Summary
Cet article décrit les méthodes de génération, de traitement médicamenteux et d’analyse des explants dérivés du patient pour évaluer les réponses aux médicaments tumoraux dans un système de modèle préclinique vivant, pertinent pour le patient.
Abstract
La compréhension de la résistance aux médicaments et le développement de nouvelles stratégies pour sensibiliser les cancers hautement résistants reposent sur la disponibilité de modèles précliniques appropriés capables de prédire avec précision les réponses des patients. L’un des inconvénients des modèles précliniques existants est l’incapacité de préserver contextuellement le microenvironnement tumoral humain (TME) et de représenter avec précision l’hétérogénéité intratumorale, limitant ainsi la traduction clinique des données. En revanche, en représentant la culture de fragments vivants de tumeurs humaines, la plate-forme d’explant dérivé du patient (PDE) permet d’examiner les réponses médicamenteuses dans un contexte tridimensionnel (3D) qui reflète le plus fidèlement possible les caractéristiques pathologiques et architecturales des tumeurs d’origine. Des rapports antérieurs avec des PDE ont documenté la capacité de la plate-forme à distinguer les tumeurs chimiosisttives des tumeurs chimiorésistantes, et il a été démontré que cette ségrégation est prédictive des réponses des patients aux mêmes chimiothérapies. Simultanément, les PDE permettent d’interroger les caractéristiques moléculaires, génétiques et histologiques des tumeurs qui prédisent les réponses aux médicaments, identifiant ainsi des biomarqueurs pour la stratification des patients ainsi que de nouvelles approches interventionnelles pour sensibiliser les tumeurs résistantes. Cet article décrit en détail la méthodologie pdE, de la collecte d’échantillons de patients à l’analyse des critères d’évaluation. Il fournit une description détaillée des méthodes de dérivation et de culture des explants, en mettant en évidence les conditions sur mesure pour des tumeurs particulières, le cas échéant. Pour l’analyse des critères d’évaluation, l’accent est mis sur l’immunofluorescence multiplexée et l’imagerie multispectrale pour le profilage spatial de biomarqueurs clés dans les régions tumorales et stromales. En combinant ces méthodes, il est possible de générer des données quantitatives et qualitatives sur la réponse aux médicaments qui peuvent être liées à divers paramètres clinicopathologiques et donc potentiellement utilisées pour l’identification de biomarqueurs.
Introduction
Le développement d’agents anticancéreux efficaces et sûrs nécessite des modèles précliniques appropriés qui peuvent également fournir un aperçu des mécanismes d’action qui peuvent faciliter l’identification de biomarqueurs prédictifs et pharmacodynamiques. L’hétérogénéité inter- et intratumorale1,2 ,3,4,5et le TME6,7 ,8,9,10,11,12 sont connus pour influencer les réponses médicamenteuses anticancéreuses, et de nombreux modèles de cancer précliniques existants tels que les lignées cellulaires, les organoïdes et les modèles murins ne sont pas en mesure de s’adapter pleinement à ces facteurs cruciaux. fonctionnalités. Un modèle « idéal » est celui qui peut récapituler les interactions spatiales complexes des cellules malignes avec les cellules non malignes dans les tumeurs ainsi que refléter les différences régionales au sein des tumeurs. Cet article se concentre sur les PDE en tant que plate-forme émergente pouvant répondre à bon nombre de ces exigences13.
Le premier exemple de l’utilisation de PDE humains, également connus sous le nom d’histocultures, remonte à la fin des années 1980 lorsque Hoffman et al. ont généré des tranches de tumeurs humaines fraîchement réséquées et les ont cultivées dans une matrice de collagène14,15. Cela impliquait la mise en place d’un système de culture 3D qui préservait l’architecture tissulaire, assurant le maintien des composants stromaux et des interactions cellulaires au sein du TME. Sans déconstruire la tumeur d’origine, Hoffman et al.16 ont annoncé une nouvelle approche de la recherche translationnelle, et depuis ce temps, de nombreux groupes ont optimisé différentes méthodes d’explant dans le but de préserver l’intégrité des tissus et de générer des données précises sur la réponse aux médicaments17,18 , 19, 20,21,22,23,24 , bien que certaines différences entre les protocoles soient évidentes. Butler et al. ont cultivé des explants dans des éponges de gélatine pour aider à la diffusion des nutriments et des médicaments à travers le spécimen20,21,25, tandis que Majumder et al. ont créé un écosystème tumoral en cultivant des explants sur une matrice composée de protéines tumorales et stromales en présence de sérum autologue dérivé du même patient22, 23.
Plus récemment, notre groupe a mis en place un protocole par lequel les explants sont générés par fragmentation des tumeurs en morceaux de 2 à 3 mm3qui sont ensuite placés sans composants supplémentaires sur des membranes perméables à l’interface air-liquide d’un système de culture24. Prises ensemble, ces nombreuses études ont démontré que les PDE permettent la culture de fragments intacts et vivants de tumeurs humaines qui conservent l’architecture spatiale et l’hétérogénéité régionale des tumeurs d’origine. Dans les expériences originales, les explants ou les histocultures étaient généralement soumises à une homogénéisation après un traitement médicamenteux, après quoi divers tests de viabilité ont été appliqués aux échantillons homogénéisés tels que le test de réponse au médicament histoculture20,21, le test MTT (bromure de 3-(6)-2,5-diphényltétrazolium), le test de la lactate déshydrogénase ou le test à base de résazurine26,27,28 . Les progrès récents dans les techniques d’analyse des paramètres, en particulier la pathologie numérique, ont maintenant élargi le répertoire des tests et des essais des paramètres qui peuvent être effectués sur les explants29,30. Pour appliquer ces nouvelles technologies, au lieu de l’homogénéisation, les explantes sont fixées dans du formol, incorporées dans de la paraffine (FFPE) puis analysées à l’aide de techniques d’immunocoloration, permettant un profilage spatial. Des exemples de cette approche ont été documentés pour le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), le cancer du sein, le cancer colorectal et les explants de mésothéliome où la coloration immunohistochimique du marqueur de prolifération, Ki67, et du marqueur apoptotique, la poly-ADP ribose polymérase clivée (cPARP), a été utilisée pour surveiller les changements dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire24,31,32,33,34.
L’immunofluorescence multiplexée est particulièrement propice au profilage spatial des réponses médicamenteuses chez les explants au point d’extrémité35. Par exemple, il est possible de mesurer la relocalisation et la distribution spatiale de classes spécifiques de cellules immunitaires, telles que les macrophages ou les lymphocytes T, au sein du TME lorsd’untraitement médicamenteux13,36,37,38, et d’étudier si un agent thérapeutique peut favoriser la transition de la « tumeur froide » à la « tumeur chaude »39 . Au cours des dernières années, ce groupe s’est concentré sur la dérivation des PDE de différents types de tumeurs (CPNPC, cancer du rein, cancer du sein, cancer colorectal, mélanome) et sur le test d’une gamme d’agents anticancéreux, y compris les chimiothérapies, les inhibiteurs de petites molécules et les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (ICO). Les méthodes d’analyse des paramètres ont été optimisées pour inclure l’immunofluorescence multiplexée afin de permettre le profilage spatial des biomarqueurs pour la viabilité ainsi que des biomarqueurs pour différents constituants du TME.
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Protocol
1. Prélèvement de tissus
- Après la chirurgie, transférer les échantillons de tumeurs humaines fraîchement réséqués dans un tube contenant 25 mL de milieu de culture frais (milieu Eagle modifié de Dulbecco complété par 4,5 g / L de glucose et de L-glutamine + 1% (v / v) de sérum de veau fœtal + 1% de pénicilline-streptomycine) et stocké sur de la glace. Traiter l’explantation dans les 2 heures suivant la chirurgie dans une hotte stérile de classe II.
2. Explant préparation
- Nettoyez tout l’équipement chirurgical (lames de greffe/surface de cire dentaire/pinces à épiler) avec une solution d’alcool méthylé industriel (IMS) à 70 %.
- Remplissez un plat de culture de 10 cm (voir la Table des matériaux)avec environ 25 mL de milieu frais et placez-le sur un lit de glace.
- À l’aide d’une pince à épiler, transférer l’échantillon sur une surface de cire dentaire (voir la Table des matériaux)et découper le tissu en fragments d’environ 2 à 3 mm3 à l’aide de deux lames de greffe de peau.
REMARQUE: Pour une meilleure performance, commencez à trancher le tissu pour obtenir une bande individuelle de 2 à 3 mm d’épaisseur, puis coupez la bande le long de la longueur pour obtenir les explants finaux. Répétez le processus jusqu’à ce que l’échantillon entier soit haché. - Transférer rapidement les explants dans le milieu de culture glacé dans le plat de 10 cm. Prendre une proportion des explants (6–9 morceaux), les placer dans un tube de 1 mL contenant 10% de solution de formol non tamponnée et laisser à température ambiante (RT) pendant 24 h.
REMARQUE: Ces fragments représenteront les explants témoins de la condition « non cultivée ». - Remplissez le nombre souhaité de puits de plaques de 6 puits avec 1,5 mL de milieu frais par puits et placez un disque d’insert de culture organotypique (voir la Table des matériaux)dans chaque puits afin qu’il flotte sur le milieu, en évitant soigneusement les bulles d’air à l’interface média-insert.
- Sélectionnez les explants au hasard et placez-les une à la fois sur le disque d’insertion. Pour être cohérent avec la condition « inculte », utilisez 6 à 9 explants par puits. Placer la plaque multipuits dans un incubateur à CO2 à 37 °C et 5 % de CO2, et laisser les explants récupérer pendant 16 h.
REMARQUE: Pour éviter d’écraser le tissu, une manipulation douce de la pince à épiler est fortement recommandée.
3. Traitement de la toxicomanie
- Après 16 h, prendre de nouvelles plaques de 6 puits, ajouter 1,5 mL de milieu frais à chaque puits, ajouter les médicaments pertinents aux concentrations souhaitées et inclure un puits pour le contrôle du véhicule. À l’aide de la pince à épiler, déplacez chaque insert contenant les explants vers les plaques à 6 puits nouvellement préparées contenant les médicaments. Placer les plaques dans l’incubateur à CO2 à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24–48 h.
- Transférer les explants non cultivés précédemment fixés dans le formol dans une cassette histologique (voir rubrique 4 ci-dessous) et stocker dans 70% d’IMS jusqu’à la fin de l’expérience.
4. Traitement histologique
- Fixation tissulaire
- Après le traitement médicamenteux, transférer les disques d’insertion contenant les explants dans de nouvelles plaques à 6 puits contenant 10% de formol et ajouter quelques gouttes de formalin à 10% sur le dessus des explants pour assurer une couverture complète avec le fixateur.
ATTENTION : Le formol est dangereux. Évitez tout contact avec la peau et manipulez-la à l’intérieur d’un aliment fumant pour éviter toute inhalation. - Laissez les explants rester toute la nuit (20–24 h) dans le formol à 10%.
- Le lendemain, trempez le nombre pertinent de petites éponges d’histologie dans 70% d’IMS et placez-les dans des cassettes d’histologie. Transférer doucement toutes les explants d’une condition de traitement médicamenteuse donnée sur une seule éponge (maintenir l’orientation des explants de sorte que les côtés des explants en contact avec les disques d’insertion, et donc les zones traitées par le médicament, soient mis en contact avec l’éponge). Placez une autre éponge pré-trempée sur le dessus des explants et fixez-la dans une cassette d’histologie (une cassette par puits/traitement).
- Immergez les cassettes dans 70% IMS, et laissez à RT pendant 24 h.
- Après le traitement médicamenteux, transférer les disques d’insertion contenant les explants dans de nouvelles plaques à 6 puits contenant 10% de formol et ajouter quelques gouttes de formalin à 10% sur le dessus des explants pour assurer une couverture complète avec le fixateur.
- Enrobage de paraffine et sectionnement des tissus
- Le lendemain, transférer les cassettes d’histologie contenant les explants dans le panier d’échantillons du processeur de tissus (voir la Table des matières)et fixer le couvercle. Placez le panier dans l’autoclave et fermez doucement. Sélectionnez le programme souhaité et démarrez le processeur. Égouttez la cornue, ouvrez-la pour retirer le panier et transférez-la dans le bain de cire du centre d’intégration.
- Après l’intégration, transférez les couvercles de cassettes métalliques dans le panier et retournez à la cornue du processeur de papier tissu pour le programme de nettoyage. Essuyez le capteur avec un mouchoir sec, retirez tout excès de cire du couvercle de l’autoclave et poursuivez le programme de nettoyage.
- Placez un bloc de paraffine dans le microtome rotatif, coupez quelques sections à 4 μm et retournez le bloc dans la glace. Repositionnez le bloc et coupez plus de sections de 4 μm. Transférez les sections avec un petit pinceau et des pinces au bain-marie pour enlever les plis et les bulles.
- Placez les sections au centre sur les lames de microscope, égouttez les lames pendant quelques minutes et placez-les dans un porte-lames pour les sécher pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C. Lorsque les sections sont sèches, rangez-les à TA dans un dossier ou une boîte à glissière pour les protéger de la poussière.
5. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E)
- Remplissez le colorant (voir la table des matériaux)avec des réactifs et définissez le programme requis pour la coloration H & E: temps d’incubation de l’hématoxyline: 5 min; temps d’incubation de l’éosine: 3 min.
- Fixez le porte-glissière au support, placez-le dans le premier récipient contenant du xylène et démarrez le programme. Retirez le support de glissière du rack et emmenez le conteneur avec le porte-diapositives dans la zone de montage.
- Montez les lames avec du phtalate de dibutyle xylène (DPX) sous la hotte d’extraction. Placez DPX sur chaque couvercle et abaissez la glissière sur le couvercle avec la section vers le bas, ce qui permet au DPX de s’étaler.
REMARQUE: DPX est dangereux. Évitez tout contact avec la peau et utilisez-la dans une hotte désignée.
6. Immunocoloration
REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées à RT, sauf indication contraire.
- Déparaffinisation et réhydratation
- Placez les lames dans un porte-diapositives et chauffez à 65 °C pendant 10 min avant de déparaffiner les sections dans du xylène pendant 3 min (2x). Minimisez la quantité de solution de report.
REMARQUE : Le xylène est inflammable, dangereux et irritant. Manipuler à l’intérieur de la hotte tout en utilisant des gants à double couche. Évitez le contact avec la peau et les yeux. Éliminer les déchets dans un contenant scellé. - Réhydrater les lames dans un gradient d’alcool comme suit : 99% IMS pendant 1 min (2x) et 95% IMS pendant 1 min. Minimisez la quantité de solution de report.
REMARQUE: IMS est hautement inflammable, volatil et irritant. Manipulez à l’intérieur de la hotte et évitez le contact avec la peau et les yeux. - Immergez complètement le porte-glissière dans de l’eau ultrapure (UP) pendant 5 min.
- Placez les lames dans un porte-diapositives et chauffez à 65 °C pendant 10 min avant de déparaffiner les sections dans du xylène pendant 3 min (2x). Minimisez la quantité de solution de report.
- Récupération d’antigènes
- Préparer le tampon de récupération de l’antigène conformément aux directives du fabricant pour l’anticorps particulier utilisé.
REMARQUE: Le tampon de citrate 0,2 M, pH 6, ou tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)-éthylènediamine acide tétraacétique (EDTA) 0,1 M, pH 9, sont les tampons communs utilisés pour les conditions acides ou alcalines, respectivement. L’acide citrique monohydraté et Tris sont des agents irritants. Préparez toutes les solutions d’origine dans la hotte. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. - Immergez le rack contenant les glissières dans un tampon de récupération d’antigène, et au micro-ondes (voir le tableau des matériaux)à pleine puissance (800 W) pendant 20 min.
REMARQUE: Gardez les diapositives complètement immergées dans la mémoire tampon pendant tout le processus. Pour éviter une réduction excessive du volume tampon, placez un couvercle sur le dessus du récipient utilisé.
- Préparer le tampon de récupération de l’antigène conformément aux directives du fabricant pour l’anticorps particulier utilisé.
- Immunofluorescence multiplex (mIF)
REMARQUE: Ce processus prend 1 à 2 jours.- Remplissez un récipient propre avec 250 mL d’eau UP et immergez complètement le porte-glissière pendant 2 min (2x). Procédez à l’assemblage de chaque diapositive dans une plaque de couverture de diapositive (voir la table des matériaux).
- Pour assembler une glissière sur une plaque de couverture, préparez un abreuvoir en verre avec de l’eau. Immergez à la fois la plaque de couverture et glissez-la dans l’eau, en plaçant la section de tissu côté face à la plaque de couverture.
- Placez le bord inférieur de la glissière sur le dessus des protubérances au bas de la plaque de couverture, et enfin alignez la glissière sur la plaque de couverture, permettant à l’eau de combler l’espace entre les deux sans air piégé. Tenez la plaque de couverture et glissez-la ensemble, puis placez-les dans un porte-plaques de couverture.
- Remplissez la plaque de couverture avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et attendez que le tampon lave les lames, en s’écoulant par gravité (2x). Pipeter 110 μL de tampon bloquant (voir le tableau des matériaux)sur chaque plaque de couverture et incuber pendant 10 min.
- Préparer la dilution d’anticorps primaire souhaitée dans le PBS ou le tampon bloquant conformément aux recommandations du fabricant. Incuber les lames avec un anticorps primaire (110 μL par lame) pendant 30 min. Laver les lames avec 5 mL de PBS (2x), comme décrit au point 6.3.2.
- Incuber les lames avec 110 μL de polymère de peroxydase de raifort pendant 30 min. Laver les lames avec 5 mL de PBS (2x), comme décrit au point 6.3.2.
- Préparer la dilution du fluorophore dans un diluant d’amplification 1:100 (v/v) et incuber les lames avec du fluorophore (110 μL par lame) pendant 10 min. Laver les lames avec 5 mL de PBS (2x), comme décrit au point 6.3.2.
REMARQUE: Pour l’utilisation du fluorophore 780, suivez les directives du fabricant. L’expérience peut être suspendue ici si les lames sont incubées dans le lavage final du PBS et stockées à 4 °C pendant la nuit. - Déclipsez les lames des plaques de couverture et revenez à l’étape de récupération de l’antigène pour commencer la coloration avec un anticorps différent. Répétez la coloration pour obtenir le nombre souhaité d’anticorps à tester.
- Après l’étape 6.3.5 pour le dernier fluorophore utilisé, conserver les lames sur les plaques de couverture, préparer une solution de 6 μM de dilactate de 4'-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) avec de l’eau UP et contre-conserver les lames pendant 5 min (110 μL par lame). Lavez les lames avec de l’eau UP (2x) et éliminez l’excès d’eau en séchant les bords des lames. Assemblez les couvercles sur les glissières à l’aide d’un support de montage et stockez-les à RT dans l’obscurité.
- Remplissez un récipient propre avec 250 mL d’eau UP et immergez complètement le porte-glissière pendant 2 min (2x). Procédez à l’assemblage de chaque diapositive dans une plaque de couverture de diapositive (voir la table des matériaux).
7. Numérisation
REMARQUE: La numérisation des diapositives a été effectuée à l’aide d’un système d’imagerie automatisé multispectral (voir la table des matériaux).
- Assemblez les glissières dans le support et chargez-les dans le scanner dans l’ordre souhaité.
REMARQUE: Il est recommandé d’inclure une lame témoin dans laquelle aucun fluorophore ou DAPI n’est utilisé pendant la coloration immunohistochimique. Cette lame sera utilisée comme témoin de la floraison intrinsèque (autofluorescence (AF)) du tissu. - Après avoir lancé le logiciel de numérisation de diapositives, sélectionnez Modifier le protocole sur la page d’accueil. Créez un nouveau protocole abordant le nom,le mode d’imagerie,le type de balayage multispectral à effectuer(4 à 7 canaux)et l’étude(répertoire).
REMARQUE: Pour modifier les paramètres par défaut des bandes analysées, sélectionnez/désélectionnez les filtres souhaités à l’aide de la fonction Sélectionner les bandes de balayage - Passez à l’exposition à l’analyse et au support de charge,puis sélectionnez le support pour la configuration du protocole. Sélectionnez Prendre une vue d’ensemble pour détecter le tissu sur la diapositive. Choisissez une diapositive affichée sur le supportet sélectionnez une zone spécifique du tissu avec le curseur rouge pour le mettre en vue réelle dans la fenêtre de gauche de l’écran.
- Sélectionnez le filtre DAPI, puis cliquez sur Autofocus ou ajustez manuellement le curseur Hauteur de scène pour mettre au point le champ d’intérêt. Cliquez sur Autoexpose pour permettre au système de trouver la meilleure exposition pour ce filtre/bande.
REMARQUE: Le temps d’exposition pour chaque filtre est réglé à 12 ms. Après avoir exposé automatiquement le système, affinez le temps d’exposition pour une meilleure estimation. Il est également possible de remplacer la valeur d’exposition automatique en tapant une valeur manuellement dans la cellule en surbrillance. - Répétez les étapes ci-dessus pour tous les filtres du protocole. Si nécessaire, modifiez les emplacements et/ou les diapositives pour trouver les meilleurs signaux pour régler les expositions.
REMARQUE: Si le tissu est surligné en rouge en vue réelle, le signal fluorescent du filtre analysé est saturé et l’auto-exposition doit être répétée. - Une fois les paramètres d’exposition établis, cliquez sur le bouton Précédent et enregistrez le protocole. Sur la page d’accueil du logiciel (voir la table des matériaux),sélectionnez Numériser les diapositives.
- Empilez tous les supports à numériser dans le Slide Carrier Hotelet prenez note de l’ordre des diapositives pour attribuer leur identifiant dans le système.
REMARQUE: Sur l’écran du logiciel, chaque support sera lié à un emplacement contenant 4 diapositives. - Pour configurer plusieurs diapositives avec les mêmes paramètres, cliquez sur Configurer les tâches, et sélectionnez un ou plusieurs emplacements avec l’option Uchanterles mêmes règles pour les mêmes diapositives. Une fois que les diapositives d’édition s’ouvrent, configurez : Tâches, Étudeet Protocole,puis cliquez sur OK.
- Étiquetez chaque diapositive en cliquant sur l’icône Emplacement et tapez un nom dans la cellule ID de diapositive. Cliquez sur Scan pour lancer la numérisation.
REMARQUE: Une fois que l’icône de la fente devient bleue et que les diapositives sont marquées d’une flèche bleue, le transporteur a toutes les règles et est prêt à être scanné. Il est possible d’enregistrer les ID de diapositive, les études, les protocoles et les tâches en cliquant sur le bouton Enregistrer la configuration.
8. Analyse
REMARQUE: Le protocole ci-dessous illustre la méthode d’analyse du phénotype.
- Préparation de l’image
- Pour préparer les images en vue de leur analyse, ouvrez le logiciel de visualisation (voir la table des matériaux),puis sélectionnez Charger les diapositives. Sélectionnez les scans souhaités pour le projet de formation sur le côté droit de l’écran.
- Pour chaque numérisation, cliquez sur Tampon, puis choisissez Projet dans la zone Sélectionner pour : Définir un tampon de taille 1 x 1 dans le champ d’image à utiliser ultérieurement comme modèle pour l’analyse de la formation. Observez que ce timbre sera marqué comme un carré rouge.
Remarque : Le nombre d’annotations de tampon pour le projet est arbitraire. Il est recommandé d’en générer un pour le balayage de fluorescence intrinsèque et quelques autres qui sont généralement représentatifs de la distribution du signal dans le tissu. - Enfin, ouvrez tous les scans de l’expérience. Pour chacun d’eux, cliquez sur Tampon, et cette fois, choisissez l’option Lot dans la case Sélectionner pour: Placer un tampon circonscrivant chaque explant.
REMARQUE: Cette fois, les timbres seront marqués comme des carrés verts et seront requis une fois l’analyse par lots lancée. Choisissez la taille appropriée pour les timbres (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) et évitez le chevauchement des timbres, ce qui générerait des données dupliquées dans le fichier exporté.
- Analyse de la formation
- Lancez le logiciel pour l’analyse (voir la table des matériaux)et créez un nouveau projet : Sélectionnez Fichier | Nouvelle | Projet.
- Tapez un nom dans la zone Nom du projet et configurez le type de projet.
REMARQUE: Les expériences ont été réalisées en utilisant les spécifications suivantes: segmentation tissulaire entraînable; segmentation cellulaire adaptative; phénotypage. - Charger les scans contenant les tampons pour la formation : Fichier | Ouvrir | Image. Dans la vue monomode,parcourez les images et sélectionnez les scans avec fluorescence intrinsèque.
- Cliquez sur le bouton Autofluorescence (AF) et, à l’aide du sélecteur d’autofluorescence,dessinez sur une partie non colorée du tissu. Cliquez sur Préparer les images pour permettre au logiciel de soustraire l’intensité de la fluorescence intrinsèque de toutes les images téléchargées pour l’entraînement.
- Cliquez sur le bouton Modifier les marqueurs et les couleurs, puis entrez les noms des marqueurs dans la case associée à leur fluorophore. Cliquez sur l’étape Segment Tissue en haut de l’écran pour ouvrir la fenêtre Tissue Segmentation Training.
- Dans la fenêtre Catégories de tissus, tapez le nom des catégories de tissus dans lesquelles segmenter les images (par exemple, Tumeur, Stroma, Arrière-plan, Nécrose).
- Dans la fenêtre Formation à la segmentation tissulaire, cliquez sur le bouton Dessiner et dessinez des régions autour de groupes de cellules pour définir une catégorie de tissus d’intérêt. Par exemple, pour définir une zone tumorale, dessinez une région autour d’un groupe de cellules tumorales. Passez à la catégorie suivante et répétez le processus de dessin.
REMARQUE: Il est recommandé de dessiner des régions dans la plupart des images téléchargées pour la formation. Il est également possible d’affiner la formation en éditant l’échelle de motif et la résolution de segmentation dont les détails sont mieux décrits dans le manuel d’utilisation. - Après avoir défini les régions d’entraînement, procédez à Train the Tissue Segmenter.
REMARQUE: Pendant le processus de formation, le logiciel affiche le pourcentage de précision de la segmentation tissulaire. Pour des résultats optimaux, il est recommandé que la segmentation des tissus soit précise à au moins 90%. Une fois le segmenteur stabilisé, cliquez sur le bouton Terminé. - Pour voir le masque Catégorie de tissu sur toutes les images, cliquez sur le bouton Segmenter tout.
- Après avoir vérifié la qualité de la segmentation des tissus, redessinez les régions d’entraînement autour des zones qui ont été mal classées et réentraînez la segmenteuse tissulaire jusqu’à ce que le processus réussisse.
- Cliquez sur l’étape Segmentation des cellules dans la barre d’étapes en haut de la fenêtre pour poursuivre l’analyse.
- Choisissez les compartiments cellulaires à segmenter : Noyaux, Cytoplasmeet/ou Membrane.
REMARQUE: Comme la segmentation cellulaire adaptative ne peut détecter que les cellules avec un signal nucléaire, ne désélectionnez pas les noyaux. Bien qu’il soit également possible de segmenter le cytoplasme et/ou la membrane, il est recommandé de choisir d’abord le composant nucléaire le plus fort et le plus abondant (par exemple, le DAPI). - Configurez le composant nucléaire à l’aide du curseur Intensité typique pour ajuster le seuil utilisé pour détecter les pixels nucléaires. Prenez note de la fenêtre d’aperçu qui s’ouvre et fournit des commentaires en direct lorsque le seuil est ajusté.
REMARQUE: Ce seuil est adaptatif et est mesuré par rapport à l’arrière-plan environnant. Augmentez cette valeur si trop d’arrière-plan est détecté comme nucléaire. Réduisez cette valeur si des noyaux faibles sont manqués. Utilisez le bouton Afficher/Masquer les régions pour activer et désactiver les masques de segmentation et vérifier si les pixels corrects sont détectés comme nucléaires. - Pour fractionner des grappes de pixels nucléaires, utilisez le panneau Fractionnement des composants nucléaires. Choisissez le bouton qui décrit le mieux la qualité de coloration des noyaux. Ensuite, utilisez la barre de défilement pour ajuster la sensibilité de fractionnement, en gardant à l’esprit que des valeurs plus faibles entraîneront plus de fractionnement.
- Cliquez sur le bouton Segmenter tout pour segmenter toutes les images. Si le résultat n’est pas précis, modifiez les paramètres et rééquencez le logiciel jusqu’à ce qu’une segmentation satisfaisante soit obtenue.
- Passez à la dernière étape de l’analyse : Phénotypage. Dans le panneau Phénotypes, ajoutez la liste des phénotypes à détecter et tapez le nom dans la zone de texte correspondante. Cliquez sur le bouton Modifier les phénotypes, sélectionnez une cellule particulière pour afficher un menu déroulant et choisissez le phénotype correspondant.
REMARQUE: Au moins cinq cellules pour chaque phénotype sont nécessaires pour entraîner le classificateur. Désactiver la visualisation des noyaux permet une meilleure visualisation du phénotype cellulaire à attribuer. - Une fois la sélection pour la formation terminée, cliquez sur le bouton Classificateur de train.
REMARQUE: Le logiciel classera chaque cellule de l’image, et chaque fois que des erreurs de classification se produisent, il est possible de modifier le phénotype des cellules et de répéter l’entraînement du classificateur. Enregistrez le projet avant de procéder à l’analyse par lots et cliquez sur Exporter dans la barre d’outils en haut de l’écran. - Sélectionnez l’onglet Analyse de Bath dans le menu de gauche, puis chargez le projet dans la zone Algorithme de traitement par lots ou Projet.
- Cliquez sur Options d’exportation pour créer des répertoires distincts pour chaque image, et avec le bouton Parcourir, naviguez pour trouver l’emplacement pour exporter les données. Cliquez sur toutes les options des Images et Tableaux à exporter.
- Sur le côté droit de l’écran, cliquez sur Ajouter des diapositives et chargez toutes les images contenant des tampons pour les lots préalablement préparés (étape 7.3). Cliquez sur le bouton Exécuter pour lancer l’analyse par lots et traiter un tampon à la fois, en exportant les données correspondantes.
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Representative Results
L’imagerie multispectrale des coupes histologiques colorées par mIF permet l’identification et le phénotypage des populations cellulaires individuelles et l’identification des composants tumoraux et stromaux dans l’explant TME (Figure 2). L’imagerie multispectrale est particulièrement utile pour l’analyse des tissus à forte autofluorescence intrinsèque, tels que les tissus à forte teneur en collagène, car elle permet de déconfléchir le signal d’autofluorescence des autres signaux et de l’exclure de l’analyse ultérieure. La segmentation ultérieure des tissus et des cellules in silico permet de quantifier la réponse aux médicaments avec une multitude de sorties, y compris, mais sans s’y limiter, le nombre de cellules brutes (par exemple, le pourcentage de positivité), l’intensité du signal, la taille des cellules, la zone tissulaire et l’emplacement spatial des cellules individuelles.
La segmentation tissulaire et cellulaire est donc extrêmement utile pour l’analyse quantitative des résultats du traitement médicamenteux et l’identification des réponses spécifiques aux tumeurs et aux stromologies. Par exemple, la coloration du Ki67 et du cPARP à côté d’un marqueur tumoral permet la quantification des niveaux de prolifération et de mort cellulaire, respectivement, dans les explants(Figure 3). Dans l’exemple donné, les niveaux de Ki67 et de cPARP sont quantifiés pour les régions stromales et tumorales dans les PDE en réponse à l’inhibiteur du point de contrôle immunitaire (ICI) de la protéine de mort cellulaire antiprogrammée 1 (PD-1), le nivolumab. En outre, la capacité d’extraire des informations spatiales à partir de sections colorées permet le calcul des distances intercellulaires ainsi que des distances aux frontières tumorales et à d’autres structures. Par conséquent, les changements dans la distribution cellulaire après un traitement médicamenteux peuvent être analysés quantitativement (Figure 4). L’exemple illustré représente le traitement par PDE avec le nivolumab.
Figure 1: Flux de travail pour la génération et l’analyse des ODE. (A) Des échantillons de tumeurs humaines fraîchement réséqués sont traités et disposés sur un disque d’insert de culture perméable flottant dans un milieu de culture. (B) Après un traitement médicamenteux, les explants sont récoltés, soumis à la FFPE, puis sectionnés pour analyse histologique, par exemple, pour la coloration H & E. (C) La coloration mIF et le balayage des coupes de tissus sont effectués pour générer des images multispectrales à partir desquelles les signaux individuels peuvent être déconvolulés et analysés séparément. (D) L’analyse d’images composites permet de séparer les zones tumorales et stromales et d’évaluer le phénotype de différents types de cellules. Abréviations : PDE = explant dérivé du patient; FFPE = fixé dans le formol, incorporé dans la paraffine; H&E = hématoxyline et éosine; mIF = immunofluorescence multiplex; HRP = peroxydase de raifort; H2O2 = peroxyde d’hydrogène; Ab = anticorps; TSA = amplification du signal tyramide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Exemple d’une section de tissu coloré mIF. Le tissu explant du CPNPC a été coloré pour les marqueurs de la viabilité cellulaire, à savoir cPARP (rouge) et Ki67 (vert) ainsi qu’un marqueur de pan-cytokératine (jaune) et DAPI (bleu) pour marquer les noyaux. L’imagerie multispectrale a été réalisée pour déconvoluer les signaux fluorescents et éliminer l’autofluorescence. Les images montrent un grossissement de 20x du champ sélectionné. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : mIF = multiplex immunofluorescence; CPNPC = cancer du poumon non à petites cellules; cPARP = poly-ADP ribose polymérase clivée; CK = cytokératine; DAPI = 4'-6-diamidino-2-phénylindole; AF = autofluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Quantification de la mort cellulaire et de la prolifération dans les EDP. Exemple de diagrammes en boîte et en moustache montrant l’induction de l’apoptose dans les PDE du CPNPC après 24 h de traitement avec 5 μg/mL de nivolumab par rapport au contrôle moyen. Le pourcentage d’événements de prolifération (Ki67) et de mort cellulaire apoptotique (cPARP) est affiché dans la zone tumorale et le stroma, respectivement. Chaque point représente une seule explantation, la ligne centrale de la boîte représente la médiane de la distribution et les côtés de la boîte (en bas et en haut) représentent respectivement les premier et troisième quartiles. Les barres d’erreur représentent la plage interquartile (supérieure à 1,5 x IQR). Abréviations : PDE = explant dérivé du patient; CPNPC = cancer du poumon non à petites cellules; cPARP = poly-ADP ribose polymérase clivée; IQR = plage interquartile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Organisation spatiale après traitement médicamenteux. (A) Images représentatives montrant la coloration mIF des marqueurs des lymphocytes T - CD4, FOXP3, CD8 (panneau de gauche) - réalisée sur un explant de mélanome, et l’analyse phénotypique correspondante (à droite) identifiant les distances intercellulaires entre les cellules CD8+ et les cellules Treg (CD4+/FOXP3+). Barres d’échelle = 200 μm. (B) Graphique d’histogramme montrant une distance accrue entre les lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) et les lymphocytes Treg (CD4+/FOXP3+) après le traitement des PDE de mélanome avec 5 μg/mL de nivolumab, confirmant les effets ciblés du médicament IO. L’unité de densité est exprimée comme le nombre de cellules divisé par la somme de toutes les cellules par bande passante. Abréviations : mIF = multiplex immunofluorescence; CD = groupe de différenciation; FOXP3 = Boîte à tête de fourche P3; PDE = explant dérivé du patient; CPNPC = cancer du poumon non à petites cellules; IO = immuno-oncologie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cet article décrit les méthodes de génération, de traitement médicamenteux et d’analyse des PDE et met en évidence les avantages de la plate-forme en tant que système de modèle préclinique. La culture ex vivo d’une tumeur fraîchement réséquée, qui n’implique pas sa déconstruction, permet la rétention de l’architecture tumorale13,24 et donc, les interactions spatiales des composants cellulaires dans le TME ainsi que l’hétérogénéité intratumorale. Cette méthode montre comment, en utilisant un marqueur spécifique à la tumeur, il est possible d’identifier les zones de tissu tumoral par rapport aux zones de stroma et donc de séparer les réponses médicamenteuses dans ces compartiments (Figure 3). De plus, plusieurs biomarqueurs peuvent être profilés simultanément pour évaluer, par exemple, le mouvement sur cible des cellules immunitaires au sein du TME (Figure 4).
Une publication précédente a documenté l’application de cette plateforme PDE à la stratification des PDE NSCLC pour la chimiothérapie standard de soins, le cisplatine, montrant qu’il est possible de séparer le chimiosistant des populations chimiosensibles24. Ces résultats liés à la PDE reflètent les réponses des patients. En suivant les méthodes décrites ici, il est possible d’entreprendre des approches similaires pour d’autres types de tumeurs et avec différents types de médicaments, de chimiothérapie ou autres. La séparation des EDP en populations sensibles aux médicaments et résistantes aux médicaments crée une ressource inestimable pour générer davantage d’informations mécanistes sur la résistance aux médicaments. Par exemple, étant donné que les PDE peuvent être traités pour l’isolement de l’ARN, de l’ADN, des protéines ou des métabolites, cela peut permettre la mise en œuvre de technologies « omiques » pour identifier les biomarqueurs clés qui sont prédictifs de la réponse. Alternativement, les sections FFPE générées à partir de PDE traitées peuvent être utilisées pour un profilage spatial approfondi afin de comprendre comment différents types de cellules dans la PDE contribuent à la résistance aux médicaments.
Cela pourrait être facilité par d’autres développements dans les approches d’imagerie multispectrale et de cytométrie de masse35,40,41,42,43, ce qui permettrait de profiler simultanément des centaines de biomarqueurs. Les modèles précliniques qui évaluent l’efficacité immunothérapeutique sont très recherchés, et cet article démontre que les EDP peuvent combler ce créneau critique(Figure 3 et Figure 4). Des anticorps monoclonaux ciblant les points de contrôle immunitaires, tels que l’antigène cytotoxique des lymphocytes T 4 et le ligand PD-1 / mort programmée-1 (PD-L1), ont été développés44,45,46,47 avec des améliorations remarquables de la survie globale des patients dans un grand nombre de tumeurs solides par rapport à la chimiothérapie standard. Cependant, les IIC sont efficaces chez un nombre limité de patients pour des raisons qui ne sont pas claires, nécessitant l’identification de biomarqueurs prédictifs48. La caractéristique exceptionnelle des PDE - préserver l’architecture 3D du tissu tumoral - facilite l’évaluation de l’efficacité de l’ICI (Figure 3) et la surveillance des cellules immunitaires en réponse au traitement ICI (Figure 4). Ainsi, les PDE sont une plate-forme idéale pour distinguer les cas sensibles à l’ICI des cas résistants à l’ICI et pour étudier les mécanismes qui sous-tendent cette distinction.
La technologie PDE souffre de quelques inconvénients. La génération de résultats expérimentaux précis à partir de PDE repose sur l’intégrité tumorale et, parfois, les échantillons de tumeurs après la chirurgie sont trop nécrotiques pour être traités pour les PDE. De plus, malgré quelques exemples spécifiques de maintien de l’intégrité tissulaire après une culture prolongée25, pour la plupart des cas signalés, l’intégrité et la viabilité ont été perdues après 72 h en culture, et la désintégration des tissus se produit. La fenêtre de temps pour effectuer des expériences médicamenteuses est donc relativement limitée, interdisant l’utilisation de ce modèle pour l’étude des mécanismes de résistance médicamenteuse acquise ou l’étude de l’invasion et des métastases13. L’extension de la viabilité des explants pourrait devenir possible à l’avenir grâce au développement de nouvelles technologies, telles que les échafaudages et les canaux perfusés, qui peuvent faciliter la diffusion et l’absorption des nutriments, permettant une culture plus étendue.
Cependant, jusqu’à ce que ces améliorations puissent être apportées, la plate-forme PDE devrait être considérée comme une méthode de culture à court terme qui peut fournir des données immédiates sur la réponse aux médicaments. Il devrait être utilisé avec d’autres systèmes modèles, tels que les organoïdes et les modèles PDX, qui peuvent fournir des données de réponse aux médicaments à plus long terme. Dans l’ensemble, la plate-forme PDE est un système de modèle préclinique de preuve de concept qui est utile pour déterminer la sensibilité de la tumeur d’un patient à un agent anticancéreux donné, pour obtenir des informations sur les mécanismes d’action des médicaments dans une tumeur réelle et pour développer des biomarqueurs prédictifs et pharmacodynamiques.
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Disclosures
Rien à divulguer
Acknowledgments
Nous remercions les chirurgiens et les pathologistes des hôpitaux universitaires de Leicester NHS Trust pour avoir fourni du tissu tumoral réséqué chirurgicalement. Nous remercions également l’installation d’histologie de Core Biotechnology Services pour son aide au traitement des tissus et à la section des blocs de tissus FFPE et Kees Straatman pour son soutien à l’utilisation du Vectra Polaris. Cette recherche a été soutenue et financée par le consortium Explant composé de quatre partenaires : l’Université de Leicester, l’unité de toxicologie du MRC, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories et LifeArc. Un soutien supplémentaire a été fourni par le CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Le financement des OGM, des CD et des NA a été fourni par le programme Catalyst de Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066), qui est soutenu par un financement de Pfizer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
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