Summary
Dette papir beskriver metoder til generering, lægemiddelbehandling og analyse af patientafledte explants til vurdering af tumormedicinresponser i et levende, patientrelevant, præklinisk modelsystem.
Abstract
En forståelse af resistens over for lægemidler og udvikling af nye strategier til at sensibilisere meget resistente kræftformer er afhængige af tilgængeligheden af egnede prækliniske modeller, der præcist kan forudsige patientens reaktioner. En af ulemperne ved eksisterende prækliniske modeller er den manglende evne til kontekstuelt at bevare det menneskelige tumormikromiljø (TME) og nøjagtigt repræsentere intratumoral heterogenitet, hvilket begrænser den kliniske oversættelse af data. I modsætning hertil, ved at repræsentere kulturen af levende fragmenter af menneskelige tumorer, den patient-afledte explant (PDE) platform tillader narkotika svar, der skal undersøges i en tre-dimensionel (3D) sammenhæng, der afspejler de patologiske og arkitektoniske træk ved de oprindelige tumorer så tæt som muligt. Tidligere rapporter med PDEs har dokumenteret platformens evne til at skelne kemosensitive fra chemoresistant tumorer, og det har vist sig, at denne adskillelse er forudsigende for patientens reaktioner på de samme kemoterapier. Samtidig giver PDEs mulighed for at afhøre molekylære, genetiske og histologiske træk ved tumorer, der forudsiger lægemiddelresponser og derved identificerer biomarkører til patient stratificering samt nye interventionelle tilgange til at sensibilisere resistente tumorer. Dette papir rapporterer PDE-metoden i detaljer, fra indsamling af patientprøver til endpoint-analyse. Det giver en detaljeret beskrivelse af explant afledning og kultur metoder, der fremhæver skræddersyede betingelser for bestemte tumorer, hvor det er relevant. Til endpointanalyse er der fokus på multiplexed immunofluorescence og multispektral billeddannelse til rumlig profilering af nøglebiomarkører inden for både tumorale og stromale regioner. Ved at kombinere disse metoder er det muligt at generere kvantitative og kvalitative lægemiddelresponsdata, der kan relateres til forskellige klinikopatologiske parametre og dermed potentielt bruges til biomarkøridentifikation.
Introduction
Udviklingen af effektive og sikre kræftmidler kræver passende prækliniske modeller, der også kan give indsigt i virkningsmekanismer, der kan lette identifikationen af prædiktive og farmakodynamiske biomarkører. Inter- og intratumor heterogenitet1,2,3,4,5 og TME6,7,8,9,10,11,12 er kendt for at påvirke anticancer narkotika svar, og mange eksisterende prækliniske kræft modeller såsom cellelinjer, organoider, og musemodeller er ikke i stand til fuldt ud at rumme disse afgørende Funktioner. En "ideel" model er en, der kan generobre de komplekse rumlige interaktioner af maligne med ikke-ondartede celler i tumorer samt afspejle de regionale forskelle inden for tumorer. Denne artikel fokuserer på PDF-filer som en ny platform, der kan opfylde mange af disse krav13.
Det første eksempel på brugen af menneskelige PDEs, også kendt som histokulturer, går tilbage til slutningen af 1980'erne, da Hoffman et al. genererede skiver af nyopførte menneskelige tumorer og dyrkede dem i en kollagenmatrix14,15. Dette indebar etablering af et 3D-kultursystem, der bevarede vævsarkitektur, hvilket sikrede vedligeholdelse af stromale komponenter og celleinteraktioner inden for TME. Uden at dekonstruere den oprindelige tumor, Hoffman et al.16 varslede en ny tilgang til translationel forskning, og siden denne tid, mange grupper har optimeret forskellige explant metoder med det formål at bevare væv integritet og generere nøjagtige lægemiddelrespon data17,18,19,20,21,22,23,24 , selv om nogle forskelle mellem protokollerne er tydelige. Butler et al. dyrkede explants i gelatine svampe til at hjælpe udbredelsen af næringsstoffer og narkotika gennem prøven20,21,25, mens Majumder et al. skabt en tumor økosystem ved dyrkning explants på toppen af en matrix bestående af tumor og stromale proteiner i overværelse af autolog serum stammer fra samme patient22, 23.
For nylig oprettede vores gruppe en protokol, hvorved explants genereres ved fragmentering af tumorer i 2 - 3 mm3-størrelsestykker, der derefter placeres uden yderligere komponenter på gennemtrængelige membraner ved luft-flydende interface af et kultursystem24. Tilsammen har disse talrige undersøgelser vist, at PDEs tillader kulturen af intakte, levende fragmenter af menneskelige tumorer, der bevarer den rumlige arkitektur og regionale heterogenitet af de oprindelige tumorer. I originale forsøg blev explants eller histokulturer normalt udsat for homogenisering efter lægemiddelbehandling, hvorefter der blev anvendt forskellige levedygtighedsanalyser på de homogeniserede prøver såsom histokulturlægemiddelrespons assay20,21, MTT (3-(6)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) assay, laktat dehydrogenase assay, eller resazurin-baserede assay26,27,28 . Nylige fremskridt inden for endpointanalyseteknikker, især digital patologi, har nu udvidet repertoiret af endpointtests og -analyser, der kan udføres på explants29,30. For at anvende disse nye teknologier, i stedet for homogenisering, explants er fastsat i formalin, indlejret i paraffin (FFPE) og derefter analyseret ved hjælp af immunstaining teknikker, der tillader rumlig profilering. Eksempler på denne fremgangsmåde er blevet dokumenteret for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), brystkræft, kolorektal cancer, og lungehindekræft explants hvorved immunohistokemisk farvning for spredning markør, Ki67, og apoptotisk markør, kløvet poly-ADP ribose polymerase (cPARP), blev brugt til at overvåge ændringer i cellespredning og celledød24,31,32,33,34.
Multipelxet immunofluorescence er særligt modtagelig for rumlig profilering af lægemiddelresponser i explants ved slutpunkt35. For eksempel er det muligt at måle omfordeling og rumlig fordeling af specifikke klasser af immunceller, såsom makrofager eller T-celler, inden for TME ved lægemiddelbehandling13,36,37,38, og undersøge, om et terapeutisk middel kan favorisere overgangen fra "kold tumor" til "hot tumor"39 . I de senere år har denne gruppe fokuseret på afledning af PDEs fra forskellige tumortyper (NSCLC, nyrekræft, brystkræft, kolorektal cancer, melanom) og testning af en række anticancermidler, herunder kemoterapier, småmolekylehæmmere og immunkontrolpunkthæmmere (ICIs). Endpoint analysemetoder er blevet optimeret til at omfatte multiplexed immunofluorescence at tillade rumlig profilering af biomarkører for levedygtighed samt biomarkører for forskellige bestanddele af TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vævssamling
- Efter operationen overføres nyopførte menneskelige tumorprøver til et rør, der indeholder 25 mL frisk kulturmedium (Dulbeccos modificerede Eagle medium suppleret med 4,5 g/L glukose og L-glutamin + 1% (v/v) fosterkalkale serum + 1% penicillin-streptomycin) og opbevares på is. Behandle explant inden for 2 timer af kirurgi i en steril klasse II hætte.
2. Explant forberedelse
- Rengør alt kirurgisk udstyr (transplantatblade/tandvoksoverflade/pincet) med 70 % industriel methyleret spiritusopløsning (IMS).
- Fyld en 10 cm kulturskål (se materialebordet)med ~ 25 mL frisk medium, og læg den oven på en seng af is.
- Brug pincet til at overføre prøven til en tandvoksoverflade (se materialetabellen), og skær vævet i fragmenter på ca. 2-3 mm3 ved hjælp af to hudtransplantationsblade.
BEMÆRK: For at opnå den bedste ydeevne skal du begynde at skære vævet for at opnå en individuel strimmel på 2-3 mm tykkelse, og skær derefter strimlen langs længden for at opnå de endelige explants. Gentag processen, indtil hele prøven er hakket. - Overfør eksplanterne straks ind i det iskolde kulturmedium i 10 cm skålen. Tag en del af explants (6-9 stykker), læg dem i et 1 mL rør, der indeholder 10% af ikke-buffered formalinopløsning, og lad dem stå ved stuetemperatur (RT) i 24 timer.
BEMÆRK: Disse fragmenter vil repræsentere kontroleksplanterne for den "ukulturerede" tilstand. - Fyld det ønskede antal brønde af 6-brønds plader med 1,5 mL frisk medium pr. brønd, og placer en organoskopisk kulturindsatsskive (se materialetabellen)i hver brønd, så den flyder oven på mediet og omhyggeligt undgår luftbobler ved medieindsatsgrænsefladen.
- Vælg explants tilfældigt, og placer dem en ad gangen oven på indsætningsdisken. For at være i overensstemmelse med den "uncultured" tilstand, skal du bruge 6-9 explants per brønd. Anbring multiwellpladen i en CO 2-inkubator ved 37 °C og 5 % CO2,og lad explants komme sig i 16 timer.
BEMÆRK: For at undgå at knuse vævet anbefales det stærkt at håndtere pincet.
3. Narkotikabehandling
- Efter 16 timer skal du tage nye 6-brøndsplader, tilsætte 1,5 mL frisk medium til hver brønd, tilsæt de relevante lægemidler i de ønskede koncentrationer og medtag en brønd til køretøjskontrollen. Brug pincet, flytte hver indsats, der indeholder explants til den nyligt forberedte 6-brønd plader, der indeholder narkotika. Anbring pladerne i CO2-inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 24-48 timer.
- Overfør de ikke-dyrkede explants, der tidligere var fastsat i formalin, til en histologikassette (se afsnit 4 nedenfor), og opbevar i 70% IMS indtil forsøgets afslutning.
4. Histologisk behandling
- Vævsfiksering
- Efter lægemiddelbehandling overføres indsætningsskiverne, der indeholder explants, til nye 6-brøndplader, der indeholder 10% formalin, og tilsæt et par dråber på 10% formalin på toppen af explants for at sikre fuldstændig dækning med fikseringsmidlet.
FORSIGTIG: Formalin er farlig. Undgå enhver kontakt med huden, og håndtere det inde i en røg mad for at forhindre indånding. - Lad explants at forblive natten over (20-24 timer) i 10% formalin.
- Den næste dag skal du suge det relevante antal små histologisvampe i 70% IMS og placere dem inde i histologikassetter. Overfør forsigtigt alle explants fra en given lægemiddelbehandlingstilstand på en enkelt svamp (opretholder explanternes orientering, så siderne af explants i kontakt med skærskiverne og dermed de lægemiddelbehandlede områder placeres i kontakt med svampen). Placer en anden presoaked svamp på toppen af explants, og fastgør i en histologi kassette (en kassette pr godt / behandling).
- Dyk kassetterne ned i 70% IMS, og lad på RT i 24 timer.
- Efter lægemiddelbehandling overføres indsætningsskiverne, der indeholder explants, til nye 6-brøndplader, der indeholder 10% formalin, og tilsæt et par dråber på 10% formalin på toppen af explants for at sikre fuldstændig dækning med fikseringsmidlet.
- Paraffinindlejring og vævssektion
- Den følgende dag overføres histologikassetterne, der indeholder explantserne, til vævsprocessorens prøvekurv (se materialetabellen) og låget fastgøres. Læg kurven i retorten og luk forsigtigt. Vælg det ønskede program, og start processoren. Dræn retorten, åbn den for at fjerne kurven, og overfør kurven til indlejringscentervoksbadet.
- Efter indlejring overføres metalkassettelåg i kurven og vender tilbage til vævsprocessorens retort til rengøringsprogrammet. Tør sensoren af med et tørt væv, fjern overskydende voks fra retortlåget, og fortsæt med rengøringsprogrammet.
- Placer en paraffinblok i rotationsmikrotomen, skær et par sektioner ved 4 μm, og sæt blokken tilbage til is. Flyt blokken, og skær mere 4 μm sektioner. Overfør sektionerne med en lille pensel og sammenkrækkes på et vandbad for at fjerne folder og bobler.
- Placer sektionerne centralt på mikroskopslids, dræn rutsjebanerne i få minutter, og læg dem i et diasstativ for at tørre natten over i en inkubator ved 37 °C. Når sektionerne er tørre, skal du opbevare dem på RT i en diasmappe eller -boks for at beskytte mod støv.
5. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning
- Fyld stainren (se materialetabellen) med reagenser, og indstil det nødvendige program til H&E farvning: hæmatoxylin inkubationstid: 5 min; eosin inkubationstid: 3 min.
- Fastgør diasstativet til bæreren, læg den i den første beholder med xylen, og start programmet. Fjern glideholderen fra stativet, og tag beholderen med glidestativet til monteringsområdet.
- Monter rutsjebanerne med dibutylphthalat xylen (DPX) under ekstraktionshætten. Placer DPX på hver coverlip, og sænk rutsjebanen på dækslerne med sektionen nedad, så DPX kan sprede sig.
BEMÆRK: DPX er farligt. Undgå enhver kontakt med huden og brug i en udpeget røghætte.
6. Immunstaining
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres på RT, medmindre andet er angivet.
- Deparaffinering og rehydrering
- Placer rutsjebanerne i et diasstativ, og varm ved 65 °C i 10 min, før sektionerne nedbrydes i xylen i 3 min (2x). Minimer mængden af fremførselsløsning.
BEMÆRK: Xylen er brandfarlig, farlig og irriterende. Håndter inde i røghætten, mens du bruger dobbeltlagshandsker. Undgå hud- og øjenkontakt. Affald bortskaffes i en forseglet beholder. - Rehydrere dias i en alkohol gradient som følger: 99% IMS i 1 min (2x) og 95% IMS i 1 min. Minimer mængden af fremførselsløsning.
BEMÆRK: IMS er meget brandfarlig, flygtig og irriterende. Håndter inde i røghætten, og undgå hud- og øjenkontakt. - Skuberstativet helt ned i ultrapurt (UP) vand i 5 min.
- Placer rutsjebanerne i et diasstativ, og varm ved 65 °C i 10 min, før sektionerne nedbrydes i xylen i 3 min (2x). Minimer mængden af fremførselsløsning.
- Hentning af antigen
- Forbered antigenudtagningsbuffer i henhold til producentens retningslinjer for det anvendte antistof.
BEMÆRK: Citratbuffer 0,2 M, pH 6 eller tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)-ethylendiamin tetraacetsyre (EDTA) 0,1 M, pH 9, er de almindelige buffere, der anvendes til henholdsvis sure eller alkaliske tilstande. Citronsyre monohydrat og Tris er irriterende stoffer. Forbered alle lagerløsninger i røghætten. Undgå kontakt med hud og øjne. - Dyk stativet med rutsjebanerne ned i antigenudtagningsbufferen og mikrobølgeovnen (se materialetabellen) ved fuld effekt (800 W) i 20 min.
BEMÆRK: Hold diasene helt nedsænket i bufferen under hele processen. For at undgå overdreven reduktion af buffervolumen skal du placere et låg oven på den anvendte beholder.
- Forbered antigenudtagningsbuffer i henhold til producentens retningslinjer for det anvendte antistof.
- Multiplex immunofluorescence (mIF)
BEMÆRK: Denne proces tager 1-2 dage.- Fyld en ren beholder med 250 mL UP vand, og helt nedsænke diasstativet i 2 min (2x). Fortsæt med at samle hvert dias i en slideforsideplade (se materialetabellen).
- For at samle en rutsjebane på en forsideplade skal du forberede et glastrug med vand. Dyk både forsidepladen og rutsjebanen i vandet, og læg vævssektionens side ud mod dækpladen.
- Placer den nederste kant af diaset oven på fremspringene i bunden af forsidepladen, og juster til sidst rutsjebanen til forsidepladen, så vandet kan udfylde hullet imellem uden luft fanget. Hold dækpladen og skub sammen, og læg dem i et dækpladestativ.
- Fyld dækpladen med fosfatbufferet saltvand (PBS), og vent på, at bufferen vasker diasene og flyder ud af tyngdekraften (2x). Pipet 110 μL af blokerende buffer (se materialetabellen) på hver forsideplade og inkuberes i 10 min.
- Forbered den ønskede primære antistoffortynding i PBS eller blokeringsbuffer i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Inkuberes diasene med primært antistof (110 μL hver dias) i 30 min. Rutsjebanerne vaskes med 5 mL PBS (2x) som beskrevet i 6.3.2.
- Inkuber diasene med 110 μL peberrod peroxidasepolymer i 30 min. Rutsjebanerne vaskes med 5 mL PBS (2x) som beskrevet i 6.3.2.
- Fortynding af fluorophor i forstærknings fortyndingsstof 1:100 (v/v) og inkuberes med fluorophore (110 μL hvert dias) i 10 min. Rutsjebanerne vaskes med 5 mL PBS (2x) som beskrevet i 6.3.2.
BEMÆRK: Ved brug af fluorophor 780 skal du følge producentens retningslinjer. Forsøget kan sættes på pause her, hvis rutsjebanerne inkuberes i pbs' endelige vask og opbevares ved 4 °C natten over. - Unclip dias fra coverplates, og gå tilbage til antigen hentning skridt til at starte farvning med et andet antistof. Gentag farvningen for det ønskede antal antistoffer, der skal testes.
- Efter trin 6.3.5 for den sidste fluorophore i brug skal lysbillederne opbevares på forsiderne, der fremstilles 6 μM opløsning på 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilactat med UP-vand og modvirke rutsjebanerne i 5 min (110 μL hver rutsjebane). Vask rutsjebanerne med UP-vand (2x), og fjern overskydende vand ved at tørre kanterne af diasene. Saml dækslerne på lysbillederne ved hjælp af monteringsmedium, og opbevar på RT i mørke.
- Fyld en ren beholder med 250 mL UP vand, og helt nedsænke diasstativet i 2 min (2x). Fortsæt med at samle hvert dias i en slideforsideplade (se materialetabellen).
7. Scanning
BEMÆRK: Diasscanning blev udført ved hjælp af et multispektralt automatiseret billedsystem (se materialetabellen).
- Saml diasene i bæreren, og læg dem i scanneren i den ønskede rækkefølge.
BEMÆRK: Det anbefales, at der medtages et kontroldias, hvor der ikke anvendes fluorophore eller DAPI under immunohistokemisk farvning. Dette dias vil blive brugt som kontrol for iboende florescence (autofluorescence (AF)) af vævet. - Når du har startet diasscannersoftwaren, skal du vælge Rediger protokol på startsiden. Opret en ny protokol, der adresserer navnet, billedbehandlingstilstanden, den type multispektral scanning, der skal udføres (4-7 kanaler), og undersøgelse (mappe).
BEMÆRK: Hvis du vil ændre standardindstillingerne for analyserede bånd, skal du vælge/fravælge de ønskede filtre ved hjælp af funktionen Vælg scanningsbånd - Fortsæt med Scan Exposure and Load carrier, og vælg til sidst bæreren til protokolopsætningen. Vælg Tag oversigt for at registrere vævet på diaset. Vælg et dias, der vises på bæreren, og vælg et bestemt område af vævet med den røde markør for at få det til livevisning i venstre vindue på skærmen.
- Vælg DAPI-filteret, og klik på Autofokusering, eller juster skyderen Scenehøjde manuelt for at fokusere interessefeltet. Klik på Autoexpose for at gøre det muligt for systemet at finde den bedste eksponering for det pågældende filter /bånd.
BEMÆRK: Eksponeringstiden for hvert filter er indstillet til 12 ms. Når du har autoeksponeret systemet, skal eksponeringstiden forfines til et bedre estimat. Det er også muligt at tilsidesætte autoeksponeringsværdien ved at skrive en værdi manuelt i den fremhævede celle. - Gentag ovenstående trin for alle filtre i protokollen. Hvis det er nødvendigt, skal du ændre placeringerne og/eller diasene for at finde de bedste signaler til indstilling af eksponeringerne.
BEMÆRK: Hvis vævet er fremhævet med rødt i live view, er det analyserede filters fluorescerende signal mættet, og autoeksponering skal gentages. - Når eksponeringsindstillingerne er oprettet, skal du klikke på knappen Tilbage og gemme protokollen. Vælg Scan slidespå softwarehjemmesiden (se tabellen materialer).
- Stak alle de bærere, der skal scannes ind i Slide Carrier Hotel, og notere sig rækkefølgen af dias til at tildele deres id i systemet.
BEMÆRK: På softwareskærmen vil hver operatør være relateret til en slot, der indeholder 4 dias. - Hvis du vil konfigurere flere dias med de samme parametre, skal du klikke på Konfigurer opgaverog vælge et eller flere pladser med indstillingen Usynge de samme regler for desamme dias. Når Rediger dias åbnes, skal du konfigurere: Opgaver, Undersøgelseog Protokolog klikke på OK.
- Mærk hvert dias ved at klikke på ikonet Slot, og skriv et navn i dias-id-cellen. Klik på Scan for at begynde at scanne.
BEMÆRK: Når slotikonet bliver blåt, og diasene er markeret med en blå pil, har bæreren alle reglerne og er klar til at blive scannet. Det er muligt at gemme dias-id'er, undersøgelser, protokoller og opgaver ved at klikke på knappen Gem installation.
8. Analyse
BEMÆRK: Nedenstående protokol illustrerer metoden til fænotypeanalyse.
- Forberedelse af billeder
- Hvis du vil forberede billederne til analyse, skal du åbne fremvisersoftwaren (se Materialetabel) og vælge Indlæs dias. Vælg de ønskede scanninger til træningsprojekt i højre side af skærmen.
- For hver scanning skal du klikke på Stempelog vælge Projekt i feltet Vælg efter: Definer et stempel med størrelse 1 x 1 i billedfeltet, der skal bruges senere som skabelon til uddannelsesanalysen. Bemærk, at dette stempel vil blive markeret som en rød firkant.
BEMÆRK: Antallet af stempelanmærkninger for projektet er vilkårligt. Det anbefales at generere en for den iboende fluorescensscanning og et par mere, der generelt er repræsentative for signalfordelingen i vævet. - Endelig skal du åbne alle scanninger af eksperimentet. For hver skal du klikke på Stempel, og denne gang skal du vælge indstillingen Batch i feltet Vælg for: Placer et stempel, der omskær hver explant.
BEMÆRK: Denne gang vil frimærkerne blive markeret som grønne firkanter og vil være påkrævet, når batchanalysen er lanceret. Vælg den passende størrelse til frimærkerne (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3), og undgå overlapning af frimærkerne, hvilket vil generere duplikerede data i den eksporterede fil.
- Uddannelsesanalyse
- Start softwaren til analyse (se materialetabellen), og opret et nyt projekt: Vælg | Nyt | Projekt.
- Skriv et navn i feltet Projektnavn , og konfigurer projekttypen.
BEMÆRK: Forsøgene blev udført ved hjælp af følgende specifikationer: segmentering af væv, der kan trænes; adaptiv cellesegmentering; phenotyping. - Indlæs scanningerne, der indeholder frimærkerne, til træning: Fil | Åbn | Billede. I visning i enkelttilstandskal du navigere gennem billederne og vælge scanningerne med iboende fluorescens.
- Klik på knappen Autofluorescence (AF), og med Autofluorescence picker, trække på en uplettet del af væv. Klik på Forbered billeder for at gøre det muligt for softwaren at trække intensiteten af iboende fluorescens fra alle de billeder uploadet til træning.
- Klik på knappen Rediger markører og farver, og angiv mærkenavnene i den boks, der er knyttet til deres fluorophore. Klik på segmentvævstrinnet øverst på skærmen for at åbne vinduet Kursus i vævssegmentering.
- Skriv navnet på vævskategorierne i vinduet Vævskategorier for at opdele billederne i (f.eks. Tumor, Stroma, Baggrund, Nekrose).
- I vinduet Vævssegmenteringstræning skal du klikke på knappen Tegning og tegne områder omkring grupper af celler for at definere en vævskategori af interesse. For eksempel, for at definere et tumorområde, tegne et område omkring en gruppe tumorceller. Skift til den næste kategori, og gentag tegningsprocessen.
BEMÆRK: Det anbefales at tegne områder i de fleste af de billeder, der uploades til træning. Det er også muligt at forfine træningen ved at redigere mønsterskalaen og segmenteringsopløsningen, hvis detaljer er bedre beskrevet i brugervejledningen. - Efter at have defineret uddannelsesregionerne, skal du fortsætte med Train the Tissue Segmenter.
BEMÆRK: Under træningsprocessen viser softwaren procentdelen af nøjagtigheden af vævssegmentering. For optimale resultater anbefales det, at vævssegmentering er mindst 90% nøjagtig. Når Segmenter har stabiliseret sig, skal du klikke på knappen Udført. - Hvis du vil se masken Vævskategori på alle billeder, skal du klikke på knappen Inddel alle.
- Efter at have kontrolleret kvaliteten af vævssegmentering skal du tegne træningsregionerne igen omkring de områder, der var forkert klassificeret, og omdestruer Vævssegmentet, indtil processen er vellykket.
- Klik på trinsegmenteringstrinnet i trinlinjen øverst i vinduet for at fortsætte analysen.
- Vælg de cellulære rum, der skal segmenteres: Nuclei, Cytoplasmaog/eller Membrane.
BEMÆRK: Da adaptiv cellesegmentering kun kan detektere celler med atomsignal, skal du ikke de-vælge Nuclei. Selvom det også er muligt at segmentere cytoplasma og/eller membran, anbefales det at vælge den stærkeste og mest rigelige nukleare komponent først (f.eks. DAPI). - Konfigurer den nukleare komponent ved hjælp af skyderen Typisk intensitet for at justere den tærskel, der bruges til at registrere nukleare pixel. Vær opmærksom på det eksempelvindue, der åbnes og giver live feedback, når grænsen justeres.
BEMÆRK: Denne tærskel er adaptiv og måles i forhold til den omgivende baggrund. Forøg denne værdi, hvis der registreres for meget baggrund som nuklear. Sænk denne værdi, hvis svage kerner bliver savnet. Brug knappen Vis/skjul områder til at blinke segmenteringsmaskerne til og fra, og kontroller, om de korrekte pixel registreres som nukleare. - Hvis du vil opdele klynger af nukleare pixel, skal du bruge panelet Opdeling af nukleare komponenter. Vælg den knap, der bedst beskriver farvningskvaliteten af kernerne. Brug derefter skyderen til at justere opdelingsfølsomhedenunder hensyntagen til, at lavere værdier resulterer i mere opdeling.
- Klik på knappen Indlæs alle for at segmentere alle billederne. Hvis resultatet ikke er korrekt, skal du ændre indstillingerne og træne softwaren igen, indtil der er opnået en tilfredsstillende segmentering.
- Fortsæt til det sidste trin i analysen: Phenotyping. Tilføj listen over fænotyper, der skal registreres, i panelet Fænotyper, og skriv navnet i den tilsvarende tekstboks. Klik på knappen Rediger fænotyper, vælg en bestemt celle for at få en rullemenu op, og vælg den tilsvarende fænotype.
BEMÆRK: Mindst fem celler for hver fænotype er nødvendige for at træne klassificeringen. Hvis du slår visualiseringen af kernerne fra, kan du se en bedre visualisering af den cellefænotype, der skal tildeles. - Når valget til træning er fuldført, skal du klikke på knappen Træ klassificering.
BEMÆRK: Softwaren klassificerer hver enkelt celle i billedet, og når der opstår fejl i klassificeringen, er det muligt at redigere cellernes fænotype og gentage klassificeringens træning. Gem projektet, før du fortsætter med batchanalyse, og klik på eksporter på værktøjslinjen øverst på skærmen. - Vælg fanen Badanalyse i menuen til venstre, og indlæs projektet i feltet Batchalgoritme eller Projekt.
- Klik på Eksporter indstillinger for at oprette separate mapper for hvert billede, og med knappen Gennemse skal du navigere for at finde den placering, der skal eksporteres dataene. Klik på alle indstillingerne i de billeder og tabeller, der skal eksporteres.
- Klik på Tilføj dias i højre side af skærmen, og læg alle de billeder, der indeholder frimærker til tidligere forberedte batches (trin 7.3). Klik på knappen Kør for at starte batchanalysen og behandle ét stempel ad gangen og eksportere de tilsvarende data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multispektral billeddannelse af mIF-farvede histologiske sektioner gør det muligt at identificere og fænotypiske individuelle cellepopulationer og identifikation af tumor- og stromalkomponenter i explant TME (figur 2). Multispektral billeddannelse er især nyttig til analyse af væv med høj iboende autofluorescence, såsom væv med et højt kollagenindhold, da det gør det muligt for autofluorescencesignalet at blive devoluteret fra andre signaler og udelukket fra efterfølgende analyse. Efterfølgende i silico væv og celle segmentering tillader kvantificering af lægemiddelrespons med et væld af udgange, herunder, men ikke begrænset til, rå celle tal (f.eks procent positivitet), signalintensitet, cellestørrelse, vævsområde, og rumlige placering af de enkelte celler.
Væv og celle segmentering er derfor yderst nyttige for den kvantitative analyse af narkotikabehandling resultater og identifikation af tumor- og stromal-specifikke reaktioner. For eksempel giver farvning til Ki67 og cPARP sammen med en tumormarkør mulighed for kvantificering af henholdsvis spredning og celledødsniveauer i explants (Figur 3). I det givne eksempel kvantificeres Ki67- og cPARP-niveauerne for stromale og tumorregioner i PDF-områder som reaktion på det antiprogrammerede celledødsprotein 1 (PD-1) immunkontrolpunkthæmmer (ICI), nivolumab. Derudover giver evnen til at udtrække rumlige oplysninger fra farvede sektioner mulighed for beregning af intercell afstande samt afstande til tumorgrænser og andre strukturer. Derfor kan ændringer i cellefordelingen efter lægemiddelbehandling analyseres kvantitativt (Figur 4). Det viste eksempel repræsenterer PDE-behandling med nivolumab.
Figur 1: Arbejdsgang for generering og analyse af PDEs. (A) Nyopførte menneskelige tumorprøver behandles og arrangeres på en gennemtrængelig kulturindsatsskive, der flyder i kulturmedium. (B) Efter narkotikabehandling høstes eksplanterne, underkastes FFPE, og derefter afsnits til histologisk analyse, f.eks. (C) mIF farvning og scanning af vævssektionerne udføres for at generere multispektrale billeder, hvorfra individuelle signaler kan dekonvoluteres og analyseres separat. (D) Analyse af sammensatte billeder tillader adskillelse af tumor og stromal områder og vurdering af fænotypen af forskellige celletyper. Forkortelser: PDE = patientafledt explant; FFPE = fast i formalin, indlejret i paraffin; H&E = hæmatoxylin og eosin; mIF = multiplex immunfluorescence; HRP = peberrod peroxidase; H2O2 = hydrogenperoxid; Ab = antistof; TSA = tyramid signalforstærkning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel på en mIF-farvet vævssektion. NSCLC explant væv blev farves for markører for celle levedygtighed, nemlig cPARP (rød) og Ki67 (grøn) samt en pan-cytokeratin markør (gul) og DAPI (blå) for at markere kerner. Multispektral billeddannelse blev udført for at dekonvolvere fluorescerende signaler og fjerne autofluorescence. Billeder viser 20x forstørrelse af det markerede felt. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: mIF = multiplex immunofluorescence; NSCLC = ikke-småcellet lungekræft; cPARP = kløvet poly-ADP ribose polymerase; CK = cytokeratin; DAPI = 4'-6-diamidino-2-phenylindole; AF = autofluorescence. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af celledød og -spredning i PDE. Eksempel på kasse- og whiskerplotter, der viser apoptose induktion i NSCLC-PDEs efter 24 timers behandling med 5 μg/mL nivolumab sammenlignet med medium kontrol. Procentdelen af spredning (Ki67) og procentdel af apoptotiske celledød (cPARP) begivenheder vises i tumorområdet og stroma, henholdsvis. Hvert punkt repræsenterer en enkelt explant, boksens centrale linje repræsenterer medianen af fordelingen, og siderne af boksen (bund og top) repræsenterer henholdsvis første og tredje kvartiler. Fejllinjer repræsenterer det interkvilområde (længere end 1,5 x IQR). Forkortelser: PDE = patientafledt explant; NSCLC = ikke-småcellet lungekræft; cPARP = kløvet poly-ADP ribose polymerase; IQR = interkvilområde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Rumlig organisation efter lægemiddelbehandling. (A) Repræsentative billeder, der viser mIF-farvning af T-cellemarkører-CD4, FOXP3, CD8 (venstre panel)-udført på en melanom explant, og tilsvarende fænotypeanalyse (højre), der identificerer intercell-afstande mellem CD8+-celler og Treg-celler (CD4+/FOXP3+). Skalabarer = 200 μm. (B) Histogramplot, der viser øget afstand mellem cytotoksiske T-celler (CD8+) og Treg-celler (CD4+/FOXP3+) efter behandling af melanom-PDEs med 5 μg/mL nivolumab, hvilket bekræfter IO-lægemidlets on-target-virkninger. Tæthedsenheden udtrykkes som antallet af celler divideret med summen af alle celler pr. båndbredde. Forkortelser: mIF = multiplex immunofluorescence; CD = klynge af differentiering; FOXP3 = Gaffelhoved boks P3; PDE = patientafledt explant; NSCLC = ikke-småcellet lungekræft; IO = immunoonkologi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver metoderne til generering, lægemiddelbehandling og analyse af PDEs og fremhæver fordelene ved platformen som et præklinisk modelsystem. Ex vivo dyrkning af en frisk resected tumor, som ikke indebærer dens dekonstruktion, giver mulighed for fastholdelse af tumor arkitektur13,24 og dermed de rumlige interaktioner af cellulære komponenter i TME samt intratumoral heterogenitet. Denne metode viser, hvordan det ved hjælp af en tumorspecifik markør er muligt at identificere områder af tumorvæv versus områder af stroma og derfor adskille lægemiddelresponser inden for disse rum (Figur 3). Derudover kan flere biomarkører profilers samtidigt for at vurdere f.eks.
En tidligere publikation dokumenterede anvendelsen af denne PDE-platform til stratificering af NSCLC PDEs for standarden for pleje kemoterapi, cisplatin, viser, at det er muligt at adskille chemoresistant fra kemosensitive populationer24. Disse PDE-relaterede resultater afspejler patientens reaktioner. Ved at følge de metoder, der er beskrevet her, Er det muligt at foretage lignende tilgange til andre tumortyper og med forskellige typer af lægemidler, kemoterapi eller på anden måde. Adskillelsen af PDEs i lægemiddelfølsomme og lægemiddelresistente befolkninger skaber en uvurderlig ressource til at generere yderligere mekanistisk indsigt i lægemiddelresistens. For eksempel, fordi PDEs kan behandles for RNA, DNA, protein, eller metabolit isolation, dette kan gøre det muligt for gennemførelsen af "omic" teknologier til at identificere centrale biomarkører, der er forudsigende for respons. Alternativt kan FFPE-sektioner genereret fra behandlede PDF-filer bruges til omfattende rumlig profilering for at forstå, hvordan forskellige celletyper i PDE bidrager til lægemiddelresistens.
Dette kan lettes af yderligere udvikling inden for multispektral billeddannelse og massecytometri nærmer sig35,40,41,42,43, hvilket ville gøre det muligt at profilere hundredvis af biomarkører samtidigt. Prækliniske modeller, der evaluerer immunterapeutisk effekt, er meget efterspurgte, og dette papir viser, at PDF-filer kan udfylde denne kritiske niche (Figur 3 og Figur 4). Monoklonale antistoffer rettet mod immunkontrolpunkter, såsom cytotoksisk T-lymfocytantigen 4 og PD-1/programmeret død ligand-1 (PD-L1), er blevet udviklet44,45,46,47 med nogle bemærkelsesværdige forbedringer i den samlede patients overlevelse i et stort antal solide tumorer sammenlignet med standard kemoterapi. IMI'er er imidlertid effektive hos et begrænset antal patienter af grunde, der ikke er klare, hvilket nødvendiggør identifikation af prædiktive biomarkører48. Det fremragende træk ved ATBE-bevare 3D-arkitekturen af tumorvæv-letter evalueringen af ICI-effekt (Figur 3) og overvågning af immunceller som reaktion på ICI-behandling (Figur 4). PDE'er er således en ideel platform til at skelne mellem ICI-følsomme versus ICI-resistente tilfælde og til at undersøge de mekanismer, der ligger til grund for denne sondring.
PDE-teknologi lider under nogle få ulemper. Generering af nøjagtige, eksperimentelle resultater fra PDEs er afhængig af tumorintegritet, og lejlighedsvis tumorprøver efter operationen er for nekrotiske til at behandle for PDEs. På trods af nogle specifikke eksempler på tilbageholdelse af vævsintegritet efter langvarig kultur25er integritet og levedygtighed desuden gået tabt efter 72 timer i kulturen, og vævsopløsning forekommer. Tidsvinduet til at udføre lægemiddelforsøg er derfor relativt begrænset, der forbyder brugen af denne model til undersøgelse af mekanismerne for erhvervet lægemiddelresistens eller studiet af invasion og metastaser13. En udvidelse af explants' levedygtighed kan blive mulig i fremtiden gennem udvikling af nye teknologier, såsom stilladser og gennemsyrede kanaler, hvilket kan lette udbredelsen og udbredelsen af næringsstoffer, hvilket giver mulighed for en mere udvidet kultur.
Indtil disse forbedringer kan foretages, bør PDE-platformen dog betragtes som en kortsigtet kulturmetode, der kan give øjeblikkelige narkotikaresponsdata. Det bør anvendes sammen med andre modelsystemer, såsom organoider og PDX-modeller, der kan give mere langsigtede lægemiddelresponsdata. Samlet set er PDE-platformen et proof-of-concept præklinisk modelsystem, der er til brug ved bestemmelse af følsomheden af en patients tumor til et givet anticancermiddel, for at få indsigt i mekanismer for lægemiddelhandling i en reel tumor og til udvikling af prædiktive og farmakodynamiske biomarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Intet at afsløre
Acknowledgments
Vi takker kirurger og patologer på University Hospitals of Leicester NHS Trust for at give kirurgisk resected tumorvæv. Vi takker også Histology facilitet inden for Core Biotechnology Services for hjælp med vævsbehandling og ræsning af FFPE væv blokke og Kees Straatman for støtte med brug af Vectra Polaris. Denne forskning blev støttet og finansieret af Explant Consortium bestående af fire partnere: University of Leicester, MRC Toxicology Unit, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories og LifeArc. Der blev ydet yderligere støtte fra CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Finansiering af GM, CD og NA blev ydet af Breast Cancer Now's Catalyst Programme (2017NOVPCC1066), som støttes af midler fra Pfizer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, Suppl 1 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 15_suppl 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 4_suppl 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
