Summary
Dieser Beitrag beschreibt Methoden zur Generierung, medikamentösen Behandlung und Analyse von patientenabgeleiteten Explantaten zur Beurteilung von Tumormedikamentenreaktionen in einem lebenden, patientenrelevanten, präklinischen Modellsystem.
Abstract
Das Verständnis der Arzneimittelresistenz und die Entwicklung neuartiger Strategien zur Sensibilisierung hochresistenter Krebsarten beruhen auf der Verfügbarkeit geeigneter präklinischer Modelle, die das Ansprechen der Patienten genau vorhersagen können. Einer der Nachteile bestehender präklinischer Modelle ist die Unfähigkeit, die menschliche Tumormikroumgebung (TME) kontextuell zu erhalten und die intratumorale Heterogenität genau darzustellen, wodurch die klinische Übersetzung von Daten eingeschränkt wird. Im Gegensatz dazu ermöglicht die PDE-Plattform (Patient Derived Explant) durch die Darstellung der Kultur lebender Fragmente menschlicher Tumoren die Untersuchung von Arzneimittelreaktionen in einem dreidimensionalen (3D) Kontext, der die pathologischen und architektonischen Merkmale der ursprünglichen Tumoren so genau wie möglich widerspiegelt. Frühere Berichte mit PDEs haben die Fähigkeit der Plattform dokumentiert, chemosensitive von chemoresistenten Tumoren zu unterscheiden, und es wurde gezeigt, dass diese Segregation prädiktiv für das Ansprechen von Patienten auf dieselben Chemotherapien ist. Gleichzeitig ermöglichen PDEs die Möglichkeit, molekulare, genetische und histologische Merkmale von Tumoren zu untersuchen, die Arzneimittelreaktionen vorhersagen, wodurch Biomarker für die Patientenstratifizierung sowie neuartige interventionelle Ansätze zur Sensibilisierung resistenter Tumore identifiziert werden. Dieses Papier berichtet ausführlich über die PDE-Methodik, von der Sammlung von Patientenproben bis hin zur Endpunktanalyse. Es enthält eine detaillierte Beschreibung der Explantatableitungs- und Kulturmethoden und hebt gegebenenfalls maßgeschneiderte Bedingungen für bestimmte Tumore hervor. Für die Endpunktanalyse liegt der Schwerpunkt auf der multiplexierten Immunfluoreszenz und der multispektralen Bildgebung für die räumliche Profilierung wichtiger Biomarker sowohl in tumoralen als auch in stromalen Regionen. Durch die Kombination dieser Methoden ist es möglich, quantitative und qualitative Drug-Response-Daten zu generieren, die mit verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern in Beziehung gesetzt und somit potenziell für die Identifizierung von Biomarkern verwendet werden können.
Introduction
Die Entwicklung wirksamer und sicherer Krebsmedikamente erfordert geeignete präklinische Modelle, die auch Einblicke in Wirkmechanismen geben können, die die Identifizierung prädiktiver und pharmakodynamischer Biomarker erleichtern können. Es istbekannt,dass die inter- und intratumorische Heterogenität1,2,3,4,5 und die TME6,7,8,9,10,11 ,12 die Reaktionen auf Krebsmedikamente beeinflussen, und viele bestehende präklinische Krebsmodelle wie Zelllinien, Organoide und Mausmodelle sind nicht in der Lage, diese entscheidenden Funktionen. Ein "ideales" Modell ist eines, das die komplexen räumlichen Interaktionen von malignen mit nicht-malignen Zellen innerhalb von Tumoren rekapitulieren und die regionalen Unterschiede innerhalb von Tumoren widerspiegeln kann. Dieser Artikel konzentriert sich auf PDEs als eine aufstrebende Plattform, die viele dieser Anforderungen erfüllen kann13.
Das erste Beispiel für die Verwendung menschlicher PDEs, auch histokulturen genannt, stammt aus den späten 1980er Jahren, als Hoffman et al. Scheiben von frisch resezierten menschlichen Tumoren erzeugten und in einer Kollagenmatrixkultivierten 14,15. Dies beinhaltete die Etablierung eines 3D-Kultursystems, das die Gewebearchitektur bewahrte und die Aufrechterhaltung der Stromakomponenten und Zellinteraktionen innerhalb der TME sicherstellte. Ohne den ursprünglichen Tumor zu dekonstruieren, läuteten Hoffman et al.16 einen neuen Ansatz der translationalen Forschung ein, und seit dieser Zeit haben viele Gruppen verschiedene Explantatmethoden optimiert, mit dem Ziel, die Gewebeintegrität zu erhalten und genaue Arzneimittelreaktionsdaten zu generieren17,18,19,20,21,22,23,24 , obwohl einige Unterschiede zwischen den Protokollen offensichtlich sind. Butler et al. kultivierten Expflanzen in Gelatineschwämmen, um die Diffusion von Nährstoffen und Medikamenten durch die Probe20,21,25zu unterstützen, während Majumder et al. ein Tumorökosystem schufen, indem sie Explantaten auf einer Matrix kultivierten, die aus Tumor- und Stromalproteinen in Gegenwart von autologem Serum bestand, das vom selben Patienten stammt22, 23.
In jüngerer Zeit hat unsere Gruppe ein Protokoll aufgestellt, bei dem Explantaten durch Fragmentierung von Tumoren in 2 - 3 mm3-großeStücke erzeugt werden, die dann ohne zusätzliche Komponenten auf durchlässigen Membranen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche eines Kultursystems platziert werden24. Zusammengenommen haben diese zahlreichen Studien gezeigt, dass PDEs die Kultur intakter, lebender Fragmente menschlicher Tumoren ermöglichen, die die räumliche Architektur und regionale Heterogenität der ursprünglichen Tumoren beibehalten. In ursprünglichen Experimenten wurden Explantaten oder Histokulturen in der Regel nach einer medikamentösen Behandlung einer Homogenisierung unterzogen, wonach verschiedene Lebensfähigkeitstests auf die homogenisierten Proben angewendet wurden, wie der Histokultur-Wirkstoff-Response-Assay20,21, der MTT-Assay (3-(6)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid), der Lactatdehydrogenase-Assay oder der Resazurin-basierte Assay26,27,28 . Jüngste Fortschritte bei den Techniken der Endpunktanalyse, insbesondere der digitalen Pathologie, haben nun das Repertoire an Endpunkttests und Assays erweitert, die an Explantaten durchgeführt werden können29,30. Um diese neuen Technologien anzuwenden, werden Explantate anstelle der Homogenisierung in Formalin fixiert, in Paraffin (FFPE) eingebettet und dann mit Immunfärbungstechniken analysiert, was eine räumliche Profilierung ermöglicht. Beispiele für diesen Ansatz wurden für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC), Brustkrebs, Darmkrebs und Mesotheliom-Explantaten dokumentiert, wobei die immunhistochemische Färbung für den Proliferationsmarker Ki67 und den apoptotischen Marker, die gespaltene Poly-ADP-Ribose-Polymerase (cPARP), verwendet wurde, um Veränderungen in der Zellproliferation und im Zelltod zu überwachen24,31,32,33,34.
Die multiplexierte Immunfluoreszenz ist besonders geeignet für die räumliche Profilierung von Arzneimittelreaktionen in Explantaten am Endpunkt35. Beispielsweise ist es möglich, die Relokalisierung und räumliche Verteilung bestimmter Klassen von Immunzellen, wie Makrophagen oder T-Zellen, innerhalb der TME bei medikamentöser Behandlung13 , 36,37,38zumessen und zu untersuchen, ob einTherapeutikumden Übergang vom "kalten Tumor" zum "heißen Tumor" begünstigen kann39 . In den letzten Jahren hat sich diese Gruppe auf die Ableitung von PDEs aus verschiedenen Tumorarten (NSCLC, Nierenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Melanom) und die Erprobung einer Reihe von Krebsmedikamenten konzentriert, darunter Chemotherapien, niedermolekulare Inhibitoren und Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs). Endpunktanalysemethoden wurden optimiert, um die multiplexierte Immunfluoreszenz einzubeziehen, um eine räumliche Profilierung von Biomarkern für die Lebensfähigkeit sowie von Biomarkern für verschiedene Bestandteile der TME zu ermöglichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gewebeentnahme
- Nach der Operation frisch resezierte menschliche Tumorproben in ein Röhrchen mit 25 ml Frischekulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, ergänzt mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin + 1% (v/v) fetalem Kälberserum + 1% Penicillin-Streptomycin) und auf Eis gelagert. Verarbeiten Sie die Explantation innerhalb von 2 h nach der Operation in einer sterilen Haube der Klasse II.
2. Explant Vorbereitung
- Reinigen Sie alle chirurgischen Geräte (Transplantatklingen / Zahnwachsoberfläche / Pinzette) mit 70% iger industrieller Methylbenzinlösung (IMS).
- Füllen Sie eine 10 cm lange Kulturschale (siehe Materialtabelle)mit ~ 25 ml frischem Medium und legen Sie sie auf ein Eisbett.
- Übertragen Sie die Probe mit einer Pinzette auf eine Zahnwachsoberfläche (siehe Materialtabelle)und schneiden Sie das Gewebe mit zwei Hauttransplantatklingen in Fragmente von etwa2–3 mm3.
HINWEIS: Für eine optimale Leistung beginnen Sie mit dem Schneiden des Gewebes, um einen einzelnen Streifen von 2-3 mm Dicke zu erhalten, und schneiden Sie dann den Streifen entlang der Länge, um die endgültigen Explantate zu erhalten. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Probe gehackt ist. - Die Explantate zeitnah in das eiskalte Kulturmedium in der 10 cm großen Schale geben. Nehmen Sie einen Teil der Explantate (6-9 Stück), legen Sie sie in ein 1 ml Röhrchen, das 10% nicht gepufferte Formalinlösung enthält, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur (RT) für 24 h stehen.
HINWEIS: Diese Fragmente stellen die Kontrollexplantaten für den "unkultivierten" Zustand dar. - Füllen Sie die gewünschte Anzahl von Vertiefungen mit 6-Well-Platten mit 1,5 ml frischem Medium pro Vertiefung und legen Sie eine organotypische Kultureinlagenscheibe (siehe Materialtabelle)in jede Vertiefung, so dass sie auf dem Medium schwebt und Luftblasen an der Medieneinfügeschnittstelle sorgfältig vermeidet.
- Wählen Sie Explantate nach dem Zufallsprinzip aus und legen Sie sie nacheinander auf die Einlegescheibe. Um mit der "unkultivierten" Bedingung konsistent zu sein, verwenden Sie 6-9 Expflanzen pro Brunnen. Legen Sie die Multiwell-Platte in einen CO2 -Inkubator bei 37 °C und5% CO2und lassen Sie die Explantate 16 h lang zurückgewinnen.
HINWEIS: Um ein Zerquetschen des Gewebes zu vermeiden, wird ein schonender Umgang mit der Pinzette dringend empfohlen.
3. Medikamentöse Behandlung
- Nehmen Sie nach 16 h neue 6-Well-Platten, geben Sie 1,5 ml frisches Medium zu jeder Vertiefung hinzu, fügen Sie die relevanten Medikamente in den gewünschten Konzentrationen hinzu und fügen Sie eine Vertiefung für die Fahrzeugsteuerung hinzu. Bewegen Sie mit der Pinzette jeden Einsatz, der die Expflanzen enthält, auf die neu vorbereiteten 6-Well-Platten mit den Medikamenten. Legen Sie die Platten bei37 °C und 5% CO2 für 24–48 h in den CO 2-Inkubator.
- Die zuvor in Formalin fixierten unkultivierten Expflanzen werden in eine Histologiekassette (siehe Abschnitt 4 unten) überführt und bis zum Ende des Experiments in 70 % IMS gelagert.
4. Histologische Verarbeitung
- Gewebefixierung
- Nach der medikamentösen Behandlung die Insert-Discs, die die Explantate enthalten, in neue 6-Well-Platten mit 10% Formalin überführen und einige Tropfen 10% Formalin auf die Oberseite der Explantate geben, um eine vollständige Abdeckung mit dem Fixiermittel zu gewährleisten.
VORSICHT: Formalin ist gefährlich. Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit der Haut und behandeln Sie sie in einem Rauchfutter, um ein Einatmen zu verhindern. - Lassen Sie die Explantate über Nacht (20–24 h) im 10% igen Formalin verbleiben.
- Am nächsten Tag die relevante Anzahl kleiner Histologieschwämme in 70% IMS einweichen und in Histologiekassetten legen. Übertragen Sie vorsichtig alle Explantate aus einem bestimmten medikamentösen Behandlungszustand auf einen einzigen Schwamm (behalten Sie die Ausrichtung der Explantate bei, so dass die Seiten der Explantate in Kontakt mit den Insert-Discs und damit die mit Medikamenten behandelten Bereiche mit dem Schwamm in Kontakt gebracht werden). Legen Sie einen weiteren vorgesaugten Schwamm auf die Explantate und befestigen Sie ihn in einer Histologiekassette (eine Kassette pro Vertiefung / Behandlung).
- Tauchen Sie die Kassetten in 70% IMS und lassen Sie sie bei RT für 24 h stehen.
- Nach der medikamentösen Behandlung die Insert-Discs, die die Explantate enthalten, in neue 6-Well-Platten mit 10% Formalin überführen und einige Tropfen 10% Formalin auf die Oberseite der Explantate geben, um eine vollständige Abdeckung mit dem Fixiermittel zu gewährleisten.
- Paraffineinbettung und Gewebeschnitt
- Am folgenden Tag die Histologiekassetten mit den Explantaten in den Probenkorb des Gewebeprozessors (siehe Materialtabelle)überführen und den Deckel sichern. Legen Sie den Korb in die Retorte und schließen Sie ihn vorsichtig. Wählen Sie das gewünschte Programm aus und starten Sie den Prozessor. Lassen Sie die Retorte abtropfen, öffnen Sie sie, um den Korb zu entfernen, und geben Sie den Korb in das Einbettungszentrum Wachsbad.
- Nach dem Einbetten die Metallkassettendeckel in den Korb geben und für das Reinigungsprogramm in die Retorte des Tissue-Prozessors zurückkehren. Wischen Sie den Sensor mit einem trockenen Tuch ab, entfernen Sie überschüssiges Wachs aus dem Retortendeckel und fahren Sie mit dem Reinigungsprogramm fort.
- Positionieren Sie einen Paraffinblock im rotierenden Mikrotom, schneiden Sie einige Abschnitte bei 4 μm und bringen Sie den Block wieder auf Eis. Positionieren Sie den Block neu und schneiden Sie weitere 4 μm-Abschnitte. Übertragen Sie die Abschnitte mit einem kleinen Pinsel und einer Pinzette auf ein Wasserbad, um Falten und Blasen zu entfernen.
- Positionieren Sie die Schnitte mittig auf Objektträgern, lassen Sie die Objektträger einige Minuten ablaufen und legen Sie sie in ein Objektträgergestell, um sie über Nacht in einem Inkubator bei 37 ° C zu trocknen. Wenn die Abschnitte trocken sind, lagern Sie sie bei RT in einem Dia-Ordner oder einer Box, um sie vor Staub zu schützen.
5. Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung
- Füllen Sie den Färber (siehe Materialtabelle)mit Reagenzien und stellen Sie das erforderliche Programm für die H & E-Färbung ein: Hämatoxylin-Inkubationszeit: 5 min; Eosin Inkubationszeit: 3 min.
- Befestigen Sie das Schiebegestell am Träger, legen Sie es in den ersten Behälter mit Xylol und starten Sie das Programm. Entfernen Sie den Schieberträger aus dem Rack und bringen Sie den Behälter mit dem Schiebegestell in den Montagebereich.
- Montieren Sie die Objektträger mit Dibutylphthalat-Xylol (DPX) unter der Absaughaube. Legen Sie DPX auf jeden Deckglas und senken Sie den Schieber mit dem Abschnitt nach unten auf den Deckglas, damit sich der DPX ausbreiten kann.
HINWEIS: DPX ist gefährlich. Vermeiden Sie jeglichen Hautkontakt und verwenden Sie ihn in einem dafür vorgesehenen Abzug.
6. Immunfärbung
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten bei RT durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
- Deparaffinisierung und Rehydratation
- Legen Sie die Dias in ein Diagestell und erhitzen Sie sie bei 65 °C für 10 min, bevor Sie die Abschnitte für 3 min (2x) in Xylol entparaffinisieren. Minimieren Sie die Menge der Verschleppungslösung.
HINWEIS: Xylol ist brennbar, gefährlich und reizend. Griff in der Abzugshaube, während Sie doppellagige Handschuhe verwenden. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt. Entsorgen Sie den Abfall in einem versiegelten Behälter. - Rehydrieren Sie die Objektträger in einem Alkoholgradienten wie folgt: 99% IMS für 1 min (2x) und 95% IMS für 1 min. Minimieren Sie die Menge der Verschleppungslösung.
HINWEIS: IMS ist leicht entzündlich, flüchtig und reizend. Griff in den Abzug und Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt. - Tauchen Sie das Schiebegestell 5 Minuten lang vollständig in hochreinem (UP) Wasser ein.
- Legen Sie die Dias in ein Diagestell und erhitzen Sie sie bei 65 °C für 10 min, bevor Sie die Abschnitte für 3 min (2x) in Xylol entparaffinisieren. Minimieren Sie die Menge der Verschleppungslösung.
- Antigen-Retrieval
- Bereiten Sie den Antigen-Retrieval-Puffer gemäß den Richtlinien des Herstellers für den jeweiligen verwendeten Antikörper vor.
ANMERKUNG: Citratpuffer 0,2 M, pH 6 oder Tris(Hydroxymethyl)aminomethan (Tris)-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 0,1 M, pH 9 sind die üblichen Puffer, die für saure bzw. alkalische Bedingungen verwendet werden. Zitronensäuremonohydrat und Tris sind Reizstoffe. Bereiten Sie alle Lagerlösungen im Abzug vor. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. - Tauchen Sie das Rack mit den Objektträgern in den Antigen-Retrieval-Puffer und die Mikrowelle (siehe Materialtabelle)bei voller Leistung (800 W) für 20 Minuten.
HINWEIS: Halten Sie die Folien während des gesamten Vorgangs vollständig im Puffer untergetaucht. Um eine übermäßige Reduzierung des Puffervolumens zu vermeiden, legen Sie einen Deckel auf den verwendeten Behälter.
- Bereiten Sie den Antigen-Retrieval-Puffer gemäß den Richtlinien des Herstellers für den jeweiligen verwendeten Antikörper vor.
- Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF)
HINWEIS: Dieser Vorgang dauert 1–2 Tage.- Füllen Sie einen sauberen Behälter mit 250 ml UP-Wasser und tauchen Sie das Schiebegestell für 2 min (2x) vollständig ein. Fahren Sie mit dem Zusammenbau jedes Objektträgers zu einer Diadeckplatte fort (siehe Tabelle der Materialien).
- Um einen Schlitten auf einer Deckplatte zusammenzusetzen, bereiten Sie einen Glastrog mit Wasser vor. Tauchen Sie sowohl die Deckplatte als auch den Gleiter in das Wasser und legen Sie den Gewebeabschnitt seitlich auf die Deckplatte.
- Positionieren Sie die untere Kante des Objektträgers oben auf den Ausstülpungen an der Unterseite der Deckplatte und richten Sie den Schlitten schließlich an der Abdeckplatte aus, so dass das Wasser den Spalt dazwischen füllen kann, ohne dass Luft eingeschlossen ist. Halten Sie die Abdeckplatte zusammen und schieben Sie sie zusammen und legen Sie sie in ein Abdeckplattengestell.
- Füllen Sie die Deckplatte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und warten Sie, bis der Puffer die durch Schwerkraft (2x) abfließenden Objektträger gewaschen hat. Pipet 110 μL Blockierpuffer (siehe Tabelle der Materialien)auf jede Deckplatte und inkubieren Sie für 10 min.
- Bereiten Sie die gewünschte primäre Antikörperverdünnung in PBS oder Blockierpuffer gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor. Inkubieren Sie die Objektträger mit primärem Antikörper (110 μL pro Objektträger) für 30 min. Waschen Sie die Objektträger mit 5 ml PBS (2x), wie in 6.3.2 beschrieben.
- Die Objektträger mit 110 μL Meerrettichperoxidase-Polymer für 30 min inkubieren. Waschen Sie die Objektträger mit 5 ml PBS (2x), wie in 6.3.2 beschrieben.
- Die Fluorophorverdünnung in Amplifikationsverdünner 1:100 (v/v) vorbereiten und die Objektträger mit Fluorophor (110 μL pro Objektträger) für 10 min inkubieren. Waschen Sie die Objektträger mit 5 ml PBS (2x), wie in 6.3.2 beschrieben.
HINWEIS: Befolgen Sie für die Verwendung von Fluorophor 780 die Richtlinien des Herstellers. Das Experiment kann hier unterbrochen werden, wenn die Objektträger in der letzten Wäsche von PBS inkubiert und über Nacht bei 4 °C gelagert werden. - Lösen Sie die Objektträger von den Deckplatten und kehren Sie zum Antigen-Retrieval-Schritt zurück, um die Färbung mit einem anderen Antikörper zu beginnen. Wiederholen Sie die Färbung für die gewünschte Anzahl von Antikörpern, die getestet werden sollen.
- Halten Sie nach Schritt 6.3.5 für das letzte verwendete Fluorophor die Objektträger auf den Deckplatten, bereiten Sie eine 6-μM-Lösung mit 4'-6-Diamidino-2-phenylindolat (DAPI) -Dilactat mit UP-Wasser vor und halten Sie die Objektträger für 5 min (110 μL pro Objektträger) auf. Waschen Sie die Objektträger mit UP-Wasser (2x) und entfernen Sie überschüssiges Wasser, indem Sie die Ränder der Objektträger trocknen. Montieren Sie die Deckgläser auf den Dias mit einem Montagemedium und lagern Sie sie bei RT im Dunkeln.
- Füllen Sie einen sauberen Behälter mit 250 ml UP-Wasser und tauchen Sie das Schiebegestell für 2 min (2x) vollständig ein. Fahren Sie mit dem Zusammenbau jedes Objektträgers zu einer Diadeckplatte fort (siehe Tabelle der Materialien).
7. Scannen
HINWEIS: Das Scannen von Objektträgern wurde mit einem multispektralen automatisierten Bildgebungssystem durchgeführt (siehe Materialtabelle).
- Montieren Sie die Dias in den Träger und legen Sie sie in der gewünschten Reihenfolge in den Scanner ein.
HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Kontrollobjektträger beizufügen, in dem während der immunhistochemischen Färbung kein Fluorophor oder DAPI verwendet wird. Dieser Objektträger wird als Kontrolle für die intrinsische Blüte (Autofluoreszenz (AF)) des Gewebes verwendet. - Nachdem Sie die Diascanner-Software gestartet haben, wählen Sie auf der Startseite Protokoll bearbeiten aus. Erstellen Sie ein neues Protokoll, das sich mit dem Namen, dem Bildgebungsmodus, der Art des durchzuführenden multispektralen Scans (4–7 Kanäle) und der Studie (Verzeichnis) befasst.
HINWEIS: Um die Standardeinstellungen der analysierten Bänder zu ändern, aktivieren/deaktivieren Sie die gewünschten Filter mit der Funktion Scanbänder auswählen - Fahren Sie mit Scan Exposure und Load Carrierfort und wählen Sie schließlich den Carrier für die Protokolleinrichtung aus. Wählen Sie Übersicht übernehmen, um das Gewebe auf dem Objektträger zu erkennen. Wählen Sie eine Folie, die auf dem Trägerangezeigt wird, und wählen Sie einen bestimmten Bereich des Gewebes mit dem roten Cursor aus, um ihn im linken Fenster des Bildschirms in die Live-Ansicht zu bringen.
- Wählen Sie den DAPI-Filteraus und klicken Sie auf Autofokus oder passen Sie den Schieberegler Bühnenhöhe manuell an, um das Interessengebiet zu fokussieren. Klicken Sie auf Autoexpose, damit das System die beste Belichtung für diesen Filter / dieses Band finden kann.
HINWEIS: Die Belichtungszeit für jeden Filter ist auf 12 ms eingestellt. Nachdem Sie das System automatisch belichtet haben, verfeinern Sie die Belichtungszeit auf eine bessere Schätzung. Es ist auch möglich, den Autobelichtungswert zu überschreiben, indem Sie einen Wert manuell in die markierte Zelle eingeben. - Wiederholen Sie die obigen Schritte für alle Filter im Protokoll. Ändern Sie bei Bedarf die Positionen und/oder Dias, um die besten Signale für die Einstellung der Belichtungen zu finden.
HINWEIS: Wenn das Gewebe in der Live-Ansicht rot hervorgehoben ist, ist das Fluoreszenzsignal des analysierten Filters gesättigt und die Autobelichtung muss wiederholt werden. - Sobald die Belichtungseinstellungen festgelegt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Zurück und speichern Sie das Protokoll. Wählen Sie auf der Software-Homepage (siehe Materialtabelle) dieOption Folien scannenaus.
- Stapeln Sie alle zu scannenden Träger in das Slide Carrier Hotelund notieren Sie sich die Reihenfolge der Dias, um ihre ID dem System zuzuweisen.
HINWEIS: Auf dem Softwarebildschirm wird jeder Träger mit einem Steckplatz mit 4 Dias verknüpft. - Um mehrere Folien mit den gleichen Parametern zu konfigurieren, klicken Sie auf Tasks konfigurierenund wählen Sie einen oder mehrere Slots mit der Option Using the same rules for the same slides. Sobald die Folien bearbeiten geöffnet ist, konfigurieren Sie: Aufgaben, Studieund Protokoll, und klicken Sie auf OK.
- Beschriften Sie jede Folie, indem Sie auf das Symbol Steckplatz klicken, und geben Sie einen Namen in die Zelle Folien-ID ein. Klicken Sie auf Scannen, um den Scanvorgang zu starten.
HINWEIS: Sobald das Slot-Symbol blau wird und die Dias mit einem blauen Pfeil markiert sind, hat der Träger alle Regeln und kann gescannt werden. Es ist möglich, die Folien-IDs, Studien, Protokolle und Aufgaben zu speichern, indem Sie auf die Schaltfläche Setup speichern klicken.
8. Würdigung
HINWEIS: Das folgende Protokoll veranschaulicht die Methode zur Phänotypanalyse.
- Bildvorbereitung
- Um die Bilder für die Analyse vorzubereiten, öffnen Sie die Viewer-Software (siehe Materialtabelle)und wählen Sie Folien laden. Wählen Sie auf der rechten Seite des Bildschirms die gewünschten Scans für das Trainingsprojekt aus.
- Klicken Sie für jeden Scan auf Stempelund wählen Sie Projekt im Feld Auswählen für: Definieren Sie einen Stempel mit der Größe 1 x 1 im Bildfeld, der später als Vorlage für die Trainingsanalyse verwendet werden soll. Beachten Sie, dass dieser Stempel als rotes Quadrat markiert wird.
HINWEIS: Die Anzahl der Stempelanmerkungen für das Projekt ist beliebig. Es wird empfohlen, einen für den intrinsischen Fluoreszenzscan und einige weitere zu erzeugen, die im Allgemeinen repräsentativ für die Signalverteilung innerhalb des Gewebes sind. - Öffnen Sie schließlich alle Scans des Experiments. Klicken Sie für jeden einzelnen auf Stempel, und wählen Sie diesmal die Option Stapel im Feld Auswählen für: Platzieren Sie einen Stempel, der jede Expflanze umschreibt.
HINWEIS: Diesmal werden die Stempel als grüne Quadrate markiert und sind erforderlich, sobald die Chargenanalyse gestartet ist. Wählen Sie die geeignete Größe für die Briefmarken (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) und vermeiden Sie Überlappungen der Stempel, die doppelte Daten in der exportierten Datei erzeugen würden.
- Trainingsanalyse
- Starten Sie die Software für die Analyse (siehe Tabelle der Materialien)und erstellen Sie ein neues Projekt: Wählen Sie Datei | Neue | Projekt.
- Geben Sie einen Namen in das Feld Projektname ein, und konfigurieren Sie den Projekttyp.
ANMERKUNG: Die Experimente wurden unter Verwendung der folgenden Spezifikationen durchgeführt: trainierbare Gewebesegmentierung; adaptive Zellsegmentierung; Phänotypisierung. - Laden Sie die Scans mit den Stempeln für das Training: Datei | | öffnen Bild. Navigieren Sie in der Singlemode-Ansichtdurch die Bilder und wählen Sie die Scans mit intrinsischer Fluoreszenz aus.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Autofluoreszenz (AF) und zeichnen Sie mit der Autofluoreszenz-Auswahlauf einen nicht gefärbten Teil des Gewebes. Klicken Sie auf Bilder vorbereiten, damit die Software die Intensität der intrinsischen Fluoreszenz von allen zum Training hochgeladenen Bildern subtrahieren kann.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Markierungen und Farben bearbeiten und geben Sie die Markernamen in das Feld ein, das mit ihrem Fluorophor verknüpft ist. Klicken Sie auf den Schritt Gewebe segmentieren oben auf dem Bildschirm, um das Fenster Gewebesegmentierungstraining zu öffnen.
- Geben Sie im Fenster Gewebekategorien den Namen der Gewebekategorien ein, in die die Bilder unterteilt werden sollen (z. B. Tumor, Stroma, Hintergrund, Nekrose).
- Klicken Sie im Fenster Gewebesegmentierungstraining auf die Schaltfläche Zeichnen und zeichnen Sie Regionen um Zellgruppen, um eine Gewebekategorie von Interesse zu definieren. Um beispielsweise einen Tumorbereich zu definieren, zeichnen Sie eine Region um eine Gruppe von Tumorzellen. Wechseln Sie zur nächsten Kategorie und wiederholen Sie den Zeichenvorgang.
HINWEIS: Es wird empfohlen, in den meisten Bildern, die für das Training hochgeladen wurden, Regionen zu zeichnen. Es ist auch möglich, das Training zu verfeinern, indem Sie die Musterskala und die Segmentierungsauflösung bearbeiten, deren Details im Benutzerhandbuch besser beschrieben sind. - Nachdem Sie die Trainingsregionen definiert haben, fahren Sie mit Train the Tissue Segmenterfort.
HINWEIS: Während des Trainingsprozesses zeigt die Software den Prozentsatz der Genauigkeit der Gewebesegmentierung an. Für optimale Ergebnisse wird empfohlen, dass die Gewebesegmentierung mindestens 90% genau ist. Sobald sich der Segmenter stabilisiert hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig. - Um die Gewebekategorie-Maske auf allen Bildern anzuzeigen, klicken Sie auf die Schaltfläche Alle segmentieren.
- Nachdem Sie die Qualität der Gewebesegmentierung überprüft haben, zeichnen Sie die Trainingsregionen um die Bereiche, die falsch klassifiziert wurden, neu und trainieren Sie den Tissue Segmenter neu, bis der Prozess erfolgreich ist.
- Klicken Sie auf den Schritt Zellsegmentierung in der Schrittleiste oben im Fenster, um mit der Analyse fortzufahren.
- Wählen Sie die zellularen Kompartimente, um sie zu segmentieren: Kerne, Zytoplasmaund / oder Membran.
HINWEIS: Da die adaptive Zellsegmentierung nur Zellen mit Kernsignal erkennen kann, sollten Sie die Kerne nicht auswählen. Obwohl es auch möglich ist, Zytoplasma und/oder Membran zu segmentieren, wird empfohlen, zuerst die stärkste und am häufigsten vorkommende Kernkomponente (z. B. DAPI) zu wählen. - Konfigurieren Sie die Kernkomponente mit dem Schieberegler Typische Intensität, um den Schwellenwert anzupassen, der zum Erkennen von Kernpixeln verwendet wird. Beachten Sie das Vorschaufenster, das sich öffnet und Live-Feedback gibt, wenn der Schwellenwert angepasst wird.
HINWEIS: Dieser Schwellenwert ist adaptiv und wird relativ zum umgebenden Hintergrund gemessen. Erhöhen Sie diesen Wert, wenn zu viel Hintergrund als nuklear erkannt wird. Senken Sie diesen Wert, wenn schwache Kerne übersehen werden. Verwenden Sie die Schaltfläche Ein-/Ausblenden von Bereichen, um die Segmentierungsmasken ein- und auszublenden und zu überprüfen, ob die richtigen Pixel als nuklear erkannt werden. - Um Cluster von Kernpixeln zu teilen, verwenden Sie das Bedienfeld "Kernkomponentenaufteilung". Wählen Sie die Schaltfläche, die die Färbequalität der Kerne am besten beschreibt. Verwenden Sie dann den Schieberegler, um die Teilungsempfindlichkeitanzupassen, wobei zu beachten ist, dass niedrigere Werte zu einer stärkeren Aufteilung führen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle segmentieren, um alle Bilder zu segmentieren. Wenn das Ergebnis nicht korrekt ist, ändern Sie die Einstellungen und trainieren Sie die Software neu, bis eine zufriedenstellende Segmentierung erreicht ist.
- Fahren Sie mit dem letzten Schritt der Analyse fort: Phänotypisierung. Fügen Sie im Bedienfeld "Phänotypen" die Liste der zu erkennenden Phänotypen hinzu, und geben Sie den Namen in das entsprechende Textfeld ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Phänotypen bearbeiten, wählen Sie eine bestimmte Zelle aus, um ein Dropdown-Menü aufzurufen, und wählen Sie den entsprechenden Phänotyp aus.
HINWEIS: Mindestens fünf Zellen für jeden Phänotyp sind notwendig, um den Klassifikator zu trainieren. Das Ausschalten der Visualisierung der Kerne ermöglicht eine bessere Visualisierung des Zellphänotyps, der zugewiesen werden muss. - Sobald die Auswahl für das Training abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Train Classifier.
HINWEIS: Die Software klassifiziert jede einzelne Zelle im Bild, und wann immer Fehler in der Klassifizierung auftreten, ist es möglich, den Phänotyp der Zellen zu bearbeiten und das Training des Klassifikators zu wiederholen. Speichern Sie das Projekt, bevor Sie mit der Stapelanalyse fortfahren, und klicken Sie in der Symbolleiste oben auf dem Bildschirm auf Exportieren. - Wählen Sie im linken Menü die Registerkarte Bath-Analyse aus, und laden Sie das Projekt in das Feld Batch-Algorithmus oder Projekt.
- Klicken Sie auf Exportoptionen, um separate Verzeichnisse für jedes Bild zu erstellen, und navigieren Sie mit der Schaltfläche Durchsuchen, um den Speicherort für den Export der Daten zu finden. Klicken Sie auf alle Optionen der zu exportierenden Bilder und Tabellen.
- Klicken Sie auf der rechten Seite des Bildschirms auf Folien hinzufügen und laden Sie alle Bilder, die Stempel für zuvor vorbereitete Stapel enthalten (Schritt 7.3). Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Stapelanalyse zu starten und einen Stempel nach dem anderen zu verarbeiten und die entsprechenden Daten zu exportieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die multispektrale Bildgebung von mIF-gefärbten histologischen Schnitten ermöglicht die Identifizierung und Phänotypisierung einzelner Zellpopulationen sowie die Identifizierung von Tumor- und Stromakomponenten im explantierten TME (Abbildung 2). Die multispektrale Bildgebung ist besonders nützlich für die Analyse von Geweben mit hoher intrinsischer Autofluoreszenz, wie z. B. Gewebe mit hohem Kollagengehalt, da sie es ermöglicht, das Autofluoreszenzsignal von anderen Signalen zu entpacken und von der anschließenden Analyse auszuschließen. Die anschließende In-silico-Gewebe- und Zellsegmentierung ermöglicht die Quantifizierung der Arzneimittelreaktion mit einer Vielzahl von Ergebnissen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf rohe Zellzahlen (z. B. prozentuale Positivität), Signalintensität, Zellgröße, Gewebefläche und räumliche Lage einzelner Zellen.
Die Gewebe- und Zellsegmentierung ist daher äußerst nützlich für die quantitative Analyse medikamentöser Behandlungsergebnisse und die Identifizierung tumor- und stromaspezifischer Reaktionen. Zum Beispiel ermöglicht die Färbung für Ki67 und cPARP neben einem Tumormarker die Quantifizierung von Proliferations- bzw. Zelltodwerten in Explantaten (Abbildung 3). Im gegebenen Beispiel werden Ki67- und cPARP-Spiegel für Stroma- und Tumorregionen in PDEs als Reaktion auf den antiprogrammierten Immun-Checkpoint-Inhibitor (ICI) Nivolumab für das antiprogrammierte Zelltodprotein 1 (PD-1) Quantitiert. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, räumliche Informationen aus gefärbten Schnitten zu extrahieren, die Berechnung von Interzellenabständen sowie Entfernungen zu Tumorgrenzen und anderen Strukturen. Daher können Veränderungen der Zellverteilung nach medikamentöser Behandlung quantitativ analysiert werden (Abbildung 4). Das gezeigte Beispiel stellt die PDE-Behandlung mit Nivolumab dar.
Abbildung 1: Arbeitsablauf zur Erzeugung und Analyse von PDEs. (A) Frisch resezierte menschliche Tumorproben werden aufbereitet und auf einer durchlässigen Kultureinlegescheibe angeordnet, die in Kulturmedium schwebt. (B) Nach medikamentöser Behandlung werden die Explantate geerntet, FFPE unterzogen und dann für die histologische Analyse, z. B. für die H&E-Färbung, geschnitten. (C) mIF-Färbung und Abtastung der Gewebeschnitte werden durchgeführt, um multispektrale Bilder zu erzeugen, aus denen einzelne Signale dekonvolutiert und separat analysiert werden können. (D) Die Analyse von zusammengesetzten Bildern ermöglicht die Trennung von Tumor- und Stromabereichen und die Beurteilung des Phänotyps verschiedener Zelltypen. Abkürzungen: PDE = patient-derived explant; FFPE = fixiert in Formalin, eingebettet in Paraffin; H & E = Hämatoxylin und Eosin; mIF = Multiplex-Immunfluoreszenz; HRP = Meerrettichperoxidase; H2O2 = Wasserstoffperoxid; Ab = Antikörper; TSA = Tyramid-Signalverstärkung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiel eines mIF-gefärbten Gewebeschnitts. NSCLC-Explantatgewebe wurde für Marker der Zelllebensfähigkeit gefärbt, nämlich cPARP (rot) und Ki67 (grün) sowie einen Pan-Cytokeratin-Marker (gelb) und DAPI (blau), um Kerne zu markieren. Multispektrale Bildgebung wurde durchgeführt, um die fluoreszierenden Signale zu dekonvolutieren und Autofluoreszenz zu entfernen. Die Bilder zeigen die 20-fache Vergrößerung des ausgewählten Feldes. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: mIF = Multiplex-Immunfluoreszenz; NSCLC = nicht-kleinzelliger Lungenkrebs; cPARP = gespaltene Poly-ADP-Ribose-Polymerase; CK = Cytokeratin; DAPI = 4'-6-Diamidino-2-phenylindol; AF = Autofluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung des Zelltods und der Zellproliferation in PDEs. Beispiel für Box- und Whisker-Plots, die die Apoptose-Induktion bei NSCLC PDEs nach 24 h Behandlung mit 5 μg/ml Nivolumab im Vergleich zur Mittelkontrolle zeigen. Der Prozentsatz der Proliferation (Ki67) und der Prozentsatz der apoptotischen Zelltodereignisse (cPARP) wird im Tumorbereich bzw. stroma angezeigt. Jeder Punkt stellt eine einzelne Expflanze dar, die zentrale Linie der Box stellt den Median der Verteilung dar, und die Seiten der Box (unten und oben) stellen das erste bzw. dritte Quartil dar. Fehlerindikatoren stellen den Interquartilsbereich dar (weiter als 1,5 x IQR). Abkürzungen: PDE = patient-derived explant; NSCLC = nicht-kleinzelliger Lungenkrebs; cPARP = gespaltene Poly-ADP-Ribose-Polymerase; IQR = Interquartilsbereich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Räumliche Organisation nach medikamentöser Behandlung. (A) Repräsentative Bilder, die die mIF-Färbung von T-Zell-Markern - CD4, FOXP3, CD8 (linkes Bild) - an einem Melanom-Explantat zeigen, und entsprechende Phänotypanalyse (rechts), die Interzellabstände zwischen CD8+-Zellen und Treg-Zellen (CD4+/FOXP3+) identifiziert. Skalenbalken = 200 μm. (B) Histogramm-Diagramm, das einen erhöhten Abstand zwischen zytotoxischen T-Zellen (CD8+) und Treg-Zellen (CD4+/FOXP3+) nach Behandlung von Melanom-PDEs mit 5 μg/ml Nivolumab zeigt und die On-Target-Effekte des IO-Arzneimittels bestätigt. Die Dichteeinheit wird ausgedrückt als die Anzahl der Zellen geteilt durch die Summe aller Zellen pro Bandbreite. Abkürzungen: mIF = Multiplex-Immunfluoreszenz; CD = Cluster der Differenzierung; FOXP3 = Gabelkopfbox P3; PDE = vom Patienten abgeleitete Explantate; NSCLC = nicht-kleinzelliger Lungenkrebs; IO = Immunonkologie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieser Beitrag beschreibt die Methoden zur Erzeugung, medikamentösen Behandlung und Analyse von PDEs und beleuchtet die Vorteile der Plattform als präklinisches Modellsystem. Die Ex-vivo-Kultivierung eines frisch resezierten Tumors, die keine Dekonstruktion beinhaltet, ermöglicht die Beibehaltung der Tumorarchitektur13,24 und damit der räumlichen Wechselwirkungen zellulärer Komponenten in der TME sowie der intratumoralen Heterogenität. Diese Methode zeigt, wie es durch die Verwendung eines tumorspezifischen Markers möglich ist, Bereiche von Tumorgewebe gegenüber Bereichen von Stroma zu identifizieren und somit Arzneimittelreaktionen innerhalb dieser Kompartimente zu trennen (Abbildung 3). Zusätzlich können mehrere Biomarker gleichzeitig profiliert werden, um beispielsweise die On-Target-Bewegung von Immunzellen innerhalb der TME zu beurteilen (Abbildung 4).
Eine frühere Veröffentlichung dokumentierte die Anwendung dieser PDE-Plattform auf die Stratifizierung von NSCLC PDEs für die Standard-Chemotherapie, Cisplatin, und zeigte, dass es möglich ist, Chemoresistant von chemosensitiven Populationen zu trennen24. Diese PDE-bezogenen Befunde spiegeln die Reaktionen der Patienten wider. Durch die Befolgung der hier beschriebenen Methoden ist es möglich, ähnliche Ansätze für andere Tumorarten und mit verschiedenen Arten von Medikamenten, Chemotherapeutika oder anderweitig durchzuführen. Die Trennung von PDEs in arzneimittelempfindliche und arzneimittelresistente Populationen schafft eine unschätzbare Ressource, um weitere mechanistische Einblicke in die Arzneimittelresistenz zu gewinnen. Da PDEs beispielsweise für die Isolierung von RNA, DNA, Proteinen oder Metaboliten verarbeitet werden können, kann dies die Implementierung von "omischen" Technologien ermöglichen, um wichtige Biomarker zu identifizieren, die das Ansprechen vorhersagen. Alternativ können FFPE-Abschnitte, die aus behandelten PDEs generiert werden, für ein umfangreiches räumliches Profiling verwendet werden, um zu verstehen, wie verschiedene Zelltypen in der PDE zur Arzneimittelresistenz beitragen.
Dies könnte durch weitere Entwicklungen in den multispektralen Bildgebungs- und Massenzytometrieansätzen35,40,41, 42,43erleichtert werden, die es ermöglichen würden, Hunderte von Biomarkern gleichzeitig zu profilieren. Präklinische Modelle, die die immuntherapeutische Wirksamkeit bewerten, sind sehr gefragt, und dieses Papier zeigt, dass PDEs diese kritische Nische füllen können (Abbildung 3 und Abbildung 4). Monoklonale Antikörper, die auf Immun-Checkpoints abzielen, wie zytotoxisches T-Lymphozyten-Antigen 4 und PD-1 /programmierter Todesligand-1 (PD-L1), wurdenentwickelt 44,45,46,47 mit einigen bemerkenswerten Verbesserungen des Gesamtüberlebens des Patienten bei einer großen Anzahl solider Tumoren im Vergleich zur Standardchemotherapie. ICIs sind jedoch bei einer begrenzten Anzahl von Patienten aus Gründen wirksam, die nicht klar sind, was die Identifizierung prädiktiver Biomarker erforderlich macht48. Die herausragende Eigenschaft von PDEs - die Erhaltung der 3D-Architektur von Tumorgewebe - erleichtert die Bewertung der ICI-Wirksamkeit (Abbildung 3) und die Überwachung von Immunzellen als Reaktion auf eine ICI-Behandlung (Abbildung 4). Daher sind PDEs eine ideale Plattform, um ICI-sensitive von ICI-resistenten Fällen zu unterscheiden und die Mechanismen zu untersuchen, die dieser Unterscheidung zugrunde liegen.
Die PDE-Technologie leidet unter einigen Nachteilen. Die Generierung genauer, experimenteller Ergebnisse aus PDEs hängt von der Tumorintegrität ab, und gelegentlich sind Tumorproben nach der Operation zu nekrotisch, um sie für PDEs zu verarbeiten. Darüber hinaus ist trotz einiger spezifischer Beispiele für die Beibehaltung der Gewebeintegrität nach längerer Kultur25in den meisten berichteten Fällen die Integrität und Lebensfähigkeit nach 72 h in Kultur verloren gegangen, und es kommt zu Gewebezerfall. Das Zeitfenster für die Durchführung von Drogenexperimenten ist daher relativ begrenzt, so dass die Verwendung dieses Modells für die Untersuchung der Mechanismen der erworbenen Arzneimittelresistenz oder die Untersuchung von Invasion und Metastasierung verbotenist 13. Die Erweiterung der Lebensfähigkeit von Expflanzen könnte in Zukunft durch die Entwicklung neuer Technologien wie Gerüste und durchblutete Kanäle möglich werden, die die Diffusion und Aufnahme von Nährstoffen erleichtern und eine längere Kultur ermöglichen können.
Bis diese Verbesserungen jedoch vorgenommen werden können, sollte die PDE-Plattform als kurzfristige Kulturmethode betrachtet werden, die sofortige Daten zum Ansprechen auf Medikamente liefern kann. Es sollte zusammen mit anderen Modellsystemen wie Organoiden und PDX-Modellen verwendet werden, die längerfristige Daten zum Ansprechen auf Arzneimittel liefern können. Insgesamt ist die PDE-Plattform ein präklinisches Proof-of-Concept-Modellsystem, das bei der Bestimmung der Empfindlichkeit des Tumors eines Patienten gegenüber einem bestimmten Krebsmittel, bei der Ableitung von Einblicken in die Mechanismen der Arzneimittelwirkung in einem realen Tumor und bei der Entwicklung prädiktiver und pharmakodynamischer Biomarker von Nutzen ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nichts zu enthüllen
Acknowledgments
Wir danken den Chirurgen und Pathologen des University Hospitals of Leicester NHS Trust für die Bereitstellung von chirurgisch reseziertem Tumorgewebe. Wir danken auch der Histology-Einrichtung innerhalb von Core Biotechnology Services für die Hilfe bei der Gewebeverarbeitung und dem Schneiden von FFPE-Gewebeblöcken und Kees Straatman für die Unterstützung bei der Verwendung des Vectra Polaris. Diese Forschung wurde vom Explant Consortium unterstützt und finanziert, das aus vier Partnern besteht: der University of Leicester, der MRC Toxicology Unit, den Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories und LifeArc. Zusätzliche Unterstützung kam vom CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Die Finanzierung für GM, CD und NA wurde durch das Catalyst-Programm von Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066) bereitgestellt, das durch Eine Finanzierung von Pfizer unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, Suppl 1 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 15_suppl 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 4_suppl 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
