure 4F,G) se trouvait à moins de 200 nm (la résolution du microscope optique) de la cellule Car4+ bleu clair (zones blanches indiquées par des flèches dans la figure 4G). La tonnelle terminale associée au tracé vert est représentée en magenta(Figure 4F et Figure 4H)et se trouve à moins de 200 nm des cellules Car4+ bleu clair et bleu foncé (zones blanches de la Figure 4H). Comme la cellule la plus proche de ces tonnelles était à plus de 200 nm, il y avait un voxel non étiqueté séparant les deux structures.

Les cellules progénitrices en division ont été marquées à l’aide d’injections d’EdU aux jours 0, 1 et 3, et les tissus ont été prélevés le jour 4. La coloration à la kératine-8 et à l’EdU de monture entière des papilles gustatives fongiformes a révélé que des cellules marquées par l’EdU étaient présentes à l’intérieur et à l’extérieur des papilles gustatives(Figure 5A-C). Les cellules individuelles EdU+/kératine-8+ (sarcelle et jaune) et les noyaux EdU+/kératine-8- (violet et magenta) ont été segmentés(Figure 5B,C). La cellule bleu foncé montrée était de la kératine-8+ et avait une forme allongée compatible avec les cellules matures transductrices de goût. Ces surfaces sont représentées avec la papille gustative orientée du pore à la base(Figure 5B)et le long du long axe de la papille gustative(Figure 5C). Chaque structure pourrait être visualisée en tranches optiques individuelles en masquant la fluorescence à l’intérieur de chaque structure (Figure 5D-F). Les noyaux magenta et violet se trouvent à l’extérieur de la bordure kératine-8+ de la papille gustative indiquée par le contour en pointillés blancs(Figure 5D,E). Les cellules jaunes, sarcelles et bleues se trouvaient dans la papille gustative(Figure 5D-F). Les cellules individuelles transductrices de goût peuvent être reconstruites à l’aide d’un logiciel d’imagerie basé sur des pixels de l’étiquetage Car4(Figure 6A-C)ou du marquage PLCβ2(Figure 6D-F). Un logiciel d’imagerie basé sur des pixels a été utilisé pour mesurer la proximité la plus proche entre les cellules, ce qui a révélé qu’une cellule Car4+ (même cellule que celle illustrée à la figure 6B)se trouvait à moins de 200 nm d’une seule cellule PLCβ2+(figure 6G,vert). La zone où les cellules se trouvaient à moins de 200 nm les unes des autres est indiquée en blanc(Figure 6G)et indiquée par des flèches blanches. La cellule la plus proche suivante était à plus de 200 nm et est représentée en jaune sur la figure 6H,I dans deux orientations différentes. La figure 7 illustre l’isolement et l’analyse de l’innervation se terminant à l’intérieur de la papille (mais à l’extérieur de la papille gustative) et comprend sa distribution autour de la papille gustative et sa distance de l’épithélium.

Figure 1
Figure 1: Préparation de l’épithélium lingual pour la coloration fongiforme des papilles gustatives. (A) Vue de la langue coupée avec épithélium et muscle marqués avant toute dissection. (B) Une fois que suffisamment de muscle a été enlevé, il ne reste qu’une petite quantité de muscle sur la face inférieure de l’épithélium. En plus d’évaluer la progression de la dissection en visualisant le côté coupé de l’épithélium, (C) poser l’épithélium à plat sur une lame de verre sous la lunette de dissection révèle que certaines parties du tissu sont uniformément translucides (rectangle violet); suffisamment de muscle a été retiré de cette zone. En revanche, les flèches violettes indiquent les régions à gauche où il y a plus de muscle à enlever. Une fois que toute la face inférieure de l’épithélium est similaire à la zone du rectangle violet, passez à l’étape suivante. (D) Après que des parties de l’épithélium ont été congelées avec le côté musculaire vers le bas, les muscles supplémentaires et la lamina propria sont enlevés sous forme de sections minces à l’aide du cryostat. Lorsque le sectionnement est terminé, l’épithélium restant est mince et translucide. (E-F) Les sections en série (20 μm) ont été recueillies sur une lame de verre, et chaque section a été visualisée au microscope fluorescent avant de couper la section suivante. Bien en dessous de l’épithélium, les fibres musculaires sont orientées dans plusieurs directions de sorte que les fibres musculaires sont présentes à la fois en coupe transversale et le long de la fibre musculaire(E,rectangle rouge). Les sections sérielles en E-F montrent la transition des fibres musculaires orientées dans plusieurs directions(E,rectangle rouge) aux fibres musculaires orientées principalement dans une direction(F,rectangle rouge), ce qui est indicatif de la frontière muscle-lamina propria. Une autre région du même morceau de tissu (rectangles jaunes) démontre que lorsque les fibres musculaires sont orientées dans une direction, la section suivante produira probablement du tissu conjonctif parce que tout le muscle a été retiré de cette région. Les rectangles bleus représentent tous deux le dessous de l’épithélium. Si des papilles gustatives sont présentes sur la section (G, flèches rouges), trop de tissu a été enlevé. Idéalement, la section est complète lorsque la face inférieure de l’épithélium (mais pas de papilles gustatives) est visible dans les sections enlevées(F,rectangle jaune). Bien que les zones avec des fibres musculaires orientées dans la même direction(E,rectangle jaune et F,rectangle rouge) conviennent également à la section, les zones où les fibres musculaires sont orientées dans plusieurs directions(E,rectangle rouge) doivent être évitées. (G) Une fois que les sections comprennent le dessous de l’épithélium / lamina propria, il n’est possible de couper que quelques sections supplémentaires avant que trop d’épithélium n’ait été enlevée et que les sections comprennent des papilles gustatives. (H) L’erreur la plus courante est révélée par des sections de cryostat où l’épithélium est vu au bord du tissu, le muscle est vu à l’intérieur de l’épithélium et le muscle OTC / clairsemé est présent au milieu. Cela est le plus souvent dû au fait de ne pas poser le tissu à plat sur le fond du moule tissulaire avant la congélation ou à un aplatissement insuffisant avec une pince émoussée. Barres d’échelle en A-C = 1 mm; barres d’échelle en E, F, H = 100 μm; barre d’échelle en G = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Dissection du palais pour la coloration. (A) Le palais a été disséqué d’abord à l’aide de ciseaux à lame mince pour couper le palais dur, (B) puis en utilisant les mêmes ciseaux pour séparer le palais mou du tissu conjonctif sous-jacent. Après avoir retiré le tissu de la cavité buccale, tout tissu restant a été retiré avec les ciseaux. À ce stade, il ne reste que des glandes à l’arrière du palais mou. Une lame de rasoir a été utilisée pour gratter doucement ces glandes. La surface épithéliale(C)arrière et(D)de la dissection complète du palais sont montrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Mesure du volume dans les papilles gustatives à monture entière. (A) Les papilles gustatives à monture entière ont été imagées du pore gustatif à la base de la papille gustative de sorte que le plan de la plus haute résolution soit le plan x-y. Chaque tranche optique a été visualisée dans un logiciel d’analyse d’image basé sur des pixels, et la fonction de contour a été utilisée pour dessiner manuellement la périphérie de la papille gustative colorée avec de la kératine-8. (B) Un exemple de tranche optique est fourni. (C) La position de cette section représentative le long du long axe de la papille gustative est indiquée par la ligne jaune. Après chaque section optique, une surface a été créée qui représente le volume de la papille gustative (blanc). Masquage ou duplication du canal fluorescent correspondant à la papille gustative (kératine-8 en D)ou l’innervation marquée tdTomato (pseudo-colorée en bleu en E)dans le volume représentant la papille gustative. La fluorescence dans la papille gustative en (E) a été utilisée pour générer une surface représentant le volume d’innervation dans la papille gustative (F, bleu). (G) Une approche similaire a été appliquée aux papilles gustatives circumvallates de monture entière imagées dans la même orientation que la papille gustative fongiforme dans A. (H) La mesure du volume des papilles gustatives fongiformes et circumvallates et de leur volume respectif d’innervation a révélé qu’il n’y a pas de corrélation entre la papille gustative et le volume d’innervation pour les papilles gustatives échantillonnées pour l’une ou l’autre région. Barres d’échelle en A-D, F = 4 μm; barre d’échelle en G = 5 μm. Ce chiffre a été modifié à partir d’Ohman-Gault et al.50. Abréviations : FF = fongiforme ; CV = circumvallate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Tonnelles terminales représentatives dans les papilles gustatives fongiformes utilisant un marquage génétique cellulaire clairsemé. (A) Bourgeons gustatifs entiers colorés avec des marqueurs cellulaires transducteurs de goût Car4 (blanc) et PLCβ2 (vert). (B) Cette papille gustative a deux tonnelles terminales étiquetées, qui sont montrées avec la papille gustative enlevée après la reconstruction des fibres. (C) La tonnelle bleue a 6 extrémités de branches et une hauteur orthogonale dans la papille gustative de 33,4 μm et (D) la tonnelle verte a 7 extrémités de branches. (E) Le dendrogramme correspondant à la tonnelle verte est fourni avec chaque longueur de segment en micromètres. (F-H) La distance entre les structures a été mesurée. (F-G) Le tracé bleu en C a été segmenté et est représenté en rouge. (G) Les zones où cette tonnelle terminale se trouve à moins de 200 nm de la cellule Car4+ bleu clair sont indiquées par des flèches blanches. (F, H) La tonnelle terminale représentée par la reconstruction verte est représentée en magenta. (H) La tonnelle magenta (associée au tracé vert en 4B, D) se trouve à moins de 200 nm des cellules Car4+ bleu foncé et bleu clair. Barre d’échelle en A, B = 4 μm; barres d’échelle en F-H = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Des supports entiers peuvent être utilisés pour suivre l’incorporation de nouvelles cellules gustatives. Des souris ont été injectées avec de l’EdU pour étiqueter les progéniteurs diviseurs les jours 0, 1 et 3 et sacrifiées le jour 4. (A, B) Les cellules marquées avec EdU (vert) peuvent être identifiées à la fois autour et dans la papille gustative, qui est marquée avec de la kératine-8 (A, blanc, B, gris). (B, C) Les cellules individuelles marquées EdU, kératine-8+ à l’intérieur de la papille gustative et les noyaux marqués kératine-8-, EdU sont segmentés à l’extérieur de la papille gustative. (D-F) La fluorescence à l’intérieur de chaque structure segmentée en A-B a été masquée et peut être vue en coupe transversale. Le périmètre de la papille gustative est délimité par une ligne pointillée blanche (D-F). (D) La cellule jaune se trouve dans la papille gustative et est à la fois marquée EdU et kératine-8+. Le noyau magenta est à l’extérieur des papilles gustatives et est de la kératine-8-. (E) La cellule sarcelle est à l’intérieur de la papille gustative et à la fois marquée EdU et kératine-8+. Le noyau violet marqué EdU est de la kératine-8- et à l’extérieur de la papille gustative (flèche blanche). (F) La cellule bleue est de la kératine-8+ et allongée, compatible avec les cellules matures transductrices du goût. Barres d’échelle en A-C = 3 μm; barres d’échelle en D = 2 μm; barres d’échelle dans E, F = 4 μm. Abréviation: EdU = 5-ethynyl-2′-désoxyuridine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Les formes des cellules des papilles gustatives entières peuvent être analysées ainsi que leurs relations avec d’autres cellules des papilles gustatives. (A-F). La segmentation des cellules des papilles gustatives individuelles pour créer des surfaces isole les cellules des papilles gustatives individuelles, facilitant ainsi une visualisation claire. Les cellules individuelles (A-C) Car4+ et (D-F) PLCβ2+ montrent la variation des formes de cellules individuelles. (G) La cellule PLCβ2+ la plus proche de la cellule Car4+ dans B a été déterminée à moins de 200 nm (à un seul petit emplacement de 0,5 μm2 indiqué par une flèche). La cellule la plus proche suivante était à plus de 300 nm et pouvait être distinguée en tant que structure distincte de la cellule Car4+ segmentée. (H, I) La cellule la plus proche suivante a été segmentée; et la fluorescence masquée est représentée en jaune. Les trois points les plus proches pour la cellule la plus proche suivante (jaune) sont indiqués par des pointes de flèche dans H, I. Barres d’échelle en A-C = 3 μm; barres d’échelle en D, E = 4 μm; barre d’échelle en F = 2 μm; barres d’échelle en G-I = 3 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Quantification de l’innervation de la papille. (A) Certaines étiquettes pour les neurones du goût marquent également l’innervation de la papille. (B) L’innervation à l’intérieur de la papille gustative est séparée de l’innervation à l’extérieur de la papille gustative en segmentant la papille gustative (comme décrit pour la figure 3),(C)en masquant l’innervation à l’intérieur de la papille gustative (rouge), puis en masquant l’innervation à l’extérieur de la papille gustative uniquement (bleu foncé). Le volume d’innervation à la papille gustative (rouge) était de 1649,6 μm3. L’innervation à l’extérieur de la papille gustative comprendra des fibres gustatives sous la papille qui ne doivent pas être incluses dans la quantification de l’innervation de la papille. (D) La fluorescence de l’innervation de la papille a été masquée (bleu clair). Le volume d’innervation de la papille était de 121,8μm3. Barres d’échelle en A-D = 4 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le développement d’une approche pour collecter et colorer de manière cohérente les papilles gustatives entières de trois régions gustatives de la cavité buccale (fongiforme, circumvallate et palais) apporte des améliorations significatives pour l’analyse des cellules transductrices du goût, le suivi des cellules nouvellement incorporées, l’innervation et les relations entre ces structures. De plus, il facilite la localisation d’un marqueur neuronal secondaire potentiel à l’intérieur ou à l’extérieur d’une population marquée50. Ceci est particulièrement pertinent étant donné que les papilles gustatives reçoivent également une innervation somatosensorielle robuste52,53, qui peut également marquer certains neurones du goût. Les papilles abritant les papilles gustatives peuvent également être imagées en utilisant un grossissement plus faible. Cela permet de visualiser l’innervation à l’ensemble de la papille, ainsi qu’aux papilles gustatives, et permet des analyses indépendantes de l’innervation qui pénètre dans la papille gustative et les fibres nerveuses environnantes.

Les terminaisons nerveuses somatosensorielles de la peau peuvent être distinguées en fonction de leur organisation autour des follicules pileux et de leurs relations avec d’autres composants de l’épithélium; des analyses parallèles dans les papilles gustatives peuvent donner des caractérisations similaires54,55. L’établissement d’une base normale pour les relations à l’intérieur et la composition des papilles gustatives et des papilles servira de base pour déterminer les mécanismes sous-jacents aux déficits dans les fonctions gustatives périphériques56,57. La papille gustative est un organe terminal sensoriel dynamique où le renouvellement cellulaire et le remodelage terminal de la tonnelle sont coordonnés par une variété de facteurs58. Les recherches sur les circuits potentiels dans la papille gustative59, les processus pathologiques57et les chimiothérapies qui perturbent la fonction gustative normale58 pourraient être améliorées par cette méthode, qui maintient intactes les papilles gustatives entières et les fibres nerveuses. La méthode de montage complet décrite ici élargit les possibilités d’analyse et affine les mesures possibles.

Étant donné que la langue est un tissu dense et hétérogène, et que la papille gustative elle-même contient de nombreuses jonctions de cellule à cellule qui limitent la perméabilité27,le développement d’une approche pour effectuer une coloration complète des papilles gustatives a présenté un défi de taille. Les méthodes précédentes consistaient à prendre des sections représentatives60 ou à couper des sections plus épaisses, ce qui limitait ensuitelapénétration des anticorps32,33,34. De plus, la sélection de papilles gustatives entières de ces sections plus épaisses a biaisé les données en faveur de papilles gustatives plus petites. Alternativement, peler l’épithélium est susceptible de perturber les fibres nerveuses des papilles gustatives; ceux-ci ne sont pas spécifiquement étiquetés lorsque cette approche est utilisée39,40. Les tonnelles nerveuses forment un grand plexus dans une papille gustative26,50,61, il n’est donc pas clair si l’enlèvement de la tonnelle perturbe les relations normales entre les autres cellules de la papille gustative. En revanche, la méthode actuelle du goût et des bourgeons entiers permet de quantifier des nombres absolus et des mesures. Cette coloration permet de préserver et d’analyser de nombreuses caractéristiques des cellules transductrices (type, forme et emplacement) et les tonnelles terminales (ainsi que les relations entre elles).

Cette approche comporte plusieurs limites. En particulier, certains anticorps qui ont été utilisés dans des sections minces62 ne fonctionnent pas dans des montures entières, ce qui limitera les types de structures qui peuvent être examinées. En outre, comme la résolution de la microscopie confocale est limitée, les données structurelles analysées à partir de cellules individuelles et de relations entre cellules seront également limitées24. Par exemple, on peut déterminer que les cellules se trouvent à moins de 200 nm les unes des autres, mais les structures spécialisées entre les cellules (p. ex., synapses)63 ne peuvent pas être examinées. Enfin, tous les types de cellules ne peuvent pas être étiquetés à l’aide de cette approche. Par exemple, il s’est avéré difficile d’étiqueter spécifiquement les cellules qui transduisent le sel dans cette préparation. Ces cellules pourraient être un sous-ensemble d’une combinaison de cellules de type 1, de type II et de type III14,15,16,17,18,19,64. Les cellules de type I, qui sont principalement des cellules de soutien, ne peuvent pas être examinées dans des montures entières car elles semblent s’enrouler autour d’autres cellules, ce qui les rend difficiles à distinguer en tant qu’entités distinctes65. Avoir un marqueur fiable pour les cellules transductrices de sel permettrait des analyses plus complètes14,66. De même, comme la coloration PLCβ2 représente des cellules gustatives capables de transduire plusieurs types de stimuli, une étiquette permettant une séparation plus poussée de ce type de cellule serait également une amélioration.

Voici des étapes préparatoires importantes qui nécessitent des soins. Tout d’abord, assurez-vous que la couche musculaire qui reste après la dissection est uniforme et aussi mince que possible. Si cette couche n’est pas uniforme, la pénétration des anticorps ne sera finalement pas uniforme. Deuxièmement, il est crucial que les morceaux d’épithélium reposent à plat dans le fond de la moisissure tissulaire avant de geler, et que des pinces émoussées soient utilisées pour appuyer légèrement sur le tissu jusqu’à ce qu’il soit gelé. Lorsque la quantité minimale de muscle (dans une couche paire) reste sur la face inférieure de l’épithélium, aussi peu que trois sections de cryostat atteindront la face inférieure de l’épithélium. Le positionnement du tissu dans un cryostat, de sorte que des sections soient prélevées sur l’ensemble du visage du tissu, entraîne parfois l’ablation inégale de parties du tissu. Pour ces raisons, il est fortement recommandé d’éviter une décongélation supplémentaire, une dissection supplémentaire et une recongélation du tissu. Au lieu de cela, il faut prendre soin d’évaluer la dissection tissulaire avant de congeler le tissu.

Dans l’ensemble, la méthode de préparation des tissus de monture entière présentée ici peut être utilisée pour collecter les papilles gustatives entières ainsi que la papille environnante de trois régions gustatives: fongiforme, circumvallate et palais. Bien qu’une variété de maladies56,57 et chimiothérapies56 soient connues pour perturber la fonction gustative, les mécanismes sous-jacents à ces changements restent inconnus. L’utilisation de l’approche de coloration globale pour les papilles gustatives présentée ici représente une conception expérimentale robuste où les cellules transductrices de goût et leurs fibres nerveuses pourraient être étiquetées pour déterminer si un déficit est dû à la perte d’un type cellulaire spécifique, à des morphologies de tonnelles terminales compromises, à des relations perturbées entre les cellules transductrices de goût ou à des relations perturbées entre les cellules transductrices et leurs fibres nerveuses. De plus, il serait possible non seulement de quantifier le nombre absolu de nouvelles cellules marquées dans les papilles gustatives, mais aussi de quantifier le nombre de nouvelles cellules transductrices du goût (marquées EdU) d’un type défini (c.-à-d. PLCβ2+ ou Car4+). On pourrait également examiner si ces nouvelles cellules développent des formes normales et s’incorporent normalement dans la papille gustative (c.-à-d. se déplacent dans la papille gustative après le traitement). Beaucoup de ces mesures, ainsi que le nombre de papilles gustatives, peuvent toutes être faites à partir du même tissu, limitant le nombre d’animaux différents nécessaires pour une expérience. Ces possibilités pourraient faciliter la rationalisation des méthodes expérimentales pour fournir des interventions cliniques pour les déficits du goût, ainsi que fournir un aperçu des mécanismes normaux sous-jacents à la fonction gustative.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Kavisca Kuruparanantha pour ses contributions à la coloration des tissus et à l’imagerie des papilles gustatives circumvallates, Jennifer Xu pour la coloration et l’imagerie de l’innervation de la papille, Kaytee Horn pour les soins aux animaux et le génotypage, et Liqun Ma pour sa coloration tissulaire des papilles gustatives du palais mou. Ce projet a été soutenu par R21 DC014857 et R01 DC007176 à R.F.K et F31 DC017660 à L.O.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7 (2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, Supplement 1 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444 (1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117 (2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100 (2011).
  48. Hirsch, M. -R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399 (2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5 (2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815 (2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1 (2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, ÉG., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Tags

Neurosciences Numéro 168 papille gustative monture entière innervation afférente langue goût
Coloration, visualisation et analyse en monture entière des papilles gustatives fongiformes, circonvallates et palatines
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohman, L. C., Krimm, R. F.… More

Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter