Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Helmonterad färgning, visualisering och analys av fungiforma, cirkumvallat och smaklökar med gom

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62126
Automatic Translation
1, 1
1Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

Summary

Detta dokument beskriver metoder för vävnadsberedning, färgning och analys av hela fungiform, cirkumvallat och gommen smaklökar som konsekvent ger hela och intakta smaklökar (inklusive nervfibrerna som innervate dem) och upprätthåller relationerna mellan strukturer inom smaklökar och den omgivande papillan.

Abstract

Smaklökar är samlingar av smaktransdukterande celler specialiserade för att upptäcka undergrupper av kemiska stimuli i munhålan. Dessa transdukterande celler kommunicerar med nervfibrer som bär denna information till hjärnan. Eftersom smaktransdukterande celler kontinuerligt dör och ersätts under hela vuxenlivet, är smakknoppsmiljön både komplex och dynamisk, vilket kräver detaljerade analyser av dess celltyper, deras platser och eventuella fysiska relationer mellan dem. Detaljerade analyser har begränsats av tungvävnad heterogenitet och densitet som har avsevärt minskat antikroppspermeabilitet. Dessa hinder kräver sektioneringsprotokoll som resulterar i att smaklökar delas mellan sektioner så att mätningarna bara approximeras och cellrelationer går förlorade. För att övervinna dessa utmaningar innebär de metoder som beskrivs häri att samla in, imaging och analysera hela smaklökar och enskilda terminal arbors från tre smakregioner: fungiform papillae, cirkumvallat papiller och gommen. Att samla hela smaklökar minskar partiskhet och teknisk variabilitet och kan användas för att rapportera absoluta tal för funktioner inklusive smak-knopp volym, total smak-knopp innervation, transdukterande cellantal och morfologin hos enskilda terminal arbors. För att demonstrera fördelarna med denna metod ger detta papper jämförelser av smaklök och innervationsvolymer mellan fungiforma och omkretsa smaklökar med en allmän smakknoppmarkör och en etikett för alla smakfibrer. Ett arbetsflöde för användning av glescellig genetisk märkning av smakneuroner (med märkta delmängder av smaktransdukterande celler) tillhandahålls också. Detta arbetsflöde analyserar strukturerna hos enskilda smaknerv arbors, celltypsnummer och de fysiska relationerna mellan celler med hjälp av bildanalysprogramvara. Tillsammans ger dessa arbetsflöden ett nytt tillvägagångssätt för vävnadsberedning och analys av både hela smaklökar och den fullständiga morfologin hos deras innervating arbors.

Introduction

Smaklökar är samlingar av 50-100 specialiserade epitelceller som binder undergrupper av kemisk smak stimuli som finns i munhålan. Smaktransdukterande celler tros i allmänhet existera som typ1,2,3,4,5,6,7,8,9, ursprungligen baserat på elektronmikroskopikriterier som senare korrelerades med molekylära markörer. Typ II-celler uttrycker fosfolipas C-beta 2 (PLCβ2)2 och övergående receptorpotentialjonkanal, underfamilj M medlem 51 och innehåller celler som omvandlar söta, bittra och umami1,10. Typ III-celler uttrycker kolsyra anhydras 4 (Car4)11 och synaptosomalassocierade protein 258 och betecknar celler som främst svarar på sur smak11. Cellerna som omvandlar sälta har inte varit så tydligt avgränsade12,13,14, men kan potentiellt inkludera typ I- och typ III-celler15,16,17,18,19. Smaklökarmiljön är komplex och dynamisk, med tanke på att smaktransdukterande celler ständigt vänder sig under hela vuxenlivet och ersätts av basala stamceller3,20,21. Dessa smaktransdukterande celler ansluter till pseudo-unipolära nervfibrer frångeniculate och petrosal ganglier, som passerar smakinformation till hjärnstammen. Dessa neuroner har främst kategoriserats baserat på vilken typ av smakinformation de bär22,23 eftersom information om deras morfologi har varit svårfångad fram till nyligen24. Typ II-celler kommunicerar med nervfibrer via kalciumhomeostasmodulatorprotein 1 jonkanaler25, medan typ III-celler kommunicerar via klassiska synapser8,26. Ytterligare karakterisering av smakknoppceller- inklusive transdukterande celltypslinjer, faktorer som påverkar deras differentiering och strukturerna för anslutande arbors är alla områden av aktiv undersökning.

Smaklökstudier har hindrats av flera tekniska utmaningar. De heterogena och täta vävnaderna som utgör tungan minskar avsevärt antikroppspermeabiliteten för immunohistokemi27,28,29. Dessa hinder har krävt sektioneringsprotokoll som resulterar i uppdelning av smaklökar över sektioner så att mätningarna antingen approximeras baserat på representativa avsnitt eller summeras över sektioner. Tidigare har representativa tunna sektioner använts för att approximera både volymvärden och transduktoriska cellantal30. Tjockare seriell sektion möjliggör avbildning av alla smaklökar och summering av mätningar från varje avsnitt31. Att skära sådana tjocka sektioner och välja endast hela smaklökar snedvrider provtagningen mot mindre smaklökar32,33,34. Nerv innervation uppskattningar från sektionerade smaklökar har baserats på analyser av pixel nummer13,35, om kvantifierasalls 36,37,38. Dessa mätningar ignorerar helt strukturen och antalet enskilda nerv arbors, eftersom arbors är uppdelade (och vanligtvis dåligt märkta). Slutligen, även om peeling bort epitel tillåter hela smaklökar att färgas39,40, tar det också bort smak-knopp nervfibrer och kan störa de normala relationerna mellan celler. Därför har undersökningar av de strukturella relationerna inom smaklökar begränsats på grund av denna störning som orsakas av färgningsmetoder.

Insamling av hela strukturen eliminerar behovet av representativa sektioner och gör det möjligt att bestämma absoluta värdens mätningar av volymer, cellantal och strukturmorfologier41. Den här metoden ökar också noggrannheten, begränsar partiskhet och minskar den tekniska variationen. Detta sista element är viktigt eftersom smaklökar visar betydande biologisk variabilitet både inom34,42 och över regioner43,44, och hela smak-knopp analyser gör det möjligt att jämföra absoluta celltal mellan kontroll och experimentella förhållanden. Dessutom tillåter förmågan att samla intakta smaklökar analysen av de fysiska relationerna mellan olika transledande celler och deras tillhörande nervfibrer. Eftersom smaktransdukterande celler kan kommunicera med varandra45 och kommunicerar med nervfibrer46, är dessa relationer viktiga för normal funktion. Således kan funktionsförlustförhållanden inte bero på förlust av celler, utan i stället på förändringar i cellrelationer. Här tillhandahålls en metod för att samla hela smaklökar för att uppnå fördelarna med absoluta mätningar för raffinering av volymanalyser för både smaklökar och deras innervationer, smakcellsräkningar och former, och för att underlätta analyser av transdukterande cellrelationer och nerv-arbor morfologier. Två arbetsflöden presenteras också nedströms denna nya fullmonteringsmetod för vävnadsberedning: 1) för att analysera smaklökvolym och total innervation och 2) för glescellig genetisk märkning av smakneuroner (med undergrupper av smaktransdukterande celler märkta) och efterföljande analyser av smaknerv-morfologi, antal smakcellstyper och deras former samt användning av bildanalysprogramvara för att analysera de fysiska relationerna mellan transledande celler och de mellan translederande celler och de mellan translederande celler. celler och deras nervceller. Tillsammans ger dessa arbetsflöden ett nytt tillvägagångssätt för vävnadsberedning och för analyser av hela smaklökar och den fullständiga morfologin hos deras innervating arbors.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla djur togs om hand i enlighet med riktlinjerna i U.S. Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory Animals och NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Phox2b-Cre möss (MMRRC stam 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) eller TrkBCreER möss (Ntrk2tm3.1 (cre/ERT2)Ddg) föddes med tdTomato reporter möss (Ai14). AdvillinCreER47 föddes med Phox2b-flpo48 och Ai65. För 5-etynyl-2′-deoxyuridin (EdU) injektioner, EdU förbereddes och doser beräknas enligt Perea-Martinez et al.49.

1. Beredning av material

  1. Utarbetande av lösningar
    1. Lös upp 5,244 g monobasiskt natriumfosfat och 23 004 g dibasiskt natriumfosfat i dubbeldestillerat vatten (ddH2O) på en omrörningsplatta. Justera pH-värdet till 7,4 och få den totala volymen att erhålla 1 L 0,2 M natriumfosfatbuffert (PB).
    2. Lös upp paraformaldehyd i ddH2O i en rökhuv genom uppvärmning under omrörning på en omrörningsplatta tills lösningen når 90 °C. Tillsätt 4 M NaOH-lösningen droppvis för att rensa paraformaldehyden och filtrera lösningen med en vakuum Erlenmeyerkolv och keramiskt filter med filterpapper. Tillsätt en lika stor volym på 0,2 M PB och justera pH-värdet till 7,4 för att erhålla 4 % PFA i 0,1 M PB.

2. Vävnadsberedning

  1. Insamling av vävnader
    1. Offra möss som använder en bedövningsöverdos med en arbetslösning som innehåller 10 ml steril saltlösning och 0,25 ml av en stamlösning som innehåller 5 g 2,2,2-tribromoetanol och 5 ml tert-amylalkohol. Perfusera transkardikat med 4% PFA i 0,1 M PB; ta bort tungorna och gommen.
    2. Isolera de omkretsala smaklökarna med hjälp av ett koronalsnitt som skiljer den bakre tungan, bakom den intermolära eminensen; skär av smaklökarna med ett rakblad; och sedan bisect den främre tungan vid mittlinjen. Efterfixa över natten vid 4 °C med 4% PFA i 0,1 M PB.
    3. Kryoskydd vävnaden i 30% sackaros över natten vid 4 °C.
      OBS: Vävnaden kan frysas i optimal skärtemperatur (OCT) förening med 2-metylbutan kyls i en bägare på torris och lagras vid -80 °C om proceduren måste pausas här.
  2. Fungiforma smaklökar
    1. Kyl 2-metylbutan i en bägare på torris inför steg 2.2.8.
    2. Tina och skölj tungan i 0,1 M PB. Placera ena halvan av den främre tungan som innehåller fungiformen papiller på en glasrutschbana under ett dissekerande mikroskop.
    3. Använd trubbiga tångar och dissekeringssaxar för att ta bort muskeln. Använd trubbiga tångar för att hålla vävnaden öppen när det linguala epitelet är krökt och säkerställ en platt orientering genom att hålla bladen på den grova dissekeringssaxen parallella med epitelet.
    4. Kassera tungans ventrala icke-keratiniserade epitel eftersom det inte innehåller några smaklökar.
    5. Använd fin dissekeringssax för närmare dissekering på undersidan av det keratiniserade epitelet.
      OBS: Det är viktigt att dissekera nära epitelet så att den återstående muskeln är av enhetlig tjocklek och ytan är jämn för att säkerställa enhetlig antikroppsinträngning. Konsekvensen av den icke-enhetliga tjockleken på den återstående muskeln kommer att vara ojämn sektion på kryostaten, med exponering av epitel i områden med mindre muskler och ett tjockare muskelskikt för andra områden, vilket hindrar antikroppsinträngning.
    6. Använd de trubbiga tångarna för att lägga en bit epitel i en vävnadsform (muskelsidan ner) och se till att den ligger platt. När vävnaden är platt, tillsätt en droppe OCT till vävnaden.
      OBS: Med tanke på att tungans spets är böjd kan det vara nödvändigt att göra ett snitt i epitelet där det är krökt så att vävnaden kan göras för att ligga platt.
    7. Placera vävnadsformen på en metallbas (tidigare kyld i torris) under dissekeringsområdet. Fortsätt att knacka lätt på vävnaden med tången tills oct har frusit för att säkerställa att vävnaden fryser så platt som möjligt.
    8. När oct har frusit, tillsätt snabbt ytterligare OKT och placera formen i en bägare av 2-metylbutan (kyls i torr is) tills den är frusen.
    9. Cryostat-sektionering
      OBS: Kryostaten används för fin avlägsnande av återstående subkutan vävnad, vilket kan hämma antikroppsinträngning(figur 1).
      1. Montera OCT-formarna på kryostaten och skär 20 μm sektioner. Samla varje sektion och se den under ljusmikroskopet för att bedöma dess närhet till epitelets botten (figur 1E - H).
      2. När vävnaden har rakats från undersidan av epitelet, tina epitelet och skölj det två gånger i 0,1 M PB på en shaker.
  3. Cirkumvallat smaklökar
    1. Använd ett koronalsnitt med ett rakblad, separera cirkumvallatpapilen från den främre tungan. Använd två parasagittala snitt med samma rakblad för att avlägsna vävnaden lateralt till papillan under ett dissekerande scope. Placera papillan i en vävnadsform med tång så att en sidokant av cirkumvalent papillan vetter mot botten av vävnadsformen.
      OBS: Vävnaden kan frysas i OKT med 2-metylbutan kyls i en bägare på torris och lagras vid -80 °C om proceduren måste pausas här.
    2. Skär vävnaden i 90 μm flytande sektioner på kryostaten.
  4. Smaklökar på gommen
    1. Skär den hårda gommen i främre delen av korsningen av den mjuka och hårda gommen (figur 2). Använd sax för att separera den mjuka gommen från den underliggande vävnaden och se till att eventuella återstående benfragment skärs bort. Ta bort ytterligare muskler och bindväv.
      OBS: När den har avlägsnats kommer all vävnad som återstår att bestå av körtlar och lös bindväv, som lätt fästs vid undersidan av gommen.
    2. Håll gommen med trubbiga tångar och ta bort de återstående körtlarna och lös bindväv genom att försiktigt skrapa dem med ett rakblad.
      OBS: Vävnaden kan frysas i OKT med 2-metylbutan kyls i en bägare på torris och lagras vid -80 °C om proceduren måste pausas här.

3. Immunohistokemi färgning

  1. Tvätta vävnaderna med 0,1 M PB, 3 x 15 min. Placera vävnaderna i 1 mL-rör med blockeringslösning (3% åsneserum, 0,5% icke-joniskt tensid (se materialtabellen),0,1 M PB) vid 4 °C över natten.
  2. Ta bort blockeringslösningen och inkubera vävnaden i primär antikropp (kanin anti-PCLβ2) i antikroppslösning (0, 1 M PB, 0, 5% icke-joniskt tensid) i 5 dagar vid 4 °C.
  3. Tvätta med 0,1 M PB, 4 x 15 min varje tvätt och inkubera i sekundär åsneanti-kanin 488 antikropp (1:500) i antikroppslösning i 2 dagar vid 4 °C.
  4. Tvätta med 0,1 M PB, 4 x 15 min varje tvätt och blockera med 5% normalt kaninserum i antikroppslösning.
  5. Tvätta med 0,1 M PB, 4 x 15 min. Inkubera med åsne antikaninblockerande antikropp (20 μg/ml) i antikroppslösning i 2 dagar vid 4 °C.
  6. Tvätta med 0,1 M PB, 4 x 15 min varje tvätt och inkubera sedan med primär antikroppsdred (kanin) konjugerad till en fluorescerande etikett (enligt tillverkarens instruktioner) i en antikroppslösning i 5 dagar vid 4 °C.
  7. Tvätta med 0,1 M PB, 4 x 15 min varje tvätt och inkubera sedan med primär antikropp (getskydd-Car4 (1:500)) i antikroppslösning i 5 dagar vid 4 °C.
  8. Tvätta med 0,1 M PB, 4 x 15 min varje tvätt. Inkubera med sekundär åsne anti-get 647 antikropp (1:500) i antikroppslösning i 2 dagar vid 4 °C.
  9. Tvätta med 0,1 M PB, 4 x 15 min varje tvätt och montera (epitelsidan uppåt) i vattenhaltiga monteringsmedier och placera ett täckskydd över vävnadssektionen.
    OBS: Om du använder antikroppar från olika arter, som i fallet med keratin-8 och dsRed, tillsätt alla primära antikroppar till antikroppslösningen i steg 3.2 och alla sekundära antikroppar i steg 3.3 innan du fortsätter till steg 3.9.

4. Konfokal avbildning och dekonvolution

  1. Fånga konfokala bilder med ett konfokalt mikroskop med ett 60x-mål (Numerisk bländare= 1,40), 4 ms/pixel, zoom på 3, Kalman på 2 och storlek 1024 x 1024. Välj en stegstorlek på 0,47 mm längs z-axeln. För att fånga innervation till papillan, använd en zoom på 2,5 om synfältet med en zoom på 3 är för smalt för att fånga all innervation till papillan.
  2. Observera att vissa inställningar automatiskt importeras med bilden om du vill dekonverta bilderna. Fyll därför i de återstående detaljerna för modalitet, objektivlins, numerisk bländare, nedsänkningsmedium, provmedium och fluoroforer som fångats i bilden. Välj sedan 3D-dekonvolution.

5. Bildanalys

  1. Smaklök och innervationsvolym
    1. Importera dekonvoluterade bildstaplar till en pixelbaserad bildanalysprogramvara (se tabellen över material) för att bestämma smaklökens volym och volym av total innervation i smaklöken.
      1. Avmarkera volym på huvudobjektmenyn.
      2. Välj Lägg till nya ytor på Objekt-menyn. Välj Hoppa över automatisk skapande, redigera manuelltoch välj sedan Kontur.
      3. Klicka på Välj och observera pilen som visas som ett + för att hjälpa till att spåra smaklökkantens kant. Flytta utsnittet och skissera smaklök i varje optisk sektion. När konturerna är klara klickar du på Skapa yta.
      4. Observera volymobjektet taste-bud som nu visas på huvudmenyn Objekt. Leta reda på smaklökvolymen under Verktyg.
    2. Volym av innervation i smaklök
      1. Markera pennikonen under smakknoppobjektet och välj sedan Maskera alla.
      2. I rullgardinsmenyn väljer du den fluorescerande kanal som motsvarar nervfiberetiketten. Kontrollera Skapa duplicerad kanal.
      3. Markera Ange voxels utanför ytan till:och skriv 0 i rutan.
      4. Observera den nya kanalen som visas i fönstret Displayjustering, som är en oförändrad dubblett av den fluorescerande kanal som valts i smaklök.
      5. Välj Skapa ny surfacepå huvudmenyn Objekt . Avmarkera Hoppa över automatisk skapande, redigera manuellt.
      6. Klicka två gånger på den blå pilen för att gå vidare till nästa steg.
      7. Klicka på Delete, klicka sedan på den gröna dubbelpilen för att slutföra ytan, som representerar volymen av nervfibrerna som finns i smaklök. Om du vill hitta värdet för volymen väljer du Verktyg under menyn nervfiberobjekt och väljer Volym på den nedrullningsbara menyn.
    3. Volym av innervation till papillan
      1. Skapa en volym av smaklök enligt beskrivningen i avsnitt 5.1.
      2. Markera pennikonen under smaklödobjektet och välj sedan Maskera alla.
      3. I rullgardinsmenyn väljer du den fluorescerande kanal som motsvarar nervfiberetiketten. Kontrollera Skapa duplicerad kanal.
      4. Markera Ställ in voxels inuti ytan på: och skriv 0 i rutan. Klicka på OK.
      5. Generera en yta genom att klicka på Lägg till ny yta. Välj segment endast en intresseregion.
      6. Klicka på den blå pilenoch öka Z-värdet så att intresseområdet börjar vid basen av smaklöken.
      7. Klicka två gånger på den blå pilen för att gå vidare till nästa steg.
      8. Klicka på Delete, klicka sedan på den gröna dubbelpilen för att slutföra ytan, som representerar volymen av innervationen till papillan. Om du vill hitta värdet för volymen väljer du Verktyg under menyn nervfiberobjekt och väljer Volym på den nedrullningsbara menyn.
    4. Terminal arbor kontaktanalys
      1. Bildförberedelse
        1. Gå till Redigera-menyn och välj Beskär 3D. Beskär bilden på alla sidor och ta bort utrymme utanför smaklök.
          OBS: Beskär så nära smaklök utan att ta bort någon relevant struktur - någon överflödig bild kommer att förlänga bearbetningstiden.
        2. Välj Redigera på huvudmenyn och klicka på Ändra datatyp. Välj Till: 32-bitars flottör på rullgardinsmenyn.
        3. Välj Lägg till nya ytor på Objekt-menyn. Klicka på Hoppa över automatisk skapande, redigera manuellt, välj Konturoch dra sedan segmentpositionen åt höger för att hitta det totala antalet optiska segment.
        4. Generera isometriska voxels och se till att voxels i stället för att voxels är rektanglar (0,0691 x 0,0691 x 0,474) som XxYxZ, respektive, voxels är 0,0691 x 0,0691 x 0,0691 genom att dela rektanglar i kuber med identiska värden för fluorescensintensitet som den ursprungliga rektangulära voxeln. Välj Bildegenskaper. Dividera sedan Z-värdet för Voxel-storlek med X- eller Y-värdet (= 0,474/0,0691) och multiplicera det värdet med antalet segment (optiska sektioner) som hittades i föregående steg.
        5. Gå tillbaka till Redigera på huvudmenyn och välj Sampla 3D.
        6. Ersätt Z-värdet (antal segment) med det nyligen beräknade värdet.
      2. Skapa automatiska ytor baserade på fluorescens
        1. Klicka på Lägg till ny yta igen för att lägga till en ny yta, avmarkera Segmentera endast ett område av intresseoch klicka på Nästa.
        2. Välj kanal för en av de smaktransdukterande celltyperna på listrutan Källaskanal. Avmarkera Utjämna och fortsätt till nästa steg.
        3. Ändra inte något på nästa skärm som visar omfattningen av fluorescerande intensiteter som finns i bilden. Klicka på den blå pilen längst ner igen för att gå vidare till nästa steg.
        4. Klicka på Delete, klicka sedan på den gröna dubbelpilen för att slutföra ytan.
        5. Gå till objektmenyn till vänster på skärmen där den färdiga cellytan visas och kommer att kallas något generiskt som Surface 2. Dubbelklicka på ytnamnet för att namnge det enligt vad etiketten representerar.
          OBS: I detta fall är den genererade ytan baserad på den PLCß2-märkta cellen.
        6. Om det finns punkter i stället för en yta klickar du på Surface i stället för Mittpunktunder menyn i det nedre vänstra hörnet. Klicka sedan på OK när du uppmanas att göra det.
        7. Upprepa steg 5.3.2.1-5.3.2.5 för andra smaktransdukterande cellmarkörer och nervfibermarkören.
        8. Spara (exportera) förloppet.
        9. Klicka på en celltyp Surface på huvudmenyn. Klicka på Verktygpå objektets meny och klicka sedan på Avståndsomvandling.
        10. Vänta tills en popup-ruta med titeln XTDistanceTransformation visas. Välj Utanför Surface-objekt. Anteckna den nya kanalen som visas på menyn Displayjustering med namnet Avstånd till ytnamn.
        11. Välj nervfiberytan på objektmenyn. Klicka på pennikonen och sedan Maskera alla.
        12. Välj den nya kanalen Avstånd till ytnamnpå den nedrullningsbara menyn som visas . Anteckna den nya kanalen som visas i fönstret Displayjustering med namnet Maskerat avstånd till ytnamn.
        13. Skapa ett nytt objekt med huvudobjektmenyn. Avmarkera Segmentet endast en region av intresse och klicka på den blå pilen. Välj maskerat avstånd till PLCß2-kanal och avmarkera Smooth.
        14. På nästa skärm kontrollerar du om det finns några regioner där de smaktransdukterande cellerna ligger inom det minsta avståndet från de nervfibrer som kan urskiljas av denna programvara. För att göra detta, ställ in en gräns på 0,01-0,11 μm för att kontrollera om det finns någon receptorcellfluorescens så nära nervfibrerna.
        15. Skriv 0.01 i den gröna rutan till vänster om du vill ange det nedre tröskelvärdet genom att trycka på Tabb. Klicka sedan på den röda knappen och skriv 0.11 för att ställa in det övre tröskelvärdet. Tryck på Tabb och klicka sedan på den blå pilen längst ner för att gå vidare till nästa steg.
        16. Klicka på Delete och sedan den gröna dubbelpilen för att avsluta.
        17. Byt namn på den här ytan Inom 0.01-0.11 från PLCß2 på Objektmenyn. Välj Inom 0,01 - 0,11 på PLCß2-ytan på Objektmenyn.
        18. Välj pennan och klicka sedan på Maskera alla. Välj den röda (nervfiber) kanalen på den nedrullningsbara menyn och klicka på OK. Anteckna den nya kanalen som visas i fönstret Displayjustering som kallas Maskerad CHS2.
        19. Klicka på kanalens namn; byt namn på kanalen Inom 0.01 - 0.11 av PLCß2.
          OBS: Detta är en fluorescerande kanal som representerar en kopia av den röda fluorescerande kanalen som finns i den skapade ytan.
        20. Klicka på vitt i mitten av färgväljaren. Välj en färg som kontrasterar mot färgerna på strukturerna.
        21. Exportera (dvs. spara) filen i det här skedet.
        22. Upprepa steg 5.4.2.9-5.4.2.21 för andra smaktransdukterande cellmarkörer.
        23. Exportera (dvs. spara) filen i det här skedet.
          OBS: För att analysera närheten till en märkt celltyp till en annan, byt helt enkelt ut nervfiberytan i steg 5.4.2.11 (och följande steg) med föremålet för intresse och motsvarande komponenter som hänför sig till varje efterföljande steg.

6. Neuron arbor rekonstruktion och absolut cellnummer kvantifiering

  1. Terminal arbor spårning och analys
    1. Öppna den dekonvoluterade bildfilen i en 3D-vektorbaserad bildanalysprogramvara (se tabellen över material),välj Spåra, klicka på Neuronoch klicka sedan på Dendrite.
    2. Rulla till basen av smaklök i bildstapeln. Spåra varje fiber till slutet medan du bläddrar igenom bildstacken.
    3. När du är i grenänden högerklickar du på slutet och väljer Slut. Högerklicka på och välj Bifurcating Nodevid grenpunkter.
      OBS: Detta gör det möjligt att spåra en gren till slutet och sedan återgå till bifurcating-punkten och spåra den andra grenen med programmet som erkänner att denna spårning fortfarande är av samma neuron.
    4. Spara datafilen som en . DAT-fil, som sedan kan öppnas för analys i 3D-vektorbaserad bildanalysprogramvara.

7. Kvantifiering av cellnummer

  1. Kvantifiera de märkta smakknoppcellerna i alla bildanalysprogrampaket så länge distinkta markörer för transdukterande celltyper som är förankrade i z-positionen kan placeras på kärnnivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Färgning av det linguala epitelet med antikroppar mot dsRed och keratin-8 (en allmän smak-knoppmarkör) märkt både hela smaklökar och all smak-knopp innervation i Phox2b-Cre:tdTomato möss50,51 (Figur 3A). Att avbilda dessa smaklökar från porerna till baserna gav den högsta upplösningen x-y planbilder (figur 3A, B). Konturfunktionen hos det pixelbaserade bildprogrammet användes för att beskriva smaklökernas periferi i varje avsnitt (figur 3B) och sedan generera en yta (figur 3C) som representerade smaklökvolymen. Maskering (eller duplicering) fluorescensen i samband med smaklökens etikett endast inom ytan skapade en ny kanal som endast innehöll denna fluorescens och eliminerade eventuella papillafärgning som dolde smaklöken (figur 3D). Nervfiberfluorescensen i smaklöken maskerades (figur 3E) och användes för att automatiskt skapa en yta som representerar volymen av innervation i den (figur 3F). Ett liknande tillvägagångssätt användes också för att mäta smak-knoppvolym och dess tillhörande innervation i omkrets smaklökar (figur 3G). Representativa mätdata visade inga korrelationer mellan smak-knoppvolymer och innervationsvolymer i vare sig fungiformen (p = 0,115) eller omkrets(p = 0,090) mätregioner(figur 3H).

Administrering av en låg dos tamoxifen hos TrkBCreER:tdTomato möss orsakar genrekombination och märkning av ett litet antal nervceller så att smaklökarna innervattas med noll till några märkta terminal arbors (den neuronala delen i smaklöken). Det linguala epitelet färgades med hjälp av en anti-dsRed antikropp för terminal arbors och anti-Car4 (sur) och anti-PLCβ2 (söt, bitter och umami) antikroppar för de smaktransdukterande cellerna (figur 4A). Ett vektorbaserat bildanalysprogram användes för att spåra de märkta terminal arbors (figur 4B). De ortogonala höjderna hos arbors som är associerade med de blå och gröna spårningarna var 33,4 μm (figur 4C) respektive 32,4 μm (figur 4D). 3D Convex Hull mätningarna (dvs. omfattningen av terminal arbor i smaklök) för den blå terminal arbor var 644,0 μm3 och 3647,0 μm3 för den gröna arbor. Dendrogrammet för den gröna spårningen visas i figur 4E med grenlängder uppmätta i mikron. Den gröna arboren hade sju grenändar och en total längd på 183,4 μm. Kvantifiering av det absoluta antalet PLCβ2+ och Car4 + celler visade att denna smaklök hade 17 PLCβ2 + celler och två Car4 + celler. Med hjälp av cellpixelbaserad bildbehandlingsprogram för att bestämma den närmaste närheten mellan nervfibrer och smaktransdukterande celler visade att av totalt 19 smaktransdukterande celler i smaklök var den blå terminal arbor (visas i rött i figur 4F, G) inom 200 nm (upplösningen av ljusmikroskopet) i den ljusblå Car4 + -cellen (vita områden som anges av pilar i figur 4G). Den terminal arbor som är associerad med den gröna spårningen visas i magenta (figur 4F och figur 4H) och ligger inom 200 nm av både de ljusblå och mörkblå Car4 + -cellerna (vita områden i figur 4H). Som nästa närmaste cell till dessa arbors var mer än 200 nm bort, fanns det en omärkt voxel som skiljer de två strukturerna.

Dela stamceller märktes med injektioner av EdU på dag 0, 1 och 3, och vävnader samlades in på dag 4. Helmonterade keratin-8 och EdU färgning av fungiform smaklökar visade att EdU-märkta celler fanns både inom och utanför smaklökarna (figur 5A-C). Enskilda EdU+/keratin-8+ celler (kricka och gul) och EdU+/keratin-8- kärnor (lila och magenta) var segmenterade(figur 5B, C). Den mörkblå cellen visas var keratin-8 + och hade en långsträckt form överensstämmer med mogna smak-givaren celler. Dessa ytor visas med smaklök orienterad från por till bas (figur 5B) och längs smaklökarnas långa axel (figur 5C). Varje struktur kan ses i enskilda optiska skivor genom att maskera fluorescensen inom varje struktur (figur 5D-F). Magenta och lila kärnor är utanför keratin-8 + gränsen för smaklök som indikeras av den vit prickade konturen (figur 5D, E). De gula, kricka och blå cellerna fanns i smaklök (figur 5D-F). Enskilda smaktransdukterande celler kan rekonstrueras med hjälp av pixelbaserad bildbehandlingsprogram med antingen Car4-märkning(figur 6A-C) eller PLCβ2-märkning (figur 6D-F). En pixelbaserad bildbehandlingsprogramvara användes för att mäta den närmaste närheten mellan celler visade att en Car4 + cell (samma cell som visas i figur 6B) var inom 200 nm av en enda PLCβ2 + cell (figur 6G, grön). Området där cellerna var inom 200 nm från varandra visas i vitt (figur 6G) och indikeras av vita pilar. Nästa närmaste cell var mer än 200 nm bort och visas i gult i figur 6H,I i två olika riktningar. Figur 7 visar isoleringen och analysen av den inrevation som slutar i papillan (men utanför smaklöken) och innehåller dess fördelning runt smaklöken och dess avstånd från epitelet.

Figure 1
Figur 1: Beredning av lingual epitel för fungiform smaklökfärgning. (A) Vy av den skurna tungan med epitel och muskel märkt före eventuell dissekering. (B) När tillräckligt med muskler har tagits bort finns det bara en liten mängd återstående muskler på undersidan av epitelet. Förutom att utvärdera utvecklingen av dissekeringen genom att titta på epitelets skurna sida,c) lägga epitel platt på en glasrutschbana under dissekeringsområdet avslöjar att vissa delar av vävnaden är jämnt genomskinliga (lila rektangel); tillräckligt med muskler har tagits bort från detta område. Däremot indikerar de lila pilarna regioner till vänster där det finns mer muskler som behöver tas bort. När hela undersidan av epitelet liknar området i den lila rektangeln, fortsätt till nästa steg. (D) Efter att delar av epitelet har frusits med muskelsidan nedåt, avlägsnas ytterligare muskler och laminapropria som tunna sektioner med kryostaten. När sektionering är klar är det återstående epitelet tunt och genomskinligt. (E-F) Seriella sektioner (20 μm) samlades på en glasrutschbana, och varje sektion sågs under ett fluorescerande mikroskop innan nästa sektion klipptes. Väl under epitelet är muskelfibrer orienterade i flera riktningar så att muskelfibrer finns både i tvärsnitt och längs muskelfibern (E, röd rektangel). De seriella sektionerna i E-F visar övergången från muskelfibrer orienterade i flera riktningar(E, röd rektangel) till muskelfibrer som är orienterade mestadels i en riktning (F, röd rektangel), vilket indikerar muskel-lamina propria gränsen. En annan region i samma vävnad (gula rektanglar) visar att när muskelfibrerna är orienterade i en riktning, kommer nästa avsnitt sannolikt att ge bindväv eftersom alla muskler har tagits bort från den regionen. De blå rektanglarna representerar båda undersidan av epitelet. Om smaklökar finns på sektionen (G, röda pilar), har för mycket vävnad tagits bort. Helst är sektioneringen komplett när undersidan av epitel (men inga smaklökar) är synlig i de borttagna sektionerna (F, gul rektangel). Även om områden med muskelfibrer orienterade i samma riktning (E, gul rektangel och F, röd rektangel) också är lämpliga för sektionering, bör områden där muskelfibrerna är orienterade i flera riktningar(E, röd rektangel) undvikas. ( G) När sektionerna innehåller undersidan av epitel/lamina propria är det endast möjligt att skära några ytterligare sektioner innan för mycket av epitel har tagits bort och sektionerna innehåller smaklökar. (H) Det vanligaste misstaget avslöjas av kryostatsektioner där epitel ses vid vävnadens kant, muskler ses inuti epitelet och OTC/ gles muskel finns i mitten. Detta beror oftast på att inte lägga vävnaden platt på botten av vävnadsformen innan du fryser eller otillräcklig utplatta med trubbiga tångar. Skalningsstänger i A-C = 1 mm; skalstänger i E, F, H = 100 μm; skalstång i G = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Dissekering av gom för färgning. (A) Gommen dissekerades först med tunn bladsax för att skära den hårda gommen,( B) och sedan använda samma sax för att separera den mjuka gommen från den underliggande bindväven. Efter att ha tagit bort vävnaden från munhålan avlägsnades eventuell återstående vävnad med saxen. Vid denna tidpunkt är allt som kan förbli körtlar på baksidan av den mjuka gommen. En rakblad användes för att försiktigt skrapa bort dessa körtlar. Den (C) bakre och (D)epitelytan för den färdiga dissekeringen av gommen visas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Mätvolymen i helmonterade smaklökar. (A) Helmonterade smaklökar avbildades från smakporen till smaklökbasen så att planet med högsta upplösning är x-y-planet. Varje optisk sektor sågs i pixel-baserade bildanalys programvara, och kontur funktionen användes för att manuellt beskriva periferin av smak knopp färgade med keratin-8. (B) Ett exempel på en optisk sektor tillhandahålls. c)Placeringen av detta representativa avsnitt längs smaklökernas långa axel visas med den gula linjen. Efter att varje optisk sektion skisserats skapades en yta som representerar volymen på smaklök (vit). Maskering eller duplicering av den fluorescerande kanalen som motsvarar smaklöken (keratin-8 i D) eller den tdTomato-märkta innervationen (pseudofärgad blå i E) i volymen som representerar smaklöken. Fluorescensen i smaklök i (E) användes för att generera en yta som representerar volymen av innervation i smaklök (F, blå). g)Ett liknande tillvägagångssätt tillämpades på helmonterade omkrets smaklökar avbildade i samma riktning som den fungiforma smaklök i A. (H)Mätningen av volymen av fungiforma och cirkumvalenta smaklökar och deras respektive volym av innervation visade att det inte finns något samband mellan smaklöken och innervationsvolymen för smaklökar som provtagits för någon av regionerna. Skalningsstaplar i A-D, F = 4 μm; skalstång i G = 5 μm. Denna siffra har ändrats från Ohman-Gault et al.50. Förkortningar: FF = fungiform; CV = omkrets. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativa terminal arbors i fungiform smaklökar med hjälp av sparse cellgenetisk märkning. (A) Helmonterad smaklök fläckad med smaktransdukterande cellmarkörer Car4 (vit) och PLCβ2 (grön). (B) Denna smaklök har två märkta terminal arbors, som visas med smaklök borttagen efter rekonstruerande fibrerna. (C) Den blå arbor har 6 grenändar och en ortogonal höjd i smaklök på 33,4 μm och (D) den gröna arboren har 7 grenändar. (E) Dendrogrammet som motsvarar den gröna arboren är försett med varje segmentlängd i mikrometer. (F-H) Avståndet mellan strukturerna mättes. (F-G) Den blå spårningen i C var segmenterad och visas i rött. ( G) De områden där denna terminal arbor ligger inom 200 nm från den ljusblå Car4 + cellen indikeras av vita pilar. (F, H) Terminal arbor representeras av den gröna rekonstruktionen visas i magenta. (H) Magenta arbor (associerad med den gröna spårningen i 4B, D) ligger inom 200 nm av både de mörkblå och ljusblå Car4 +-cellerna. Skalstång i A, B = 4 μm; skalstaplar i F-H = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Helfästen kan användas för att spåra inkorporering av nya smakknoppceller. Möss injicerades med EdU för att märka dela stamceller på dag 0, 1 och 3 och offrades på dag 4. (A, B) Celler märkta med EdU (grön) kan identifieras både runt och inom smaklök, som är märkt med keratin-8 (A, vit, B, grå). (B, C) Enskilda EdU-märkta, keratin-8+ celler inuti smaklök och keratin-8-, EdU-märkta kärnor är segmenterade utanför smaklök. (D-F) Fluorescensen inom varje struktur segmenterad i A-B maskerades och kan ses i tvärsnitt. Smaklökarnas omkrets är skisserad med en vit prickad linje (D-F). (D) Den gula cellen finns i smaklök och är både EdU-märkt och keratin-8+. Magentakärnan är utanför smaklök och är keratin-8-. (E) Krickacellen finns inuti smaklök och både EdU-märkt och keratin-8+. Den lila EdU-märkta kärnan är keratin-8- och utanför smaklök (vit pil). (F) Den blå cellen är keratin-8+ och långsträckt, i överensstämmelse med mogna smaktransdukterande celler. Skalningsstaplar i A-C =3 μm; skalstänger i D = 2 μm; skalstänger i E, F = 4 μm. Förkortning: EdU = 5-etynyl-2′-deoxyuridin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Former av hela smakknoppceller kan analyseras tillsammans med deras relationer med andra smakknoppceller. (A-F). Segmentering av enskilda smakknoppceller för att skapa ytor isolerar enskilda smakknoppceller, vilket underlättar tydlig visualisering. Enskilda (A-C) Car4+ och (D-F) PLCβ2 + celler visar variationen i enskilda cellformer. ( G) Den närmaste PLCβ2+-cellen till Car4+-cellen i B bedömdes ligga inom 200 nm (på en enda liten plats på 0,5 μm2 som indikeras med pil). Nästa närmaste cell var större än 300 nm bort och kan särskiljas som en separat struktur från den segmenterade Car4 + cellen. (H, I) Nästa närmaste cell var segmenterad; och den maskerade fluorescensen visas i gult. De tre närmaste punkterna för nästa närmaste cell (gul) indikeras med pilspetsar i H, I. Skalningsstaplar i A-C = 3 μm; skalstänger i D, E = 4 μm; skalstång i F = 2 μm; skalstänger i G-I = 3 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Kvantifiering av innervation till papillan. (A) Vissa etiketter för smakneuroner märker också innervation till papillan. B) Innervationen i smaklöken separeras från insidan utanför smaklöken genom att smaklöken (enligt beskrivningen för figur 3),c) maskerar innervationen inuti smaklöken (röd) och sedan maskerar innervationen utanför smaklöken endast (mörkblå). Volymen av innervation till smaklök (röd) var 1649,6 μm3. Innervationen utanför smaklöken kommer att innehålla smakfibrer under papillan som inte bör ingå i kvantifieringen av innervationen till papillan. (D) Fluorescensen av innervationen till papillan var maskerad (ljusblå). Volymen av innervation till papilla var 121,8 μm3. Skalningsstänger i A-D = 4 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utvecklingen av ett tillvägagångssätt för att konsekvent samla och fläcka hela smaklökar från tre munhålan smakregioner (fungiform, omkrets och gommen) ger betydande förbättringar för att analysera smaktransdukterande celler, spåra nykorporerade celler, innervation och relationer mellan dessa strukturer. Dessutom underlättar det lokalisering av en potentiell sekundär neuronmarkör både inom eller utanför en märkt befolkning50. Detta är särskilt relevant med tanke på att gustatory papillae också får robust somatosensory innervation52,53, som också kan märka vissa smakneuroner. Papillerna som rymmer smaklökar kan också avbildas med en lägre förstoring. Detta möjliggör visualisering av innervationen till hela papillan, liksom till smaklökarna, och möjliggör oberoende analyser av innervationen som tränger in i smaklöken och de omgivande nervfibrerna.

Somatosensory nervändelser i huden kan särskiljas baserat på deras organisation runt hårsäckar och deras relationer till andra komponenter i epitelet; parallella analyser i gustatory papiller kan ge liknande karakteriseringar54,55. Upprättandet av en normal grund för relationerna inom och sammansättningen av smaklökar och papiller kommer att fungera som en baslinje för att bestämma mekanismerna bakom underskott i perifera smakfunktioner56,57. Smaklök är ett dynamiskt sensoriskt ändorgan där cellomsättning och terminal arbor remodeling samordnas av en mängd olika faktorer58. Undersökningar av de potentiella kretsarna inom smaklök59, sjukdomsprocesser57, och kemoterapier som stör normal smakfunktion58 kan förbättras med denna metod, som upprätthåller hela smaklökar och nervfibrer intakta. Hela monteringsmetoden som beskrivs här både utökar möjligheterna till analys och förfinar de mätningar som är möjliga.

Med tanke på att tungan är en tät och heterogen vävnad, och att smaklök själv innehåller många cell-till-cell-korsningar som begränsar permeabilitet27, presenterade utvecklingen av ett tillvägagångssätt för att åstadkomma hela monteringsfärgning av smaklökar en betydande utmaning. Tidigare metoder omfattade att ta representativa avsnitt60 eller skära tjockare sektioner, som sedan begränsade antikroppspenetration32,33,34. Dessutom partiskade valet av hela smaklökar från dessa tjockare sektioner data mot mindre smaklökar. Alternativt kommer peeling av epitel sannolikt att störa smaklökarvfibrer; Dessa är inte specifikt märkta när detta tillvägagångssätt används39,40. Nerv arbors bildar en stor plexus inom en smaklök26,50,61, så det är oklart om arbor borttagning stör de normala relationerna mellan andra celler i smaklök. Den nuvarande metoden med hela smaklök gör det däremot möjligt att kvantifiera absoluta tal och mätningar. Denna färgning tillåter många transdukterande cellfunktioner (typ, form och plats) och terminal arbors (liksom relationer mellan dem) att bevaras och analyseras.

Det finns flera begränsningar i detta tillvägagångssätt. I synnerhet fungerar vissa antikroppar som har använts i tunna sektioner62 inte i hela fästen, vilket kommer att begränsa de typer av strukturer som kan undersökas. Dessutom, eftersom konfokal mikroskopiupplösning är begränsad, kommer strukturella data som analyseras från enskilda celler och från relationer mellan celler också att begränsas24. Till exempel kan celler bestämmas vara inom 200 nm av varandra, men specialiserade strukturer mellan celler (t.ex. synapser)63 kan inte undersökas. Slutligen kan inte alla celltyper märkas med den här metoden. Det har till exempel visat sig vara svårt att specifikt märka celler som omvandlar salt i detta preparat. Dessa celler kan vara en delmängd av en kombination av typ 1-, typ II- och typ III-celler14,15,16,17,18,19,64. Typ I-celler, som främst stöder celler, kan inte undersökas i helfästen eftersom de verkar lindas runt andra celler, vilket gör dem svåra att skilja som separata enheter65. Att ha en tillförlitlig markör för salttransdukterande celler skulle möjliggöra mer omfattande analyser14,66. På samma sätt, eftersom PLCβ2 färgning representerar smakceller som kan omvandla flera typer av stimuli, en etikett som tillät ytterligare separation av denna celltyp skulle också vara en förbättring.

Följande är viktiga förberedande steg som kräver vård. Se först till att muskelskiktet som förblir efter dissekering är jämnt och så tunt som möjligt. Om detta skikt inte är jämnt kommer antikroppsinträngningen i slutändan inte att vara enhetlig. För det andra är det viktigt att epitelens bitar ligger platt i botten av vävnadsformen före frysning, och att trubbiga tångar används för att lätt trycka på vävnaden tills den är frusen. När den minimala mängden muskler (i ett jämnt lager) förblir på undersidan av epitelet, kommer så få som tre kryostatsektioner att nå undersidan av epitelet. Placering av vävnaden i en kryostat, så att sektioner tas över hela vävnadsytan, resulterar ibland i att delar av vävnaden avlägsnas ojämnt. Av dessa skäl rekommenderas starkt att undvika ytterligare upptining, ytterligare dissekering och återfrysning av vävnaden. I stället bör man vara noga med att utvärdera vävnadsfördissekering innan vävnaden fryses.

Sammantaget kan metoden för hela monteringsvävnadsberedningen som presenteras här användas för att samla hela smaklökar samt den omgivande papillan från tre smakknoppregioner: fungiform, cirkumvallat och gommen. Även om en mängd olika sjukdomsförhållanden56,57 ochkemoterapier 56 är kända för att störa smakfunktionen, är mekanismerna bakom dessa förändringar fortfarande okända. Att använda hela monteringsfärgningsmetoden för smaklökar som presenteras här representerar en robust experimentell design där både smaktransdukterande celler och deras nervfibrer kan märkas för att avgöra om ett underskott beror på förlust av en viss celltyp, komprometterade terminala arbormorfologier, störda relationer mellan smaktransdukterande celler eller störda relationer mellan transledande celler och deras nervceller. Dessutom skulle det vara möjligt att inte bara kvantifiera det absoluta antalet märkta nya celler i smaklökar, utan också att kvantifiera antalet nya smaktransdukterande celler (EdU-märkta) av definierad typ (dvs PLCβ2+ eller Car4+). Huruvida dessa nya celler utvecklar normala former och normalt införlivas i smaklök (dvs. flyttar in i smaklök efter behandling) kan också undersökas. Många av dessa åtgärder, tillsammans med smaklöknummer, kan alla göras av samma vävnad, vilket begränsar antalet olika djur som behövs för ett experiment. Dessa möjligheter skulle kunna underlätta rationaliseringen av experimentella metoder för att tillhandahålla kliniska interventioner för smakunderskott, samt ge insikt i de normala mekanismerna bakom smakfunktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Kavisca Kuruparanantha för hennes bidrag till vävnadsfärgning och avbildning av omkrets smaklökar, Jennifer Xu för färgning och avbildning av innervation till papillan, Kaytee Horn för djurvård och genotypning och Liqun Ma för hennes vävnadsfärgning av mjuksmaksknopparna. Detta projekt stöddes av R21 DC014857 och R01 DC007176 till R.F.K och F31 DC017660 till L.O.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7 (2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, Supplement 1 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444 (1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117 (2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100 (2011).
  48. Hirsch, M. -R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399 (2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5 (2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815 (2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1 (2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, ÉG., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Tags

Neurovetenskap nummer 168 smaklök hela fäste innervation afferent tunga smak
Helmonterad färgning, visualisering och analys av fungiforma, cirkumvallat och smaklökar med gom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohman, L. C., Krimm, R. F.… More

Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter