Summary
Qui viene presentato un protocollo per isolare e trasfezionare le cellule epiteliali primarie dell'iride e del pigmento retinico da vari mammiferi (topi, ratti, conigli, suini e bovini). Il metodo è ideale per studiare approcci di terapia genica oculare in vari set-up per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo.
Abstract
La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è la causa più frequente di cecità nei pazienti >60 anni, che colpisce circa 30 milioni di persone in tutto il mondo. L'AMD è una malattia multifattoriale influenzata da fattori ambientali e genetici, che portano a compromissione funzionale della retina a causa della degenerazione cellulare epiteliale pigmentata retinica (RPE) seguita dalla degradazione dei fotorecettori. Un trattamento ideale includerebbe il trapianto di cellule RPE sane che secernono fattori neuroprotettivi per prevenire la morte delle cellule RPE e la degenerazione dei fotorecettori. A causa delle somiglianze funzionali e genetiche e della possibilità di una biopsia meno invasiva, il trapianto di cellule epiteliali pigmentate dell'iride (IPE) è stato proposto come sostituto dell'RPE degenerato. La secrezione di fattori neuroprotettivi da parte di un basso numero di cellule trapiantate subretinamente può essere ottenuta mediante trasfezione mediata da trasposoni(SB100X)con geni che codificano per il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) e / o il fattore stimolante le colonie di macrofagi dei granulociti (GM-CSF). Abbiamo stabilito l'isolamento, la coltura e la trasfezione mediata da SB100Xdi cellule RPE e IPE di varie specie tra cui roditori, maiali e bovini. I globi vengono espiantati e la cornea e la lente vengono rimosse per accedere all'iride e alla retina. Utilizzando una spatola su misura, le celle IPE vengono rimosse dall'iride isolata. Per raccogliere le cellule RPE, può essere necessaria un'incubazione di tripsina, a seconda della specie. Quindi, utilizzando la spatola personalizzata RPE, le celle vengono sospese nel mezzo. Dopo la semina, le cellule vengono monitorate due volte a settimana e, dopo aver raggiunto la confluenza, trasfettate dall'elettroporazione. L'integrazione genica, l'espressione, la secrezione proteica e la funzione sono state confermate da qPCR, WB, ELISA, immunofluorescenza e saggi funzionali. A seconda della specie, 30.000-5 milioni (RPE) e 10.000-1,5 milioni (IPE) di cellule possono essere isolate per occhio. Le cellule geneticamente modificate mostrano una significativa sovraespressione di PEDF/GM-CSF con la capacità di ridurre lo stress ossidativo e offrono un sistema flessibile per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo per sviluppare approcci di terapia genica oculare.
Introduction
Il nostro gruppo si sta concentrando sullo sviluppo di approcci rigenerativi per il trattamento della degenerazione neuroretinica, cioè AMD, mediante terapia genica non virale basata su RPE e IPE. L'istituzione pre-clinica di tali terapie richiede modelli in vitro trasferibili agli esseri umani. Pertanto, l'obiettivo dello studio qui presentato è quello di fornire protocolli per l'isolamento, la coltura e l'ingegneria genetica delle cellule PRIMARIE RPE e IPE. Il razionale per stabilire l'isolamento delle cellule PE da più specie è quello di confermare in modo robusto la sicurezza e l'efficienza dell'approccio e aumentarne la riproducibilità e la trasferibilità. La linea cellulare RPE umana disponibile ARPE-19 differisce dalle cellule primarie (ad esempio, sono meno pigmentate) ed è, quindi, solo di valore limitato per le analisi pre-cliniche1. Inoltre, le cellule di mammifero non umane possono essere acquistate a costi inferiori e in quantità maggiori; il tessuto del donatore umano può essere ottenuto da varie banche oculari, ma la disponibilità è limitata e costosa. Infine, i nuovi medicinali per terapie avanzate (ATMP, cioè cellule, tessuti o medicinali per terapia genica) devono essere applicati in almeno due specie diverse prima di essere testati nei pazienti e questi studi in vivo richiedono la preparazione di trapianti di cellule allogeniche.
Le malattie neurodegenerative della retina sono la principale causa di cecità nei paesi industrializzati, comprendendo malattie comuni come l'AMD, così come malattie rare come la retinite pigmentosa, in cui la morte delle cellule retiniche alla fine porta alla cecità. Il danno alle cellule RPE, ai fotorecettori e alle cellule gangliari retiniche (RGC) può in alcuni casi essere rallentato, ma attualmente non sono disponibili terapie curative. Gli ATMP offrono il potenziale per correggere i difetti genetici, integrare geni terapeutici o sostituire le cellule degenerate, consentendo così lo sviluppo di terapie rigenerative e curative per malattie come l'AMD; 13 terapie geniche hanno già ottenuto l'approvazione alla commercializzazione, inclusa una terapia per il trattamento della degenerazione retinica associata alla mutazione RPE652,3. Tra gli anziani (>60 anni), ~ 30 milioni di persone in tutto il mondo sono affette da AMD4neovascolare (nvAMD) o avascolare (aAMD). Entrambe le forme sono indotte da fattori scatenanti associati all'età tra cui danno ossidativo, compromissione della funzione e perdita di cellule RPE seguita da degradazione dei fotorecettori, tra gli altri (ad esempio alleli di rischio genetico, fumo, ipertensione)5,6. In nvAMD, la patogenesi è aggravata da uno squilibrio di fattori angiogenici e anti-angiogenici a favore del fattore di crescita endoteliale vascolare angiogenico (VEGF) che induce la neovascolarizzazione coroidale (CNV). Ad oggi, solo nvAMD è curabile con iniezioni intravitreali mensili di inibitori della proteina VEGF per sopprimere il CNV; nessun trattamento efficace è ancora disponibile per aAMD6,7.
Diversi studi hanno valutato terapie cellulari per sostituire la terapia anti-VEGF: gli studi condotti da Binder et al., in cui cellule RPE autologhe appena raccolte sono state trapiantate in pazienti con nAMD8,9,10,hanno mostrato un moderato miglioramento visivo, ma solo un piccolo gruppo di pazienti ha raggiunto un'acuità visiva finale abbastanza alta da consentire la lettura. Recentemente, uno studio clinico di fase I ha utilizzato un cerotto RPE derivato da cellule staminali embrionali per trattare l'AMD con risultati promettenti; vale a dire, efficacia, stabilità e sicurezza del cerotto RPE per un massimo di 12 mesi in 2 dei 10 pazienti trattati11. Inoltre, diversi gruppi hanno pubblicato studi in cui i cerotti autologhi RPE-Bruch membrana-coroide sono stati prelevati dalla retina periferica e trapiantati nella macula12,13,14; e per il trapianto sono stati generati cerotti RPE derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)15. Per l'aAMD, gli anticorpi mirati alla via del complemento sono stati testati in studi clinici6,16 e uno studio di fase I utilizzando una singola iniezione intravitreale di un vettore virale adeno-associato (AAV) che codifica il gene per il fattore CD59 (AAVCAGsCD59) in pazienti con atrofia geografica (GA) è stato completato17; lo studio di fase II è stato recentemente avviato e mira a reclutare 132 pazienti con aAMD avanzata e a valutare l'esito a 2 anni dopo l'intervento18. Infine, il gruppo di studio FocuS ha avviato uno studio clinico multicentrico di fase I/II che valuta la sicurezza, la risposta alla dose e l'efficacia di un vettore AAV ricombinante non replicante che codifica un fattore del complemento umano19.
In primo luogo, l'obiettivo di una terapia rigenerativa AMD è il trapianto di cellule RPE funzionali, che sono state danneggiate o perse. Tuttavia, le cellule IPE e RPE condividono molte somiglianze funzionali e genetiche (ad esempio, fagocitosi e metabolismo del retinolo) e, poiché le cellule IPE sono raccolte in modo più fattibile, sono state proposte come sostituto RPE20. Anche se è stato precedentemente dimostrato che il trapianto di cellule IPE ritarda la degenerazione dei fotorecettori nei modelli animali21,22 e stabilizza la funzione visiva nei pazienti con nvAMD allo stadio finale, non è stato osservato alcun miglioramento significativo in questipazienti 23. La mancanza di efficacia può essere dovuta al basso numero di cellule trapiantate e/o allo squilibrio dei fattori retinici neuroprotettivi. Un approccio alternativo sarebbe quello di trapiantare cellule epiteliali pigmentate trasfettate che sovraesprimono fattori neuroprotettivi per ripristinare l'omeostasi retinica, mantenere le cellule RPE rimanenti e proteggere i fotorecettori e gli RGC dalla degenerazione. Di conseguenza, proponiamo una nuova terapia che comprende il trapianto di cellule funzionali RPE o IPE che sono state sottoposte a ingegneria genetica per secernere proteine neuroprotettive e anti-angiogeniche, come PEDF, GM-CSF o fattori di crescita insulino-simili (IGF). Il vantaggio di sviluppare e analizzare questo approccio in diverse specie invece di utilizzare una linea cellulare, una sola specie, o tessuto umano è: 1) aumentata riproducibilità e trasferibilità dei risultati come dimostrato da numerosi studi realizzati in laboratori indipendenti e diverse specie1,24,25; 2) le cellule suine o bovine sono fattibilmente usa e getta senza il sacrificio di altri animali; 3) la disponibilità soprattutto di cellule suine e bovine consente a grandi serie di test di produrre risultati robusti; 4) la conoscenza di isolare, colturare e modificare geneticamente le cellule dai modelli maggiormente utilizzati consente analisi in vivo in più specie24,25,26 e offre quindi un migliore rapporto rischio-beneficio per i primi pazienti trattati; 5) la flessibilità del protocollo presentato ne consente l'utilizzo in vari modelli e set up sperimentali e per tutte le terapie cellulari oculari con e senza ingegneria genetica. Al contrario, tecniche alternative come le linee cellulari o il tessuto umano sono solo di limitata trasferibilità e/ o disponibilità limitata. Le linee cellulari come l'ARPE-19 sono ideali per esperimenti preliminari; tuttavia, la bassa pigmentazione e l'alta proliferazione differiscono significativamente dalle cellule primarie1. Le cellule RPE e IPE, isolate dal tessuto umano del donatore, offrono una preziosa fonte per esperimenti in vitro trasferibili; tuttavia, otteniamo tessuto umano da una Banca degli occhi statunitense-americana, il che significa che il tessuto ha almeno due giorni (dopo l'enucleazione) e richiede un trasporto lungo e costoso, ma il tessuto del donatore locale non è disponibile in quantità sufficienti per una ricerca produttiva. Il vantaggio dell'uso di cellule primarie è confermato da molteplici studi di altri gruppi27,28.
Per lo sviluppo di una terapia genica non virale a base cellulare utilizzando il sistema di trasposoni SB100X per trasfettare cellule primarie RPE e IPE con i geni che codificano per PEDF e/o GM-CSF per trattare nvAMD e aAMD, rispettivamente29,30,31,32,abbiamo prima stabilito la trasfezione delle cellule ARPE-191 . Successivamente, i protocolli di isolamento e trasfezione sono stati stabiliti in cellule primarie bovine e sucine facilmente accessibili. Ora, è stato stabilito l'isolamento e la trasfezione di cellule primarie RPE e IPE da cinque diverse specie, da piccoli (come topi) a grandi mammiferi (come bovini). È stato confermato in cellule primarie RPE e IPE derivate da occhi di donatori umani30. La produzione conforme alle buone pratiche di fabbricazione (GMP) dell'ATMP è stata convalidata utilizzando anche tessuto di donatore umano33. Infine, sia la sicurezza che l'efficienza dell'approccio sono state valutate in vivo in tre diverse specie per le quali il protocollo è stato adattato: topo, ratto e coniglio. Nel set-up clinico, una biopsia dell'iride sarà prelevata dal paziente e le cellule IPE saranno isolate e trasfettate nella camera bianca, prima che le cellule vengano trapiantate subretinamente nello stesso paziente. L'intero processo si svolgerà durante una singola sessione chirurgica della durata di circa 60 minuti. Lo sviluppo dell'approccio terapeutico e la valutazione della sua efficienza hanno richiesto eccellenti modelli in vitro ed ex vivo per implementare metodi di consegna genica robusti ed efficienti, per analizzare l'efficienza della consegna genica, la produzione terapeutica di proteine e gli effetti neuroprotettivi e per produrre trapianti di cellule per testare l'approccio in vivo1,24,25,29,30 . Vale la pena ricordare che la terapia ha l'approvazione etica per uno studio clinico di fase Ib/IIa da parte della commissione etica per la ricerca del Cantone di Ginevra (n. 2019-00250) e attualmente gli ultimi dati pre-clinici richiesti per l'autorizzazione dalle autorità di regolamentazione svizzere sono raccolti utilizzando il protocollo presentato. A questo proposito, i dati pre-clinici in vivo hanno dimostrato una significativa riduzione del CNV e un'ottima sicurezza24,25,31.
Qui viene descritto l'isolamento e la coltura di cellule RPE / IPE da bovini, suini, conigli, ratti e topi e l'uso del sistema di trasposone integrativo SB100X combinato con l'elettroporazione come metodo efficiente di consegna genica. In particolare, le cellule PE primarie sono state trasfettate per sovraesprimere PEDF e GM-CSF. La raccolta di questi protocolli consente di eseguire gli studi in vitro e in vivo in tutte le fasi pre-cliniche dello sviluppo di ATMP. Inoltre, il set-up ha il potenziale per essere adattato ad altri geni di interesse e malattie.
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Protocol
I protocolli in cui gli animali sono stati coinvolti sono stati eseguiti da personale certificato e previa autorizzazione del Dipartimento cantonale della sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale di Ginevra, Svizzera, e secondo la Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva (approvazione n. GE/94/17). Ratti adulti sani brown norway, topi C57BL/6 e conigli bianchi neozelandesi sono stati eutanasizzati da un sovradosaggio di Pentobarbital (150 mg/kg) diluito in NaCl iniettato allo 0,9% intraperitoneale e gli occhi sono stati enucleati immediatamente dopo il sacrificio. Occhi suini e bovini sono stati ottenuti da un macello locale entro 6 ore dal sacrificio e sono stati trasportati in laboratorio su ghiaccio.
1. Prima della preparazione
- Preparare un mezzo completo (DMEM / F12 di Ham integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS), 80 U / mL di penicillina / 80 μg / mL di streptomicina e 2,5 μg / mL di amfotericina B). Riscaldare il mezzo, 1x PBS e 0,25% di tripsina (se necessario) a bagnomaria a 37 °C.
- Metti un drappo sterile nel cappuccio per preparare un posto di lavoro asettico. Introdurre tutti gli strumenti e i materiali sterili necessari all'interno della cappa.
NOTA: Solo l'enucleazione degli occhi e la pulizia del tessuto muscolare e della pelle rimanenti sono le procedure eseguite all'esterno del cappuccio, il resto dei passaggi deve essere eseguito all'interno del cappuccio.
2. Isolamento delle cellule PE di ratto/topo
- Usa forbici curve e pinza Colibri per enucleare gli occhi dopo l'eutanasia dell'animale. Pulire il tessuto muscolare rimanente e la pelle dagli occhi usando forbici e pinza (non sterili).
NOTA: La dimensione delle forbici e delle pinza utilizzate per l'enucleazione e la pulizia degli occhi dipende dalla specie (ad esempio, per ratti e topi gli strumenti saranno più piccoli di quelli utilizzati per suini e bovini) (vedi Figura S1).- Raccogliere gli occhi in un tubo da 50 ml riempito con PBS non sterile e trasferire il tubo nella cappa a flusso laminare. Disinfettare gli occhi immergendoli per 2 minuti in una soluzione a base di iodio, quindi trasferirli in una capsula di Petri riempita con PBS sterile.
- Apertura della lampadina
- Dopo aver trasferito gli occhi su una capsula di Petri sterile, tenerne uno saldamente vicino al nervo ottico con Colibri o pinna appuntita. Perforare un foro vicino al limite dell'iride (tra pars plana e ora serrata) con un ago da 18 G. Inserire piccole forbici nel foro e tagliare intorno all'iride. Rimuovere il segmento anteriore (cornea, lente e iride) e metterlo in una capsula di Petri. Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate.
- Isolamento delle cellule IPE
- Rimuovere la lente e con una pince fine estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Mettere l'iride in una capsula di Petri, lavare con PBS sterile e lasciarlo in PBS fino a quando non viene preparata più iride.
- Ripeti i passaggi da 2.2.1 a 2.3.1 affinché tutti gli occhi siano preparati quel giorno.
- Aggiungere 50 μL di tripsina allo 0,25% per iride e incubare per 10 minuti a 37 °C. Rimuovere la tripsina, aggiungere 150 μL di mezzo completo per iride e raschiare delicatamente l'IPE con una pipetta Pasteur piatta lucidata a fuoco; utilizzare pinze sottili per immobilizzare il tessuto. Raccogliere la sospensione cellulare e inserire un tubo da 1,5 ml. Utilizzare 10 μL della sospensione cellulare diluita 1:3 con tripano blu per contare le cellule nella camera neubauer34,35.
- Se non trasfettato immediatamente, seminare 200.000 cellule/pozzetti in una piastra a 24 pozzetti (100.000 cellule/cm2)in 1 mL di terreno completo (10% FBS) (per la semina vedi Tabella 1). Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Potrebbe essere necessario raggruppare più occhi insieme per avere abbastanza cellule per la semina.
- Isolamento delle celle RPE
- Rimuovere l'umore vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinna sottile. Evitare di danneggiare l'epitelio pigmentato retinico.
- Taglia il segmento a metà con un bisturi #10 per avere il globo completamente aperto e lavalo con PBS sterile.
- Aggiungere 50 μL di tripsina allo 0,25% per occhio e incubare per 10 minuti a 37 °C. Rimuovere la tripsina e aggiungere 150 μL di mezzo completo per globo e raschiare delicatamente le cellule RPE con un bisturi rotondo; utilizzare pinze sottili per immobilizzare il tessuto. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare; diluire 1:4 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
- Vedere il passaggio 2.3.4.
NOTA: Potrebbe essere necessario raggruppare più occhi insieme per avere abbastanza cellule per la semina.
3. Isolamento delle cellule di PE di coniglio
- Eseguire la pulizia e la disinfezione come descritto nei passaggi da 2.1 a 2.1.1.
- Metti un occhio su un impacco di garza sterile e tienilo saldamente vicino al nervo ottico. Aprire l'occhio con il bisturi #11 e le forbici a circa 2 mm sotto il limbus. Rimuovere il segmento anteriore (cornea, lente e iride) e metterlo in una capsula di Petri. Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate.
- Isolamento delle cellule IPE
- Eseguire il passaggio 2.3.1. Rimuovere il corpo ciliare dall'iride tagliando con un bisturi #10.
- Dopo la preparazione di 2 iris, incubare con 1 mL di tripsina allo 0,25 % a 37 °C per 10 minuti; durante questo periodo, le celle RPE possono essere isolate (vedere il passaggio 3.4). Rimuovere la tripsina e aggiungere 1 mL di mezzo completo all'iride e isolare le cellule grattando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata al fuoco. Risuscimere accuratamente le cellule mediante pipettaggio e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:3 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
- Vedere il passaggio 2.3.4.
- Isolamento delle celle RPE
- Eseguire il passaggio 2.4.1.
- Metti una garza sterile in un piatto da 12 pozzetti e metti il bulbo sopra la garza.
- Lavare con PBS ed eseguire il passaggio 2.4.3.
NOTA: utilizzare una pipetta Pasteur curva lucidata a fuoco. - Centrifugare le celle 10 min a 120 x g.
- Vedere il passaggio 2.3.4.
4. Isolamento delle cellule PE suine
- Eseguire la pulizia come descritto nel passaggio 2.1. Lavare con PBS e disinfettare gli occhi immergendo per 2 minuti in soluzione a base di iodio, risciacquare con PBS. Continuare con il passaggio 3.2.
- Isolamento delle cellule IPE
- Eseguire il passaggio 3.3.1. Dopo la preparazione di 2 iris, aggiungere 1 mL di mezzo completo e isolare le celle grattando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata al fuoco. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:4 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
- Vedere il passaggio 2.3.4.
- Isolamento delle celle RPE
- Eseguire il passaggio 2.4.1. Posizionare la lampadina in una capsula di Petri e lavare con PBS. Riempire la lampadina con 1 mL di mezzo completo.
- Utilizzando una pipetta Pasteur curva lucidata al fuoco, rimuovere con cura le celle RPE. Assicurati di raschiare dal basso verso l'alto per evitare di scivolare verso il basso del complesso di membrana coroide-Bruch. Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo utilizzando una pipetta da 1.000 μL e trasferirla in un tubo da 1,5 mL per la ricaspensione. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:8 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
- Vedere il passaggio 2.3.4.
5. Isolamento delle cellule di EP bovina
- Eseguire la pulizia come descritto nel passaggio 2.1. Lavare con PBS e disinfettare gli occhi immergendo per 2 minuti in soluzione a base di iodio, risciacquare con PBS. Continuare con il passaggio 3.2.
- Isolamento delle cellule IPE
- Eseguire il passaggio 3.3.1. Dopo la preparazione di due iris, incubare con 2 ml di tripsina allo 0,25% a 37 °C per 10 min. Durante questo periodo, le celle RPE possono essere isolate (vedere il passaggio 5.3).
- Rimuovere la tripsina e aggiungere 2 mL di mezzo completo all'iride e isolare le cellule graffiando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata a fuoco. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Centrifugare le celle 10 min a 120 x g. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:4 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
- Se non trasfettato immediatamente, seminare 320.000 cellule/pozzetti in una piastra a 6 pozzetti in 3 ml di terreno completo (10% FBS) (per la semina vedere Tabella 1). Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 °C, 5% CO2.
- Isolamento delle celle RPE
- Seguire il passaggio 2.4.1. Posizionare la lampadina in una capsula di Petri e lavare con PBS. Dopo la preparazione di 2 occhi riempire il bulbo circa 3/4 con tripsina e incubare per 25 minuti a 37 °C con il coperchio della capsula di Petri sopra i bulbi.
- Rimuovere la tripsina e aggiungere 1 mL di mezzo completo. Eseguire il passaggio 4.3.2. Centrifugare le celle 10 min a 120 x g.
- Vedere il passaggio 5.2.3.
6. Coltivazione - cambio medio
- Coltura le cellule in DMEM /Ham's F12, integrato con 10% FBS, 80 U / mL penicillina / 80 μg / mL streptomicina e 2,5 μg / mL amfotericina B, a 37 ° C e 5% CO2 in un incubatore umidificato. Dopo 3-4 giorni pipettare su e giù per raccogliere le cellule non aderenti e mettere metà del volume in un altro pozzo. Riempire fino a 1 ml con mezzo completo.
NOTA: in questo modo è possibile avere una superficie sufficientemente grande da consentire a tutte le celle isolate di collegarsi e massimizzare l'output. - Dopo altri 3-4 giorni ripetere la raccolta cellulare, ma questa volta mettendo insieme le cellule non aderenti da due pozzeli in un unico pozzo (ad esempio, A1 + B1 in C1). Aggiungi medio a tutti i pozzi. Osservare le cellule e cambiare il mezzo 2 volte a settimana (per le piastre a 6 e 24 pozzi utilizzare rispettivamente 3 e 1 ml / pozzo). Quando le cellule raggiungono la confluenza, passare al mezzo completo con l'1% di FBS o utilizzare le cellule per esperimenti (ad esempio, trasfezione).
NOTA: le cellule RPE e IPE sono confluenti rispettivamente dopo 3-4 e 4-5 settimane dopo l'isolamento. La purezza della coltura cellulare è stata corroborata controllando la morfologia cellulare (cellule pigmentate) e marcatori specifici come descritto da Johnen e colleghi36.
7. Elettroporazione di celle primarie in PE
- Eseguire l'elettroporazione come descritto prima1,37.
- A seconda del numero di cellule trasfettate utilizzare piastre a 6, 24 o 48 polizze (vedi Tabella 2)per seminare le cellule in mezzo senza antibiotici o antimicotici. Per le successive 2 settimane aggiungere gocce con penicillina media contenente (80 U / mL), streptomicina (80 μg / mL) e amfotericina B (2,5 μg / mL) due volte a settimana. Sostituire completamente il mezzo 2 settimane dopo la trasfezione.
- Per determinare la crescita cellulare, l'efficienza della trasfezione e la secrezione proteica, monitorare le cellule settimanalmente al microscopio e analizzare il surnatante di coltura cellulare mediante western blot. Prima della fine della coltura, prendere un surnatante di coltura cellulare di 24 ore per quantificare la secrezione proteica tramite ELISA, contare le cellule, misurare la fluorescenza mediante citometria basata su immagini (nel caso di cellule trasfettate da Venere)seguendo le istruzioni dei produttori (vedere Tabella dei materiali)e raccogliere il pellet cellulare per l'analisi dell'espressione genica basata su RT-qPCR.
NOTA: Questi metodi non sono inclusi nel presente documento poiché non è lo scopo di spiegare in dettaglio l'analisi delle cellule, ma piuttosto il loro isolamento. La densità di semina cellulare è la stessa per tutte le specie (100.000 cellule/cm2)ma poiché il numero di cellule isolate varia, sono state utilizzate piastre diverse. Inoltre, per topi, ratti e conigli potrebbe essere necessario mettere in comune 2-3 occhi per avere abbastanza cellule per la semina.
| Specie | Trattamento con tripsina | N° celle IPE | N° celle RPE | Piastra per semina (100.000 celle/cm2) |
| Topo/ratto | Sì | ~50.000 | ~150.000 | Piastre a 24 pozzi |
| Coniglio | Sì | ~350.000 | ~2.500.000 | Piastre a 24 pozzi |
| Maiale | No | ~1.000.000 | ~3.000.000 | Piastre a 24 pozzi |
| Bovino | Sì | ~1.700.000 | ~5.000.000 | Piastre a 6 pozzi |
Tabella 1: Numero di cellule PE primarie isolate da occhi di specie diverse.
| Nome | Area | Volume medio | Tripsina | Volume medio per fermare l'azione della tripsina | Densità di semina |
| Piastra a 6 pozzi | 9,6 cm² | 3,0 ml | 0,5 ml | 1,0 ml | 3x105 |
| Piastra a 24 pozzi | 2,0 cm² | 1,0 ml | 0,2 ml | 0,8 ml | 5x104 |
| Piastra a 48 pozzi | 1,1 cm² | 0,5 ml | 0,1 ml | 0,4 ml | 0,5-1x104 |
Tabella 2: Volumi di coltura cellulare e densità di semina.
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Representative Results
Isolamento dell'EP da diverse specie di mammiferi
Utilizzando i protocolli di cui sopra, le cellule IPE e RPE sono state isolate e coltivate con successo da cinque specie diverse. Il numero di cellule ottenute da ciascuna procedura dipende dalla specie e dalle dimensioni dell'occhio (Tabella 1). Come mostrato nella Figura 1,le cellule mostrano la morfologia e la pigmentazione tipiche delle cellule PE (ad eccezione delle cellule di coniglio mostrate, derivate da conigli albini della Nuova Zelanda bianca (NZW). A 21 giorni dopo l'isolamento, le cellule sono confluenti, pronte per essere utilizzate per ulteriori esperimenti (ad esempio, trasfezioni). Va notato che le colture di tutte le specie sono monitorate e controllate ulteriormente fino a 2 anni confermando la normale morfologia e l'espressione stabile del transgene (dati non mostrati).
La dedifferenziazione, lo stress cellulare e i cambiamenti nell'espressione genica sono stati esclusi dalla RT-qPCR e dall'immunoistochimica. Un pannello di geni (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) analizzati in cellule RPE umane trasfettate (cellule ARPE-19) ha confermato il normale pattern di espressione RPE1; che potrebbe essere confermato nelle cellule IPE bovine primarie mediante immunofluorescenza per RPE65 (Figura 2). Inoltre, Johnen e colleghi hanno confermato l'immunostifica ZO-1 nelle cellule IPE e RPE sucine primarie36.
Figura 1: Micrografie di cellule PE di vari mammiferi a 21 giorni dopo l'isolamento. Le cellule IPE e RPE di topo, coniglio (coniglio albino NZW), maiale e bovino sono mostrate al giorno 21 post-isolamento. Per tutte le specie, le culture mostrate sono confluenti. Si noti che le cellule pe di coniglio non sono pigmentate (ingrandimento originale, 50x). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immunostaining RPE65 di cellule IPE primarie. Colorazione RPE65 (verde) di cellule IPE bovine trasfettate con il plasmide di trasposone pFAR4-CMV-PEDF utilizzando un numero cellulare iniziale di 1 x10 4 cellule rispetto alle cellule di controllo non trasfettate (ingrandimento originale, 200x). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Vitalità dell'RPE primario trasfettato
La vitalità cellulare è mostrata nella Figura 3. Per escludere una potenziale tossicità del tampone utilizzato per il processo di elettroporazione, le celle RPE primarie pre-coltivate sono state sospese in tampone di elettroporazione da un kit disponibile in commercio o in un tampone nutritivo sviluppato da un'azienda farmaceutica (composizione riservata) ed elettroporate (E) (senza aggiunta di plasmide) come descritto nella fase 7 del protocollo. La vitalità cellulare è stata studiata 3 ± 1 giorni dopo la trasfezione utilizzando un kit di analisi di citotossicità disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali)seguendo le istruzioni del produttore. I saggi sono stati sempre eseguiti con un controllo senza alimentazione (Co-P) (non elettroporated). Non è stato osservato alcun impatto sulla vitalità cellulare per nessuno dei tamponi testati (Figura 3).
Figura 3: Vitalità delle cellule RPE primarie sospese in diversi tamponi. 1 x 104 celle sono state sospese in un tampone di elettroporazione da un kit disponibile in commercio o in un tampone nutritivo. La vitalità cellulare è stata misurata 3 ± 1 giorni dopo la trasfezione utilizzando un kit di analisi di citotossicità disponibile in commercio. Non sono state osservate differenze di vitalità tra i diversi buffer; i dati sono rappresentati come ± SD (n=2 donatori, 3 replicati/donatori). E: celle elettroporate, Co-P: controllo senza alimentazione. AU: unità arbitrarie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Trasfezioni di cellule PE pre-coltivate con il gene reporter Venus
50.000-100.000 cellule PE pre-coltivate di diverse specie sono state trasfettate con la proteina Venere fluorescente gialla (pT2-CAGGS-Venus) utilizzando il sistema di consegna del gene di trasposone SB100X iperattivo. Le micrografie mostrate nella Figura 4 confermano che le cellule sono state trasfettate con successo (cellule fluorescenti a 21 giorni dopo la trasfezione). La Figura 5 mostra la quantificazione dell'efficienza di trasfezione in cellule RPE suine pre-coltivate (n = 6 donatori, 50.000 cellule / trasfezione) trasfettate con Venere (pT2-CAGGS-Venere). La percentuale di cellule fluorescenti e MFI è stata misurata utilizzando la citometria basata su immagini seguendo le istruzioni del produttore al giorno della cessazione della coltura cellulare (30 ± 5 giorni dopo la trasfezione). La percentuale media di cellule fluorescenti era del 50± del 30% ma variabile che andava dal 95± 6% (donatore 2) al 28± all'1% (donatore 4) (Figura 5). In tutti gli esperimenti, le cellule ARPE-19 trasfettate sono state utilizzate come controllo positivo. Inoltre, l'efficienza della trasfezione è sempre stata confrontata con i controlli negativi: Co-P (controllo senza potenza [non elettropolato]) e Co + P (controllo con potenza [elettroporato ma senza aggiunta di plasmidi]). L'esperimento è stato eseguito anche con cellule IPE (dati non mostrati).
Figura 4: Micrografie di cellule PE pre-coltivate trasfettate con pT2-CAGGS-Venere. Lecellule di coniglio trasfettato da Venere (A), bovino (B) e suino (C) PE sono mostrate a 21 giorni dopo la trasfezione. Come controllo positivo, 50.000 cellule ARPE-19 sono state trasfettate con Venere (D). Micrografia sinistra: campo luminoso, micrografia destra: filtro GFP (480 nm) (ingrandimento originale, 50x). Le trasfezioni sono state fatte in triplice copia e sono stati inclusi controlli negativi: Co-P (controllo senza potenza [non elettropolato]) e Co + P (controllo con potenza [elettropolato ma senza aggiunta di plasmidi]) (non mostrato). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Efficienza di trasfezione in cellule RPE suini trasfettate con il gene reporter di Venere. (A) 50.000 cellule RPE suine primarie sono state trasfettate con pT2-CAGGS-Venere, l'efficienza media complessiva della trasfezione è stata del 50± 30% e l'IFM media è stata di 2712 ± 197 al giorno della cessazione delle colture cellulari (30±5 giorni dopo la trasfezione). Il grafico mostra la media ± SD (n=3 repliche) di 6 animali diversi. (B) La percentuale di cellule di Venere+ ARPE-19 utilizzate come controllo positivo, è stata del 98±6% ed è rimasta stabile per i 138 giorni in cui le cellule sono state seguite. L'intensità media di fluorescenza (IFM) è stata di 5.785 ± 1.255. Il grafico mostra la media ± SD (n=3 repliche) per ogni giorno. Co-P (controllo senza potenza [non elettropolato]) e Co+P (controllo con potenza [elettroporate ma senza aggiunta di plasmidi]) sono stati inclusi in tutti gli esperimenti di trasfezione (non mostrati). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Trasfezioni di cellule appena PE con gene reporter di Venere
10.000-50.000 cellule PE appena isolate dai conigli sono state trasfettate con la proteina fluorescente gialla Venere (pFAR4-CMV-Venus) e le colture cellulari sono state monitorate al microscopio. Nella Figura 6 le cellule fluorescenti possono essere osservate al giorno 21 post-trasfezione. La percentuale di cellule fluorescenti misurate mediante citometria basata su immagini è stata del 53± del 29% per le cellule IPE e del 28± del 23% per le cellule RPE (dati non mostrati).
Figura 6: Micrografie di cellule PE appena trasfettate isolate dal coniglio. 50.000 cellule IPE e RPE di coniglio sono state trasfettate con pFAR4-CMV-Venere. La fluorescenza viene mostrata al giorno 21 post-trasfezione. Micrografia sinistra: campo luminoso, micrografia destra: filtro GFP (480 nm). In tutti i casi, le trasfezioni sono state fatte in triplice copia (ingrandimento originale, 50x). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Trasfezioni di cellule PE con i geni terapeutici PEDF e GM-CSF
50.000 cellule PE sono state trasfettate con PEDF e la secrezione proteica è stata monitorata da WB (Figura 7). Il segnale WB per le cellule trasfettate era più alto rispetto alle cellule non trasfettate per tutte le specie e i giorni studiati; non è stata osservata alcuna diminuzione della secrezione proteica entro questo periodo.
Figura 7: Analisi WB della secrezione di PEDF di cellule PE trasfettate. L'analisi WB di supernatanti di suini (pre-coltivati) (A) e bovini (appena) (B) cellule PEDF-trasfettate mostrano una secrezione di PEDF più elevata rispetto al controllo (cellule non trasfettate) e stabile nel tempo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1: Strumenti utilizzati per l'isolamento dell'EP a seconda della specie. (A) Strumenti non sterili utilizzati per l'enucleazione degli occhi e la pulizia del tessuto muscolare e della pelle rimanenti. Il set 1 viene utilizzato per ratti, topi e conigli e il set 2 viene utilizzato per gli occhi di maiale e bestiame. (B) Strumenti sterili utilizzati per l'isolamento dell'EP. Si noti la diversa dimensione delle forbici e delle pinza utilizzate a seconda delle dimensioni dell'occhio. Le pipette Pasteur rotonde e piatte lucidate al fuoco vengono utilizzate rispettivamente per la raschiatura di RPE e IPE. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Avere metodi standardizzati per isolare e colturare le cellule PE è fondamentale nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici per le malattie degenerative della retina. Con i protocolli qui presentati, le cellule PE possono essere isolate con successo da diverse specie e coltivate per lunghi periodi (fino ad ora, la coltura più lunga è stata mantenuta per 2 anni1,38); è stata osservata la morfologia, la pigmentazione e la funzione tipiche delle cellule PE (Figura 1, Figura 2). Si noti che in particolare per le colture pure di RPE, è importante estrarre completamente la retina per evitare la contaminazione con le cellule retiniche neurali; per le cellule IPE, il corpo ciliare deve essere rimosso dall'iride come spiegato nel protocollo. La confluenza delle cellule si ottiene in un tempo relativamente breve (~ 21 giorni), dopo di che le cellule sono pronte per la trasfezione con geni terapeutici o per l'uso in altri esperimenti (ad esempio, esposizione ad agenti tossici, proteine, ecc.). Inoltre, i protocolli non sono solo cruciali per i test pre-clinici in vitro e in vivo, ma anche importanti per l'applicazione umana, cioè la convalida dei trapianti di cellule PE trasfettate; in particolare per il trattamento dell'AMD come in fase di sviluppo da parte del nostro gruppo, dove le cellule IPE saranno isolate da una biopsia dell'iride, immediatamente trasfettate e trapiantate subretinamente allo stesso paziente all'interno di una sessione chirurgica. L'isolamento e il trapianto subretinico di cellule IPE autologhe sono stati stabiliti nei conigli39 e neipazienti 23. Poiché il trapianto di cellule IPE autologhe ha avuto successo ma non è stato sufficiente per ripristinare la vista, la trasfezione delle cellule per sovraesprimere fattori neuroprotettivi, come PEDF e GM-CSF, è stata aggiunta all'approccio e stabilita in altre tre specie (topo, ratto e bovino). Con i metodi qui descritti per l'isolamento, la coltura e la modificazione genetica delle cellule PE, i rispettivi trapianti di cellule possono ora essere preparati da varie specie per testare la tossicità e l'efficienza dell'approccio in vivo.
È stato dimostrato che, utilizzando il sistema di trasposone iperattivo SB100X, le cellule PE di varia origine possono essere modificate in modo efficiente per sovraesprimere PEDF (Figura 7); sono stati pubblicati risultati simili utilizzando IPE di ratto e RPE24 e cellule RPE umane29,30. La trasfezione con PEDF è stata proposta per trattare nvAMD mediante inibizione della neovascolarizzazione mediata da VEGF e protezione delle cellule RPE e dei neuroni retinici dal glutammato e dallo stress ossidativo nonché dall'ischemia40,41. La conferma della secrezione proteica stabile a lungo termine (Figura 7) ha confermato le cellule PE come un affidabile "sistema di somministrazione di farmaci" biologico. A questo proposito, l'efficienza della trasfezione studiata con il gene reporter Venus (Figura 4, Figura 5, Figura 6) ha confermato elevate efficienze di trasfezione di ~ 20-100% (dipendenti da specie e donatori) come riportato in Johnen et al. 1.
Va notato che sebbene la dimensione dei plasmidi utilizzati fosse variabile, dai miniplasmidi pFAR (~ 3.000 bp) ai plasmidi con una spina dorsale pT2 (~ 5.000 bp)30, le efficienze di trasfezione erano relativamente elevate. Le differenze osservate nell'efficienza della trasfezione sono probabilmente dovute alla variabilità nel tempo dall'enucleazione all'isolamento cellulare e nella conservazione dei tessuti, ma non hanno alterato la morfologia cellulare né il tempo in cui le cellule raggiungono la confluenza (~ 21 giorni dopo l'isolamento), o il tempo in cui le cellule sono state seguite dopo la trasfezione. In generale, una considerazione importante per ottenere una trasfezione di successo è che la fonte di cellule PE dovrebbe essere il più fresca possibile; questo è particolarmente importante per le trasfezioni con cellule PE appena isolate.
Confrontando con i trapianti di fogli cellulari, la terapia che il nostro gruppo sta sviluppando (cellule trasfettate trapiantate subretinamente come sospensione cellulare) è meno invasiva poiché la prima richiede grandi retinotomie con i rischi associati di vitreoretinopatia proliferativa e fibrosi subretinica42. Inoltre, negli innesti di fogli per AMD umida l'area di CNV viene rimossa insieme alla coroide adiacente e quindi, la sopravvivenza dell'innesto potrebbe essere compromessa43. Infine, l'idea di utilizzare un cerotto cellulare non è compatibile con la procedura proposta, in cui l'isolamento, la modifica e il trapianto delle cellule vengono eseguiti durante una singola sessione chirurgica. D'altra parte, i problemi intrinseci delle cellule PE trapiantate come sospensioni cellulari sono la potenziale morte cellulare durante il parto, la mancanza di adesione e la varianza nella distribuzione cellulare; ma questi inconvenienti potrebbero essere superati con approcci di ingegneria tissutale42; inoltre, la sopravvivenza cellulare potrebbe essere migliorata mediante l'uso di agenti pro-sopravvivenza44,45,46,47. Riteniamo che il trapianto di cellule PE primarie sovraesprimendo fattori neuroprotettivi come PEDF e GM-CSF come sospensione cellulare sia un approccio promettente per il trattamento dell'AMD, e per sviluppare questa terapia i protocolli qui presentati sono cruciali poiché consentono la standardizzazione dell'isolamento, della coltura e dell'analisi delle cellule PE primarie.
In sintesi, il protocollo fornisce un sistema modello avanzato per lo sviluppo e la sperimentazione pre-clinica in vitro e in vivo di terapie medicinali avanzate oculari in cinque diverse specie, abbastanza robusto da compensare le variazioni individuali nella qualità cellulare dalle diverse fonti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Un ringraziamento merita Gregg Sealy e Alain Conti per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione europea nell'ambito del Settimo programma quadro, della Fondazione nazionale svizzera per le scienze e della Fondazione Schmieder-Bohrisch. Z.I. ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] e B.M.W. da una borsa di ricerca Fulbright e da una borsa di studio di eccellenza del governo svizzero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
- Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
- Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
- Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
- Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
- Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
- Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , Springer-VerlaglWien. New York. 7985-7987 (2004).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
- Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
- Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
- Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
- Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , NCT03144999 (2019).
- , Hemera Biosciences. Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , NCT04358471 (2020).
- Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , NCT03846193 (2019).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
- Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
- Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
- Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
- Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , Boston, USA. Meeting Abstract: MDD228. Poster (2020).
- Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
- Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
- Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
- Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
- Marienfeld. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
- Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
- Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
- Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
- Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
- Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
- Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
- Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
- Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
- Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).
